Historické mezníky. Název protein - Berzelius. Objevena v tšina aminokyselin. Sumner krystalizace ureázy v istém stavu katalytický

Transkript

1 Proteomická analýza

2 Historické mezníky 1838 Název protein - Berzelius Objevena v tšina aminokyselin Sumner krystalizace ureázy v istém stavu katalytický inek Tiselius elfo jako metodika lení protein Martin a Synge vývoj chromatografických technik Pauling a Corey sekundární struktury protein Sanger aminokyselinové složení insulinu Monod a spol. alosterické zm ny v konformaci protein

3 PROTEIN J. J. Berzelius 1838 Proteios PROTEOMIKA Marc Wilkins 1994 PROTEOM Kompletní sada bílkovin p ítomných v daném okamžiku v bu ce, nebo tkáni, zahrnující veškeré jejich modifikace, vzájemné interakce, lokalizaci a metabolický obrat. PROTEOMIKA kvantitativní a kvalitativní charakterizace úplné sady bílkovin organely, bun né linie, tkán nebo organismu kvantitativní a kvalitativní porovnání proteomu za r zných podmínek

4 Vnit ní parametry Vn jší parametry Genetické dispozice Stárnutí Onemocn ní Lé iva Životní prost edí Bu ka Geny mrna Proteiny Genová analýza SNP Mutace Sekvenace Analýza exprese mrna Protein Analýza interakcí Protein-protein Antigen-protilátka Enzym-substrát Protein-DNA Ligand-receptor

5 Co je to proteomika? decký obor studující proteiny Proteomika Genomika PROTEin+genOME Proteom Exprese +posttransla ní modifikace +alternativní sest ih +alternativní zavinutí Genom Souhrn všech protein v daném organismu Lidské t lo obsahuje miliony protein Exprese protein v rámci jednoho organismu se liší v r zných ástech t la, v r zných stádiích životního cyklu a v r zných podmínkách prost edí Souhrn všech gen v daném organismu Lidský genom obsahuje gen Genom je konstantní celek

6 Cíle proteomiky Získat globální a integrovaný pohled na biologii studiem kompletní bílkovinné sít bu ky, spíše než studiem jednotlivých protein. Cílem je nejen identifikovat všechny bílkoviny, ale zárove pochopit jejich funkci a strukturu a vytvo it 3D mapu bu ky (ur it lokalizaci jednotlivých bílkovin).

7 íklady obecných funkcí protein Enzym Strukturní protein Transportní protein Pohybový protein Zásobní protein Signální protein Receptorový protein Regula ní protein v genové expresi Proteiny se zvláštním posláním

8 Pro proteomika když máme genomiku? nelze ur it funkci proteinu na základ sekvence DNA nebo mrna nelze popsat molekulární mechanismy pomocí studia genomu 200 typ posttransla ních modifikací existuje alternativní translace!!!! špatná korelace hladin mrna a skute ných hladin bílkovin!!! PRO PROTEOMIKA KDYŽ MÁME GENOMIKU? PROTOŽE PROTEINY A NIKOLIV GENY VYTVÁ EJÍ FENOTYP!

9 Jeden gen, mnoho bílkovin

10 Centrální dogma molekulární biologie

11 Základním stavebním kamenem bílkoviny je aminokyselina

12 Od RNA k proteinu Jazyk RNA se p ekládá do jazyka protein. Genetický kód nazýváme tripletový, protože t i nukleotidy v RNA specifikují jednu aminokyselinu v proteinu RNA se sestává ze ty písmen : A,U,G,C

13 Tripletový kód

14 Genetický kód je tripletový AUG je startovní kodón, kóduje metionin UAA, UAG, UGA jsou stop kódony Genetický kód je degenerovaný: ve tšin p ípad je jedna aminokyselina kódována víc než jedním tripletem (max. 6) Genetický kód byl rozlušt n na po átku šedesátých let XX. století

