LABOSERV s.r.o., Hudcova 532/78b, Brno, Návod k ELISA soupravě. hcomp Kat. č. COMP 200

Transkript

1 Wielisa Návod k ELISA soupravě hcomp Kat. č. COMP 200 ELIS A souprava pro stanovení lidského COMP (oligomerní bílkovina z matrice chrupavky) Mikrotitrační proužky (12x8) 96 jamek Skladovat při teplotě +2 8 C Jen pro výzkumné účely Poštovní adresa Ulice Tel. Internet Wieslab Sölvegatan IDEON Research Park Lund Fax S Lund Švédsko wieslab@wieslab.se Švédsko Verze: Ver , rev.13/07 MS Strana 1 z 6

2 Předpokládané použití Souprava Wielisa COMP je enzymatický imunologický test pro kvantitativní stanovení neporušené nebo fragmentované lidské oligomerní bílkoviny z matric chrupavky (COMP) v séru nebo synoviální tekutině. Test slouží jako indikátor přeměny COMP. Analýzu by měli provádět proškolení laboratorní odborníci. Jen pro výzkumné účely. Souhrn a vysvětlení COMP je vícenásobně přikládaná bílkovina s vysokou molekulární hmotností, původně izolovaná z chrupavky (Hedbom et al., 1992; Mörgelin et al., 1992). Tato bílkovina se v chrupavce vyskytuje v hojném množství, ale nachází se i ve šlachách a jiných tkáních (DiCesare et al., 1994). Tato bílkovina patří do skupiny thrombospondinu (Oldberg et al., 1992). Ukázalo se, že měření neporušené bílkoviny COMP a jejích fragmentů v synoviální tekutině nebo séru koreluje s poškozením chrupavky ve studiích pacientů s revmatoidní artritidou a osteoartritidou (Månsson et al., 1995; Saxne and Heinegård, 1992; Sharif et al., 1995). V synoviální tekutině se COMP do jisté míry vyskytuje jako zjevně nepoškozená bílkovina, ale většinou se nachází jako několik různých fragmentů (Neidhart et al., 1997). V séru se vyskytují fragmenty kda. Přesná povaha těchto fragmentů není známa. Princip testu Wielisa COMP Test využívá přirozenou lidskou COMP chrupavky kloubní, kterou se potáhnout 96miskové mikrotitrační destičky a králičí polyklonální antisérum proti lidskému COMP. Je ve standardním inhibičním formátu ELISA s krokem předinkubace přes noc se vzorkem a primárním antisérem. Po předinkubaci přes noc se roztok přenese na destičku potaženou COMP. Vázaná protilátka se stanovuje pomocí králičího anti-lidského konjugátu IgG označeného alkalickou fosfatázou. Varování a bezpečnostní pokyny - Složky lidského séra používané při přípravě kontrol a kalibrační přípravky v sadě byly testovány na přítomnost protilátek proti viru selhání lidské imunity 1 a 2 (HIV 1 a 2), žloutence typu C (HCV) a povrchovému antigenu žloutenky typu B pomocí metod schválených FDA a byly shledány negativní. Protože žádná zkušební metoda nemůže nabídnout úplné ujištění o nepřítomnosti virů HIV, HCV, žloutenky typu B nebo jiných infekčních činitelích, je nutno se vzorky a reagenciemi na lidské bázi nakládat tak, jako by byly infekční. - Centra pro kontrolu a prevenci nemocí a národní instituty zdraví doporučily, aby se s potenciálně infekčními činiteli nakládalo na úrovni biologické bezpečnosti 2. - Všechny roztoky obsahují jako konzervační látku ProClin 300. Nikdy nepipetujte ústy a zabraňte styku reagencií nebo vzorku pacienta s kůží. Reagencie obsahující ProClin mohou být dráždivé. Zabraňte styku s kůží a očima. V případě styku místo oplachujte velkým množstvím vody. - Koncentrace COMP v daném vzorku stanovené testy od různých výrobců se může kvůli rozdílům v metodách testování a specifičnosti reagencie lišit. Obsah soupravy a skladování reagencií - Jeden rámeček s 12 stripy (8 jamek) potaženými COMP a jedno víčko zabalené ve fólii s vysoušedlem. - Šest kalibračních roztoků 600 µl/každý, (10, 20, 30, 40, 60, 80 ng/ml), obsahujících COMP v ředicím roztoku, které postačují pro čtyři křivky kalibračního přípravku. - Dvě předředěná kontrolní séra (C1 a C2), každé o objemu 600 µl. - 2 x 32 ml ředicí roztok, tj. vzorkový ředicí pufr (červená barva). - 7 ml anti-comp reagencie pro předinkubaci (červená barva) ml konjugátový pufr s konjugátem označeným alkalickou fosfatázou proti králičímu IgG (modrá barva) ml promývací pufr 30x koncentrovaný ml roztok substrátu pnpp Všechny reagencie, kromě promývacího roztoku, jsou připraveny k použití. Při skladování uchovávejte všechny součásti při teplotě 4 C. Odebírejte jen počet proužků potažených COMP potřebný pro test, přičemž fólii balení odstraňujte opatrně. Ver , rev.13/07 MS Strana 2 z 6

