UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI. Přírodovědecká fakulta Katedra biochemie

Transkript

1 UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI Přírodovědecká fakulta Katedra biochemie Vyšetření paraneoplastických protilátek u vybraných nádorových onemocnění DIPLOMOVÁ PRÁCE Autor: Bc. Jan Cmajdálka Studijní program: M1406 Biochemie Studijní obor: Biochemie Forma studia: Prezenční Vedoucí práce: Mgr. Lucie Roubalová Termín odevzdání práce:

2 Prohlašuji, že jsem uvedenou diplomovou práci vypracoval samostatně pod vedením a odborným dohledem paní Mgr. Lucie Roubalové za použití citované literatury. V Olomouci dne Jan Cmajdálka 2

3 Rád bych poděkoval především vedoucí mé diplomové práce Mgr. Lucii Roubalové za odborné vedení a pomoc při vypracování této práce. Poděkování za pomoc během odběru vzorků patří také personálu Oddělení klinické biochemie Fakultní nemocnice Olomouc. Panu RNDr. Davidu Friedeckému, Ph.D. děkuji za pomoc při zpracování fotografií. V neposlední řadě děkuji své rodině za podporu v průběhu celého studia. 3

4 Bibliografická identifikace: Jméno a příjmení autora Bc. Jan Cmajdálka Název práce Vyšetření paraneoplastických protilátek u vybraných nádorových onemocnění Typ práce Diplomová Pracoviště Oddělení klinické biochemie, FN Olomouc Vedoucí práce Mgr. Lucie Roubalová Rok obhajoby práce 2013 Abstrakt Paraneoplastické protilátky jsou orgánově specifické protilátky třídy IgG namířené proti neuronálním antigenům. Tyto antigeny jsou exprimovány buňkami nervové tkáně, ale také buňkami nádorovými. Paraneoplastické neurologické syndromy jsou degenerativní onemocnění centrálního či periferního nervového systému nebo svalové tkáně, která vznikají v souvislosti s malignitou bez přímé invaze nádoru. Paraneoplastické protilátky jsou vysoce specifické markery paraneoplastické etiologie u pacientů s neurologickými příznaky. Význam laboratorního vyšetření paraneoplastických protilátek je důležitý pro včasnou detekci kancerogenního procesu a zahájení včasné léčby. K detekci protilátek byla použita imunochemická metoda zvaná imuno-dot-bloting. Cílem práce je stanovení citlivosti metody, porovnání souprav různých výrobců, zavedení metody do rutinní laboratorní praxe, vypracování diskuze a její porovnání s dostupnou literaturou. Klíčová slova Paraneoplastické protilátky, anti-hu, anti-yo, anti-ri, anti- CV2, anti-amphiphysin, anti-ma1/ma2, paraneoplastické neurologické syndromy Počet stran 72 Počet příloh 0 Jazyk Český 4

5 Bibliographical identification: Autor s first name and surname Bc. Jan Cmajdálka Title Determination of paraneoplastic antibodies in selected cancers Type of thesis Master Department Department of clinical biochemistry, UH Olomouc Supervisor Mgr. Lucie Roubalová The year of presentation 2013 Abstract Paraneoplastic antibodies are organ-specific IgG antibodies againts neuronal antigens. These antigens are expressed by neural tissue cells but also tumor cells. Paraneoplastic neurological syndromes are degenerative diseases of the central or peripheral nervous system or muscle tissue that arise in connection with malignancy without tumor invasion. Paraneoplastic antibodies are highly specific markers of paraneoplastic etiology in patients with neurological symptoms. The laboratory investigation of paraneoplastic antibodies is important in the diagnosis and management of these disorders. Immunochemical method called immuno-dot-blotting was used to determine antibodies. The aim of this thesis is to determine sensitivity of methods, compare sets from different producers, put the method into laboratory practice, create the disccusion and comparison with the available literature. Keywords Paraneoplastic antibodies, anti-hu, anti-yo, anti-ri, anti-cv2, anti-amphiphysin, anti-ma1/ma2, paraneoplastic neurological syndromes Number of pages 72 Number of appendices 0 Language Czech 5

6 Obsah 1. Cíle diplomové práce Teoretická část Paraneoplastické protilátky Dobře charakteristické paraneoplastické protilátky Paraneoplastické syndromy Paraneoplastické neurologické syndromy Klasické PNS Neklasické PNS Diagnóza PNS Výskyt Patogeneze PNS Nádorová onemocnění typická pro PNS Nádorové markery Praktická část Chemikálie Biologický materiál Výběr skupin pacientů Metodika měření Detekce protilátek Princip metody Ověření citlivosti metody Algoritmus ředícího pokusu pozitivních kontrol Postup analýzy Výsledky Ověření citlivosti Naměřené výsledky - skupina Naměřené výsledky - skupina Diskuse Závěr Literatura Seznam hypertextových odkazů Seznam použitých zkratek

7 1. Cíle diplomové práce Cílem práce bylo zavedení metody detekce paraneoplastických protilátek do rutinní laboratorní praxe na Oddělení klinické biochemie Fakultní nemocnice Olomouc. Součástí zavedení metody je vytvoření SOPVu nebo-li standardního operačního postupu vyšetření. Dále byla cílem práce detekce paraneoplastických protilátek v séru a v mozkomíšním moku pacientů s neurologickými symptomy bez přítomnosti karcinomu i s různými typy karcinomů. V neposlední řadě bylo cílem práce stanovení citlivosti metody, porovnání souprav různých výrobců a podrobná diskuze výsledků srovnaná s dostupnou literaturou

8 2. Teoretická část Paraneoplastické protilátky Paraneoplastické protilátky jsou orgánově specifické protilátky třídy IgG namířené proti neuronálním antigenům. Tyto neuronální antigeny jsou exprimovány neuroektodermální (nervovou) tkání a nádorovými buňkami. Proto jsou tyto protilátky často nazývané jako onkoneurální protilátky (Graus F., et al., 2010). První protilátka byla popsána pány Greenlee a Brashear v roce 1983 u dvou pacientů s nádorem vaječníku a paraneoplastickou cerebelární degenerací metodou imunofluorescenční mikroskopie. Jednalo se o protilátku anti-yo (PCA-1) (Greenlee J. E. & Brashear H. R., 1983). Podle lokalizace antigenu v nervové buňce se protilátky klasifikují jako nukleární, cytoplazmatické a membránové (Tab. 1) (Iorio R. & Lennon V. A., 2012). Tab. 1: Klasifikace paraneoplastických protilátek Protilátky Antigeny Molekulová hmotnost (kda) Nukleární protilátky ANNA-1 (anti-hu) HuD,HuC,Hel-N ANNA-2 (anti-ri) NOVA 1, 2 55 a 80 ANNA AGNA-1 SOX-1 - Anti-Ma1/Ma2 PNMA1, 2 40 a 42 Anti-Zic 4 Zic-4 - Cytoplazmatické protilátky PCA-1 (anti-yo) CDR2 34, 52, 62 PCA PCA-Tr - - Anti-Amphiphysin Amphiphysin 128 Anti-CRMP-5 (CV2) CRPM-5 66 Membránové protilátky Anti-VGCC N VGCC N - Anti-VGCC P/Q VGCC P/Q - VGKC LGI1, CASPR2 - Anti-AChr Achr - Anti-NMDA receptor NR1 - Anti-AMPA receptor GluR1, 2 - Anti-GABA β GABA β - Glycin receptor α1 GlyR - GAD GAD65 65 a