15 Rozlušt ní genetického kódu 1961: Marshall Nirenberg vytvo il um lou mrna, která se sestával ze samých uracil : UUUUUUUUUUUUUUUU atd. výsledkem translace byla bílkovina, sestávající ze samých fenylalanin : phe-phe-phe-phe atd. Nirenberg uzav el: kodón UUU kóduje fenylalanin do 1965 byl znám celý genetický kód

16 Genetický kód se musel vyvinout velmi dávno Genetický kód je (tém ) univerzální, sdílí jej celá živá p íroda, od nejjednodušších bakterií po savce p íjemným d sledkem je, že díky technikám genových manipulací jž dnes baktérie vyrábí látky d ležité pro lov ka (nap. insulin, STH) Rostlinka tabáku, do které byl vložen gen pro luciferázu od sv tlušek.

17 Genetický kód se musel vyvinout velmi dávno Do t chto prasat byl vložen gen z medúzy a prasata ve tm sv télkují

18 Mitochondriální kód se v p ti trojicích liší

19 tecí rámec kódony mezi sebou nemají mezery, ale p esto jsou teny jako t ípísmenková slova. tecí rámec specifikuje první písmeno, od kterého za ínáme íst a dává nám smysl ty: d d jed med dj edm ed anglická verse: The red dog ate the cat her edd oga tet hec at nebo Why did the red bat eat the fat rat? W hyd idt her edb ate att hef atr at

20 Translace v eukaryotické bu ce Strukturní gen je epsán do pre-mrna Pre-mRNA je upravena do mrna mrna opouští jádro Na ribozómech podléhá mrna translaci a vzniká polypeptidový et zec

21 V prokaryotické bu ce je transkripce spojena s translací

22 Iniciace translace

23 Elongace polypeptidového et zce Elongace za íná p len ním aminoacyl-trna ke správnému kodonu na A míst ribozomu

24 Elongace translace

25 Terminace translace Na stop kodon se navazuje bílkovina zvaná release factor a syntéza polypeptidu je ukon ena. Nov vzniklý polypeptid se uvolní od trna; trna se uvolní z ribozómu a dv ribozomální podjednotky se uvolní od mrna Syntéza polypeptidu pokra uje dokud není dosaženo stop kodonu

26 Terminace translace

27 Polysomy Danou mrna m že v daném ase íst více ribozóm Tímto zp sobem je možné vytvo it sou asn mnoho polypeptid z jediné mrna

28 Iniciace Elongace Terminace

29 Polyribozómy

30 Signální peptidy ur ují práv vzniklým protein m jejich bun nou destinaci

31 Signální peptid signální peptid je tvo en sekvencí cca 20 aminokyselin na nebo poblíž N-konci vznikajícího peptidu signální peptid je rozeznán tzv. SRP ásticí (signal-recognition particle). Tato ástice poutá peptid a ribosom k receptorovému proteinu v membrán ER. receptorový protein v sob obsahuje pór, kterým peptid pronikne do ER. Enzymy potom signální peptid obyvkle odstraní Ubikvitinylace

32 Transkripce a translace v eukaryotické bu ce ehled

33 Srpkovitá anémie

34 Nár st diverzity protein Posttransla ní modifikace Alternativní sest ih Alternativní zavinutí Primární transkript mrna p ed posttranskrip ní modifikací Alternativní sest ih Posttransla ní modifikace Alternativní zavinutí

35 Posttransla ní modifikace Chemická modifikace protein po translaci 1. P ipojení funk ních skupin (acetát, fosfát, lipidy, cukry) 2. Modifikace amino skupin 3. Strukturní zm ny (tvorba disulfidických vazeb, proteolytické št pení)

36 Alternativní sest ih Z primárního transkriptu (1 genu) vzniká více mrna a tedy více r zných protein

37 Alternativní zavinutí Protein se zavinuje tak, aby byla co nejmenší jeho volná energie Existuje však n kolik alternativních konformací. Lokální minima (alternativní konformace) Globální minimum (nativní stav)

