Výzkumný ústav rostlinné výroby Praha Ruzyně

Transkript

1 Výzkumný ústav rostlinné výroby Praha Ruzyně Optimalizovaná metodika PAGE pro analýzu esteráz v hlízách brambor (Solanum tuberosum L.) Vypracovaná jako výstup projektu 1B VÝVOJ A TESTOVÁNÍ SYSTÉMU ANALYTICKÝCH METOD PRO PRAKTICKOU CHARAKTERIZACI ODRŮD BRAMBOR REGISTROVANÝCH V ČR Autoři: Mgr. Světlana Sýkorová, CSc. & kol. Srpen 2006

2 OPTIMALIZOVANÁ METODIKA PAGE PRO ANALÝZU ESTERÁZ V HLÍZÁCH BRAMBOR (SOLANUM TUBEROSUM L.) Vypracovaná jako výstup projektu 1B VÝVOJ A TESTOVÁNÍ SYSTÉMU ANALYTICKÝCH METOD PRO PRAKTICKOU CHARAKTERIZACI ODRŮD BRAMBOR REGISTROVANÝCH V ČR Světlana Sýkorová a kol. sykorova@vurv.vz Vydal: Výzkumný ústav rostlinné výroby, Praha Text: 2006 S. Sýkorová, E. Matějová, M. Berová Foto: 2006 S. Sýkorová, J. Bradová Grafická úprava: 2006 M. Sýkora, L. Štočková Vydáno bez jazykové úpravy ISBN:

3 Optimalizovaná metodika PAGE pro analýzu esteráz v hlízách brambor (UPOV 2002) obsahující vlastní modifikace řešitelů Obsah: 1. Počet hlíz na test Přístroje a zařízení Chemikálie Chemikálie pro extrakci proteinů Chemikálie pro elektroforézu Chemikálie pro detekci esteráz 4. Roztoky Extrakční roztoky Pufry a gelové roztoky Barvicí roztoky pro esterázy 5. Pracovní postup Příprava vzorků Příprava gelů Příprava gelů pro PAGE ph 7,9 pro esterázy Nanášení vzorků Elektroforéza Podmínky PAGE ph 7,9 pro esterázy Barvení Barvení esteráz (vlastní modifikace) 6. Identifikace alel Identifikace alel esterázových lokusů Obrázek genotypů Est Obrázek genotypů Est Stanovení hodnot REM pro jednotlivé alely lokusů Est 2 a Est 3 (vlastní modifikace) S. Sýkorová & kol. VÚRV Praha

4 Optimalizovaná metodika PAGE pro analýzu esteráz v hlízách brambor (UPOV 2002) obsahující vlastní modifikace řešitelů 1. Počet hlíz na test: - pro DUS ( odlišnost, uniformitu a stálost) : 10 hlíz - pro kontrolu identity: 4 hlízy Hlízy by měly být zralé, přednostně sklizené po zaschnutí listů. Hlízy skladované v rozmezí teplot 4 10 C mohou být použity nezávisle na sezóně, dokud nezačnou klíčit. 2. Přístroj a zařízení: centrifuga kryostat zdroj stejnosměrného proudu alespoň na 400 V a 150 ma třepačka (kývačka) na ploché gely vertikální elektroforetický přístroj pro 2 gely Může být použit jakýkoli vhodný přístroj pro elfo, jestliže umožňuje udržování konstantní teploty gelů. Tloušťka gelu by neměla být vyšší než 1,5 mm. Zdroj proudu by měl mít možnost nastavení konstantního proudu nebo konstantního napětí. 3. Chemikálie: Všechny chemikálie stupně analytical reagent (p.a.) nebo lepší Chemikálie pro extrakci proteinů Amidočerň 10 B Siřičitan sodný Na 2 SO 3 Disiřičitan sodný Na 2 S 2 O 5 Sacharóza Chemikálie pro elektroforézu Akrylamid roztok (velmi toxický!!) (AA) Persíran amonný (APS) Bisakrylamid roztok (BIS) Kyselina boritá TRIS - Tris- (hydroxymethyl) - aminomethan Bromfenolová modř (BPB) 3- (Dimethylamino) propionitril (DMAPN) S. Sýkorová & kol. VÚRV Praha 4