9 V roce 2002 byly přezkoumány všechny doposud objevené onkoneurální protilátky a z nich bylo vybráno a definováno šest protilátek jako tzv. dobře charakteristické protilátky (Tab. 2) (Graus F. et al., 2004). Tab. 2: Dobře charakteristické paraneoplastické protilátky Protilátky Antigeny Molekulová hmotnost (kda) Anti-Hu HuD, HuC, Hel-N Anti-Yo CDR2 34, 52, 62 Anti-Ri NOVA 1, 2 55 a 80 Anti-Ma1/Ma2 (Ta) PNMA1, 2 40 a 42 Anti-Amphiphysin Amphiphysin 128 Anti-CV2 CRPM-5 66 Jedná se o protilátky, které jsou typické pro paraneoplastické neurologické syndromy (PNS). Tyto tzv. dobře charakteristické protilátky reagují s intracelulárními antigeny s definovanou molekulovou hmotností. Bývají silně spojeny s nádorovým onemocněním a jsou detekovány u pacientů s dobře definovanými neurologickými syndromy (Graus F. et al., 2004). Existují také tzv. částečně charakteristické protilátky, které se vyskytují pouze u malého počtu pacientů a jejichž cílové antigeny nejsou známy. Jsou to protilátky PCA-Tr, ANNA-3, PCA-2, anti-zic4, anti-mglur1 (Beukelaar J. W. & Sillevis Smitt P. A., 2006). Paraneoplastické protilátky jsou vysoce specifické markery paraneoplastické etiologie u pacientů s neurologickými příznaky. Detekce těchto protilátek ulehčuje diagnózu paraneoplastických neurologických syndromů a napomáhá odhalit preexistující nádorové onemocnění. Protilátky bývají nalezeny u % pacientů s PNS (Raspotnig M., et al., 2011). Pořadí výskytu těchto protilátek v rutinním screeningu u pacientů s možnými PNS je anti-hu ~ anti-cv2 > anti-yo > anti-amphiphysin > anti-ri > anti-ma2, kdy anti-hu společně s anti-cv2 protilátkami jsou nejvíce vyskytovanými protilátkami (Monstad S. E. et al., 2009). Všichni pacienti s neurologickými příznaky, jejichž sérum je pozitivní na tyto dobře charakteristické onkoneurální protilátky, by měly být definováni jako pacienti s určitým paraneoplastickým syndromem, bez ohledu na to, jestli mají nebo nemají skrytou malignitu (Gozzard P. & Maddison P., 2011). Ačkoli jsou onkoneurální protilátky často asociované s PNS, mohou být nalezeny také u pacientů s nádorovým onemocněním bez neurologických příznaků (Monstad S. E. et al., 2009). Téměř jedna třetina pacientů s PNS nemá žádné dobře - 9 -

10 charakteristické onkoneurální protilátky. U těchto pacientů se včasná diagnóza nádoru stává problémem, což vede k opožděné nádorové léčbě (Honnorat J., 2006). Paraneoplastické protilátky předpovídají typ nádorového onemocnění mnohem přesněji než neurologické syndromy (Gozzard P. & Maddison P., 2011) Dobře charakteristické paraneoplastické protilátky Anti-Hu (ANNA-1 = Anti-Neuronal Nuclear Antibody) Jde o nejčastější onkoneurální diagnostikovanou protilátku. Název Hu pochází z první slabiky příjmení pacienta, u kterého byly tyto protilátky objeveny. Nejvíce jsou spojovány se subakutní senzitivní neuronopatií (SSN), paraneoplastickou limbickou encefalitidou (PLE) a paraneoplastickou mozečkovou degenerací (PCD). Mezi nejběžnější nádorová onemocnění, které se pojí s protilátkou anti-hu patří malobuněčný karcinom plic (SCLC), nádory varlat a prostaty mužů. U pacientů s pozitivními anti-hu protilátkami bývá vzácně nalezen neuroblastom (internet 5). Anti-Hu protilátky rozpoznávají proteiny o velikosti kda, které se nacházejí v cytoplazmě a jádrech všech neuronů (Honnorat J., 2006). Jsou namířené proti neuron-specifickým proteinům HuD, HuC a Hel-N1. HuD proteiny jsou také exprimovány na všech SCLC buňkách (Beukelaar J. W., 2009). Tyto RNA-vázající proteiny se podílejí na post-transkripční regulaci RNA v neuronech (McKeon A. & Pittock S. J., 2011). Pacienti s pozitivními protilátkami anti-hu jsou obvykle muži v průměrném věku 63 let. Neurologické příznaky u lidí jsou příčinou úmrtí z více než 65 % (Graus G. Et al., 2001). Anti-Yo (PCA-1 = Purkinje cell autoantibodies) Jedná se o protilátky namířené proti Purkyňovým buňkám. Název Yo pochází z prvních dvou písmen příjmení prvního pacienta, u něhož byly protilátky objeveny. Tyto protilátky jsou nejčastěji spojovány s paraneoplastickou mozečkovou degenerací (PCD). Nádorová onemocnění typická pro anti-yo protilátky jsou karcinom prsu, vaječníku, vejcovodu a karcinom dělohy. Pacienti s pozitivními anti-yo protilátkami jsou převážně ženy. Antigeny rozpoznané těmito protilátkami jsou 32, 52 a 62 kda proteiny exprimované v cytoplazmě Purkyňových buněk. Proteiny s molekulovou hmotností 62 kda jsou navíc exprimovány v mukóze střeva (internet 5). CDR2 (cerebellar degeneration-related protein 2), antigen o molekulové hmotnosti 52 kda, reguluje DNA transkripci inhibicí c- Myc genu (McKeon A. & Pittock S. J., 2011)

11 Anti-Ri (ANNA-2) Tyto protilátky se nejvíce nacházejí u pacientů s paraneoplastickým syndromem opsoklonus-myoklonus. Pacienti s touto protilátkou mívají nejčastěji nádorová onemocnění jako je SCLC, karcinom prsu, karcinom vaječníku, karcinom dělohy, karcinom děložního hrdla a karcinom močového měchýře (Pittock S. J. et al., 2003, Prestigiacomo C. J. et al., 2001). Jsou namířeny proti antigenům Nova-1 (55 kd) a Nova-2 (80 kd). Tyto antigeny obsahují RNA-vázající domény, které regulují neuronální pre-mrna. Nova-1 (Neuron oncological ventral antigen-1) je specifický protein, který se podílí na sestřihu premrna. Tento protein se považuje za cílový antigen u paraneoplastického opsoklonumyoklonu (Knudsen A. et. al, 2006). Nova-1 a nova-2 přispívají k biologické rozmanitosti prostřednictvím regulace alternativního sestřihu neuronálních transkriptů kódující synaptické proteiny. Protilátky anti-ri se nacházejí v jádrech všech neuronů v CNS (Honnorat J., 2006). Jsou exprimovány také buňkami SCLC (McKeon A. & Pittock S. J., 2011). Pacienti s pozitivními protilátkami anti-ri jsou převážně ženy. Muži s pozitivními protilátkami anti-ri se nacházejí vzácně (Heeyoung K. et al., 2009). Anti-Ma1/Ma2 (Ta) Protilátky anti-ma1/ma2 jsou asociovány s paraneoplastickou limbickou encefalitidou spojenou s výskytem zárodečného tumoru varlete (Honnorat J., 2006). Ve spojení s PNS ovlivňují především střední spánkové laloky, mezimozek, mozkový kmen a mozeček. Tyto protilátky jsou namířené proti antigenům Ma1 (PNMA1) a Ma2 (PNMA2) o molekulové hmotnosti 40 a 42 kda. Funkce Ma proteinů je zatím neznámá. Jsou lokalizované v jadérku a ostatních malých strukturách, kde jsou koncentrovány ribonukleoproteiny a ribosomální proteiny, a proto se spekuluje, že Ma proteiny hrají roli v RNA transkripci (McKeon A. & Pittock S. J., 2011). Pacienti s pozitivními protilátkami anti-ma2 jsou obvykle muži ze 78 % s nádorem varlete. Pacienti pozitivní na protilátky anti-ma1 a anti-ma2 jsou častěji ženy, které mají z 82 % nádor prsu, tlustého střeva nebo vaječníku. Protilátky anti-ma1 a anti-ma2 jsou exprimovány jak nervovým systémem, tak i nádory. Protilátky anti-ma1 jsou také exprimovány zdravými varlaty (Rosenfeld M. R. et al., 2001). Anti-Amphiphysin Protilátky anti-amphiphysin byly poprvé objeveny u pacientů se stiff-person syndromem. Tyto protilátky byly také pozorovány u pacientů s paraneoplastickou encefalomyelitidou a senzorickou neuropatií. Nádorová onemocnění typická pro tuto protilátku jsou SCLC, karcinom prsu a karcinom vaječníku (Honnorat J., 2006)

