Katalogové číslo: 4225 ( ) Souprava pro enzymové imunostanovení

Transkript

1 0318 HBc IgM Katalogové číslo: 4225 ( ) Souprava pro enzymové imunostanovení (96 testů) Kalibrační křivka Calibration Curve 6 ampulek obsahující 1,8 ml standardu derivovaných z plasmy pozitivních pacientů na HBcAb IgM, chemicky inaktivované, kalibrované podle Paul Erlich Institute (HBc-Referenzserum-IgM 84). Koncentrace: CAL1: 0 U/ml; CAL2: 5 U/ml; CAL3: 10 U/ml; CAL4: 20 U/ml; CAL5: 50 U/ml, CAL6: 100 U/ml. Obsahují 2% BSA, 100 mm Tris pufru ph 7.4±0.1 a 0.1% Kathon GC jako konzervant. Barevně kódováno modře. Připraveno k použití. Poznámka: I když je plasma chemicky inaktivována, zacházejte s ní jako s potenciálně infekční. ZKRÁCENÝ POSTUP 1. Napipetujte do jamek 100 μl kalibrátorů, kontrol a naředěných vzorků (sérum nebo plasma), vynechejte jednu jamku pro blank. 2. Inkubace 60 min při 37 C. 3. Promyjte 4-5x (350 μl). 4. Napipetujte 100 μl enzymového konjugátu. 5. Inkubujte 60 min při 37 C. 6. Promyjte 4-5x (350 μl). 7. Napipetujte 100 μl substrátu. 8. Inkubace 20 min při laboratorní teplotě (18-30 C). 9. Napipetujte 100 μl stop roztoku. 10. Odečtěte absorbanci při 450 nm a 620 nm. POUŽITÍ Capture ELISA metoda prokvatiativní a kvatitativní detekci IgM protilátek proti core antigenu hepatitidy B (HBcAb) v lidském séru nebo plasmě. Souprava může být použita pro screening krevních jednotek a další sledování HBV infikovaných pacientů. Použití pouze pro in vitro diagnostiku. SHRNUTÍ A VÝKLAD Virus hepatitidy B je celosvětově geograficky i populačně rozšířený DNA virus. Je jedním z 5 striktně hepatotropických virů společně s viry A, C, Delta a E. Tyto viry mohou způsobovat akutní onemocnění se symptomy řazenými mezi mírné symptomatické infekce až po prudké, velmi rychle vznikající a probíhající hepatitidy 1-3. Typickými symptomy je žlutnutí kůže a očí (žloutenka), tmavá moč, extrémní únava, nausea, zvracení, abdominální bolest 4. HBV může způsobit chronickou infekci, kdy se pacient nikdy nezbaví viru a po mnoha letech se může rozvinout cirhóza nebo karcinom jater 4, obzvlášť jestliže k infekci došlo v dětství 5,6. V tomto případě, infekce přetrvává více než 6 měsíců. Více než 90% infikovaných dospělých budou mít akutní spontánně mizející infekci 1. Infekce u mladých a dětí se nejpravděpodobněji vyvine v chronickou hepatitidu. U 90% kojenců infikovaných HBV infekcí v prvním roce života a 30-50% kojenců a dětí infikovaných do 4 let se vyvine chronická hepatitida a 25% těchto infikovaných zemřou na karcinom jater nebo cirhózu. HBV je nejzávažnější typ virové hepatitidy způsobující chronickou hepatitidu, pro kterou je k dispozici vakcína. V roce 1991 WHO navrhovala zvážit umístění vakcinace proti hepatitidě B do národních programů imunizace. Terapie je založena na alfa-interferonu, který ulehčuje od symptomů 5-6. Odpověď organismu na tuto léčbu je u 40-50% pacientů s aktivní chronickou HBV infekcí 5-6. U chronické HBV není důkaz o jaterním poškození 1,2, infekce přetrvává a pacient zůstává infekční. Přenos onemocnění může