Cvičení z forenzní chemie

Transkript

1 První vydání Cvičení z forenzní chemie Vítězslav Maier Martin Švidrnoch Adam Přibylka Joanna Znaleziona Olomouc 2014, Katedra analytické chemie

2 Metody odběru a zviditelnění otisků prstů

3 Metody odběru a zviditelnění otisků prstů Identifikace krevních stop Odběrem a analýzou otisků prstů se zabývá odvětví kriminalistické techniky zvané daktyloskopie. Tento obor zkoumá otisky papilárních linií článků prstů (ale také např. dlaní či jejich částí). Vedle zajišťování kriminalistických stop a jejich vyhledávání je hlavním cílem daktyloskopického zkoumání zjistit identitu osoby, která otisk zanechala. Vzhledem k tomu, že průběhy papilárních linií jsou pro každého člověka jedinečné (podobně jako DNA), lze říci, že s největší pravděpodobností neexistují dva lidé, kteří by měli všechny otisky prstů totožné. Každá papilární linie představuje vyvýšenou kožní vrstvu, do níž vede kanálek s vyústěním potních žláz. Dotykem se z papilárních linií přenesou částečky prachu a dalších nečistot společně s potem a vytvoří tak kriminalistickou stopu daktyloskopický otisk. Díky tomu představuje daktyloskopie jednu ze základních kriminalistických metod, které jsou velmi často využívány k nalezení a identifikaci pachatele. Zviditelnění otisku prstů přenesen. Pro naše účely postačí jako fólie pro přenos otisku prstu lepící páska nebo bílá samolepící fólie.. Chemické metody Pot přenesený z papilárních linií při zanechání otisku prstu obsahuje celou řadu chemických látek, které mohou interagovat s činidly. Mezi chemické látky, které se používají ke zviditelnění otisků prstů, patří zejména ninhydrin, jód, dusičnan stříbrný nebo estery kyanoakrylové kyseliny (tzv. kyanoakryláty). Jód jako takový patří spíše na pomezí fyzikálních a chemických metod, neboť princip detekce je založen na sublimaci jódu a zachytávání jeho částeček na otiscích. Ostatní metody pak využívají chemické reakce, které vedou k viditelné změně (zvýraznění, zabarvení), avšak mnohdy může dojít k poškození nebo zničení materiálu nebo předmětu, na kterém je otisk umístěn. Ninhydrinové činidlo funguje na principu reakce ninhydrinu s aminokyselinami obsaženými v potu (obr. 1), které ulpí při dotyku na předmětu. Existuje několik základních metod, které se v kriminalistické praxi běžně používají. Nejčastějším postupem pro zviditelnění (nalezení) otisků je použití tzv. daktyloskopických prášků. Profesionální produkty jsou značně rozdílné a závisí zejména na okolních podmínkách (teplota, vlhkost, fyzikální podklad otisku apod.) a stáří otisku. Pro účely tohoto cvičení budeme používat dva typy daktyloskopických prášků magnetický železný prach a karbonizovaný uhlík (grafitový prášek). Pro latentní otisky prstů nebo otisky na předmětech a místech, pro které jsou práškové metody nevhodné, využijeme metody chemického zviditelnění, založené na chemické reakci mezi složkami otisku prstu (zejména potu a jeho složek) a chemickým činidlem. Práškové metody Tyto metody jsou vhodné především pro otisky zanechané na matných površích, jako je sklo, plast a jiné syntetické materiály nebo keramika. Principem této metody je adsorpce práškového materiálu na složky otisků. Daktyloskopické prášky se dají hrubě rozdělit na magnetické (např. modifikovaný nebo čistý železný prach) nebo nemagnetické (např. hliníkový prášek, měděný prášek nebo zmíněný grafit (případně jemné aktivní uhlí). Výhodou magnetických prášků je fakt, že je lze buďto přímo nanášet pomocí permanentního magnetu nebo lze přebytečný prášek magnetem zachytit a odstranit. Takto získané daktyloskopické stopy se poté buďto fotografují (v závislosti na povrchu, na němž jsou) nebo se přenášejí tzv. daktyloskopickými fóliemi a poté dále zpracovávání (fotografují, skenují apod.). Daktyloskopických fólii existuje rovněž celá řada a záleží a jejich volba závisí na konkrétním případě použití. Obecně se využívají černé nebo bíle folie na bázi želatiny, na kterou je otisk po zviditelnění Obr. 1: reakce ninhydrinu a aminokyselinou 2

4 Ninhydrin se běžně používá jako činidlo k detekci aminokyselin, působí jako oxidační činidlo a při reakci nejdříve dojde dekarboxylaci příslušné aminokyseliny (např. alaninu, kdy v obr. 1 R = CH3) a vzniklý amin pak podléhá oxidativní deaminaci. Ninhydrin se během této reakce přemění na zabarvený produkt. Reakce může probíhat jak v neutrálním (obr. 1.1) tak kyselém prostředí (obr. 1.2.), a oba produkty pak mají mírně odlišné zabarvení. Jód se používá ve formě prášku nebo jemných krystalků a obvykle je buďto uvolňován teplem přímo na místě (zahřátím speciální trubičky rukou) nebo ve vyvíjecích nádobách v laboratoři. Dusičnan stříbrný se jako činidlo využívá k detekci halogenidových iontů a jako takový může reagovat s chloridovými ionty přítomnými v potu. Vzniká bílá sraženina, které se účinkem záření (běžného polychromatického světla nebo UV záření) přeměňuje na elementární stříbro a tím se zvýrazní zabarvení otisku (černání). Estery kyseliny kyanoakrylové, které se využívají např. jako tzv. vteřinová lepidla, našly své uplatnění také ve forenzní chemii zejména při detekci tzv. latentních otisků prstů. Zahřátím kyanoakrylátů dojde k vývoji par, které se na otiscích prstů usazují ve formě polykyanoakrylát (obr. 2.). Ten je viditelný i pouhým okem, lze však využit i přídavek fluorescenčního nebo nefluorescenčního barviva, který otisk prstu ještě zvýrazní a zviditelní. Takto detekované otisky lze rovněž snadno přenést a dále zpracovávat. Obr. 2: obecné schéma polymerace methyl kyanoakrylátu (Nu - představuje nukleofil, v případě detekce otisků prstů např. OH - ) 3