12 Tyto protilátky rozpoznávají 128 kda antigeny exprimované v synaptických vehiklech mozečku. Pacienti s pozitivními protilátkami anti-amphiphysin jsou převážně ženy (McKeon A. & Pittock S. J., 2011). Anti-CV2 (CRMP-5) Protilátky anti-cv2 byly poprvé objeveny u pacientů s mozečkovým syndromem a s periferní neuropatií (Antoine J. C. et al., 1993). Název CV2 pochází z iniciál pacienta, u kterého byly prvně objeveny tyto protilátky, jehož vzorek séra byl označen číslem 2 (Honnorat J. et al., 1998). Tyto protilátky se nacházejí převážně u pacientů s polyneuropatií a mozečkovou degenerací. Dále se nacházejí u pacientů s encefalitidou, encefalomyelitidou, retinopatií, optickou neuritidou a choreou. Z 60 % jsou protilátky anti-cv2 asociovány s SCLC. Další nádorová onemocnění pojící se s těmito protilátkami jsou maligní thymom a děložní sarkom (Honnorat J., 2006) Anti-CV2 protilátky rozpoznávají cytoplazmatické proteiny o velikosti 66 kda., které jsou exprimované mozečkem a buňkami v bílé hmotě mozkové (Rogemond V. & Honnorat J., 2000, Honnorat J. et al., 1996). Pacienti s protilátkami anti-cv2 jsou ze 70 % mužského pohlaví ve věku kolem 62 let (Honnorat J., 2006). Často se vyskytují po boku protilátek anti-hu (Honnorat J. et al., 2012) Paraneoplastické syndromy Paraneoplastické syndromy jsou heterogenní skupinou symptomů a funkčních poruch u pacientů s maligním tumorem. Tyto poruchy vznikají sekrecí hormonů, peptidů či cytokinů nádorovými tkáněmi nebo v důsledku imunologické reaktivity maligních a normálních tkání. Projevy těchto syndromů se vyskytují spíše na vzdálených místech než v místě nádoru či jeho metastází (internet 5). Paraneoplastické syndromy se mohou vztahovat k různým orgánovým systémům, přičemž nejčastější jsou endokrinologické, neurologické, dermatologické, revmatologické nebo hematologické (internet 14). Paraneoplastické syndromy slouží jako časný indikátor maligní choroby, neboť se vyskytují v raných stadií nádorů. Proto je kladen důraz na včasnou diagnostiku a terapii (internet 5) Paraneoplastické neurologické syndromy Paraneoplastické neurologické syndromy jsou degenerativní onemocnění centrálního nebo periferního nervového systému nebo svalové tkáně, která vznikají v souvislosti s malignitou bez přímé invaze nádoru (internet 5). Paraneoplastické jsou

13 nazývány proto, že neurologické příznaky nejsou výsledkem invaze tumoru či jeho metastázy, chemoterapie, radioterapie, malnutrice ani oportunní infekce. Vznikají postižením různých struktur nervového systému patologickým procesem s přítomností charakteristických protilátek proti centrálním nebo periferním neuronovým antigenům (Nestrašil I., 2005). První popis PNS se datuje do 19. století a byl popsán francouzským lékařem M. Auche, který v roce 1890 popsal zapojení periferního nervového systému u pacientů s nádorovým onemocněním (Auche M., 1890). Většina PNS má subakutní a progresivní průběh. PNS mohou být nerozeznatelné od obvyklých neurologických onemocnění (Vernino S., 2006). Subakutní progresivní klinický průběh a těžké postižení je typické pro PNS. Avšak nízká progrese, relaps nebo benigní průběh neurologických onemocnění nevylučuje diagnózu PNS (Honnorat J., 2006). PNS se vyskytují izolovaně nebo v asociaci. PNS jsou obvykle rozděleny podle Posnerovy klasifikace (Tab. 3). Některé syndromy jsou definované jako tzv. klasické syndromy, protože jejich přítomnost silně nasvědčuje skrytému nádoru. Ostatní syndromy jsou definované jako tzv. neklasické syndomy, neboť nejsou asociovány s nádory v takové míře jako klasické syndromy (Gozzard P. & Maddison P., 2011). Tab. 3: Posnerova klasifikace PNS Syndromy Klasické PNS Paraneoplastická encefalomyelitida Limbická encefalitida Detekované protilátky anti-hu, anti- Amphiphysin, anti-cv2 anti-hu, anti-ma2, anti- CV2, anti-amphiphysin Nejvíce vyskytované skryté nádory SCLC SCLC, karcinom varlat, prsu Paraneoplastická mozečková degenerace Senzorická neuropatie anti-yo, anti-cv2, anti- Ri, anti-hu, anti-ma anti-hu, anti-cv2, anti- Amphiphysin SCLC,karcinom prsu, dělohy, vaječníku, vejcovodu SCLC, karcinom prsu, vaječníku Opsoklonus-myoklonus syndrom Neklasické PNS Encefalitida mozkového kmene anti-ri, anti-hu SCLC, karcinom prsu, dělohy, vaječníku, vejcovodu anti-hu, anti-ri, anti-ma2 karcinom prsu, dělohy, vaječníku, vejcovodu, varlat a SCLC Stiff-person syndrom anti-amphiphysin karcinom prsu