probíhat krevní cestou nebo krevními deriváty, sexuálním přenosem, z matky na plod při porodu, injekční jehlou nebo transfúzí 4. Virus se nepřenáší kontaminovanými potravinami ani vodou 4. Vysoká prevalence HBV je v jižní, východní a střední Evropě. Nízká prevalence (5%) je na Středním a Dálném východě a méně než 1% v západní Evropě a Severní Americe 4. U HBV infekce můžeme pozorovat tři fáze onemocnění na základě serologických testů: inkubace, akutní fáze a léčba. Prvním markerem onemocnění je přítomnost povrchového antigenu (HBsAg), který je možný detekovat v séru 4-12 týdnů po infekci před nástupem symptomů 1,2,5. HBcAg je hlavní komponentou jádra viru HBV. Partikule mají velikost 27 nm a obsahují kružnicovou dvoušroubovici, specifickou DNA-polymerázu a HBcAg. HBcAg se skládá 17 kd polypeptidu uvolněného při degradaci jádra; antigen obsahuje alespoň jednu imunologickou determinantu. Při primární infekci jsou anti-hbcag IgM protilátky jedny z prvních ukazatelů HBV hepatitidy, které se v séru pacienta objevují, objevují se o něco pozdě než HBsAg. Vysoké titry HBcAb IgM jsou při akutní infekci, v průběhu onemocnění klesají a objevují se IgG protilátky.u pacientů v rekonvalescenci jsou tyto protilátky téměř nedetekovatelné. U chronicky nemocných pacientů zvýšení HBc IgM naznačuje reaktivaci onemocnění. Stanovení HBcAb společně s detekcí dalších markerů HBV infekce v séru nebo plasmě, je důležitým markerem pro klasifikaci virového agens. PRINCIP STANOVENÍ Metoda je založena na principu IgM capture. IgM protilátky přítomné ve vzorku jsou zachyceny na pevné fázi, která je koutována protilátkou proti lidské IgM. Po odmytí ostatních komponent vzorku a partikulí IgM protilátek je přidán k IgM vázaných na pevné fázi purifikovaný rekombinační HBcAg vázaný s křenovou peroxidázou. Po inkubaci se nenavázaný konjugát odstraní promytím a přidá se substrát. Barevná intenzita je úměrná množství IgM protilátek ve vzorku. REAGENCIE Reagencie dostačují na 96 stanovení. Před použitím reagencie vytemperujte na laboratorní teplotu. Antigenem potažené jamky (mikrotitrační destička) Antigen Coated Wells 12x8 lámajících stripů mikrotitrační destičky koutovaných purifikovaným antihuman IgM specifickou protilátkou, zatavená v obalu se sušidlem. Kontrolní sérum Control Serum Jedna ampulka obsahující lyofilizovanou reagencii. Rekonstituujte EIA vodou objemem uvedeným na štítku. Obsahuje 4% bovinních sérových proteinů, protilátky HBc IgM v koncentraci 20 PEI U/ml ±10%, 0.1% Kathon GC a 0,2 mg/ml gentamycin sulfátu jako konzervant. Připraveno k použití. Barevně kódováno zeleně. Poznámka: I když je plasma chemicky inaktivována, zacházejte s ní jako s potenciálně infekční. Poznámka: Objem potřebný k rozpuštění reagencie se může měnit podle šarže, prosím dodržujte vždy přesný objem uvedený na štítku. Promývací roztok (20x) Wash buffer 60 ml 20x koncentrovaného roztoku. Ředěný roztok obsahuje 10 mm fosfátový pufr ph7,0 ± 0,2, 0,5% Tween 20 a 0,1% kathon GC. Konjugát Enzyme Conjugate Jedna lahvička obsahující 16 ml červeně