5 Nalezení a zviditelnění daktyloskopické stopy Úkol: Proveďte sérii postupů vedoucí ke zviditelnění otisků prstů na předložených předmětech. Pomůcky: sada jemných štětců, plastové nebo skleněné petriho misky, uzavíratelná průhledná plastová nádobka (vyvíjecí komora pro kyanoakrylátovou nebo jodovou reakci), rozprašovač, kádinky, odměrný válec, plastové nádobky, mikroskopická sklíčka, váhy a navažovací lodičky nebo papír, sušárna, bílý papír. Chemikálie: ninhydrin, ethanol, methanol, kyselina octová, jód, kyanoakrylát (např. vteřinové lepidlo), dusičnan stříbrný, železný prach, aktivní uhlí nebo grafitový prášek, voda. Příprava činidel: 1.) Ninhydrin 50 mg ninhydrinu se naváží a převede do plastové nádobky a přidá se 25 ml ethanolu a 750 µl kyseliny octové (99 %). S ninhydrinem pracujeme opatrně a v rukavicích, neboť při kontaktu s kůží dojde k podobné reakci a zabarvení jako s o- tisky prstů. Připravený roztok převedeme do nádobky s rozprašovačem. 2.) Dusičnan stříbrný připravíme methanolický roztok dusičnanu stříbrného rozpuštěním 500 mg AgNO3 ve 25 ml methanolu. Roztok uchováváme v hnědých zásobních lahvičkách a chráněný před přímým světlem. Část roztoku potřebnou pro práci převedeme do nádobky s rozprašovačem. 3.) Jód a kyanoakrylát použijeme jodový prášek nebo jemné krystalky, které umístíme přímo do vyvíjecí komory. V případě kyanoakrylátu dáme malé množství (několik kapek) vteřinového lepidla např. na kousek alobalu a ten umístíme do vyvíjecí komory. Při přípravě těchto činidel a následné práci s nimi pracujte vždy v rukavicích a v digestoři! Pozor zejména na vteřinové lepidlo, neboť i malé množství rychle zasychá a lepí většinu materiálů. 4.) Práškové materiály jako železný nebo grafitový prach používáme přímo ze zásobních lahví a v digestoři (v rukavicích a nejlépe s rouškou a v digestoři, neboť vdechovaný prach je zdraví škodlivý a dráždí). Postup: Předložené materiály, na které byly naneseny otisky prstů (případně sami otisky prstů naneste dle pokynů vedoucího cvičení), podrobte zkoumání pomocí uvedených činidel. Skleněné, keramické nebo plastové materiály jsou vhodné jak pro metody chemické tak i práškové, zatímco otisky prstu např. na papíru lze lépe zviditelnit pomocí chemických činidel ninhydrinu a dusičnanu stříbrného. Obecný postup práce je následující: V rukavicích (!!) opatrně (abyste nedošlo k poškození nebo vzniku dalších otisků) zkoumané předměty rozdělíme na plastové, kovové, skleněné nebo keramické (skupina 1), a na papírové (nebo jiné nasákavé materiály, skupina 2). Vždy je připraveno od každého materiálu více vzorků, aby mohly být vyzkoušeny všechny techniky. Otisky prstů na materiálech ze skupiny A podrobíme nejprve daktyloskopickému zkoumání pomocí prášků a zaznamenáme případné změny. Pracujeme velmi opatrně a prášek spíše sypeme než natíráme štětcem. Při příliš prudkém nanášení dojde k setření otisků nebo k detekci pouze jejich částí. Stejné materiály poté vložíme do vyvíjecí komory tak, aby se jejich plochy nedotýkaly stěn nádoby. Vložíme dané činidlo a necháme cca minut vyvíjet. Probíhá-li vyvíjení příliš pomalu a nedochází ke zviditelnění otisků, je možné nádobu mírně zahřát (cca C) např. na vodní lázni. Zviditelnění otisků se projeví jako bílý povlak v případě kyanoakrylátu nebo jako hnědočervené otisky v případě jódu). Materiály ze skupiny B (především papír) položíme na pevnou podložku (např. plast nebo sklo) v digestoři a stejnoměrně aplikujeme činidla pomocí rozprašovače. Nechte činidla zaschnout, případně zkoumaný vzorek opatrně přeneste do sušárny a vysušte (při teplotě cca C). Neprojeví-li se zabarvení, je nutné sušení opakovat. V případě dusičnanu stříbrného nanášeného na bílý podklad je potřeba vzorek nechat několik minut na světle nebo použít UV lampu aby došlo k vyloučení elementárního stříbra a ztmavnutí otisku. Vyhodnocení Pokuste se nalézt nejvhodnější činidlo pro předložený materiál. Zviditelněné otisky zaznamenejte (např. fotograficky nebo skenováním přes transparentní fólii). 4

6 Orientační zkouška na přítomnost krve Orientační zkouška je nezbytnou součástí předcházejícím vlastní analýze. Je nutné potvrdit nebo vyvrátit zdali se skutečně jedná o suspektní vzorek, neboť analýza bývá mnohdy nákladná. Obvykle, pokud je to možné, se tato kvalitativní analýza provádí přímo na místě činu, aby se zamezilo záměně vzorků. Ne vždy je to však možné, např. vzhledem k množství vzorku, jeho lokalizaci (pevný povrch, látka či jiný materiál schopný sorpce činidel) apod. Z mnoha typů kvalitativní analýzy krevních stop jsou zde uvedeny dvě nejběžnější a nejjednodušší. 2. Činidlo na bázi 3,3,5,5 -tetramethylbenzidinu (TMB) Deriváty benzidinu se peroxidem vodíku nebo jiným oxidačním činidlem oxidují na produkty modré barvy, tzv. benzidinovou modř. Reakce je katalyzována buďto enzymaticky pomocí peroxidas (POD) nebo látkami, které ve své molekule obsahují porfyrin hem s centrálním atomem železa, tedy např. krevní barvivo hemoglobin. Pro účely kvalitativní orientační analýzy používá 3,3,5,5 -tertramethylbenzidin (TMB) v prostředí kyseliny octové nebo kyselého pufru. 1. Činidlo na bázi luminolu Luminol (neboli 5-amino-2,3-dihydroftalazin-1,4-dion) je luminofor (Obr. 3), při jehož oxidaci v bazickém prostředí za katalýzy dochází k chemiluminiscenci, která je charakteristická světle modrým zabarvením. Katalýza této oxidačně-redukční reakce je zde zajištěna právě krevním barvivem - hemoglobinem, který je přítomen v krvi a krevních stopách Orientační zkouška za pomoci luminolu má však svá omezení. Kromě hemoglobinu mohou uvedenou reakci katalyzovat také ionty některých přechodných kovů, především Cu 2+ a Co 2+ nebo chlornanové anionty často přítomné v desinfekčních prostředcích (např. SAVO). Bazické prostředí je možno zajistit různými způsoby, optimální ph je v rozmezí Výběr a použití pufru však závisí na celé řadě dalších faktorů, zejména nesmí žádná ze složek pufru nijak interagovat se vzorkem nebo jeho částmi. Luminol je však látka velmi špatně rozpustná ve vodných prostředích a svůj vliv zde hraje nejen ph ale i iontová síla roztoku. Obr. 4: Struktura 3,3,5,5 -tetramethylbenzidinu Úkol: Prokažte přítomnost krevních stop na předloženém vzorku Pomůcky: plastové nádobky, kádinky, rozprašovač, mikrozkumavky, lodičky, váhy, mikropipety. Chemikálie: peroxid vodíku (30 %, v/v), kyselina octová, 3,3,5,5 -tertramethylbenzidin (TMB), luminol, uhličitan sodný, peroxoboritan sodný, voda, dimethylsulfoxid (DMSO). Příprava činidel a postup: 1.) Luminol Odvažte 100 mg luminolu do 50 ml kádinky a přidejte 9 ml deionizované vody. K vzniklé suspenzi přidejte 0,5 g bezvodého uhličitanu sodného (Na2CO3) a důkladně promíchejte až do rozpuštění (v případě že se všechen luminol nerozpustil, přidejte opět menší množství uhličitanu). Obr. 3: Struktura luminolu Do mikrozkumavky odvažte 0,5 g peroxoboritanu sodného a doplňte na objem 1 ml deionizovanou vodou a důkladně rozpusťte pomocí ultrazvukové lázně. Před použitím činidla k analýze oba roztoky slijte a aplikujte buď do roztoku, o kterém předpokládáte že obsahuje krev, nebo rozprašujte na krví znečištěný povrch (oděv, papír atd.). 5

7 Pozitivní zkouška se projeví viditelnou modrou fluorescencí, kterou je nutné pozorovat ve tmě. 1. TMB Na lodičce odvažte 5 mg tetramethylbenzidinu (TMB) a rozpusťte v 5 ml dimethylsulfoxidu (DMSO). Připravte 50 ml základního roztoku ledové kyseliny octové o koncentraci 0,1 mol.dm -3. Poté smíchejte 1 ml TMB rozpuštěný v DMSO s 9 ml roztoku kyseliny octové a dobře promíchejte. Před analýzou přidejte k připravené směsi 5 µl 30% peroxidu vodíku a důkladně promíchejte. Vzniklé činidlo aplikujte obdobně jako luminol (viz výše), pozitivní zkouška se projeví jasně modrým (event. zeleným) zabarvením. Použitá literatura 1. J. Pješčák a kol. Kriminalistika, Obzor, Bratislava S. Bell, Forensic Chemistry, Prentice Hall, 2nd edition, J. Tesař, Soudní lékařství, Avicenum Praha 1976 Doplňující otázky 1. Jakým způsobem by bylo možné odebrat otisky prstů zemřelému? 2. K identifikaci krevních skvrn se ještě používá Bertrandova zkouška. Popište princip této metody. 6

8 Stanovení ethanolu v biologickém materiálu

9 Stanovení ethanolu v biologickém materiálu pro forenzní účely Tabulka 1: Korelace hladin alkoholu v krvi s akutními klinickými projevy Stanovení ethanolu (alkoholu) v biologickém materiálu se pro forenzní účely provádí dvěma různými metodami. Především jde o metodu plynové chromatografie s plamenově ionizačním detekorem (GC-FID) s využitím head space a klasickou volumetrickou metodu tzv. Widmarkova metoda (zkouška). Obě uvedené metody mají své výhody a nevýhody. Forenzně uznávaná metoda je dnes pouze plynová chromatografie s využitím head space. Policie využívá ještě i terénní stanovení hladiny alkoholu ve vydechovaném vzduchu. Přepočet na hladinu alkoholu v krvi je možný, ale předpokládá nezávislý poměr vydechovaného vzduchu a krve, což je variabilní. Fyzikálně-chemické vlastnosti ethanolu Hladina alkoholu v krvi (mg/dl) (0,1 až 0,5 g.kg -1 ) (0,3 až 1,2 g,kg -1 ) (0,9 až 2,5 g.kg -1 ) Klinický stav střízlivost eufórie excitace Symptomy a projevy Normální chování. Minimální změny chování odhalitelné pouze speciálními testy. Mírná eufórie se zvýšenými sociálním projevy, zvýšení sebevědomí. Snížení pozornosti a sebekontroly. Emoční nestabilita, ztráta kritického myšlení a kontroly, výpadky paměti. Ztráta pohybové koordinace, zvýšení reakčního času, snížení citlivosti na vnější podněty. Ethanol je alifatický alkohol (CH3CH2OH). Je to bezbarvá kapalina, v bezvodém stavu má ostrou vůni. Ve směsi s vodou je alkoholická vůně jemnější a sladší. Teplota varu ethanolu je 78,5 C. Hustota ethanolu při teplotě 25 C rovna 0,789 g.cm -3.Ethanol je méně polární než voda a z tohoto důvodu prochází snadněji buněčnými membránami a difunduje to tkání. Mezní koncentrace absolutního ethanolu, která je zachytitelná lidským čichem ve vzduchu je 350 ppm. Ethanol je snadno zápalná látka a řadí se mezi hořlaviny 1. třídy. Ethanol je neomezeně mísitelný s vodou (1,5 až 2,3 g.kg -1 ) (2,7 až 4,0 g.kg -1 ) zmatenost stupor Dezorientace, mentální zmatenost, nevolnost, přehnané emocionální reakce, strach, smutek, hněv. Poruchy vidění - zdvojené vidění, změna vnímání tvaru a pohybu. Snížená reakce na bolest, porušená rovnováha a koordinace, setřelá nebo nesrozumitelná řeč. Apatie, významně snížená odezva na podněty, významná ztráta svalové koordinace, neschopnost stát, inkontinence, poruchy vědomí (letargie, strnulost). Účinek ethanolu na lidský organismus Na lidský organismus působí ethanol jako droga. Má tlumivý účinek na CNS (přestože v případě počáteční konzumace působí zdánlivě excitačně). Ethanol je ve velice nízké koncentraci obsažen v krvi člověka jako produkt metabolických pochodů. Fyziologická průměrná hladina ethanolu u zdravého člověka se pohybuje okolo 0,03 až 0,05 g.kg -1. Nad koncentrační hladinu 0,05 g.kg -1 už dochází k mentálnímu ovlivnění a tato hladina je tedy považována za mezní hladinu alkoholu, kdy dochází k již znatelnému zhoršení motorických funkcí. S dalším nárůstem hladiny alkoholu v krvi dochází postupně k prohlubování zhoršení motorických funkcí a koordinace pohybu, zhoršení úsudku, odstraňování zábran, dále dochází k vzrušeným emocionálmím projevům až agresivitě. Další zvyšování alkoholu v krvi má pak za následek utlumení CNS až k úpadku do bezvědomí. Letální dávka ethanolu v krvi se pohybuje v rozmezí 5 až 8 g.kg -1 pro dospělé osoby a pro děti je to hladina 3 g.kg -1. Akutní toxicita ethanolu je dále ovlivněna tolerancí na alkohol, interakcí s léčivy a drogami a také případnou hypoglykemií. Korelace mezi hladinou alkoholu v krvi a akutními klinickými projevy v případě akutní intoxikace je uvedena v tabulce (3,5 až 5,0 g.kg -1 ) > (>4,5 až 5,0 g.kg -1 ) Kóma Smrt Potlačení reflexů, poruchy dýchání, aspirace. Zástava dechu. Absorpce, distribuce a metabolismu ethanolu Absorbce, distribuce a metabolismus ethanolu je podmíněn genetickými a environmentálním faktory. Absorbce ethanolu při perorálním podání se odehrává především v tenkém střevu. Poměr mezi požitým a absorbovaným ethanolem (tedy rychlost absorbce) je dán celou řadou faktorů, např.: obsahem žaludku, rychlostí požití ethanolu, složením potravy, rychlostí vyprazdňování gastrointestinálního traktu. Ethanol jako malá a relativně polární molekula je distribuován rovnoměrně v závislosti na obsahu vody v jednotlivých tkáních. Distribuovaný objem ethanolu je úměrný celkovému obsahu vody v těle. Faktory ovlivňující celkové množství vody v těle ovlivňují zároveň distribuci ethanolu. Eliminace ethanolu probíhá z asi 90 % metabolickými pochody. Pouze 2-10% dávky ethanolu je vyloučena dechem, po- 8

10 tem a močí. Metabolická eliminace ethanolu je závislá na enzymatické oxidaci ethanolu v játrech (alkoholdehydrogenáza, aldehyddehydrogenáza). Rychlost eliminace je tedy závislá genetických na variantách enzymů podílejících se na oxidaci ethanolu. Absorpce Jak bylo uvedeno GI trakt je hlavní cestou absorpce ethanolu přijatého per os. Asi 20% absorbovaného ethanolu přechází do krve pasivní difúzí přes žaludek, zbylých 80 % přechází do krevního řečiště přes duodenum a další části tenkého střeva. Inhalační cesta vstupu a vstup přes kůži nemá z hlediska absorpce a intoxikace alkoholem velký význam díky relativně vysoké polaritě ethanolu a tedy jeho velké rozpustnosti ve vodě a nízké rozpustnosti v tucích. Absorpce ethanolu v GI probíhá pouze pasivní difúzí a je tedy řízena koncentračním gradientem (podle Fickova zákona). Rychlost absorbce ethanolu z GI traktu je dána zejména následujícími faktory: a) množstvím ethanolu, který je v kontaktu s mukózním povrchem, b) časem, po který zůstává ethanol v kontaktu s žaludeční stěnou, c) množstvím krve, které protéká v místě styku alkoholu s žaludeční stěnou, d) velikostí povrchu žaludeční stěny, který je dostupný pro resorpci alkoholu. U zdravého dospělého jedince se 80 až 90 % požitého alkoholu absorbuje přes GI trakt během minut. Distribuce Ethanol je mísitelný s vodou v jakémkoli poměru. Z tohoto důvodu se do jednotlivých tkání ethanol dostává tím více, čím je obsah vody v dané tkáni vyšší. VD ethanolu je závislý na pohl a v í, v ě k u a množství tuku v těle (obezita). Například ženy mají VD ethanolu mírně nižší než muži, protože ženské tělo obsahuje přirozeně méně vody a více tuku na jednotku hmotnosti. Distribuční objem ethanolu pro dospělou zdravou ženu se pohybuje v rozmezí 0,54 až 0,71 L.kg -1, zatímco pro dospělého zdravého muže je VD ethanolu v rozmezí 0,63 až 0,76 L.kg -1. Vazba ethanolu na proteiny Ethanol se neváže na proteiny krevní plazmy či tkání. Distribuční objem úzce koreluje s množstvím vody v těle. Ethanol rovněž neinterferuje při vazbě jiných sloučenin na proteiny plazmy. Eliminace (biotransformace) ethanolu Hlavními metabolickými pochody ethanolu jsou oxidační metabolické pochody využívající enzym alkoholdehydrogenázu a enzymatický systém mikrosomální ethanol-oxidační (MEOS). Konečným produktem enzymatické oxidace ethanolu je CO2 a H2O. Hlavní metabolická cesta ethanolu je založena na jeho oxidaci alkoholdehydrogenázou. Oxidace ethanolu alkoholdehydrogenázou (ADH) probíhá v játrech za spoluúčasti kofaktoru nikotinamidadeninnikluotidu (NAD + ). NAD + v tomto případě zastává roli akceptoru protonů během oxidace ethanolu na acetaldehyd. ADH je obsažen v cytosolu jaterních buněk. Tato metabolická dráha ethanolu je nasycena při relativně nízké koncentraci ethanolu. Enzymy podílející se na enzymatické oxidaci ethanolu vykazující významný polymorfismus (ADH, aldehydehydrogenáza (ALDH) a CYP2E1. Enzym ALDH, který je dále zodpovědný za oxidaci acetaldehydu existuje v několika formách. Nejvýznamnější jsou dva: ALDH1 - enzym obsažený v cytosolu všech buněk včetně m o z k o v ý c h s omezenou katalytickou aktivitou a ALDH2 - mitochondriální enzym přítomný v játrech a žaludku. ALDH2 vykazuje vysokou katalytickou aktivitu pro oxidaci acetaldehydu. ALDH2 je primární enzym zodpovědný za in vivo oxidaci acetaldehydu. Asijská populace má geneticky podmíněný deficit ALDH2 enzymu, který vede ke zvýšené citlivosti na acetaldehyd vzniklý oxidací ethanolu. U této populace tak dochází ke zvýšené akumulaci acetaldehydu spojené se zvýšením tepové srdeční frekvence, intenzivní zrudnutí obličeje, zvýšené pocení a erythém. Widmarkova metoda Widmarkova metoda je stále rozšířenou analytickou metodou poměrně velmi přesnou a spolehlivou. Její výhodou je vysoká citlivost a poměrná jednoduchost, která ji řadí mezi rutinní laboratorní úkony. Je využívána i jako princip při dechové zkoušce v detekčních trubičkách, které stanovují orientačně požitý alkohol na základě změny barvy detekční trubičky. Pro provedení Widmarkovy zkoušky se odebírá asi 5 až 8 mililitrů krve. Při odběru se k dezinfekci nesmí užívat alkoholu ani jiných těkavých látek, neboť by došlo ke zkreslení výsledků. Princip Widmarkovy metody spočívá v oddestilování etanolu obsaženého v krvi a jeho oxidaci známým nadbytkem dichromanu draselného v kyselině sírové. Přebytek dichromanu se stanoví jodometrickou titrací. Nevýhodou této zkoušky je její nespecifičnost, protože při Widmarkově metodě jsou mezi redukujícími látkami chovajícími se stejně jako etanol i jiné těkavé redukující látky, jako např. acetaldehyd, isopropanol apod. 9

11 Rovnice reakcí vystihující půběh Widmarkovi metody: K2Cr2O7 + 3 CH3CH2OH + 8 H2SO4 -> 2 Cr2(SO4)3 + 2 K2SO4 + 3 CH3COOH + 11 H2O K2Cr2O7 + 6 KI + 7 H2SO4 -> Cr2(SO4)3 + 4 K2SO4 + 3 I2 + 7 H2O 2 Na2S2O3 + I2 -> 2 NaI + Na2S4O6 Stanovení ethanolu v biologickém materiálu Widmarkovou metodou Úkol: Stanovte obsah ethanolu v předloženém biologickém materiálu (krev či moč). Pomůcky: Widmarkovy baňky, odměrná baňka na 500 ml, staniolové mističky, odměrný válec, byreta, kádinky, sušárna, analytické váhy, automatické pipety a špičky, centrifuga. Plynová chromatografie s plamenovým ionizačním detektorem (GC-FID) Ethanol (stejně jako jiné těkavé látky) je z vyšetřované krve v uzavřené vialce za teploty okolo 60 C odpařen do prostoru nad tekutinou. Takto vzniklý plynný vzorek je dávkován do kolony plynového chromatografu - jedná se o techniku head space (obr. 1). Na výsledném záznamu analýzy je pak retenční vzdálenost (retenční čas) mírou kvality jednotlivých rozdělených složek směsi, plocha píku je mírou kvantity. Stanovení se provádí metodou vnitřního standardu. Za konstantních podmínek analýzy je retenční čas alkoholu, stejně jako jiných těkavých látek, jež mohou být obsaženy ve vyšetřovaném vzorku, vždy stejný. Obr. 1: Schematické znázornění statické head space analýzy Obr. 2: Widmarkova titrační baňka Potřebné roztoky a činidla: 1) roztok 5% KI, 2) roztok 0,25% dichromanu draselného v koncentrované kyselině sírové (odpovídá 0,01 M roztoku), 3) roztok 1% škrobu, 4) 10% roztok kyseliny chlorovodíkové, 5) 50 mm thiosíran sodný ve vodě, 6) 5 mm thiosíran sodný ve vodě. Uvedené roztoky a činidla jsou již předem připraveny. Pracovní postup: 1. Stanovení přesné koncentrace odměrného roztoku 0,25% dichromanu draselného Do titrační baňky se odpipetuje 10 ml zásobního roztoku dichromanu draselného a přidá se 30 ml 5% roztoku jodidu draselného a 10 ml 10% roztoku kyseliny chlorovodíkové. Směs se důkladně promíchá a titruje se 50 mm roztokem thiosíranu sodného do žlutého zbarvení. Poté se přidá 1 ml 1% roztoku škorobového mazu a titruje se dále do trvale slabě modrého zbarvení. Ze spotřeby 5% roztoku jodidu draselného se vypočítá přesná koncentrace roztoku dichromanu draselného. 10

12 2. Příprava biologického materiálu k analýze a) Krev - zkumavka s předloženou krví se 5 minut centrifuguje při 3000 ot/min. Po centrifugaci se odbírá k jedné titraci 100 L séra. b) Moč se pipetuje přímo bez předchozí centrifugace. 3. Vlastní stanovení ethanolu a) Do 2 Widmarkových baněk se odměří přesně 1 ml 0,25% roztoku dichromanu draselného v koncentrované kyselině sírové. b) 2 staniolové mističky se zváží na analytických vahách, zapíše se jejich hmotnost. Do zvážených staniolových mističek se odpipetuje 100 L zkoumaného biologického materiálu a slepý vzorek (100 L roztoku dichromanu draselného v koncentrované kyselině sírové). Diferenčně se mističky zváží a odečte se navážka. c) Misky s odpipetovaným biologickým materiálem se vloží do držáčku Widmarkových baněk. d) Baňky se uzavřou na 2 hodiny do sušárny vytemperované na 60 C. Po dvou hodinách se baňky vytáhnou a nechají zchladit na laboratorní teplotu. e) Staniolové mističky se opatrně z Widmarkových baněk vyjmou a obsah Widmarkových baněk se zředí 25 ml deionizované vody a promíchá. Přidá se 1 ml roztoku 5% KI. Roztok zežloutne. Dále se přidají 3 kapky roztoku škorobového mazu. Roztok zmodrá a promíchá se. f) Roztoky ve Widmarkových baňkách se titrují 5 mm roztokem thiosíranu sodného do trvalého odbarvené. Odečte se přesně spotřeba v ml. Výpočet množství ethanolu v biologickém materiálu c = ,13. (Vb-Va)/m. x c stanovovaná koncentrace ethanolu v g/kg Vb spotřeba thiosíranu sodného při slepém pokusu Va spotřeba tiosíranu sodného při titraci vzorku m navážka vzorku v mg X faktor zohledňující typ biologického materiálu V případě stanovené alkoholu z krevního séra je nutné celý výsledek vydělit ještě číslem 1,2. Výsledná koncentrace alkoholu pak odpovídá obsahu ethanolu v plné krvi. Stanovení ethanolu metodou plynové chromatografie Úkol: Stanovte obsah ethanolu v předloženém biologickém materiálu (krev či moč). Pomůcky: skleněné vialky, gumové zátky, pertle, pertlovací kleště, automatické pipety a špičky, centrifuga. 1. Příprava biologického materiálu k analýze a) Krev - zkumavka s předloženou krví se 5 minut centrifuguje při 3000 ot/min. Po centrifugaci se odbírá k jedné titraci 100 ul séra. b) Moč se pipetuje přímo bez předchozí centrifugace. 2. Vlastní analýza a) Do standardizovaných skleněných vialek se nepipetuje 0,5 ml biologického materiálu (séra, moči) a 0,5 ml vnitřního standardu 0,4 (v/v) roztoku terciárního buthanolu. b) Vialka se uzavře gumovou zátkou a zapertluje pod dohledem vedoucího cvičení. Zapertlované vialka se vloží na termostatu plynového chromatografu. c) Stejným způsobem se připraví řada kalibračních roztoků se známým obsahem ethanolu o koncentraci 0,05 až 4,0 promile vždy se stejnou koncentrací vnitřního standardu. d) Spolu s vedoucím cvičení se provede nastavení parametrů GC-FID analýzy a spustí se analýza. 3. Vyhodnocení Odečtou se plochy píků odpovídající vnitřnímu standardu a píku ethanolu v kalibračních standardech a biologických vzorcích. Zkonstruuje se kalibrační křivka a vypočítá se koncentrace ethanolu v analyzovaném biologickém vzorku. Získaný výsledek se násobí přepočítávacími faktory zohledňujícími typ biologického materiálu: sérum = 0,7937 moč = 0,9852 Použitá literatura: 1. B. Levine, Principles of Forensic Toxicology, AACC Press; Fourth edition (2013). 2. A. Negrusz, G. Cooper, Clarke's Analytical Forensic Toxicology, Pharmaceutical Press; 2 edition (2013). 11

13 Doplňující otázky: 1. Napište rovnice reakcí vyjadřující metabolismu ethanolu a ethylenglykolu. 2. Popište stručně princip plamenového ionizačního detektoru (FID), který se v plynové chromatografii využívá k detekci organických látek. 3. Jaký je princip detekčních zařízení pro orientační stanovení ethanolu v dechu při zkoušce řidičů na přítomnost alkoholu? Příprava roztoků: 1. Roztok 5% jodidu draselného 25 g KI se rozpustí ve 475 ml deionizované vody. Roztok je potřeba uchovávat v temné lahvi. 2. Roztoku 0,25% dichromanu draselného v koncentrované kyselině sírové 1,25 g dichromanu draselného se rozpustní v mírně zahřáté deionizované vodě o objemu cca 15 ml a kvantitativně se převede do odměrné baňky na 500 ml. Roztok se doplní po značku koncentrovanou kyselinou sírovou. Dichroman draselný nesmí vykrystalizovat. Vzniklý roztok je potřeba uchovávat v temné lahvi a připravovat maximálně 2 dny před vlastním cvičením. 3. Roztok 1% škrobového mazu 1 g škrobu se smíchá v kádince s několika ml deionizované vody za vzniku kaše. Kaše se přelije 120 ml vařící deionizované vody a povaří se 15 min. Poté se nechá odpařit na výsledný objem 100 ml. Roztok je nutné uchovávat v tmavé lahvi. 4. Roztok 10% kyseliny chlorovodíkové 100 ml koncentrované kyseline chlorovodíkové (37%) se smíchá s 324 ml destilované vody. 5. Roztok 50 mm thiosíranu sodného 26 g pentahydrátu thiosíranu sodného se rozpustí ve 100 ml deionizované vody a zakonzervuje se přídavkem 1 g kyanidu rtuťnatého. Roztok je nutné uchovávat v lednici. 6. Roztok 5 mm thiosíranu sodného 25 ml 50 mm thiosíranu sodného se rozpustí ve 250 ml deionizované vody. Roztok se připraví vždy čerství před samotným stanovením. 12

14 Izolace, zakoncentrování a stanovení post blast (povýbuchových) zplodin metodou kapalinové chromatografie s DAD detektorem kapilární elektroforézy s DAD detektorem

15 Izolace, zakoncentrování a stanovení post blast (povýbuchových) zplodin metodou kapalinové chromatografie s DAD detektorem kapilární elektroforézy s DAD detektorem Povýstřelové zplodiny (vedlejší produkty výstřelu) - různé kovové i nekovové částice vzniklé hořením prachové náplně náboje a zápalkové slože a průchodem střely vývrtem v hlavě zbraně. Patří sem i další nečistoty vymetené střelou v průběhu výstřelu (rez, zbytky konzervačních prostředků). Povýstřelové zplodiny jsou i viditelné v okamžiku výstřelu jako záblesk nebo plamen a dým v okolí ústí hlavně střílející zbraně. Část povýstřelových zplodin se zachycuje i na rukou a oděvu střílející osoby i na předmětech v blízkosti střely. Zkoumání povýstřelových zplodin má význam především pro určení vzdálenosti střelby. Význam mají při posouzení sebevraždy nebo sebepoškození. Je známo, že člověk si může způsobit zásah do životně důležitých center organismu z maximální vzdálenosti asi 75 cm. Povýstřelové zplodiny, které unikly netěsnostmi zbraně při střelbě, mají společně s povýstřelovými zplodinami, které unikly z hlavně význam při posouzení, zdali konkrétní osoba střílela, nebo byla v blízkosti střelby, eventuálně bylo stříleno v určitém prostoru (místnosti, dopravní prostředek apod.). Stejně tak je analýza povýbuchových zplodin důležitá při posouzení, zda palná zbraň byla v okamžiku střelby v určitém místě či zavazadle. Jako vzorky určené k expertíze jsou pak odebírány povýbuchové zplodiny z různých míst z b r a n ě, v okolí výstřelu a také z rukou samotného střelce. Hlavní metodou analýzy povýstřelových zplodin je analýza pomocí elektronového skenovacího mikroskopu. Částečky, které jsou hlavní součástí povýstřelových zplodin, mají charakteristický tvar i chemické složení. Další metodou analýzy chemického složení povýstřelových zplodin jsou chromatografické metody, kapilární elektroforéza, metody atomové spektrometrie a hmotnostní spektrometrie. Chromatografické metody a elektroforetické metody umožňují separaci jednotlivých chemických individuí tvořích povýstřelovou zplodinu stejně tak umožňují provádět analýzu složení nevybuchlých zajištěných složí, náloží amatérsky konstruovaných výbušnin apod. Základní dělení explosiv pro forenzní účely je zobrazeno na obr. 1. Obr. 1: Základní dělení explosiv pro forenzní účely Z dělení je patrné, že mezi explosiva jsou řazeny i pohonné hmoty, které v mnoha případech tvoří hlavní složku výbušnin připravených ilegální domácí výrobou. Dále se explosiva dělí na primární a sekundární explosiva. Primární explosiva jsou velmi citlivá k iniciaci jiskrou, plamenem, či mechanickou silou. Sekundární explosiva jsou obecně méně citlivé vůči uvedeným mechanismům iniciace explose a k jejich iniciaci typicky dochází s pomocí primární explosiv. Jako terciární explosiva jsou pak označovány látky a směsi, které jsou relativně necitlivé vůči iniciaci, např. NH4NO3. Tyto látky vyžadují přítomnost nějaký další složky k detonaci. Zvláštní skupinu tvoří explosiva domácí výroby, které jsou vyráběny z dostupných prekurzorů evenutálně z explosiv pocházející z trestné činnosti. Z chemického hlediska je možné dělit explosiva podle chemické struktury a funkčních skupin: sloučeniny obsahující dusík (např. TNT), aromatické nitraminy (Tetryl), estery kyseliny dusičné (nitroglycerin), peroxidy (TATP), iniciační explosiva (styfnát olova), 14

16 soli (nitrát močoviny), palivo/oxidující složka (dusičnan amonný/benzíd nebo ANFO). Příklady struktur některých explosiv jsou na obr. 2. Analýza výbušnin a povýbuchových zplodin s pomocí kapalinové chromatografie Analýza výbušnin a povýbuchových zplodin obecně klade vysoké nároky na odběr, přípravu, zakoncentrování a přečištění vzorku před vlastní analýzou. Povýbuchové zplodiny i nevybuchlé rozbušky je vždy nutné podrobit extrakci do dvou extrakčních činidel (vodné a organické). Voda nebo vodné pufry se používají pro extrakci ve vodě rozpustných složek, jako jsou anorganické ionty nebo například cukry. Jako organické rozpouštědlo se nejvíce využívá aceton pro organické ve vodě nerozpustné složky explosiv. Organické balasty a rušivé složky, které se v tomto případě velmi ochotně koextrahují musí pak být v extraktu odstraněni dalšími přečišťovacími postupy. Konkrétní přečišťovací postup pak závisí na použité koncové analytické technice. Velmi často se využívá přečištění acetonového extraktu pomocí vhodného sorbentu, kterými mohou být například Porapak T nebo Florisil. Organické složky explosiv jsou tak zachyceny na zvoleném sorbentu, mohou být promyty a eluovány vhodným organickým rozpouštědlem. Vodné extakty jsou přečišťovány obyčejně pouze filtrací. Pro některé organické složky explosiv je vhodná i SPE extrakce. Anorganické složky mohou být zachyceny na iotoměničích Amberlite XAD-2, XAD-4, XAD-8 (v poměru 1:1:1), C18 fázích, fenylových fázích a kyano- fázích. Úkol: Prověďte izolaci, zakoncentrování a analýzu povýstřelových zplodin a explosiv pomocí HPLC-DAD a CE-DAD Chemikálie: standardy explosiv v methanolu o koncentraci 10 mg/l (TNT, 2,4-DNT, 2,6- DNT, Tetryl RDX), dusičnany kovů (mědnaté, vápenaté, barnaté) methanol, acetonitril, pyridinium sulfát, 1M HCl, mravenčan amonný, deionizovaná voda. Pomůcky: kádinky, mikrozkumavky, injekční stříkačka - hamiltonka, láhve pro mobilní fáze, stříkačkové filtry s póry 45 um, automatické pipety a špičky, vialky a víčka pro LC a CE, ultrazvuk. Parametry LC separace LC kolona - hypersil GOLD PFP, 1,9 um, 100 x 2.1 mm. Mobilní fáze: A: 1 mm ammonium formiát ve vodě, B: methanol Injekce 2 ul, detekční vlnová délka 214 a 254 nm. Obr. 2: Příklady struktur některý explosiv Gradient Time (min) A(%) B(%)

17 Parametry CE separace Nepokrytá křemenná kapilára, vnitřní průměr 50 µm, celková délka 48.5 cm, efektivní délka 40 cm, Pracovní elektrolyt 10 mm pyridinium sulfát ph 7.0 Napětí + 15 kv, injekce 100 mbar/10s Postup práce: Stanovení vápenatých, barnatých a mědnatých iontů s pomocí CE-DAD Pro obě metody sestrojte kalibrační křivky a proveďte stanovení koncentrací kovů a organických látek v předložených vzorcích. Doplňující otázky 1. Jakým způsobem byste provedli analýzu zábavné pyrotechniky na přítomnost nepovolených výbušnin (TNT, hexogen)? 2. Jaké další typy detekce ve spojení s kapalinovou chromatografií a kapilární elektroforézou je možné pro analýzu kovů a organických složek výbušnin Použitá literatura 1. J. Bogusz, Forensic Science, B.H. Stuart, Forensic Analytical Techniques, B. Levine ed., Principles of Forensic Toxicology, AACCPress, Předložený vzorek zábavné pyrotechniky nejdříve extrahujte 10 ml deionizované vody v plastové nádobce v ultrazvuku po dobu 15 min. Vodný extrakt přefiltrujte a použijte pro analýzu na přítomnost anorganických kovových iontů s pomocí kapilární elektroforézy s nepřímou UV-VIS detekcí. 2. Připravte pracovní elektrolyt o složení 10 mm pyridinium sulfát a upravte na ph 7.0 s pomocí zředěné kyseliny chlorovodíkové. 3. Připravte standardní kalibrační roztoky pro barnaté, vápenaté a mědnaté ionty (použijte dusičnany kovů) v rozmezí 0.5 mg/l až 50 mg/l. 4. Na kapilární elektroforéze nastavte metodu CE_postblast.M a proveďte analýzy standardních kalibračních roztoků a extrahovaného vzorku dle pokynů vedoucího cvičení. Stanovení organických složek s pomocí LC-DAD 1. Druhou část předloženého vzorku extrahujte v 10 ml acetonu po dobu 15 min v ultrazvuku ve skleněné baňce. Proveďte SPE extrakci s pomocí C18 fází. Návod k SPE extraktoru je v příloze. Po extrakci eluujte organických post blast residua s pomocí hexanu. 2. Po SPE extrakci eluát jímejte do připravené mikrozkumavky. Extrakt odpařte pod proudem dusíku při teplotě 25 C do sucha. Odparek po extrakci rekonstituujte ve 200 ul mobilní fáze, která bude použita pro separaci. 3. Připravte kalibrační roztoky organických látek (TNT, 2,4-DNT, 2,6-DNT, Tetryl RDX) v koncentračním rozmezí 0.5 ug/l až 50 ug/l 4. S pomocí vedoucího cvičení spusťte na LC-DAD chromatografu metodu LC_postblast.M a proměřte kalibrační roztoky a extrahovaný vzorek. 5. Na základě retenčních časů standardů a separovaných látek v extraktu proveďte identifikaci jednotlivých organických látek ve vzorku. 16

18 Identifikace barviv

19 Identifikace barviv pomocí Ramanovy spektrometrie V kriminalistických laboratořích se provádí technická expertíza písemností, která se mimo jiné zabývá zkoumáním použitých psacích prostředků: tiskových inkoustů, propisek, centropenů, razítek, atd. Analýza tohoto typu pomáhá zodpovědět následující otázky: Zda byly dokumenty napsané stejným psacím prostředkem? Zda jsou dokumenty pravé? Zda byly dokumenty vytvořené ve stejnou dobu, nebo Jak starý je zkoumaný text? Každý zpochybněný dokument je nejdříve zkoumán vizuálními metodami. Objekt se posuzuje pouhým zrakem nebo s pomocí lupy za denního nebo umělého osvětlení, případně v různém barevném osvětlení. Při expertíze je potřeba pracovat v gumových rukavicích, aby nedošlo ke kontaminaci nebo poškození dalších případných stop. Když výše uvedené metody nedávají jednoznačné odpovědi, je nutné použit další techniku. Tabulka 1: Analytické metody využívané v analýze inkoustů. Metoda Destruk,vní? Využi, Op#cká mikroskopie v polarizovaném světle Polarized Light Microscopy (PLM) Chromatografie na tenké vrstvě- Thin Layer Chromatography (TLC) Infračervená spektroskopie a mikrospektrofotometrie Ramanova spektroskopie ne ano ne ne Charakteris#ka barviv, určení pořadí nanesených barviv, makroskopická analýza. Srovnávací analýza pigmentů a barviv. Charakteris#ka barviv a polymerů, srovnávací analýza zkoumaných objektů. Rentgenová analýza Charakteris#ka anorganických barviv, komplexní exper#za při určování fází ne pigmentů uměleckých předmětů (obrazů, soch, plas#k apod.), automobilových laků. Hmotnostní spektrometrie Mass Spectrometry (MS) Závisí na zkoumaném vzorku a způsobu ionizaci Charakteris#ka organických složek badaného objektu. Hmotnostní spektrometrie indukčně Charakteris#ka barviv. ano vázaného plazmatu ICP- MS Hmotnostní spektrometrie indukčně Charakteris#ka barviv. vázaného plazmatu Ne/minimálně s laserovou ablací (LA- ICP- MS) Pyrolyza GC/GC- MS ano Charakteris#ka pryskyřic. Kriminalistické laboratoře upřednostňují spektroskopické metody, a to z důvodu, že tyto metody nepotřebují speciální předúpravy vzorku a navíc jsou nedestruktivní. Při analýze inkoustů musíme pamatovat, že se jedná o směs látek (filmotvorné látky, aditiva, rozpouštědla, konzervační prostředky, barviva). Mezi hlavní složky inkoustů patří pojivo, konzervační a barvonosné látky. Typické složení inkoustu v kuličkovém peru je: 50 % rozpouštědla, 25 % barviva, 25 % jiné látky, ale konkrétní chemické a množstevní složení inkoustů je u všech výrobců výrobním tajemstvím. Chemické a fyzikální vlastnosti psacích prostředků závisí na jejich podobě a to zejména na původní podobě, kdy se jedná o nádobky s inkousty, tušemi, různými druhy tužek a popisovačů, nebo v podobě po jejich aplikaci na zkoumaný objekt (otisky razítek, vytvořený tisk, psací tahy různých psacích prostředků). Původní podoba vzorků přináší méně informací a z hlediska interpretace výsledků je jednodušší. V případě aplikování inkoustů na objekt (nejčastěji papír) se mění jejich vlastnosti z úvahy na probíhající změny (odpařování rozpouštědel, polymerace, oxidace nebo jiné chemické reakce). Ramanova spektrometrie Ramanova spektrometrie je perspektivní, nedestruktivní metodou umožňující analýzu in-situ. Nejčastěji je využívána pro identifikaci zakázaných drog, analýzu vláken, inkoustů, výbušnin, padělaných výrobků a peněz. Ramanova spektroskopie podobně jak infračervená spektrometrie (IČ) měří vibrační pohyby molekuly, observovaný fyzikální jev je však rozdílný. Ramanova spektrometrie měří rozptyl světla, zatímco IČ je založena na absorbci fotonů. Ramanovo spektrum je závislostí intenzity rozptýleného záření na Ramanově posunu ν (cm -1 ), což je rozdíl energie mezi laserovým paprskem a rozptýleným zářením. Intenzita Ramanových čar je dána změnami polarizovatelnosti molekuly během vibračního pohybu. Absorpční pásy mající vrcholy v intervalu cm -1, jsou vhodné pro identifikaci funkčních skupin (např. OH, C=O, N H, CH3 aj.). Pásy v oblasti cm -1 se nazývají oblastmi otisku palce (fingerprint region). Změřená Ramanova spektra neznámých vzorků jsou srovnávána s referenční knihovnou spekter, čímž se metodou otisku prstu identifikují neznámé molekuly. Pozorované typy čar v Ramanově spektru: Rayleighův čáry - když se molekula po interakci se zářením vrátí do stejného energetického stavu. Při přechodu z vyššího do nižšího energetického stavu dojde k vyzáření fotonu se stejnou vlnovou délkou, jako měl budící laser. anti-stokesovy čáry - v oblasti vyšších frekvencí. Pokud se elektron při přechodu dostane do nižší energetické hladiny, než ze které byl vybuzen, dojde k vyzáření fotonu s kratší vlnovou délkou. 18

20 Stokesovy čáry - u nižších frekvencí Ramanova spektra. Molekula po interakci se zářením se přenáší do vyššího energetického stavu. Elektron se po excitaci vrátí na vyšší energetickou hladinu, než ze které byl vybuzen, tak dojde k vyzáření fotonu s delší vlnovou délkou než má budící laser. Všechny typy čar jsou schematicky znázorněny na Obr. 1. Obr. 2 Schéma Ramanova spektrometru [5]. Častým problémem, který se vyskytuje při analýze inkoustů Ramanovou spektroskopií, je fluorescence. K eliminaci tohoto problému se využívá buď concave baseline correction nebo metoda povrchem zesíleného Ramanova rozptylu (SERS). SERS využívá skutečnost, že Ramanův signál z molekuly adsorbované na povrchu některých kovů (např. Ag, Au) může být výrazně silnější než Ramanův signál z té samé molekuly (může být řádově až ). Úkol: Porovnejte inkousty ze dvou částí dokumentů. Zjištěte zda byl dokument padělán. Obr.1. Ramanův rozptyl a Stokesovy a anti-stokesovy linie. Experimentalní uspořadaní Zdroj monochromatického záření z UV/VIS oblasti: rtuťová výbojka (dříve), lasery (plynové nebo pevnolátkové; oblast VIS nebo blízká IČ) Vzorek: plynný, kapalný, pevný Kyvety skleněné nebo nefluoreskující křemenné; vyhřívané, chlazené, rotující Rozpouštědla: vodná, organická se slabými Ramanovými pásy Detektory: dříve fotografická deska, dnes fotonásobič, event. diodové pole Pomůcky a chemikálie: Roztok Ag nanočástic o koncentraci 5M, pipety, kádinky, viálky na vzorky, propisky, nůžky Postup: 1. Proveďte odběr vzorků z dokumentu a z dostupného srovnávacího materiálu (různé propisky) 2. Proveďte extrakci do methanolu rozpusťte odebraný vzorek v 500 µl methanolu, umístěte do ultrazvukové lázně na 5 minut 3. Proveďte SERS experiment, z důvodu zesílení signálu a redukce možné fluorescence k 1 ml Ag nanočástic přidejte 10 µl roztoku NaCl a 10µl vzroku Podle pokynů vedoucího cvičení proveďte měření pomocí Ramanovy spektroskopie 4. Proveďte vyhodnocení spekter a srovnejte naměřená data Tabulka 2: Parametry měření pro Ramanovu spetrometrii Ramanův spektrometr (Nicolet) iraman Plus spektrometr Laser Nd:YAG (1064 nm) Laser 532 nm Rozsah vlnočtů cm -1 Rozsah vlnočtů cm -1 Rozlišení 4 cm -1 Rozlišení 4 cm -1 19

21 Doplňující otázky: 1. Které další analytické metody, by bylo možné použít pro analýzu inkoustů a barviv? 2. Navrhněte metodu pro odhalení padělání úředních razítek. Použitá literatura: 1. J. Straus, J. Suchánek, V. Porada Kriminalistické stopy obsahující informaci o vlastnostech vnitřní stavby (struktury) nebo vnitřního složení objektu, Soudní inženýrství ročník 15, I. Doležal: Svět tisku-padělání tiskovin. ( ). 3. S. Bell: Forensic Chemistry, Parentice Hall, P. Matějka: Ramanova spektroskopie v Návody pro laboratorní cvičení z analytické chemie III, (Matějka P. a kol.), VŠCHT Praha 2002, vydání první. 5. V. Milata a kol. Aplikovaná molekulová spektroskopia 1. vyd. Bratislava: Slovenská technická univerzita v Bratislavě s. 6. J.M. Chalmers, H.G.M. Edwards, M.D. Hargreaves, by John Wiley & Sons, Ltd., Infrared and Raman Spectroscopy in Forensic Science, chapter: A. Guedes, A.C. Prieto, Raman Spectroscopy for the Characterizations of Inks on Written documents. Příloha 1: Charakteristické vlnočty absorpce pro Ramanovu spektrometrii Převzato z P. Matějka: Ramanova spektroskopie v Návody pro laboratorní cvičení z analytické chemie III (Matějka P. a kol.) VŠCHT Praha 2002, vydání první. 20

22 21

23 22

24 23

25 Analýza skla

26 Analýza skleněných střepů Sklo se vyrábí z anorganických oxidů. Hlavní složkou je oxid křemičitý SiO2. Specifické vlasnosti skla závisí na obsahu a zastoupení oxidů ve směsi. Např. Na2O.CaO.SiO2 - sklo sodnovápenatokřemičité (typické složení % SiO2, % Na2O, % CaO a další minoritní příměsi) se převážně používá na výrobu lahví, sklenic, běžného stolního skla a k výrobě velkoformátového skla (sklenné tabule, vytríny,...). Pokud větší množství oxidu vápenatého nahradíme oxidem olovnatým, vznikne sklo známé jako křišťál (typické složení % SiO2, % PbO, % Na2O nebo K2O a další minoritní příměsi). Obsah PbO nad 24 % dává sklu vysokou hustotou a vyšší index lomu. Všude tam, kde je potřeba vysoká odolnost skla vůči teplotě, se používá sklo boro-silikatové (boritokřemičité), vyznačující se vysokou chemickou odolnosti a nízkým koeficientem teplotní roztažnosti. Jeho typické složení je: % SiO2, 8-13 % B2O3, 4-8 % Na2O nebo K2O a 2-7 % Al2O3. Pro speciální účely se používají skla fluoridová, fosforečná nebo chalkogenidová (tj. na bázi S-Se-Te) skla. Tabulka 1 prezentuje přehled sklářských surovin rozdělených podle jejich funkcí a chemického složení. Cílem forenzní analýzy skleněných střepů je rozpoznání původu skla, zda pochází z místa činu. Analýza skleněných střepů spočívá předvším v analýze fyzikálních a optických vlastností skla, jako jsou/je: barva, tloušťka, hustota či refrakční index (RI). Pokud obě sady skla ( z m í s t a č i n u a např. nalezené na oděvu podezřelého) mají totožnou hustotu a index lomu neznamená to, že mají stejný původ, proto se musí provést další zkoumání jako je chemická analýza. Jde zejmena o elementární analýzu, zjišťění přitomnosti určitých prvků a jejich množství ve zkoumaném vzorku. Nejčastěji použiváné metody jsou elektronová mikroanalýza (EPMA), elektronová mikroskopie (SEM), atomová emisní spektrometrie (AES), hmotnostní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem (ICP-MS) nebo rentgenfluorescenční spektroskopie (XRF). Níže je uvenedné typické schéma pro forenzní analýzu skla: Tabulka 1. Přehled sklářských surovin podle jejich funkcí a chemického složení. Sklotvorné suroviny Minerály, sloučeniny Horniny SiO2 křemen, živce, nefelin sklářský (křemenný) písek Al2O3 živce, nefelin, kryolit, hydroxid hlinitý kaolin, fenolit, pegmatity, aplity B2O3 P2O5 Stabilizátory borax, sassolin, kyselina boritá fosfáty-apatit, kostní moučka CaO kalcit, dolomit, fluorit vápenec, dolomit MgO dolomit, magnezit dolomit, magnezit PbO BaO ZnO Taviva oxidy Pb3O4, PbO, cerusit uhličitan nebo dusičnan barnatý zinková běloba Na2O soda, síran a dusičnan sodný, borax, fenolit a další horniny plagioklasty, nefelin, kryolit K2O potaš, ledek, draselné živce fenolit a další horniny Li2O sloučeniny Li Obr.1. Schéma pro forenzní analýzu skla [4]. 25

27 ICP-AES, ICP-MS, LA-ICP-MS ICP-MS je vysoce citlivá metoda umožňující rychlou elementární analýzu. Technika poskytuje nízké detekční limity (pg/ml) a možnost stanovení více než 70 izotopů. U ICP-MS můžeme rozlišit tří části: 1. mechanismus zavedení vzorku (podle typu vzorku: plyn, kapalina, vzorek v pevné fázi), 2. plasma a zdroj hmotnostní spektrometrie, 3. analyzátor a detektor (viz obr.1.). Vzorek zavedený do plasmatu je zplyněn a atomizován, vytvořené atomy jsou následně ionizované v plasmě a dále transportované do MS zdroje, kde jsou separovány na základě poměru hmotnosti iontů a jeho náboje (m/z). Hlavní výhodou ICP-AES je relativně nízká cena, šíroký lineární dynamický rozsah a jednoduchost ovládání. ICP-MS poskytuje oproti ICP-AES 10 až 100-krát lepší citlivost a informaci o izotopovém složení. Nevýhodou obou postupů je však ztráta vzorku. Řešením tohoto problému je využití laserové ablace (LA), u které je spotřeba vzorku zhruba 280 ng. Navíc tato metoda nevyžaduje žádné chemické úpravy vzorku, tj. použití směsi kyselin pro rozklad, a tím dochází k minimalizaci problému s tvořením oxidů a hydridů, které jsou zdrojem interferencí. Laserová ablace, LA Technika umožňuje generovaní aerosolu jak z vodivých (kovy a jejich slitiny) tak i z nevodivých materiálů (vzorky geologické, archeologické a biologické). Nevýhodou této metody je absence vhodných certifikovaných materiálů, nutných ke kvantifikaci analyzovaného prvku. Pro přímou analýzu pevných vzorků se používá laserová sonda ve spojení s ICP MS. Nejčastěji používané vlnové délky pro lasery (pevnolátkové nebo plynové) jsou 1064, 266, 213, 193 nm. Pevnolátkový nebo plynový pulsní laser je nejčastěji zdrojem záření (infračerveného nebo ultrafialového, λ = 1064, 266, 213 nebo 187 nm). Vzorek se umisťuje v ablační cele, na pohyblivém a ovladatelném stolku a je možné jej pozorovat pomocí mikroskopu či kamery. Průměr kráteru (viz obr.3) vzniklého působením laseru na povrch vzorku se většinou pohybuje od 5 do 100 µm, hloubka závisí na energii a době působení laseru. Odpařený materiál je stržen proudem plynného argonu, atomizován, ionizován a vzniklé ionty jsou třiděny v hmotnostním spektrometru a v detektoru jsou konvertované na elektrický impuls. Obr. 2. Schéma hmotnostního spektrometru s indukčně vázaným plazmatem. Příprava vzorku skla pro ICP-AES a ICP-MS Před přistoupením k analýze musíme vzorek skla umýt a vysušit. Pro analýzu pomocí ICP- A E S a ICP-MS potřebujeme vzorek skla zmineralizovat. Nejdříve rozdrtíme vzorek na mouku a zvážíme (pro AES potřebujeme zhruba 5 až 8 mg, a pro MS 2 mg vzorku). Následně vzorek skla rozložíme pomocí směsi kyselin (HF, HCl, HNO3) v ultrazvukové lázni a potom vysušíme při teplotě 80 ºC. Ve finále vzorek rozpouštíme v kyselině dusičné. Podrobný popis mužete najt v normě ČSN