38 Schéma sou asné proteomiky

39 Základní schéma analýzy užívané v proteomice Sm s 1. Separace protein 2D-PAGE 2. Izolace Št pení trypsinem Jednotlivé proteiny 4. Sekven ní analýza Fragmentace peptid Sekvence peptid Peptidy 5. Porovnání s databází 3. Hmotnostní analýza Hmotnostní spekroskopie Hmotnostní spektra peptid Identifikace protein

40 Aplikace proteomiky v medicín (proteomika nemocí) Úloha protein ve vzniku nemocí Exprese protein u nemocí Biomarkery nemocí Detekce protein vznikajících b hem nemoci je využita k diagnóze Alzheimerova choroba (amyloid ) Srde ní onemocn ní (interleukin-6 a 8, sérový amyloid A, fibrinogen, troponiny) Renální bun ní karcinom (karbonanhydrasa IX) Vývoj nových lék Informace o proteinech zp sobující onemocn ní je využita pro vývoj nových lék 1. Známá 3D struktura proteinu-po íta ová simulace-hledání léku, který inhibuje patologický protein (HIV-1 proteasa) 2. Genetické odlišnosti mezi lidmi-odlišný proteom-vývoj individuálních lék

41 Úloha protein ve vzniku nemocí Alzheimerova choroba (AD) Neurodegenerativní onemocn ní charakterizované ztrátou neuron a synapsí Neuropatologické znaky jsou amyloid ß v senilních placích a neufibrilární vlákna intracelulárn Oxida ní stres Nerovnováha mezi tvorbou volných radikál a antioxida ním systémem sledky: Oxidace protein, lipid, DNA a cukr Oxidace protein Št pení peptidového et zce (Karbonyly protein ) Oxidace Ak zbytk (Nitrotyrosin) Navázání produkt peroxidace lipid i glykoxidace

42 Schéma pokusu

43 Úloha protein ve vzniku nemocí Výsledek Potvrzení úlohy oxida ního stresu u Alzheimerovy choroby Posttransla ní modifikace protein v mozku navozená oxida ním poškozením ispívá k rozvoji AD Identifikace poškozených protein, které jsou potenciální cíle pro lé bu

44 Biomarkery nemocí Plasmatické biomarkery u AD Diagnóza AD Klinické projevy+post mortem (histologie) Není žádný spolehlivý diagnostický test (cerebrospinální tekutina-csf se špatn získává) Periferní krev Asi 500 ml CSF je absorbováno do krve každý den Plasma by mohla být zdroj biomarker Identifikace diagnostických biomarker v periferní krvi za pomocí proteomiky: Vzorky krve pacient s AD a kontrol byly analyzovány za pomocí 2D gelové elektroforézy Byly identifikovány body, které se lišily u pacient a kontrol Tyto proteiny byly analyzovány pomocí hmotnostní spektroskopie

45 Výsledek 15 bod signifikantn odlišných u nemocných a kontrol Analýza pomocí MS: nap. α2 makroglobulin, komplement faktor H

46 Vývoj nových lék Informace o proteomu vedou k identifikaci protein zp sobující onemocn ní 1. Po íta ový software tyto proteiny využije jako cíle pro vývoj nových lék Nap. protein zp sobující onemocn ní-3d struktura-po íta vyvine látku, která ho inaktivuje (navázání na aktivní místo inaktivuje enzym) 2. Genetické odlišnosti mezi lidmi-po íta vyvine individuální lék, který je efektivn jší Virtual ligand screening HIV 1-proteasa Št pí HIV protein na menší funk ní proteiny; virus nep ežije bez tohoto enzymu (nejvýznamn jší cíl lé by HIV)

47 Souhrn Proteomika studuje proteiny, hlavn jejich strukturu, funkci a interakce Genom byl již zmapován, nyní je na ad proteom (miliony protein ) Metod, které proteomika využívá je velké množství, mezi základní pat í 2D gelová elektroforéza a hmotnostní spektroskopie Proteiny ur ují fungování organismu a jejich patologie spouští nemoci; proto je proteomika zásadní pro zjiš ování p in chorob, diagnózu a lé bu

48 Proteinové databáze