zbarveného roztoku myší monoklonální protilátky proti HBcAg vázané s křenovou peroxidázou (HRP) v MOPS pufru ph 6,2-6,7. Připraveno k použití. Obsahuje hovězí protein s 0.02% methylisothiazolone a bromonitrodioxane, 20 ppm Proclin 300. Substrát Chromogen Substrate Jedna lahvička obsahující 20 ml 50 mm roztoku citrát-fosfátového pufru Připraveno k použití. ph 3,5-3,8, 4% dimethylsulfoxid, 0,03% tetrametylbenzidin (TBM), a 0,02% peroxid vodíku. Poznámka: Chraňte před světlem. Ředící roztok Sample Diluent Jedna lahvička obsahující 60 ml 100 mm tris pufrovaného roztoku ph 7,4±0,1, 0,5% Tween 20, 2% kasein, 0,1% kathon GC, 0,9% azid sodný jako konzervační prostředek. Barevně kódováno modře. Stop roztok Stop Solution Jedna lahvička obsahující 20 ml 0,3 M kyseliny sírové. Připraveno k použití. Adhezivní fólie DALŠÍ POTŘEBNÝ MATERIÁL Inkubátor na 37 C. Reader (vlnová délka 450 nm nebo 450/620 nm). Promývačka na mikrotitrační destičky. EIA voda (dvojitě destilovaná nebo deionizovaná voda, s použitím uhlí jako desinfekčního prostředku a pro odstranění oxidačních chemikálií. Stopky. Buničina. Vortex. Běžné laboratorní skleněné nádobí: odměrné válce, zkumavky atd. Mikropipety pro přesné dávkování 5 až 150 μl roztoku a jednorázové plastikové špičky. SKLADOVÁNÍ A STABILITA REAGENCIÍ Reagencie musí být skladovány při 2-8 C. Datum expirace je uvedeno na každé komponentě a na štítku na krabičce. Po otevření (a přípravě) mají reagencie omezenou stabilitu. Mikrotitrační destička: Mikrotitrační destičky vytemperujte před použitím na laboratorní teplotu (cca hodinu před použitím) Nepoužité stripy vraťte zpět do obalu a ten vložte polyetylenového sáčku s vysoušedlem, zabraňte přístupu vzduchu. Kalibrační křivka: připravena k použití. Před použitím promíchejte na vortexu. Kontrolní sérum: rozpusťte lyofilizovaný prášek EIA vodou objemem uvedeným na štítku. Nechte rozpustit a řádně promíchejte na vortexu. Poznámka: Roztok není stabilní. Kontrolní sérum skladujte v alikvotech zamrazené při -20 C. Koncentrát promývacího roztoku: Nařeďte koncentrát EIA vodou na konečný objem 1200 ml a promíchejte. Zamezte tvorbě bublinek, mohlo by dojít k nedostatečnému promytí. Poznámka: Naředěný promývací roztok je stabilní 1 týden při teplotě 2-8 C. Enzymový konjugát: Připraveno k použití. Před použitím promíchejte na vortexu. Zabraňte kontaminaci oxidačními chemikáliemi, prachem nebo mikroorganismy. Nevystavujte slunečnímu záření, oxidačními agens a kovy. Pokud reagencii přeléváte, použijte plastové pokud možno sterilní jednorázové nádobky. Diluent vzorku: Připraveno k použití. Před použitím promíchejte na vortexu. Reagencii otevřete těsně před použitím, je náchylná k oxidaci. Substrát: Připraveno k použití. Před použitím promíchejte na vortexu. Zabraňte kontaminaci oxidanty, chemikáliemi, prachem nebo mikroby. Chraňte před světlem, oxidačními činidly a kovovými povrchy. Pokud reagencii přeléváte, použijte plastové pokud možno sterilní jednorázové nádobky. Stop roztok: Připraveno k použití. Před použitím promíchejte na vortexu.

