Úvod k biochemickému praktiku. Petr Tůma

Rozměr: px

Začít zobrazení ze stránky:

Download "Úvod k biochemickému praktiku. Petr Tůma"

Michal Pospíšil
před 5 lety
Počet zobrazení:

1 Úvod k biochemickému praktiku Petr Tůma

2 Separační metody Chromatografie objev ruský botanik M.Cvět 90.léta 19.stol. skleněná kolona naplněná CaCO 3 izolace fotosyntetických barviv znovuobjevení Martin a Synge 1941 teoretické základy chromatografie (1952 Nobelova cena) rozdělení dle skupenství mobilní fáze kapalinová plynová rozdělení dle umístění stacionární fáze kolonová plošná tenkovrstvá rozdělení dle mechanismu separace

3 odezva detektoru Princip kapalinové chromatografie mobilní fáze stacionární fáze složky směsi chromatogram s píky

4 odezva detektoru, mau výška píku, mau Základní pojmy mobilní fáze stacionární fáze chromatografická vlna pík retenční čas kvalitativní ukazatel porovnání se standardy výška a plocha píku kvantitativní ukazatel kalibrační přímka šířka píku, min plocha píku, mau.min čas, min

5 Fyzikálně-chemické mechanismy separace adsorpce rozpouštění sítový efekt gelová chromatografie iontová výměna specifická interakceafinitní chromatografie

6 Blokové schéma HPLC zásobník mobilní fáze dávkovací ventil vysokotlaké čerpadlo kolona detektor

Planární chromatografie tenkovrstvá adsorpce papírová rozpouštění rychlá identifikace čistoty látek retardační faktor R R= b/a Vypočti hodnoty R pro azobenzen a

7 Planární chromatografie tenkovrstvá adsorpce papírová rozpouštění rychlá identifikace čistoty látek retardační faktor R R= b/a Vypočti hodnoty R pro azobenzen a dimethylžluť na tenké vrstvě silufolu. Po vyvinutí vrstvy byly naměřeny tyto vzdálenosti: 7,5cm pro azobenzen, 4,2 cm pro dimethylžluť. Rozpouštědlo (toluen) vystoupal 10 cm.

8 Schéma plynového chromatografu zdroj nosného plynu dávkovač detektor kapilární kolona řídící a vyhodnocovací zařízení termostatovaný prostor

9 Spektrofotometrické metody Charakteristiky elektromagnetického vlnění rychlost c, vakuum c= m/s, prostředí v=c/n frekvence f vlnová délka λ=c/f energie fotonu E= h f (h=6, J s) korpuskulárně-vlnový dualismus λ=h/m v

elektronové hladiny elektronové hladiny Výměna energie mezi hmotu a zářením ΔE = E kon - E poč = h f absorpce látka energii přijímá přechod do excitovaného stavu (10-7 -10-8 s) transmitance T, T=Φ/Φ

10 elektronové hladiny elektronové hladiny Výměna energie mezi hmotu a zářením ΔE = E kon - E poč = h f absorpce látka energii přijímá přechod do excitovaného stavu ( s) transmitance T, T=Φ/Φ 0 absorbance A, A= log Φ 0 /Φ = -log T Lambertův Beerův zákon A = ε L c emise látka převedena do excitovaného stavu dodáním energie např.zahřátím po krátké době spontánní emise fluorescence zakázaný přechod λ emitovaného záření je delší než λ absorbovaného absorpce emise

11 Schéma spektrofotometru zdroj záření monochromátor kyveta se vzorkem fotodioda zpracování signálu

12 Výpočty ve fotometrii Lambertův Beerův zákon transmitance (propustnost) T, T=Φ/Φ 0 absorbance A, A= log Φ 0 /Φ = -log T Lambertův Beerův zákon: A = ε L c srovnávací metoda A vzorku /A standardu =c vzorku /c standardu 1. Hodnota transmitance standardního roztoku glukózy (1g/L) byla 0,49. Transmitance roztoku séra je 0,55. Jaká je koncentrace glukózy v séru v mg/l a v mm? (Mr 180). 2. Standard pro stanovení proteinů má T=0,33 a vzorek séra T=0,44. Jaký je poměr koncentrace proteinů v séru a standardním roztoku.

13 3. Molární absorpční koeficient ATP je 19, L mol -1 cm -1 při vlnové délce 260nm. Jakou hodnotu A a T lze očekávat při fotometrickém měření M roztoku ATP v 1cm kyvetě? 4. Roztok lidského sérového albuminu o koncentraci 1,0mg/ml, který propouští v 1cm kyvetě 70% dopadajícího světla o vlnové délce 280nm, byl použit jako standard pro stanovení koncentrace neznámých bílkovin v roztoku. Vzorek neznámého roztoku bílkovin propouští v téže kyvetě při 280nm 50% světla. Jaká je koncentrace bílkovin ve studovaném vzorku? (1,94mg/ml)

14 Elektromagnetická záření využívaná v analytické chemii λ druh záření spektrální metoda interakce m radiové vlny NMR s magneticky orientovanými jádry μm IČ IČ spektrometrie s vibračními a rotačními stavy molekul nm VIS, UV UV, VIS spektrometrie <1nm RTG RTG spektrometrie s valenčními elektrony s vnitřními elektrony