3 Potřebné materiály nebo zařízení, které nejsou součástí soupravy - 96 jamková destička s kulatými dny pro předinkubaci. - ELISA reader s filtrem 405 nm. - Přesné pipety s jednorázovými špičkami. - NaCl, Tween 20 a destilovaná voda na přípravu dalšího promývacího roztoku. - Promývačka ELISA destiček, absorpční tkanina, zkumavky a časovač. Odběr vzorku Vzorky séra jsou při normálním zacházení a při skladování v chladničce po kratší dobu docela stabilní. Na delší období skladování se však vzorky musí skladovat zmražené při teplotě 20 C. Na hladinu COMP má zmražení a rozmražení vzorků séra malý vliv, ale vždy by se mu mělo předcházet, protože může dojít ke vzniku sraženin. Zdá se, že vzorky synoviálních tekutin jsou k degradaci citlivější. Nepoužívejte séra, která jsou ikterická, lipemická a hemolyzovaná. NCCLS poskytuje doporučení pro skladování krevních vzorků, (Schválené standardní postupy pro nakládání s krevními vzorky a jejich zpracování, H18A, 1990). PRACOVNÍ POSTUP Všechny kalibrátory, kontroly a vzorky se musí testovat v duplikátu. Všechny roztoky musí být před vytemperovány na teplotu místnosti. PRVNÍ DEN (odpoledne) Ředění séra a předinkubace s první protilátkou 1. Vzorky séra rozřeďte 1/50 ředicím pufrem. Synoviální tekutinu rozřeďte v poměru 1/500. (Vzorky séra se musí ředit v poměru 1/30 nebo vyšším. Doporučené ředění vzorků séra je 1/50. Synoviální tekutina se musí ředit v poměru 1/200 nebo vyšším. Doporučené počáteční ředění je 1/500.) 2. Napipetujte 60 µl kalibračních přípravků C10, C20, C30, C40, C60, C80 a kontrol C1, C2 a ředěných vzorků (S) do předinkubační destičky (destička s kulatým dnem) podle níže uvedeného schématu A C80 C20 S1 B C80 C20 S1 C C60 C10 S2 D C60 C10 S2 E C40 C1 atd. F C40 C1 G C30 C2 H C30 C2 3. Do všech jamek přidejte 60 µl anti-comp reagencie a po dobu 5 min míchejte na míchačce. Inkubujte přes noc (12-18 h) při teplotě okolo 4 C. DRUHÝ DEN Teplota všech roztoků by se před použitím měla nechat ustálit na teplotu místnosti. Příprava promývacího roztoku Zřeďte 10 ml 30x koncentrovaného promývacího roztoku s 290 ml destilované vody. Při skladování při teplotě 2-8 C je ředěný promývací roztok stabilní do data doporučené spotřeby soupravy. V případě potřeby lze připravit další promývací roztok zředěním 9,0 g NaCl v 1,0 l destilované vody, přidáním 0,5 ml Tween 20 a promícháním. Ver , rev.13/07 MS Strana 3 z 6