2 VAROVÁNÍ A BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ Použití pro in vitro diagnostiku. 1. Souprava může být použita pouze řádně proškoleným personálem, pod lékařským dohledem zodpovědným za laboratoř. 2. Personál provádějící tuto analýzu musí používat ochranné pomůcky: plášť rukavice, brýle. Personál by měl být školený v biologických procedurách, jak je doporučeno Centrem pro kontrolu nemocí v Atlantě a národní instituci pro zdraví: Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, ed Personál, který přichází do styku se vzorky, by měl projít bezpečnou a efektivní vakcinací pro HBV, HAV. 4. Laboratoř by měla být zabezpečena tak, aby se zabránilo vstupu kontaminujícím látkám jako je prach nebo mikrobiální agens do ampulek a mikrotitrační destičky a při manipulaci s nimi. Substrát (TBM) chraňte před světlem. Zabraňte pohybu povrchu stolu, kde se test provádí. 5. Soupravu skladujte v chladničce při teplotě 2-8 C. 6. Nezaměňujte komponenty různých šarží. 7. Zkontrolujte, zda jsou reagencie čiré bez viditelných částic nebo zákalu. 8. Vyhněte se kontaminaci mezi vzorky použitím jednorázových špiček a jejich výměny mezi jednotlivými vzorky. 9. Vyhněte se kontaminaci mezi reagenciemi použitím jednorázových špiček a jejich výměny mezi jednotlivými reagenciemi. 10. Nepoužívejte soupravu po uplynutí doby expirace. 6x otevřená souprava nevykazuje významnou ztrátu aktivity až do 3 měsíců po otevření. 11. Se všemi vzorky zacházejte jako s potenciálně infekčními. 12. Pro přípravu a použití kapalných komponent používejte plastové nástroje. 13. Odpad vzniklý použitím soupravy musí být likvidován v souladu s národními předpisy a zákony vztahujícími se k laboratornímu chemickému odpadu, zvláště tekutý odpad z promývacích kroků, rezidua kontrol a vzorků považujte za potenciálně infekční materiál. Navrhovaný proces inaktivace a ošetření infekčního matriálu je 10% Savo po dobu hodin, nebo 20 min autoklávování při 121 C. 14. Náhodně rozlité vzorky musí být otřeny papírovými utěrkami namočenými do desinfekce a poté utřeny vodou. Utěrky by pak měly být likvidovány jako laboratorní/nemocniční odpad. 15. Další odpadové materiály vygenerované při analýze např.: špičky, kontroly, mikrotitrační destička by měli být likvidovány jako potenciálně infekční matriál podle příslušných národních zákonů a směrnic týkajících se laboratorního odpadu. 16. Pipety musí být kalibrovány pro dávkování správných objemů požadovaných pro analýzu. Měli by být pravidelně kontrolovány, aby udržovaly přesnost do 1%. Komponenty pipety, které mohou dojít do náhodného kontaktu se vzorkem nebo komponentami soupravy se musí pravidelně dekontaminovat (70% ethanol, 10% roztok desinfekce). 17. ELISA inkubátor musí být nastavený na +37 C+/- 1 C a pravidelně kontrolovaný zda udržuje teplotu. Pro inkubaci je vhodný suchý inkubátor i vodní lázeň za předpokladu, že je validován pro inkubaci ELISA testů. 18. Promývačka ELISA destiček je velmi důležitá. Promývačka musí být validovaná a správně nastavená pro tuto soupravu. Obvykle 4-5 promývacích cyklů (aspirace a dispenzace 350 μl promývacího roztoku do každé jamky na jeden cyklus. Promývací roztok by měl v jamce zůstat sec. Je doporučeno, aby v každém běhu byly stanoveny negativní a pozitivní referenční vzorky. 19. Inkubační časy mají toleranci +/- 5%. 