14 Klasické PNS Termín klasické PNS platí pro ty neurologické syndromy, které se často pojí s nádorovým onemocněním. Diagnóza klasických PNS by měla být podnětem pro vyšetření okultního nádoru bez ohledu na status protilátek. Pokud je nalezen nádor méně typický pro konkrétní PNS, je doporučeno hledání více typického nádoru (Graus F. et al., 2004). Paraneoplastická cerebelární degenerace (PCD) Jde o nejčastěji se vyskytující paraneoplastický syndrom v CNS. Je spojena s karcinomem prsu, SCLC a gynekologickými malignitami, jako je karcinom dělohy, vaječníku nebo vejcovodu. Převážně postihuje ženy v průměrném věku 61 let (Vedeler C. A. et al., 2006). U pacientů jsou detekovány především protilátky anti-yo. Dále anti- Hu, anti-tr, anti-ri, anti-cv2, anti-ma. Bylo nalezeno 9 různých specifických protilátek a více než 5 typů nádorového onemocnění, které se pojí s PCD (Vernino S., 2006). PCD je nejčastěji spojována s Yo protilátkami, které jsou namířené proti proteinu CDR2 (Touland S. et al., 2011). Protilátky přítomné v séru jsou ve vysokých titrech. Vysoké titry jsou ale i v mozkomíšním moku, což ukazuje na intratekální syntézu (internet 5). U pacientů, kteří mají vysoký předpoklad pro syndrom PCD, je proto vhodné vyšetřit i mozkomíšní mok. Neurologické příznaky předchází diagnóze nádorového onemocnění z 65 % případů. Málokdy se pojí s jinými PNS. V současné době není stanovena žádná standardní léčba pro PCD (Ogita S., 2008). Příznaky a symptomy zahrnují nestabilní nebo zhoršenou chůzi, nedostatek svalové koordinace v končetinách, neschopnost udržet pozici trupu, závratě, nevolnost, zvracení, nedobrovolné pohyby očí, dvojité vidění, potíže s mluvením nebo obtíže při polykání (internet 1). Znakem PCD je také rozsáhlá ztráta Purkyňových buněk, které můžou být spojené se zánětem v mozečkové kůře (Dalmau J. & Rosenfeld M. R., 2008). Paraneoplastická limbická encefalitida (PLE) Termín limbická encefalitida zavedl v roce 1986 Corsellis u skupiny pacientů se subakutní encefalopatií doprovázející nádorové onemocnění. Nejčastěji detekovanými protilátkami jsou anti-hu, anti-ma2, anti-amphiphysin a anti-cv2. Je asociována s SCLC, terminálním tumorem varlete a výjimečně s karcinomem prsu (Krýsl D., 2012). Protilátky jsou nalézané jak v séru, tak i v mozkomíšním moku, a to u 60 % pacientů s PLE. (Vedeler C. A. et al., 2006). PLE postihuje muže i ženy všech věkových kategorií. Jde o zánět postihující oblast mozku známou jako limbický systém, který řídí emoce, chování a některé paměťové funkce. Hlavním klinickým příznakem je subakutně rozvinutá porucha paměti a epileptické záchvaty (Krýsl D., 2012). Pacienti s LE mívají

15 také vizuální a sluchové halucinace nebo paranoidní posedlost. Pro tyto pacienty je obvyklá i deprese a úzkost (Vedeler C. A. et al., 2006). Paraneoplastická encefalomyelitida (PEM) Nádorové onemocnění typické pro PEM je SCLC. V séru a mozkomíšním moku většiny pacientů jsou nalézány protilátky anti-hu. PEM postihuje muže i ženy v průměrném věku 63 let (Graus F. et al., 2001). Méně frekventované protilátky u PEM jsou protilátky anti-cv2 a anti-amphiphysin. PEM býva často doprovázena klinickými syndromy PCD, PLE a subakutní senzorickou neuropatií (SSN) (internet 2). Projevuje se postižením více oblastí nervového systému se známkami zánětu v mozku, mozkovém kmeni, míše, gangliích zadních míšních kořenů a nervových kořenech (internet 5). Patologicky je charakterizována ztrátou neuronů a zánětlivými infiltráty v konkrétních oblastech nervové soustavy. Klinické propuknutí je subakutní a obvykle způsobuje závažné neurologické dysfunkce (Graus F. et al., 2001). Subakutní senzorická neuropatie (SSN) SSN se nejčastěji pojí s protilátkami anti-hu. Tyto protilátky nalézáme v séru i mozkomíšním moku většiny SSN pacientů. SSN postihuje muže i ženy všech věkových kategorií. Protilátky anti-cv2 a anti-amphiphysin jsou nalézány v menším měřítku u SSN pacientů (Honnorat J. & Antoine J. Ch., 2007). SCLC je nejčastěji se vyskytující nádor u SSN pacientů (Dalmau J. et al., 1992). Neuropatie je nezánětlivé poškození funkce a struktury periferních nervů. Senzorická neuropatie je charakterizována primárním poškozením senzorických nervů předních míšních kořenů. Pacienti mají zpočátku asymetrické a bolestivé neuropatie, které se vyvíjejí do úplné ztráty propriocepce (Voltz R., 2002). Jde o postižení nervů, které přenášejí zprávy z kostí, kůže a svalů do mozku. Ovlivňuje především smysly, a to nejčastěji v horních a dolních končetinách (internet 3). Opsoklonus-myoklonus (OMS) Nádorová onemocnění typická pro OMS jsou karcinom vejcovodu, dělohy a vaječníku s detekovanými protilátkami anti-ri. Dále mezi nádorová onemocnění typická pro OMS patří SCLC. Žádné protilátky u dospělých OMS pacientů s SCLC zatím ale nebyly nalezeny (Sabater L. et al., 2008). Existují případy, kdy se objevily u OMS pacientů i protilátky anti-ma2 (Wong A. et al., 2001). OMS postihuje muže i ženy v průměrném věku 66 let (Beukelaar J. W. & Sillevis Smitt P. A., 2006). OMS způsobuje rychlé, nepravidelné pohyby očí (opsoklonus) a mimovolní, chaotické svalové záškuby (myoklonus) v končetinách a trupu. Často se projevuje u dětí s neuroblastomem. Až 50 % dětí s opsoklonem-myoklonem má neuroblastom (Beukelaar J. W. & Sillevis Smitt P. A., 2006). U dospělých dochází také k poškození mozkového kmene, projevuje se periferní neuropatie, svalová rigidita a svalové

16 spasmy (internet 5). OMS je vzácná porucha, která se vyznačuje rychlým pokrokem příznaků včetně závratě, nevolností a zvracením následovaná opsoklonem, myoklonem, ataxií a encefalopatií (Brieva-Ruíz L. et al., 2008) Neklasické PNS Encefalitida mozkového kmene Encefalitida mozkového kmene se může vyskytovat ve spojitosti s různými nádory, jejichž společným patologickým znakem je ztráta neuronů a perivaskulární zánětlivé infiltráty. Nádory vejcovodu, vaječníku, dělohy, prsu, varlat a SCLC jsou nejčastěji se vyskytující nádory u tohoto syndromu. Bývá v kombinaci s OMS a PLE. Často také bývá zaměňována s rhomboencefalitidou (Jubelt B. et al., 2011). Detekované protilátky u toho syndromu jsou anti-hu, anti-ma2 a anti-ri. Mezi klinické příznaky patří pohledová obrna, porucha řeči, diplopie, centrální spánková apnoe, závratě a ataxie (Voltz R., 2002). Stiff-person syndrom Je autoimunitní CNS porucha charakterizována progresivní těžkou svalovou ztuhlostí postihující převážně páteř a nohy. To může způsobit také bolestivé svalové křeče (Squintani G. et al., 2012). V séru a mozkomíšním moku se nacházejí protilátky proti amphiphysinu v kombinaci s nádorem prsu. (Butler M. H. et al., 2000) Diagnóza PNS Před určením diagnózy PNS musejí být všechny ostatní různé diagnózy vyloučeny. Klinické příznaky nejsou nikdy patognomické (charakteristické pro určitou chorobu) pro paraneoplastickou etiologii, ale vysoký index klinického podezření je velice důležitý. Příznaky mohou být atypické, psychiatrické nebo dokonce kolísavé. Detekce dobře charakteristických paraneoplastických protilátek je velmi užitečná, protože dokazuje paraneoplastickou etiologii neurologických syndromů. Jelikož mohou být různé protilátky spojeny se stejnými klinickými nálezy a stejně tak stejné protilátky mohou být spojeny s různými klinickými nálezy, měly by se paraneoplastické protilátky hledat především screeningem než soustředěním se na specifické protilátky (Graus F. et al., 2004, Beukelaar J. W. & Sillevis Smitt P. A., 2006 ). Pokud je paraneoplastická diagnóza potvrzena nebo je na ni podezření, je nezbytné zahájit rychlé hledání nádoru. Jelikož se PNS rozvíjejí v časných stádií nádorového onemocnění, může být toto hledání dost obtížné (Beukelaar J. W. & Sillevis Smitt P. A., 2006). PNS mohou být diagnostikovány i u pacientů s mi výsledky na všechny známé onkoneurální protilátky. Pacienti s podezřelými neurologickými příznaky bez

17 pozitivity onkoneurálních protilátek v séru by měli být i přesto důkladně vyšetřeni na okultní malignitu (Gozzard P. & Maddison P., 2011). Určení diagnózy PNS je často složité. Jeden z důvodů je přítomnost PNS před klinicky ověřenou malignitou. Dalším důvodem je absence klinického obrazu a absence zobrazení včetně laboratorních abnormalit, které jsou typické pro PNS. K dosažení časné diagnózy je třeba kombinovat klinická a laboratorní hodnocení. Systematické příznaky jako jsou anorexie, ztráta váhy, horečka, únava a poruchy chuti, napomáhají určit diagnózu PNS stejně jako rodinná anamnéza nádorového onemocnění (Kannoth S., 2012). PNS by měly být brány v úvahu při diferenciální diagnóze neurologických syndromů, ať už se jedná o vyšší či nižší pravděpodobnost (Voltz R., 2002). PNS jsou definovány přítomností nádorového onemocnění a zároveň vyloučením ostatních známých příčin neurologických příznaků. Existují kritéria, která oddělují skutečné PNS od neurologických syndromů vyskytujících se náhodně s nádorovým onemocněním (Santillan A. & Bristol R. E., 2006). Na základě těchto kritérií se PNS dělí na tzv. definitivní a možné PNS. Definitivní PNS: 1) klasické syndromy s nádorovým onemocněním diagnostikovaným do 5 let od rozvoje neurologických symptomů 2) neklasické syndromy, který se významně zlepšují po léčbě nádoru bez doprovázející imunoterapie 3) neklasické syndromy diagnostikovány s nádorovým onemocněním do 5 let od rozvoje neurologických symptomů a s pozitivními neuronálními protilátkami 4) neurologické syndromy (klasické i neklasické) bez nádorového onemocnění s dobře charakteristickými neuronálními protilátkami (anti-hu, anti-yo, anti-ri, anti-ma2, anti-cv2, anti-amphiphysin) Možné PNS: 1) klasické syndromy s vysokým rizikem nádorového onemocnění bez neuronálních protilátek 2) neurologické syndromy (klasické i neklasické) bez nádorového onemocnění s částečně charakteristickými neuronálními protilátkami 3) neklasické syndromy diagnostikovány s nádorovým onemocněním do 2 let od rozvoje neurologických symptomů bez neuronálních protilátek (Dalmau J. & Rosenfeld M. R., 2008)

18 Pro rozdělení PNS na definitivní a možné se v klinické praxi používá schéma uvedené na Obr. 1. Klasické PNS Pozitivní dobře charakteristické neurální protilátky Negativní neuronální protilátky Pozitivní částečně charakteristické protilátky Vysoké riziko nádoru Nádor diagnostikován do 5 let Definitivní Možné Definitivní Možné Neklasické PNS Přítomnost nádoru Pozitivní dobře charakteristické neurální protilátky Pozitivní částečně charakteristické protilátky Negativní neuronální protilátky Zlepšení nádorové terapie Nádor diagnostikován do 5 let Nádor diagnostikován do 2 let Definitivní Definitivní Definitivní Možné Možné Obr. 1: Schéma počátečního diagnostického přístupu PNS

19 Výskyt Přesný výskyt a rozšíření těchto poruch je neznámé. Výskyt těchto poruch se mění v závislosti na neurologickém syndromu a v závislosti na nádorovém onemocnění (Beukelaar J. W., 2006). PNS jsou považované za vzácný klinický stav. Celkově se odhaduje, že 0,5-1 % všech pacientů s nádorovým onemocněním má klinicky způsobující PNS (Kannoth S., 2012). Výskyt nádorového onemocnění se liší podle neurologické poruchy od 5 do 60 %. U 80 % pacientů PNS předchází diagnóze nádorového onemocnění několik měsíců až několik let. Většina nádorových onemocnění je diagnostikována do 4-6 měsíců a riziko rozvoje těchto onemocnění značně klesá po 2 letech a stává se velmi nízké po 4 letech (Honnorat J., 2006). Převaha PNS u dětí je neznámá. Nejběžnější PNS u dětí jsou opsoklonusmyoklonus, limbická encefalitida (Wells E. M., 2011). Některé výzkumy tvrdí, že přibližně 1 pacient z pacientů s nádorovým onemocněním má PNS (Dalmau J. & Rosenfeld M. R., 2008) Patogeneze PNS Jak je obecně známo, nádorové buňky vznikají během našeho života v našem těle neustále. Většina těchto nádorových buněk je ovšem destruována pomocí imunitního systému. Za eliminaci nádorových buněk je zodpovědná tzv. specifická imunitní odpověď, která je zprostředkovaná T-lymfocyty a B-lymfocyty. Přechod mezi nespecifickou a specifickou imunitou tvoří dendritické buňky. Tyto buňky patří mezi buňky označované jako buňky APC (antigen-presenting cells), tedy buňky prezentující antigen. Dendritické buňky jsou schopné fagocytovat nádorové buňky. Po pohlcení nádorových buněk dendritické buňky migrují do lymfatických uzlin, kde tyto onkoantigeny prezentují pomocí HLA komplexu I. a II. třídy specifickým CD8+ a CD4+ T-lymfocytům. Tím dochází k aktivaci T-lymfocytů (Hořejší V. & Bartůňková J., 2009). T-lymfocyty jsou buňky schopné rozpoznávat nádorové buňky prostřednictvím svých povrchových receptorů (TCR). Důležitou součástí T-lymfocytů jsou povrchové molekuly CD4+ a CD8+. T-lymfocyty, které mají na svém povrchu molekuly CD4+, jsou označované jako pomocné T-lymfocyty (T H ). CD4+ T H -lymfocyty rozpoznávají antigeny, které jsou prezentovány HLA molekulami II. třídy. Vylučováním cytokinů stimulují imunitní reakci a pomáhají ostatním buňkám. Hlavně podporují aktivaci a proliferaci CD8+ T C -lymfocyty a stimulaci B-lymfocytů. T-lymfocyty s povrchovými molekulami CD8+ jsou označované jako cytotoxické T-lymfocyty (T C ). CD8+ T C -lymfocyty reagují s antigenem, který prezentují HLA molekuly I. třídy. Úkolem CD8+ T C -lymfocytů je rozpoznání nádorové buňky a její následné zničení