5 3. 3. Chemikálie pro detekci esteráz Dimethylformamid Hydrogenfosforečnan dvojsodný dodekahydrát (Na 2 HPO H 2 O) Fast Blue RR Salt 1-Naftylacetát Dihydrogenfosforečnan sodný monohydrát (NaH 2 PO 4. 1 H 2 O) Glycerol 4. Roztoky Extrakční roztoky č. Roztok Složky Množství Poznámka Siřičitan sodný Na 2 SO 3 5,00 g Extrakční roztok A Disiřičitan sodný Na 2 S 2 O 5 3,75 g 100 ml Extrakční roztok B Extrakční roztok C Sacharóza Amidočerň 10B Extrakční roztok A Extrakční roztok B 500 g 0,3 g do 1000 ml 10 ml 100 ml lze skladovat při 6 C lze skladovat při 6 C denně čerstvý Pufry a gelové roztoky č. Roztok Složky Množství Poznámka TRIS 30,26 g Skladovatelný v Zásobní pufr Kys.boritá 36,6 g lednici (Pufr 1) do 1000 ml % roztok AA AA 40 g do 100 ml Pro bezpečnost by měl být používán komerční roztok % roztok BIS BIS 2 g do 100 ml Pro bezpečnost by měl být používán komerční roztok % roztok APS Elektrodový pufr (Pufr 2) Gelový pufr (Pufr 3) APS Pufr Pufr g do 50 ml 100 ml 700 ml 15,8 ml do 100 ml Denně čerstvý Denně čerstvý Denně čerstvý S. Sýkorová & kol. VÚRV Praha 5

6 4. 3. Barvicí roztoky pro esterázy č. Roztok Složky Množství Poznámka Fosfátový barvicí pufr pro esterázy ph 6,4 Na 2 HPO 4 x 12 H 2 O NaH 2 PO 4 x 1 H 2 O deionizovaná voda 12,1 g 9,1 g do 1000 ml substrát pro esterázy kopulační barvivo pro esterázy % glycerin α-naftylacetát dimethylformamid Fast Blue RR pro histo dimethylformamid Glycerol deionizovaná voda 100 mg 1 ml 200 mg 1 ml 20 ml do 1000 ml vlastní modifikace připravit těsně před použitím připravit těsně před použitím skladovatelný v lednici 5. Pracovní postup Příprava vzorků Hlízy zmrazit na -20 C a pak nechat rozmrazit při pokojové teplotě. Pro analýzu každé hlízy je potřebná 2 ml centrifugační kyveta obsahující 0,4 ml extrakčního roztoku C (4.1.3). Rozmrzlé hlízy se rozříznou a vymáčknou. 1,5 ml šťávy se zachytí do výše uvedené kyvety a promíchá s extrakčním roztokem C (třepání). Dále se centrifuguje 15 minut při ot.min -1 a 10 C. Supernatanty se přenesou do nové prázdné centrifugační kyvety a zmrazí se pro pozdější provedení elfo. Před začátkem elfo se extrakty rozmrazí a promíchají Příprava gelů Příprava gelů pro PAGE ph 7,9 pro esterázy - Sestavit suché a čisté gelové kazety - Připravit cca 100 ml gel. roztoku (T: 4,9%; C: 4,7%) Postupuje se tak, že se smíchá pufr, akrylamid a BIS-akrylamid, přimíchá se siřičitan, který se nechá dokonale rozpustit. Promíchá se a polymerace se nastartuje přidáním DMAPN a APS. složky Objem gelu 40 ml 80 ml 100 ml 120 ml 150 ml 200 ml pufr ,32 ml 60,64 ml 75,8 ml 90,96 ml 113,7 ml 151,6 ml AA 40% 4,68 ml 9,36 ml 11,7 ml 14,04 ml 17,55 ml 23,4 ml BIS 2% 4,96 ml 9,92 ml 12,4 ml 14,88 ml 18,6 ml 24,8 ml Na 2 SO 3 0,0165 g 0,033 g 0,042 g 0,05 g 0,063 g 0,084 g DMAPN 0,2 ml 0,4 ml 0,5 ml 0,6 ml 0,75 ml 1,0 ml APS 2% 0,76 ml 1,52 ml 1,9 ml 2,28 ml 2,85 ml 3,8 ml S. Sýkorová & kol. VÚRV Praha 6