20. Reader musí být vybaven filtry 450 a nm. Rozsah absorbance by měl být 0 až >2,0; linearita do >2,0 a opakovatelnost >1%. Pro správné určení optických hustot je zapotřebí aby byl reader pravidelně kalibrovaný. Kontrola readeru by měla být uvedena výrobcem v manuálu. 21. Jestliže použijete ELISA automat, musí být zabezpečeny přesně všechny kritické kroky (inkubace, promytí, míchání, třepání, zpracování dat atd). V protokolu musí být jednotky a pracovní postup, zvláště pozornost se musí věnovat krokům pro dávkování vzorků a promývání, musí být zabráněno kontaminaci vzorků mezi jednotlivými jamkami. Použití ELISA automatu je doporučeno pro screening kde je počet pacientů na jeden běh V případě použití automatu musíte reagencie převést do jiných nádob, přelepujte štítky z originální ampulky. Tato operace je nutná, aby se zabránilo záměně reagencií. Po skončení testu, uchovávejte přelité reagencie při 2-8 C. ODBĚR VZORKU 1. Vzorek je plasma nebo sérum odebrané standardním způsobem ze žíly, se kterým se zachází podle zásad správné laboratorní praxe. Nebyl pozorován vliv citrátu, EDTA, heparinu. 2. Zabraňte přidání konzervačních činidel ke vzorkům, obzvláště azidu sodného, tato chemikálie může ovlivnit enzymovou aktivitu konjugátu. 3. Vzorky musí být jasně identifikovány a popsány aby nedošlo ke špatné interpretaci výsledků. U souprava pro screening krevních jednotek by se měly používat čárové kódy. 4. Hemolytické a lipemické vzorky musí být z testu vyřazeny, protože mohou generovat falešné výsledky. Vzorky obsahující zbytky fibrinu, nebo mikrobiální filamenta a těla musí být také vyřazeny, protože mohou dávat falešné výsledky. 5. Sérum a plasmu lze skladovat při 2-8 C po dobu 5 dnů, zamražené při -20 C po dobu delší. Vyhněte se opakovanému zamrazovaní-rozmrazování vzorku. 6. Jestliže jsou ve vzorku shluky, přefiltrujte vzorek pomocí filtru s 0,2-0,8 μl póry. PRACOVNÍ POSTUP PŘED ANALÝZOU 1. Zkontrolujte datum expirace na štítku na obalu soupravy. Nepoužívejte proexpirované soupravy. 2. Zkontrolujte kapalné komponenty soupravy, zda nejsou kontaminované viditelné částečky nebo agregáty. Zkontrolujte substrát, zda je bezbarvý nebo bledě modrý, aspirujte malý objem sterilní průhlednou pipetou. Zkontrolujte, zda nedošlo k vylití kapalin, přítomnost kapalin na obalu soupravy. Zkontrolujte, zda není poškozen hliníkový kryt na mikrotitrační destičce. 3. Připravte si promývací roztok, 20x nařeďte koncentrát, jak je popsáno výše. 4. Rekonstituujte kalibrátor, jak je popsáno výše. 5. Všechny ostatní komponenty vytemperujte na laboratorní teplotu a před použitím promíchejte. 6. Předehřejte si inkubátor na 37 C a připravte promývačku podle instrukcí výrobce. Nastavte správný počet promývacích cyklů. 7. Zkontrolujte ELISA reader, aby byl zapnutý alespoň 20 min před použitím. 8. Jestliže používáte ELISA automat, vyberte správný protokol metody. 9. Nastavte si pipety na požadované objemy. 10. Zkontrolujte, zda máte připraveno vše potřebné pro provedení analýzy. 11. V případě problému nepokračujte v analýze, ale poraďte se supervizorem. PRACOVNÍ POSTUP Metoda musí být provedena podle následujícího protokolu, dodržujte pro všechny vzorky správnou inkubační dobu. Oba postupy mohou být zpracovány na automatu podle požadavku lékaře. Kvantitativní analýza 1. Připravte si potřebný počet stripů. 2. Vzorky nařeďte diluentem vzorku 1:101 (1ml diluentu + 10 µl vzorku). Promíchejte. Kalibrátory a rozpuštěné kontrolní sérum se neředí. 3. Vynechejte jamku A1 a B1 prázdnou pro blank. 