20 B-lymfocyty stejně jako T-lymfocyty mají schopnost rozpoznávat nádorové buňky prostřednictvím svých povrchových receptorů (BCR). Po rozpoznání cizorodých antigenů exprimovaných nádorovou buňkou jsou schopné B-lymfocyty diferencovat v plazmatické buňky, které produkují velké množství protilátek. Tyto protilátky mají stejnou specifitu jako receptor mateřského B-lymfocytu, a tudíž se váží na stejný antigen. Napomáhají tak jeho opsonizaci a umožňují dalším buňkám imunitního systému, aby ho snáze nalezly a zneškodnily (Hořejší V. & Bartůňková J., 2009). Na základě studií bylo zjištěno, že podstata vzniku PNS spočívá v autoimunitní patologické reakci (Kannoth S., 2012). Autoimunita je schopnost imunitního systému rozpoznat antigeny vlastních tkání a reagovat s nimi. Jde o fyziologický jev, který se uplatňuje v homeostatických mechanismech. Eliminuje staré, poškozené, apoptické či jinak pozměněné buňky vlastního těla. Pokud autoimunitní reakce vede k poškození tkání, hovoří se o autoimunitních onemocnění (Hořejší V. & Bartůňková J., 2009). Imunohistopatologická analýza tkání a experimentální studie ukazují, že CD8+ T C - lymfocyty jsou zodpovědné za vznik PNS (McKeon A. & Pittock S. J., 2011). Tyto CD8+ T C -lymfocyty jsou schopné přecházet přes hematoencefalickou bariéru, která odděluje vnitřní prostření mozku od cévního systému. Tato bariéra za fyziologických podmínek brání vstupu lymfocytů a dalších buněk imunitního systému do nerovové soustavy. Přítomností nádorových buněk ovšem dochází ke snížení její integrity, a lymfocyty tak mohou procházet do nerovové tkáně (Compston A. & Coles A., 2002). V mozku CD8+ T C -lymfocyty napadají nerovové buňky a poškozují je (Darnell R. B. & Poster J. B., 2003). Tyto nervové buňky exprimují za fyziologických podmínek identické antigeny jako nádorové buňky, a proto jsou nervové buňky napadány CD8+ T C -lymfocyty (Carpentier A. F. et al., 1998). Destrukcí nervových buněk dochází ke vzniku PNS (Obr. 2) (Darnell R. B. & Poster J. B., 2003). Role protilátek v patogenezi PNS je stále nejasná. I plazmatické buňky přecházejí přes hematoencefalickou bariéru. Spolu s nimi přecházejí i CD4+ T H -lymfocyty, které stimulují B-lymfocyty k produkci specifických protilátek. Tyto protilátky jsou namířené proti intracelulárním antigenům, ale nedokáží je rozpoznat, neboť fragmenty neuronových antigenů jsou prezentovány prostřednictvím HLA komplexu třídy I. pouze CD8+ T C -lymfocytům. Tyto protilátky se tedy nepodílejí na patogenezi PNS a slouží zde pouze jako diagnostické markery (McKeon A. & Pittock S. J., 2011). Existují studie, které tvrdí, že se protilátky namířené proti intracelulárním antigenům nepodílejí na patogenezi PNS. Ovšem existují i studie, které toto tvrzení vyvrací. Byla provedena řada pokusů, kdy se pasivně přenášely protilátky od pacientů s PNS do zvířete s cílem navodit u zvířat neurologické poškození. Stejně tak se prováděla i aktivní imunizace na zvířecích modelech. Všechny tyto pokusy byly neúspěšné

21 (Roberts W. K. & Darnell R. B., 2004). Nedávné studie ovšem ukazují, že protilátky anti-amphiphysin od pacientů s paraneoplastickým stiff-person syndromem navodili neurologické poškození u laboratorních krys (Raspotnig M. et al., 2011). Proto je role intracelulárních protilátek v patogenezi PNS stále záhadou. Patogenetická role je připisována membránovým protilátkám, které jsou namířené proti membránovým antigenům. Po vytvoření komplexu antigen-protilátka dojde ke spuštění mechanismu ADCC (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity), který vede k degradaci nervových buněk (Beukelaar J. W. & Sillevis Smitt P. A., 2006). Známkou těchto poruch, které potvrzují diagnózu, je vysoký titr onkoneurálních protilátek v séru a mozkomíšním moku pacientů. Přítomnost vysokého titru protilátek u pacientů poskytuje počáteční důkaz patologické podstaty pro patogenezi onemocnění (Roberts W. K. & Darnell R. B., 2004). Geny pro onkoneurální antigeny nejsou mutovány v nádorových buňkách, a proto PNS nemohou být připisovány mutacím v genech kódujících tyto antigeny (Darnell R. B. & Poster J. B., 2003). Obr. 2: Mechanismus patogeneze

22 2. 6. Nádorová onemocnění typická pro PNS Jedná se o nádorová onemocnění, která se vyskytují u pacientů s PNS nejčastěji. Malobuněčný plicní karcinom (SCLC) SCLC je nejagresivnější forma nádorového onemocnění plic, typická pro kuřáky (Jackman D. M & Johnson B. E., 2005). U 95 % kuřáků se rozvíjí SCLC (Brownson R. C. et al., 1992). Klinicky a histologicky se liší od všech jiných typů nádorů plic. Jeho patologické rysy byly poprvé rozpoznány v roce 1926 panem W. G. Bernardem (Barnard W., 1926). Právě on popsal SCLC jako nádor odlišný od jiných typů plicních nádorů. Protože mu maligní buňky připomínaly zrnka ovsa, pojmenoval je jako oat cells. Proto bývá SCLC nazýván jako karcinom ovesných buněk. SCLC tvoří % všech plicních nádorů (internet 6). Jde o nejčastěji se vyskytující karcinom u PNS (Titulaer M. J. et al., 2011). U pacientů s tímto karcinomem nalézáme téměř všechny dobře charakteristické onkoneurální protilátky. Ovšem nejčastěji se pojí s protilátkou anti-hu a anti-cv2. Stejně tak se nachází u celé řady PNS. Karcinom prsu Karcinom prsu je nejčastějším zhoubným nádorem diagnostikovaným u žen. Ročně tímto karcinomem onemocní více než půl milionu žen na světě. Prsní nádory jsou příčinou úmrtí u 3,6 % žen naší populace. Karcinom prsu postihuje převážně ženy kolem věku 40 let. V poslední letech se objevují pacientky mladší 35 let. V malém procentu se vyskytuje i u mužů. Karcinomem prsu jsou označovány různé histologické formy maligních nádorů vznikajících z epiteliálních buněk mléčné žlázy. Tyto maligní buňky, které infiltrují prsní žlázu, se můžou dostávat do okolních struktur a vytvářet vzdálené metastáze. Nejčastěji bývá postižen horní zevní kvadrant (47 %), dále horní vnitřní kvadrant (14 %), dolní zevní kvadrant (7 %) a dolní vnitřní kvadrant (2 %) (internet 15). Onkoneurální protilátky typické pro karcinom prsu jsou anti-yo, anti-ri a anti- Amphiphysin. Z PNS se u karcinomu prsu vyskytují ty, které jsou v asociaci s těmito protilátkami. Karcinom vaječníku a vejcovodu Tyto nádory představují cca 15 % všech zhoubných novotvarů u žen. Postihují ženy převážně ve věku mezi 50 a 75 lety. Biologické chování karcinomů vaječníků a vejcovodů je velice podobné, proto jsou uváděny spolu (internet 7). Karcinom vaječníku Karcinom vaječníku se u žen vyskytuje se po 50. roce života a představuje až 70 % všech maligních nádorů vaječníku (internet 9)

23 Nádory vaječníku jsou nejčastěji děleny do skupin podle jejich histogeneze, kdy největší skupinu zaujímají epitelové nádory, které představují 90 % všech ovariálních nádorů (internet 13). Příčina vzniku nádoru vaječníku není známa. Významná role se připisuje vlivu ženských pohlavních hormonů a jejich vlivu na dozrávání vajíčka. Existují i dědičné formy nádorů ovaria, které jsou způsobeny mutací genů BRCA-1 a BRCA-2 (internet 7). Karcinom dělohy Karcinom dělohy tvoří přes 40 % gynekologických zhoubných nádorů (internet 8). Nejčastěji se setkáváme s nádorem děložního hrdla. Tento nádor postihuje ženy kolem 50. roku života, ale bývá nalézán také u žen ve věku let. Hlavní příčinou vzniku zhoubného nádoru děložního hrdla je infekce jeho epitelu způsobená jedním z typů lidských papilomaviru HPV (human pailloma virus) (internet 11). Karcinom varlat Karcinom varlat je nejčastějším nádorovým onemocněním u mužů ve věkové skupině let. V drtivé většině případů jde o nádory, které vznikají z transformované zárodečné buňky. Mluví se tedy o zárodečných (germinálních) nádorech varlat. Nádory varlat patří v současnosti mezi léčitelná nádorová onemocnění u vysokého procenta případů (95 %) (internet 12) Nádorové markery Nádorové markery jsou látky převážně bílkovinné povahy produkované maligními buňkami nebo organizmem jako odpověď na nádorové bujení. Laboratorně jsou prokazatelné v biologických tekutinách nebo v tkáních. Pomocí nádorových markerů můžeme prokázat riziko vzniku, přítomnost, prognózu nádorového onemocnění a účinnost/neúčinnost nádorové léčby. Následující nádorové markery jsou markery, které se vyskytují v různé míře u výše uvedených nádorových onemocnění. Uvedené referenční hodnoty jsou pouze orientační a pro každý typ nádorového onemocnění nebo v různém stádiu léčby je zvýšení jinak signifikantní. CA 15-3 Nádorový marker CA15-3 je antigen polymorfního epiteliálního mucinu, nazývaný rovněž MUC1. Tento marker je syntetizován v epiteliálních buňkách vývodu mléčné žlázy, slinných žláz a bronchů. Zvýšené hodnoty nalézáme především u nemocných s maligními nádory prsu. Referenční hodnota: 35 ku/l

24 CA 125 Nádorový marker CA 125 je heterogenní glykoprotein s vysokým obsahem sacharidů. Je produkován fetálními epiteliálními tkáněmi coelomového původu. V dospělosti může být v omezené míře syntetizován v epitelu normální tkáně vejcovodů, bronchů, cervixu. Zvýšené hodnoty nalézáme především u nemocných s maligním onemocněním vaječníku. Dále také u karcinomu dělohy, prsu, děložní sliznice a plic. Referenční hodnota: 35 ku/l CA 72-4 Nádorový marker CA 72-4 je antigen definovaný jako epitop mucinu. Zvýšené hodnoty nalézáme především u nemocných s adenokarcinomem žaludku, tlustého střeva, pankreasu, žlučových cest, ale také u nádorů mléčné žlázy a vaječníku. Referenční hodnota: 7 ku/l CA 19-9 Nádorový antigen CA 19-9 se vyskytuje jako glykolipid ve tkáni nebo jako mucin v séru. Ačkoli je tento antigen charakteristický spíše pro karcinomy tlustého střeva, konečníku, žaludku, jater a pankreatu, může se vyskytovat i u karcinomů prsu nebo vaječníku. Referenční hodnota: 39 ku/l CEA (karcinomembryonální antigen) Nádorový marker CEA je onkofetální glykoprotein s vysokým obsahem sacharidů. Za fyziologických podmínek je produkován ve vyvíjejícím se embryu. V dospělosti je omezeně syntetizován epiteliálními buňkami střevní sliznice, žaludku a bronchů. CEA je nejznámějším a nejvýznamnějším nádorovým markerem. Zvýšené hodnoty nalézáme především u nemocných s kolorektálním nádorem, nádorem žaludku, prsu a jater. Referenční hodnota: 5 µg/l NSE (neuron specifická enolasa-ec ) Nádorový marker NSE je glykolytický enzym přítomný ve tkáních neuroektodermálního původu, v seminomech a adenokarcinomech ledvin. Ve zdravém organismu se vyskytuje především v neuronech. Vysoké hodnoty NSE markeru nacházíme především u pacientů s SCLC a neuroblastomem. Referenční hodnota: 17 µg/l SCC (antigen skvamozních buněk) Tento antigen patří k tumor-asociovaným nádorovým antigenům. Je vhodný především pro monitoring nemocných s karcinomem plic, cervixu, hlavy a krku. Referenční hodnota: 1,7 µg/l

25 TPA (tkáňový polypeptidový antigen) Nádorový marker TPA je proliferační nádorový antigen jehož struktura odpovídá směsi fragmentů cytokeratinů. TPA je vhodný univerzální nádorový marker pro dlouhodobé sledování a monitoring nemocných s karcinomy plic, cervixu, močového měchýře a dalších. Byl prokázán ve většině karcinomů. Referenční hodnota: 75 U/l HE4 Nádorový marker HE4 je nedávno objevený marker, který byl poprvé detekován v epitelu distálního nadvarlete. Vykazuje vysokou expresi ve tkáni karcinomu vaječníku. Právě u pacientek s nádorem vaječníku lze nalézt vysoké hladiny HE4 v séru. V praxi se používá kombinace markerů HE4 a CA 125 pro větší citlivost. Tato kombinace je přesnějším prediktorem maligního onemocnění, než když jsou použity jednotlivě. Z této kombinace lze vypočítat tzv. ROMA skóre (Risk of Ovaria Malignancy Algorithm). Jde o moderní diagnostický test pro posouzení rizika ovariálního karcinomu žen s rezistencí nejasné povahy v malé pánvi. Referenční hodnoty: < 70 pmol/l premenopauzální ženy < 140 pmol/l postmenopauzální ženy (Bálková O., 2012, internet 4, internet 10) Tab. 4: Přehled vybraných karcinomů s typickými nádorovými markery Karcinomy Karcinom prsu Karcinom vaječníku Karcinom vejcovodu Karcinom dělohy SCLC Karcinom varlat. Nádorové markery CA 15-3, CA 125, CA 72-4, CEA, HE4 CA 15-3, CA 125, CA 72-4, CA 19-9, CEA CA 125, CEA CA 125, CEA, HE4 NSE, TPA, SCC CEA

26 3. Praktická část Chemikálie Prvním krokem k provedení správného postupu je výběr vhodného materiálu. V našem případě šlo o výběr komerční soupravy vhodné pro stanovení paraneoplastických protilátek. Bylo třeba provést průzkum trhu a zjistit, která souprava bude pro naše měření nejvhodnější. Protože jsme se rozhodli pro vzájemné porovnání citlivosti dvou souprav, bylo naším cílem vybrat podobné soupravy od dvou různých výrobců. Současný český trh diagnostických souprav pro vyšetření paraneoplastických protilátek nabízí relativně spoustu výrobců, jejichž soupravy slouží k detekci tří základních paraneoplastických protilátek (anti-hu, anti-yo, anti-ri) v séru, ale nabízí daleko méně výrobců, jejichž soupravy lze použít k detekci šesti základních paraneoplastických protilátek v séru. Výrobce, jehož soupravu lze použít pro detekci protilátek v séru a zároveň v likvoru, je na českém trhu pouze jeden. K měření byly vybrány čtyři soupravy ravo PNS-Blot od výrobce ravo Diagnostika a dvě soupravy Immublot Anti-Neuronal Antibody Western Blot Immunoassay od výrobce IMMCO Diagnostics. Souprava ravo PNS-Blot Tato souprava umožňuje detekci šesti základních paraneoplastických protilátek (anti-hu, anti-yo, anti-ri, anti-cv2, anti-amphiphysin, anti-ma1/ma2). Stanovení se provádí ze séra a z mozkomíšního moku. Kit obsahuje dostatečné množství reagencií k provedení 12 stanovení ze séra a 12 stanovení z likvoru. Celkově tedy obsahuje 24 stanovení. Reagencie: - koncentrovaný promývací pufr (3 x 50 ml) - ředící pufr pro vzorky obsahující 0,01% Thimerosal (3 x 25 ml) - pozitivní kontrola obsahující 0,01% Thimerosal (3 x 2 ml) - konjugát pro pozitivní kontrolu obsahující 0,01% Thimerosal (3 x 2 ml) - anti-human IgG konjugát s ALP obsahující 0,01% Thimerosal (3 x 20 ml) - substrát (BCIP/NBT) (3 x 20 ml) - 20 nitrocelulosových proužků pro detekci IgG protilátek Spotřební materiál: - čistý 1000 ml odměrný válec - čistá 1000 ml kádinka pro promývací pufr - absorpční papír nebo papírové ručníky

27 - destilovaná voda - mikropipety o velikosti µl - jednorázové špičky na pipety - 1,5 ml ependorfky - 1 kontrolní sken - 3 inkubační vaničky - budík - pinzeta - třepačka - stojany na ependrofky - Pasteurovy plastové pipety Souprava IMMCO Immublot Anti-Neuronal Antibody Tato souprava umožňuje detekci tří neuronálních protilátek anti-hu, anti-ri a anti-yo. Stanovení se provádí pouze ze séra. Kit obsahuje dostatečné množství reagencií k provedení 20 stanovení ze séra. Reagencie: - pozitivní kontrola (1 x 110 µl) - kontrola (1 x 110 µl) - konjugát A (1 x 240 µl) - konjugát B (1 x 240 µl) - ředící roztok (1 x 60 ml) - substrát (1 x 25 ml) - práškový promývací pufr - 20 Western Blot proužků - 1 kontrolní sken - 3 inkubační vaničky Spotřební materiál: - čistý 1000 ml odměrný válec - čistá 1000 ml kádinka pro promývací pufr - absorpční papír nebo papírové ručníky - destilovaná voda - mikropipety o velikosti µl - jednorázové špičky na pipety - 1,5 ml ependorfky - 1 kontrolní sken - 3 inkubační vaničky

28 - budík - pinzeta - třepačka - stojany na ependrofky - Pasteurovy plastové pipety Biologický materiál Jako biologický materiál bylo použito krevní sérum a mozkomíšní mok. Mozkomíšní mok (likvor, CSF) je čirá, bezbarvá tělní tekutina, která vyživuje a chrání mozek a míchu. Vyšetření likvoru patří k základním metodám, které přispívají k diagnostice neurologických onemocnění. Odběr likvoru se provádí lumbální punkcí, a to odběrem 3-5 ml z páteřního kanálu v oblasti bederní páteře. Likvor se odebírá do řádně označené plastové odběrové nádobky bez úprav. Odběr se provádí na Neurologické klinice Fakultní nemocnice Olomouc. Odtud se materiál transportuje na Oddělení klinické biochemie (OKB) Fakultní nemocnice Olomouc. Zde je materiál skladován v lednici při teplotě +4 C po dobu 3 dnů. Z plastové odběrové nádobky, uchovávané v lednici, bylo odebráno potřebné množství (cca 1 ml) likvoru do ependorfky a zamraženo na -20 C na pozdější analýzu. Krevní sérum je nažloutlá tekutina, která vzniká po vysrážení plné krve a následným odstraněním krevní sraženiny centrifugací. Složením odpovídá krevní plazmě, avšak na rozdíl od plazmy neobsahuje fibrinogen a další srážecí faktory krve. Pro vyšetření krevního séra se odebírá srážlivá žilní krev. Srážlivá krev se získává odběrem do řádně označených plastových nádobek bez přísad nebo se separačními gely. Odběry žilní krve se provádí na jednotlivých pracovištích Fakultní nemocnice Olomouc. Z těchto jednotlivých pracovišť jsou vzorky transportovány na OKB Fakultní nemocnice Olomouc. Zde jsou vzorky stáčeny na centrifuze pro získání krevního séra a následně skladovány v lednici při teplotě +4 C po dobu 3 dnů. Jednotlivé vzorky séra byly odebírány z plastových odběrových nádobek, uchovávaných v lednici, do 1,5 ml ependorfek. Bylo odebráno cca 1 ml séra pomocí 2000 µl automatické pipety. Během sběru vzorků se veškeré vzorky nechávaly zmrazit na -20 C na po zdější analýzu Výběr skupin pacientů Byly vytvořeny dvě skupiny pacientů, které se liší výběrovým kritériem. Veškeré informace o pacientech byly získávány z LISu (laboratorní informační systém) nazývaného OpenLims. Všichni pacienti byli vyhledávání v LISu pomocí zadání jejich rodných čísel nebo identifikačních čísel s datem odběru. Vzorky pacientů vybraných

29 pro analýzu byly vyhledány v archivu LISu a následně potřebné množství těchto vzorků bylo odebráno pro pozdější analýzu. Skupina 1: Do této skupiny byli vybíráni pacienti na základě jejich diagnózy. Tyto diagnózy byly vybírány podle klinických příznaků, které se pojí s jednotlivými PNS nejčastěji nebo jsou pro ně přímo typické (Tab. 5). Výskyt paraneoplastických protilátek u této skupiny pacientů je i tak nízký. Pacientům této skupiny byl současně odebrán mozkomíšní mok a sérum. Pro analýzu bylo vybráno 22 sér a 22 likvorů z přibližně 150 vybraných pacientů (Tab. 6). Vzorky byly testovány soupravou ravo PNS-Blot. Tab. 5: Diagnózy související s daným onemocněním Kód diagnózy G048 G049 G111 G112 G122 G130 G20 G250 G253 G35 G400 G401 G402 G409 G430 G431 G439 G61 G628 G629 G820 G822 G959 R251 R252 R270 R402 R42 R509 R51 R55 Název diagnózy Jiné encefalitidy, myelitidy a encefalomyelitidy Encefalitida, myelitida a encefalomyelitida Cerebelární - mozečková - ataxie s časným začátkem Cerebelární - mozečková - ataxie s pozdním začátkem Nemoci motorického neuronu Paraneoplastická neuromyopatie a neuropatie Parkinsonova nemoc Esenciální třes Myoklonus Roztroušená skleróza - sclerosis multiplex Idiopatická epilepsie a epil. sy příbuz. lokal. se záchv. lok. začátku Symptom. epil. a epil. sy příbuz. lokal. s jednotl. parciál. záchvaty Symptom. epil. a epil. sy příbuz. lokal. s komplexem parciál. záchvatů Epilepsie Migréna bez aury (běžná migréna) Migréna s aurou (klasická migréna) Migréna Zánětlivá polyneuropatie Jiné určené polyneuropatie Polyneuropatie Chabá paraplegie Paraplegie Nemoci míchy Třes - tremor Křeče a spazmy Ataxie NS Bezvědomí - kóma Závrať vertigo Horečka Bolest hlavy Mdloba - synkopa a zhroucení - kolaps