4 Inkubace na destičce potažené antigenem 1. Přeneste 100 µl roztoku z každé jamky v předinkubační destičce do jamek destičky potažených antigenem. 2. Inkubujte při teplotě místnosti po dobu 60 minut. Promytí po inkubaci vzorku Třikrát propláchněte promývacím roztokem (přibližně 300 µl/jamku) vždy naplněním a vyprázdněním jamek; po posledním proplachu jamky vyprázdněte zbytky tekutiny opatrným vyklepáním proužku na savou tkaninu. Přidání konjugátu Do každé jamky přidejte 100 µl konjugátu. Inkubujte po dobu 60 minut. Propláchněte stejným postupem jako je popsáno výše. Promytí po inkubaci konjugátu Přidání roztoku substrátu Do každé jamky přidejte 100 µl roztoku substrátu pnpp, inkubujte po dobu 60 minut ± 10 minut. Na ELISA readeru odečtěte absorbance při 405 nm. Analýza výsledků Pomocí příslušného softwaru vypočítejte množství COMP ve vzorku. Nejlepších výsledků proložení křivky se dosáhne pomocí algoritmu prokládání křivky typu spline. Pro výpočet úrovní COMP v séru nebo jiných vzorcích nezapomeňte provést úpravu podle použitého ředění. Kontrola kvality Kontrolní hodnoty kontrol C1 a C2 a limity jsou uvedeny v osvědčení o kontrole kvality. Skutečné kontrolní rozsahy je nutno stanovit ve vaší laboratoři. Očekávané výsledky Bylo zjištěno, že úrovně COMP v séru u 80 nevýběrových dárců krve ve věku dosahují množství 1,35 ± 0,40 µg/ml (rozsah 0,99 2,54). Pro synoviální tekutiny nejsou k dispozici žádné normální hodnoty, ale tyto hodnoty jsou obecně asi deset až dvacetkrát vyšší než úrovně v séru. V klinickém materiálu kolenní synoviální tekutiny se obsah COMP pohyboval od 14 do 48 µg/ml. Výkonové charakteristiky Přesnost intraassay byla stanovena dvojím testováním dvou vzorků. Každý vzorek byl analyzován 20x na stejné destičce. Vzorek Průměr (µg/ml) SO VK % 1 1,03 ± 0,11 ± 10,7 2 1,71 ± 0,06 ± 3,5 Přesnost interassay byla stanovena dvojím testováním dvou vzorků. Výsledky byly získány z patnácti různých cyklů. Vzorek Průměr (µg/ml) SO VK % 1 0,97 ± 0,10 ± 10,3 2 1,82 ± 0,12 ± 6,6 Ver , rev.13/07 MS Strana 4 z 6

5 Odstraňování možných problémů Problém: Možné příčiny: Řešení: Kontrolní hodnoty 1. Nesprávná teplota, 1. Zkontrolujte správnost času a mimo rozsah časování nebo pipetování, teploty. reagencie se nesmíchaly. Viz Nedostatečná přesnost níže. Test zopakujte. 2. Křížová kontaminace 2. Pipetujte pečlivě. kontrol. 3. Nesprávné ředění. 3. Test zopakujte. 4. Optická cesta není čistá. 4. Zkontrolujte nečistoty nebo přítomnost vzduchových bublin v jamkách. Dno otřete a odečtěte znovu. Výsledky všech 1. Jedna nebo více reagencií 1. Znovu zkontrolujte postup. testů negativní nepřidána nebo přidána ve Zkontrolujte nepoužité reagencie špatném pořadí. Test zopakujte. 2. Destička potažená antigenem 2. Zkontrolujte zjevnou vlhkost inaktivní. v nepoužitých jamkách. Dno otřete a odečtěte znovu. Výsledky všech 1. Kontaminované pufry nebo 1. Zkontrolujte všechny roztoky kvůli testů žluté reagencie. zákalu. 2. Promývací roztok 2. Použijte čistou nádobu. kontaminovaný. 3. Nesprávné ředění séra. 3. Test zopakujte. Zkontrolujte kvalitu vody používané na přípravu roztoku. Špatná přesnost 1. Při pipetování je CV nad 1. Zkontrolujte kalibraci pipety. 5 % nebo chybí vzorky Použijte opakovatelnou techniku. 2. Sérum nebo reagencie 2. Všechny reagencie jemně, ale nedostatečně promíchané řádně promíchejte a vytemperujte nebo neustálené na teplotu místnosti. na teplotu místnosti. 3. Přidání reagencíí trvá příliš 3. Vytvořte rovnoměrnou a jednotnou dlouho; nerovnoměrnost časových intervalů. techniku a pro zkrácení času použijte zařízení s více špičkami nebo automatický dávkovač. 4. Optická cesta není čistá. 4. Zkontrolujte vzduchové bubliny v jamkách. Dno vytřete a odečtěte znovu. 5. Promývání není konzistentní; 5. Zkontrolujte, zda se všechny jamky zachycené bubliny; promývací roztok zůstává v jamkách. plní a odsávají rovnoměrně. Odsajte přebytečnou kapalinu nad úrovní reagencí v jamce. Po posledním proplachu, jamky vyprázdněte vyklepáním proužku na savou tkaninu. 6. Nesprávné pipetování. 6. Zabraňte vzniku bublin ve špičkách pipety. Literatura DiCesare, P., Hauser, N., Lehman, D., Pasumarti, S., and Paulsson, M. (1994). Cartilage oligomeric matrix protein (COMP) is an abundant component of tendon. FEBS Lett. 354, Hedbom, E., Antonsson, P., Hjerpe, A., Aeschlimann, D., Paulsson, M., Rosa Pimentel, E., Sommarin, Y., Wendel, M., Oldberg, A., and Heinegård, D. (1992). Cartilage matrix proteins. An acidic oligomeric protein (COMP) detected only in cartilage. J.Biol.Chem. 267, Mörgelin, M., Heinegård, D., Engel, J., and Paulsson, M. (1992). Electron microscopy of native cartilage oligomeric matrix protein purified from the Swarm rat chondrosarcoma reveals a five- armed structure. J.Biol.Chem. 267, Ver , rev.13/07 MS Strana 5 z 6

6 Månsson, B., Carey, D., Alini, M., Ionescu, M., Rosenberg, L.C., Poole, A.R., Heinegård, D., and Saxne, T. (1995). Cartilage and bone metabolism in rheumatoid arthritis. Differences between rapid and slow progression of disease identified by serum markers of cartilage metabolism. J.Clin.Invest. 95, Neidhart, M., Hauser, N., Paulsson, M., DiCesare, P., Michel, B.A., and Häuselmann, H.J. (1997). Small fragments of cartilage oligomeric matrix protein in synovial fluid and serum as markers for cartilage degradation. Br.J.Rheum. 36, Oldberg, Å., Antonsson, P., Lindblom, K., and Heinegård, D. (1992). COMP (cartilage oligomeric matrix protein) is structurally related to the thrombospondins. J.Biol.Chem. 267, Saxne, T. and Heinegård, D. (1992). Cartilage oligomeric matrix protein: a novel marker of cartilage turnover detectable in synovial fluid and blood [published erratum appears in Br J Rheumatol 1993 Mar;32(3):247]. Br.J.Rheumatol. 31, Sharif, M., Saxne, T., Shepstone, L., Kirwan, J.R., Elson, C.J., Heinegård, D., and Dieppe, P.A. (1995). Relationship between serum cartilage oligomeric matrix protein levels and disease progression in osteoarthritis of the knee joint. Br.J.Rheumatol. 34, Použité symboly Datum spotřeby. Biologický materiál. Skladujte při teplotě. Výrobce. Číslo výrobní šarže. In vitro diagnostický zdravotnický prostředek. Katalogové číslo výrobku. Čtěte návod k použití. Antigen. Ředicí roztok. Konjugát. Promývací roztok 30x konc. Substrátový pufr. Substrát p-nitro-phenyl-phosphate (pnpp). Kalibrátor. Kontrola. Tableta substrátu pnpp Ver , rev.13/07 MS Strana 6 z 6