4. Napipetujte 100 µl kalibrátorů a kontrol v duplikátu, poté napipetujte 100 µl vzorků. Kontrolní séra se používají ke kontrole, že analytický sytém pracuje korektně. Zkontrolujte, zda kalibrátory, kontroly a vzorky byly přidány korektně. 5. Inkubujte 60 min při 37 C 6. Promyjte mikrotitrační destičku jak je popsáno v sekci VAROVÁNÍ A BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ 7. Do všech jamek s výjimkou jamky A1 a B1 napipetujte 100 µl konjugátu. Zkontrolujte, zda byla reagencie přidána korektně. Inkubujte 60 min při 37 C. 8. Promyjte mikrotitrační destičku jak je popsáno. 9. Napipetujte 100 µl TMB/H 2 O 2 do všech jamek i pro blank. Zkontrolujte, zda byla reagencie korektně přidána. Inkubujte 20 min při laboratorní teplotě. 10. Enzymatickou reakci zastavíte napipetováním 100 µl kyseliny sírové do všech jamek. Pipetujte se stejnou frekvencí jako v bodu 6. Poté změřte barevnou reakci na readeru při 450 nm, popř. i při nm proti blanku v jamkách A1 a B1. Schéma pro pipetování kvantitativní analýzy Kvalitativní analýza 1. Připravte si potřebný počet stripů. 2. Vzorky nařeďte diluentem vzorku 1:101 (1ml diluentu + 10 µl vzorku). Promíchejte. Kalibrátory a rozpuštěné kontrolní sérum se neředí. 3. Vynechejte jamku A1 prázdnou pro blank. 4. Napipetujte 100 µl kalibrátoru CAL1 0 U/ml v duplikátu, 100 μl CAL3 10 U/ml v duplikátu a 100 μl CAL6 100 U/ml v singletu. Poté napipetujte100 μl ředěných vzorků. Zkontrolujte, zda byly kalibrátory a vzorky přidány správně. 5. Inkubujte 60 min při 37 C. 6. Promyjte mikrotitrační destičku jak je popsáno v sekci VAROVÁNÍ A BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ 7. Do všech jamek s výjimkou jamky A1 napipetujte 100 µl konjugátu. Zkontrolujte, zda byla reagencie přidána správně. Inkubujte 60 min při 37 C. 8. Promyjte mikrotitrační destičku jak je popsáno. 9. Napipetujte 100 µl TMB/H 2 O 2 do všech jamek i pro blank. Zkontrolujte, zda byla reagencie korektně přidána. Inkubujte 20 min při laboratorní teplotě. 10. Enzymatickou reakci zastavíte napipetováním 100 µl kyseliny sírové do všech jamek. Pipetujte se stejnou frekvencí jako v bodu 6. Poté změřte barevnou reakci na readeru při 450 nm, popř. i při nm proti blanku v jamce A1. Schéma pro pipetování kvalitativní analýzy DŮLEŽITÉ POZNÁMKY 1. Stripy překrývejte adhezivní fólií pouze při manuálním zpracování, při zpracování na automatu stripy nezakrývejte. 2. Dejte pozor, aby jste se při pipetování konjugátu nedotýkali vnitřních částí

3 jamek. Mohlo by dojít ke kontaminaci. 3. Nevystavujte silnému slunečnímu světlu. 4. Jestliže při měření nemáte k dispozici sekundární filtr, zabraňte otiskům prstů na dně mikrotitrační destičky při měření při 450 nm. Otisky prstů mohou způsobit falešně pozitivní výsledky. 5. Měření výsledků by mělo být provedeno ihned po přidání stop roztoku, nejpozději do 20 min po přidání. Oxidace chromogenu může způsobit vyšší pozadí. Příklad kalibrační křivky: KONTROLA KVALITY Validace testu se provádí mocí kontrol s cílem ověření očekávaných hodnot při 450 nm nebo zda vzorku / kontroly jsou sladěny s analýzou. Kontrola Absorbance Blank < 0,100 Kalibrátor 1 0PEI U/ml < 0,150 proti blanku, CV < 30% Kalibrátor 2 5 PEI U/ml OD CAL2> OD CAL1 + 5SD OD CAL2>OD CAL1 + 0,100 Kalibrátor 3 10 PEI U/ml OD CAL3 > OD CAL1 + 0,200 Kalibrátor PEI U/ml OD CAL6 > 1,000 Kontrolní sérum OD kontroly = OD CAL4 ± 10% Jestliže výsledky splňují požadavky pro kontrolu kvality, můžete pokračovat další částí. ŘEŠENÍ PROBLÉMŮ Jestliže není dosaženo očekávaných výsledku zkontrolujte následující: Problém Absorbance blanku > 0,100 Kalibrátor 1 > 0,150; CV > 30% Kalibrátor 2 OD CAL2<OD CAL1 + SD OD CAL2<OD CAL1 + 0,100 Kalibrátor 3 OD CAL3 < OD CAL1 + 0,200 Kalibrátor 6 OD CAL6 < 1,000 Kontrolní sérum Rozdílné od CAL4; 20 U/ml Možná chyba Kontaminovaný substrát 1. Nedostatečné promytí 2. Nedostatečně připravená promývačka 3. Chyba v postupu metody, napipetování pozitivní kontroly namísto negativní 4. Kontaminace kontroly, vzorku, nebo konjugátu 5. Kontaminovaná pipeta, nebo jehly promývačky vzorky nebo konjugátem 6. Jehly promývačky jsou ucpané 4. Došlo ke kontaminaci kalibrátoru Došlo ke kontaminaci kalibrátoru 4. Došlo ke kontaminaci kalibrátoru 4. Došlo ke kontaminaci Pokud došlo k některému z výše uvedených problémů, oznamte tento problém vedoucímu laboratoře a dohodněte se na dalším postupu. VÝSLEDKY Kvantitativní metoda Jestliže je test validní sestrojte kalibrační křivku z hodnot kalibrátorů měřených při 450 nm (je doporučena 4-parametrická). Pomocí kalibrační křivky vypočítejte koncentrace anti-hbsab ve vzorcích. Důležitá poznámka: Tuto znázorněnou kalibrační křivku nepoužívejte k výpočtu. Kvalitativní metody Vypočítejte průměrné pro kalibrátory 1 a 3 (10 U/ml), zkontrolujte zda jsou validní. Příklad výpočtu: Následující data nesmí být použity pro reálný výpočet uživatele. Calibrator 1 (0 U/ml): Mean Value: Lower than OD450nm OD450nm Accepted Calibrator 3 (10 U/ml): OD450nm Mean Value: OD450nm Higher than Cal Accepted Calibrator 6 (100 U/ml) OD450nm Higher than Accepted INTERPRETACE VÝSLEDKŮ Kvalitativní výsledky Vzorky s koncentrací nižší než 10 PEI U/ml jsou považovány za negativní na IgM protilátky HBc protilátky ve většině mezinárodní lékařské literatury. Výsledky jsou interpretovány jako poměr OD vzorku při 450 nm a CAL3 nebo (S/Co), jak je uvedeno v následující tabulce: S/Co Interpretace < 0,9 Negativní 0,9-1,1 Hraniční > 1,1 Pozitivní Kvantitativní výsledky Odečtěte z kalibrační křivky koncentraci protilátek HBc IgM ve vzorku. Vzorky s koncentrací nižší než 5 PEI U/ml jsou považovány za negativní. Vzorky s koncentrací protilátek mezi 5-10 PEI U/ml jsou hraniční. Vzorky s koncentrací vyšší než 10 PEI U/ml jsou považovány za pozitivní. Důležité poznámky: 1. Jestliže pro stanovení používáte ELISA automat, nebo ELISA promývačku, zajistěte jejich správný chod. 2. Interpretace výsledků by měla být pod dohledem laboratorního supervizora, aby se snížilo riziko nesprávných výsledků. 3. Pozitivní výsledek ukazuje na HBV infekci a podle toho by mělo být s pacientem zacházeno. 4. Jestliže jsou výsledky předávány do jiné laboratoře nebo lékaři, zabraňte chybnému přenosu dat. 5. Diagnóza virové hepatitidy může být pacientovi sdělena pouze kvalifikovaným lékařem. FUNKČNÍ CHARAKTERISTIKY Vyhodnocení výkonnostních charakteristik bylo stanoveno podle běžných technických návodů nebo CTS (směrnice o IVD 98/79/EC kapitola 3). Limit detekce Limit detekce byl vypočítán pomocí: 1. Anti-HBc IgM Reference Preparation dodavatel Paul Erlich Institute, Germany (HBc-Referenzserum-IgM 84), na který byla klibrační křivka kalibrována. 2. Accurun 113 (cat. N A ) dodavatel Boston Biomedica Inc., USA