7 - Po zamíchání se gely pečlivě, ale rychle, nalijí tak, aby se zabránilo tvorbě bublinek vzduchu. Hřebeny pro vytvoření vzorkových jamek se vloží do kapalného gelu a polymerace probíhá při pokojové teplotě alespoň 15 minut. Hřebeny se potom vyjmou. Vzniklé jamky se promyjí a naplní elektrodovým pufrem ( ) Nanášení vzorků - Pro elektroforézu esteráz se nanáší do každé jamky 10 μl extraktu pomocí mikrostříkačky Hamilton Elektroforéza Podmínky PAGE ph 7,9 pro esterázy Elektrodový pufr Proud /2 gely (11 cm šířka, 1 mm tloušťka) na začátku 10* minut 78 ma Napětí pokračovat nastavením 400 V na 30** minut Teplota 10 C Směr migrace od katody (-) k anodě (+) Celkový čas elektroforézy 10* + 30** minut 5.5. Barvení: Barvení esteráz (vlastní modifikace): Gely se označí, např. odříznutím růžku. Potom se přenesou do skleněných barvicích misek, v nichž je v každé 100 ml fosfátového pufru (4.3.3) smíchaného těsně před použitím s roztoky substrátu (4.3.4) a barviva (4.3.5). Na kývací třepačce se inkubuje při laboratorní teplotě minut, kdy jsou již patrné hnědě zbarvené pruhy esteráz. Ztmavlý a vysrážený barvicí roztok se potom slije a gely se inkubují na třepačce 2 x 30 minut s deionizovanou vodou a dále na třepačce v 2% roztoku glycerolu (4.3.6.) po dobu 30 minut. Po této inkubaci se gely usuší mezi dvěma vrstvami celofánu, namočeného v 2% glycerolu. 6. Identifikace alel: Identifikace alel esterázových lokusů Pozice jednotlivých esterázových isoenzymů jsou kalibrovány odrůdou Sieglinde. Odrůda Sieglinde vykazuje 3 pruhy s vysokou enzymatickou aktivitou v následujících pozicích: Esterázové ieoenzymy bramborových hlíz jsou vysoce polymorfní. Pro jasnou interpretaci byly zymogramy rozděleny do čtyř bloků pruhů. Bloky pruhů Est 1 a Est 4 mají jen nízkou enzymatickou aktivitu. Bloky pruhů Est 2 a Est 3 mají naopak vysokou enzymatickou aktivitu. Pro stanovení odlišnosti, jednotnosti a stálosti (DUS) jsou používány pouze bloky Est 2 a Est 3. S. Sýkorová & kol. VÚRV Praha 7

8 Brambory jsou vegetativně množený tetraploidní druh. Proto je třeba očekávat mnoho heterozygotních genotypů. Jednotlivé genotypy mohou být rozlišeny pouze podle genové dávky. Takové genotypy se často nacházejí v Est 2 a Est 3. Kombinace mezi null- alelou a aktivními alelami a genotypy majícími plnou dávku genu vykazují identické pruhy. Proto jsou vyhodnoceny jako identické. Est 2 Est 3 Př. odrůdy Znač. Est 2 Est 3 Př. odrůdy Znač Est 2 Est 3 Př. odrůdy Znač. a o Desirée 4 b o Cleopatra 18 c o Obelix 22 d o Achat 5 d b Vital 23 d c Krometa 19 e o Sibu 20 f o Wali 12 g b Premiere 26 h o Jetta 6 i o Renate 8 i b Selma 7 i c Karakter 15 j o Hansa 1 j b Ute 9 j c Karolin 3 k o Belita 13 k d Junior 17 l o Roxy 16 l c Sieglinde 2 o o Ulla 11 S. Sýkorová & kol. VÚRV Praha 8

9 Obrázek schémat genotypů Est 2 V Est 2 vykazuje většina genotypů 2 pruhy (označené a-1). Byly detekovány genotypy s více než 2 pruhy. Tyto typy mohou být interpretovány jako kombinace dvou genotypů obsahujících dva pruhy. Genotyp Genotyp Př. odrůdy Pozn. Znač. Est 2 Est 3 dl o Leyla nerozlišitelný od genotypu Est 2:d + 5 Est 3: o dl c Aiko nerozlišitelný od genotypu Est 2:d + 19 Est 3: c jf o Protea 27 Existuje překrytí genových produktů 75 a 77 náležejícím genotypu Est 2: l s genovým produktem náležejícím genotypu Est 1. Proto není možné získat jasnou separaci mezi hybridy typu Est2: l x d a genotypy Est 2:d. Proto genotyp dl a genotyp l nebudou vyhodnoceny jako rozdílné Obrázek schemat genotypů Est 3 Obrázek (typy a,b, c, d, o) podle mobility stoupá od a k d, typ o žádný pruh S. Sýkorová & kol. VÚRV Praha 9

10 6.1.3.Stanovení hodnot REM pro jednotlivé alely lokusů Est 2 a Est 3 (vlastní modifikace) Měřením a kalibrací podle odrůdy pruhu definovaného jako 75 etalonové odrůdy Sieglinde byly vypočteny hodnoty REM jednotlivých pruhů alel Est 2 a Est 3. V elektroforetickém spektru jednotlivých odrůd se vyskytují ještě další pruhy s různou intenzitou, které pravděpodobně náležejí lokusům Est 1 a Est 4, případně heterozygotním projevům esterázových alel. Alely Est 2 a jejich hodnoty REM a e d c k j i h g f l o (73) (76) (79) (84) (86) Hodnoty REM uvedené v závorce představují velmi nízkou, až stopovou intenzitu enzymatické aktivity Alely Est 3 a jejich hodnoty REM a b c d o S. Sýkorová & kol. VÚRV Praha 10