15 Odměrná analýza, volumetrie Princip k roztoku analytu se přidává roztok činidla o známé koncentraci, které s analytem reaguje. Činidla se přidá takové množství, které je při reakci právě ekvivalentní množství analytu. Z objemu a koncentrace roztoku činidla se stanoví obsah analytu. Pro koncentrace analytu větší než 10-3 M. analyt + odměrný roztok produkty ekvivalenční bod analyt a činidlo ve stechiometrickém poměru subjektivní stanovení: vizuálně indikátory objektivní: potenciometricky, fotometricky titrační křivka grafické znázornění průběhu titrace logaritmické, lineární odměrný roztok (titrační činidlo) stálý roztok o přesně známé koncentraci faktor odměrného roztoku

16 Metody odměrné analýzy druhy titrací Neutralizační titrace H + + OH - H 2 O acidimetrie titrace odměrným roztokem kyseliny: HCl, H 2 SO 4, HNO 3 alkalimetrie titrace odměrným roztokem báze: NaOH, KOH, Ba(OH) 2 Srážecí titrace tvorba málo rozpustné soli: AgCl, BaSO 4 Ag + + Cl - AgCl (s) argentometrie - titrace AgNO 3 stanovení: Cl -, Br -,I -, CN - Komplexotvorné titrace tvorba málo disociovaného rozpustného komplexu chelatometrie titrace kyselinou ethylendiamintetraoctovou EDTA tvoří komplexy s dvoj-, troj- a čtyřmocnými ionty kovů stanovení Ca 2+, Mg 2+, Fe 3+, Zn 2+ Redoxní titrace založeny na přenosu elektronů oxidimetrie titrace oxidačním činidlem: např. KMnO 4 reduktometrie titrace redukčním činidlem: např.ticl 3

17 Titrační křivka titrace kyseliny silnou bazí

18 Výpočty v odměrné analýze Jaká je koncentrace HCl v žaludeční šťávě, když na titraci 10,0 ml vzorku bylo spotřebováno 6,5 ml 0,2M NaOH s faktorem 1,05? Jaká je koncentrace H 2 SO 4 ve vzorku, když na titraci 10mL vzorku bylo spotřebováno 20,6 ml 0,1M NaOH? Vzorek o neznámé koncentraci NaCl byl titrován odměrným roztokem AgNO 3 o koncentraci 0,05M. Jaká je koncentrace NaCl v neznámém vzorku, když na titraci 20,0 vzorku bylo spotřebováno 5,2ml titračního činidla? Koncentrace síranu železnatého ve vzorku byla stanovována manganometricky titrací 0,05M roztokem manganistanu draselného v kyselém prostředí. Jaká je koncentrace síranu železnatého ve vzorku, když na titraci 20,0ml vzorku bylo spotřebováno 12,2ml odměrného roztoku?

19 Redoxní rovnováha založena na přenosu elektronů oxidace odevzdávání e - Zn Zn e - redukce přijímání e - Cu e - Cu oxidačně-redukční reakce Zn + Cu 2+ Zn 2+ + Cu elektrodový potenciál E E 0 R T n F ln Ox Red

20 síla redukované formy redukčních účinků síla oxidované formy oxidačních účinků Standardní potenciály elektrod Elektroda Red/Ox n E 0, [V] K / K + 1-2,92 Na / Na + 1-2,71 Zn / Zn ,76 Pb / Pb ,13 H / H + 1 0,00 Cu / Cu ,34 Ag / Ag + 1 0,81 Cl 2 / Cl - 2 1,36 Mn 2+ / MnO ,52 F 2 / F - 2 2,85

21 Elektrochemické metody elektrochemický článek elektroda elektrodový potenciál Nernstova rovnice pro elektrodový potenciál E=E 0 +RT/nF ln c(ox) E=E 0 +0,059/n log c(ox) Petersova rovnice E=E 0 +0,059/n log c(ox)/c(red)

22 Elektrochemický článek standardní elektrodový potenciál

23 Typy elektrod Elektrody I.druhu kovové Ag elda pro Ag +, Cu elda pro Cu 2+ plynové vodíková, chlorová elda Elektrody II.druhu kov pokrytý vrstvou nerozpustné soli od kationtu kovu argentchloridová (Ag/AgCl), kalomelová (Hg/Hg 2 Cl 2 ) referentní Oxidačně redukční (redoxní) elektrody inertní kov Pt, Au nebo C měří aktivitu oxidované i redukované formy Petersova rovnice E=E 0 +0,059/n log c(ox)/c(red)

24 Vybrané typy elektrod Pt (Au) elektroda argentchloridová elektroda vodíková elektroda H 2 (1atm) Ag solný můstek AgCl Pt (Au) drátek solný můstek pevný KCl roztok kyseliny c=1m platinová čerň

25 Provedení potenciometrického měření voltmetr referentní elektroda indikační elektroda míchadlo magnetická míchačka

26 Praktické měření ph ph= -log c(h 3 O + ) skleněná elektroda membránový potenciál E=0,059 log c(h 3 O + ) ext /c(h 3 O + ) int E= konst - ph kalibrace 2 popřípadě 3 pufry Jaký je membránový potenciál buňky? Membránový potenciál buňky je určován koncentrací K + iontů vně a uvnitř buňky. V mezibuněčném prostoru je 0,01M a v cytoplasmě 0,4M. vnější referentní elektroda vnitřní referentní elektroda skleněná membrána

Podobné dokumenty

Úvod k biochemickému praktiku. Pavel Jirásek

Úvod k biochemickému praktiku. Pavel Jirásek Úvod k biochemickému praktiku Pavel Jirásek Úvodní informace 4 praktika B1 B2 B3 B4 4 týdny 8 pracovních stolů rozdělení kruhu do 8 pracovních skupin (v každé 2-3 studenti) Co s sebou na praktika plášť