4 Výsledky kontrol kvality jsou uvedeny v následujících tabulkách. HBcAB IgM Lot 0103 Lot 0103/2 LOT 0303 PEI U/ml OD450nm S/Co OD450nm S/Co OD450nm S/Co , negativní 0,040 0,035 0,044 BBI Accurun 113 lot HBcAB IgM Lot 0103 Lot 0103/2 LOT 0303 BBI 113 OD450nm S/Co OD450nm S/Co OD450nm S/Co 1 x S/Co S/Co S/Co 2 x x x x x x x negative 0,040 0,040 0,052 BBI panel PHE 102 byl testován třemi různými šaržemi a komerčně dostupnou Evropskou soupravou. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce: BBI panel kód PHE102 Lot 0103 Lot 0103/2 Lot 0303 Sorin EIA Číslo S/Co S/Co S/Co S/Co Diagnostická senzitivita Je definována jako pravděpodobnost, s jakou bude test pozitivní při přítomnosti příslušného analytu. Diagnostická senzitivita byla testována interně i externě v kvalifikované klinické laboratoři na panelu vzorků kvalifikovaných US FDA jako pozitivní. Pozitivní vzorky byly od pacientů s různou patologií HBV (akutní, chronická). Hodnocení bylo provedeno testováním více než 200 vzorků. Nalezena byla > 98%. Panel serokonverze od dodavatele BBI, USA kód PHM 935A, výsledky ve srovnání s dvěma komerčními soupravami jsou uvedeny níže: Lot 0103 Abbott EIA DiaSorin EIA Číslo S/Co S/Co S/Co > > > > > 12 > > 12 > Diagnostická specificita Je definována jako pravděpodobnost, s jakou bude test negativní při nepřítomnosti specifického analytu. Diagnostická senzitivta byla testována interně i externě v kvalifikované klinické laboratoři na panelu vozku kvalifikovaných US FDA jako negativní. Bylo testováno více než 400 negativních vzorků interně i externě. Diagnostická specificita této soupravy je > 98%. Diagnostická specificita byla stanovena testováním 50 vzorků, které obsahovaly potenciální interferenty (jiné infekční onemocnění, jiné jaterní onemocnění, dialyzovaní pacienti, těhotné ženy, hemolýza, lipémie). Nebyla pozorována žádná interference. Byly testovány zmrazené vzorky. Nebyla pozorována žádná interference. Přesnost získané ze tří vzorků v 16 replikátech v třech oddělených bězích jsou uvedeny níže: HBcAb IgM: Lot 0103 OD450nm Std.Deviation CV % Kalibrátor 5 U/ml (n=16) OD450nm Std.Deviation CV % OD450nm Std.Deviation CV % HBcAb IgM Lot 0103/2 OD450nm Std.Deviation CV %

5 Kalibrátor 5 U/ml (n=16) OD450nm Std.Deviation CV % OD450nm Std.Deviation CV % HBcAb IgM Lot 0303 OD450nm Std.Deviation CV % Kalibrátor 5 U/ml (n=16) OD450nm Std.Deviation CV % OD450nm Std.Deviation CV % Variabilitu hodnot v tabulce nezpůsobilo nesprávné zařazení v tabulce. OMEZENÍ Bakteriální kontaminace nebo tepelná inaktivace může mít vliv na výsledek testu. Diagnóza infekčního onemocnění by neměla být založena na výsledku jednoho testu. LITERATURA 1. Loccarini SA, Gust ID. Hepadnaviridae: hepatitis B virus and the delta virus. In: Balows A et al. editors. Laboratory diagnosis of in-fectious diseases: principles and practices. New York Springer-Vertag, 1988: Follett EAC. Diagnosis of hepatitis B infection. In Young H, McMil-lan A, editors. Immunological diagnosis of sexually transmitted diseases. New York: Marcel Dekker, 1988: Hollinger FB, Dienstag JL. Hepatitis B and D viruses. In: Lennette EH et al. editors. Manual of clinical microbiology; 6th ed. Wash-ington D.C.: American Society for Microbiology, 1995: World Health Organization (WHO) documents. 5. Nowicki MJ, Balistreri WF. Hepatitis A to E: building up the alpha-bet. Contemporary Peds 1992: Zuckerman AJ et al. Hepatitis B virus and hepatitis D virus. In: Principles and practice of clinical virology. 2nd ed. New York: John Wley & Sons, 1992: Perillo RP,Aach RD. The clinical course and chronic sequelae of hepatitis B virus infection. Semin. Liver Dis. 1981; 1: Datum poslední revize: