Změny exprese a produkce cyklooxygenáz v míše vlivem bolesti a farmak

Transkript

1 Změny exprese a produkce cyklooxygenáz v míše vlivem bolesti a farmak Mgr. Michaela Procházková Ústav farmakologie 3. lékařská fakulta, Univerzita Karlova Disertační práce Školitel: Prof. MUDr. Miloslav Kršiak, DrSc. Praha, 2010

2 Poděkování Na tomto místě bych ráda poděkovala mému školiteli Prof. MUDr. Miloslavu Kršiakovi, DrSc. za odborné vedení, cenné rady a podporu v průběhu mého postgraduálního studia. Můj dík patří rovněž zaměstnancům Ústavu farmakologie 3. LF UK a Ústavu imunologie a mikrobiologie 1. LF UK, kteří přispěli ke vzniku této práce. Děkuji také svým blízkým, kteří mi poskytovali motivaci a vhodné podmínky k práci. Práce je součástí výzkumného záměru MSM MŠMT. i

3 Obsah SEZNAM ZKRATEK... IV 1 LITERÁRNÍ ÚVOD A PŘEHLED DANÉ PROBLEMATIKY Vznik bolesti a úloha působků na periferii Vedení bolestivých impulzů z nociceptorů do míchy Přenos a modulace bolesti v míše Přenos a modulace bolesti v zadních rozích míšních Úloha mediátorů a receptorů v přenosu bolesti v míše Kaskáda dějů na míšní úrovni aktivovaná tkáňovým poškozením Úloha prostaglandinů v přenosu bolesti v míše Vedení bolestivých impulzů z míchy Animální modely bolesti Modely akutní bolesti Modely chronické bolesti Modely neuropatické bolesti Současné poznatky o expresi a produkci cyklooxygenáz na míšní úrovni Modely zánětlivé bolesti Model pooperační bolesti Model osteoartrózy Modely neuropatické bolesti CÍLE PRÁCE POUŽITÉ METODY Experimentální zvířata Použité experimentální modely bolesti Metody měření bolesti Molekulárně-biologické metody Použitá analgetika ii

4 3.6 Statistická analýza VÝSLEDKY Změny exprese a produkce míšní COX-1 a COX-2 u různých typů bolestí Změny míšní COX u zánětlivé bolesti Porovnání změn míšních COX u zánětlivé a pooperační bolesti Změny míšní COX u osteoartrózy Změny míšní COX u neuropatické bolesti Účinek farmak na expresi a produkci míšní COX-1 a COX-2 u zánětlivé bolesti DISKUSE Diskuse ke změnám míšní COX u různých typů bolestí Diskuse ke změnám míšní COX v modelu zánětlivé a pooperační bolesti Diskuse ke změnám míšní COX v modelu osteoartrózy Diskuse ke změnám míšní COX v modelu neuropatické bolesti Shrnutí diskuse ke změnám míšní COX u různých typů bolestí Diskuse k účinkům analgetik na míšní COX u zánětlivé bolesti Diskuse k analgetickým účinkům testovaných farmak Diskuse k účinkům zvolených analgetik na míšní COX Shrnutí diskuse k účinkům zvolených analgetik na míšní COX ZÁVĚRY A ZHODNOCENÍ CÍLŮ PRÁCE SOUHRN POUŽITÁ LITERATURA iii

5 Seznam zkratek 5HT 1B, 5HT 1D, 5HT 2 a 5HT 3 Serotoninové receptory A1, A2 Adenosinové receptory AMP, ADP, ATP Adenosinfosfáty ASIC Acid-Sensing Ion Channels CB 1, CB 2 Kanabinoidní receptory CCI Chronic Constriction Injury cdna Komplementární DNA CEL Celecoxib CFA Complete Freund s adjuvant, Freundovo adjuvans CGRP Kalcitonin gene-related peptid CNS Centrální nervový systém COX Cyklooxygenáza COX-1 Cyklooxygenáza 1 COX-2 Cyklooxygenáza 2 COX-3 Cyklooxygenáza 3 cpla 2 Kalcium dependentní cytosolická PLA 2 DIKLO Diklofenak DP, EP, FP, IP Receptory pro prostaglandiny ED Efektivní dávka GABA Kyselina γ-aminomáselná GABA A, GABA B, GABA C GABA receptory GLT1 Glutamátový transportér IASP Mezinárodní společnost pro studium bolesti iglu Ionotropní glutamátové receptory IL Interleukin inos Inducibilní NO syntáza i.p. Intraperitoneální ipla 2 Kalcium-independentní cytosolická PLA 2 i.t. Intrathekální i.v. Intravenózní KAR Karagenin MEL Meloxikam iv

6 MET mglu MIA MPE mrna NGF NK1, NK2 a NK3 NMDA nnos NSA OD PAF PAR PCR Metamizol Metabotropní receptory spřažené s G-proteinem Monojódacetát Maximal possible effect Messenger RNA Nervový růstový faktor Neurokininové receptory N-methyl-D-aspartát Neuronální NO syntáza Nesteroidní antirevmatika Optická denzita Faktor aktivující destičky Paracetamol Polymerázová řetězová reakce PGD 2 Prostaglandin D 2 PGF 2alfa Prostaglandin F 2alfa PGG 2 Prostaglandin G 2 PGH 2 Prostaglandin H 2 PGI 2 Prostaglandin I 2 PLA 2 Fosfolipáza A 2 p.o. Perorální PSNL Partial Sciatic Nerve Ligation PWL Paw Withdrawal Latency PWT Paw Withdrawal Threshold s.c. Subkutánní S.E.M. Střední chyba průměru SI Stimulační index SNI Spinal Nerve Injury SNL Spinal Nerve Ligation spla 2 Sekretorická PLA 2 SSTR2A Receptory pro somatostatin TNF Tumor nekrotizující faktor TRAM Tramadol TRPV Vaniloidní receptor v

7 1 Literární úvod a přehled dané problematiky 1.1 Vznik bolesti a úloha působků na periferii Bolest je komplexní proces, jehož složitost snad nejlépe vyjadřuje definice přijatá Mezinárodní společností pro studium bolesti (IASP): Bolest je nepříjemný smyslový a emoční prožitek (zážitek) spojený se skutečným nebo potenciálním poškozením tkáně nebo popisovaný výrazy pro takové poškození. Bolest je fyziologický děj provázející člověka po celý život. Je to nepříjemný pocit, který každý zná a nikdo ho, nehledě na výjimky, nemá rád. Pro lidský organismus je přitom bolest nutná a potřebná. Bez vnímání bolesti bychom nebyli schopni oddělit od sebe to, co je pro organismus prospěšné a co ne. Aby lidský organismus dokázal vzít bolest na vědomí, má v sobě ukrytou velmi významnou, výkonnou nervovou síť. Ta kontroluje všechny pochody od přijetí bolestivého impulzu až po reakci organismu. Vnímání bolesti zahrnuje tři základní složky: 1/ informaci o bolestivém podnětu, 2/ přenos a modulaci bolesti, 3/ percepci bolesti a její vědomé hodnocení. Přestože je vlastní mechanismus vnímání bolesti u všech lidí stejný, každý organismus reaguje na bolest různě. Genetické a pohlavní rozdíly ovlivňují jak tělesné, tak i psychické vnímání bolesti. Obecně platí, že ti, kteří jsou pozitivně naladěni a v dobré psychické pohodě, vnímají bolestivé stavy s mnohem menší intenzitou v porovnání s člověkem, který je ve stresu či napětí. 1

8 Vnímání bolesti je závislé na periferním nervovém systému, který reaguje na bolestivé (škodlivé, poškozující nebo alespoň částečně škodlivé či částečně poškozující) stimuly a tím poskytuje signál, který organismus před potenciálním nebezpečím varuje. Vysoce specializovaná senzorická vlákna (buď samostatně, nebo za pomoci jiných speciálních systémů) pak takovouto informaci předávají centrálnímu nervovému systému. Specializovaná senzorická vlákna jsou vysoce citlivá ke stimulům, jako jsou chlad, teplo nebo dotek. Nocicepce je proces detekce a signalizace přítomnosti bolestivého stimulu. Proces zpracování bolestivé informace začíná na úrovni specifických receptorů pro bolest tzv. nociceptorů. Pojem nociceptor pochází z latinského slova nocere, což v překladu znamená škodit. Poprvé byl tento termín použit anglickým fyziologem, držitelem Nobelovy ceny, Charlesem Sherringtonem. Jedná se volná nervová zakončení na konci primárních aferentních vláken, která se aktivují pouze při bolestivé stimulaci, na jiné podněty nereagují. Tyto receptory jsou nerovnoměrně rozptýleny v celém organismu najdeme je na periferii, ale také v různých tkáních (svaly, klouby) nebo v centrálním nervovém systému (CNS) a to zejména v oblasti míchy, mozkového kmene, thalamu a mozkové kůry. Nociceptory jsou charakterizovány typickou odpovědí na různé formy poškození organismu (tepelné, mechanické nebo chemické) a poskytují centrálnímu nervovému systému informaci týkající se umístění a intenzity bolestivého stimulu. Bolest je obvykle způsobena přímou aktivací nociceptorů nebo jako následek zánětlivého procesu, který uvolňuje látky, které nociceptory dráždí. Bolest je vedena pomocí periferních aferentních vláken do míchy (do zadních rohů míšních) a z míchy poté do vyšších center centrálního nervového systému, kde je bolestivá informace zpracovávána a vyhodnocována. K modulaci bolesti může docházet periferně v místě nociceptorů, v míše nebo supraspinálně. Existuje ještě skupina tzv. silent nociceptorů, reagující pouze v okamžiku velmi silného bolestivého impulzu. 2

9 Důležitým jevem při rozvoji chronické bolesti je tzv. periferní senzitizace, hyperalgezie a allodynie. Hyperalgezie je zvýšené vnímání bolesti, ke kterému nejčastěji dochází po poranění nebo při zánětu. Hyperalgezie je charakterizována tím, že bolestivý stimulus vyvolá bolest vyšší intenzity než je obvyklé. K rozvoji hyperalgezie nedochází pouze v místě poranění, ale také v jeho okolí, tedy v nepoškozené oblasti. Hyperalgezie, ke které dochází v místě poranění, se říká hyperalgezie primární, zatímco hyperalgezie v okolí tohoto poškození bývá nazývána hyperalgezií sekundární. Primární hyperalgezie byla popsána jak po tepelném, tak i po mechanickém stimulu a předpokládá se, že je převážně způsobena senzitizací nociceptorů. Senzitizace je definována jako snížení prahu vnímání bolesti. Např. popálíme-li si pokožku ruky, dojde k rozvoji výrazné tepelné hyperalgezie. Tato hyperalgezie se projevuje zvýšenou citlivostí okolní tkáně na bolest vyvolanou tepelným stimulem. Teplota, která dříve žádnou bolest nevyvolávala, se po popálení projevuje jako velmi bolestivý podnět (LaMotte et al. 1982;Meyer and Campbell 1981). Sekundární hyperalgezie byla popsána pouze po mechanickém, nikoli tepelném podnětu (Ali et al. 1996) a na jejím vzniku se zřejmě podílí senzitizace CNS. K rozvoji bolesti a hyperalgezie dochází také při mnoha onemocněních (např. močení může být velmi bolestivé u pacientů s infekcí močového traktu nebo u lidí, kteří se spálí na sluníčku, může být dotek na popálenou pokožku velmi bolestivý). Allodynie je vyvolaná pomocí podnětů, které jindy bolest nevyvolávají (např. lehký dotek). Při vzniku allodynie jsou pak tyto podněty vnímány bolestivě (Obr. 1). Akutní bolest je nejčastěji způsobena poškozením celistvosti organismu. Poranění má za následek lokální uvolnění velkého množství chemických substancí, které ovlivňují nociceptory a nociceptivní proces. Mezi tyto substance patří bradykinin, prostaglandiny, leukotrieny, serotonin, histamin, substance P, tromboxany, faktor aktivující destičky (PAF), adenosin a ATP, protony a volné radikály (Obr. 2). Kromě těchto látek mají důležitou roli také cytokiny (interleukiny a tumor nekrotizující faktor - TNF). Některé látky působí přímo 3

10 na nociceptory, jiné působí nepřímo, přes zánětlivé buňky, které postupně algogení látky uvolňují. Různé chemické látky uvolňované během zánětu mohou mít synergní účinek. Bradykinin je uvolňován při tkáňovém poškození a nachází se také v zánětlivých exudátech. Hraje významnou roli při zánětlivé bolesti a hyperalgezii (Couture et al. 2001;Dray 1997). U člověka vyvolává bolest, jestliže je podán intradermálně, intraarteriálně, intravenózně nebo intraperitoneálně. Bradykinin působí na periferii prostřednictvím dvou typů receptorů B 1 a B 2. B 1 receptor je zastoupen v porovnání s B 2 receptorem v mnohem menší míře, jeho množství se však několikanásobně zvyšuje při zánětu. Vodíkové ionty H + nízké ph, které se nachází v zánětlivých tkáních, se podílí na vzniku bolesti a hyperalgezii, která je se zánětem spojována. Kontinuální podávání látek s nízkým ph na kůži člověka způsobuje bolest a hyperalgezii na mechanické stimuly (Steen and Reeh 1993). V několika studiích byl popsán synergní účinek protonů v kombinaci s prozánětlivými mediátory při stimulaci nociceptorů (Steen et al. 1996). Tyto substance působí přes iontové kanály ASIC (acid-sensing ion channels) (Waldmann 2001). Serotonin degranulace žírných buněk způsobuje uvolňování faktoru ovlivňujícího destičky, který se podílí na uvolňování serotoninu z krevních destiček. Serotonin aktivuje nociceptory přímo a způsobuje bolest (Lang et al. 1990) aktivací serotoninových receptorů. Serotonin také potencuje bolest způsobenou bradykininem a zcitlivuje nociceptory k působení bradykininu. Histamin Substance P uvolňovaná ze zakončení nociceptorů může způsobit uvolňování histaminu ze žírných buněk. Histamin může v organismu vyvolávat několik různých odpovědí, mimo jiné vazodilataci a edém. Role histaminu při vnímání bolesti není ještě zcela objasněna, neboť podání histaminu na pokožku člověka obvykle vyvolává pocity svědění, ale nezpůsobuje bolest (Simone et al. 1991). Histamin dráždí viscerální nociceptory, zvláště je-li podán ve vysokých koncentracích (Koda et al. 1996) a zvyšuje citlivost nociceptorů na bradykinin a teplo (Mizumura et al. 1995). Na periferii působí histamin prostřednictvím H 1 receptoru. 4

11 Obr. 1 - Vliv intenzity stimulace na vznik allodynie a hyperalgezie. Upraveno podle (Ambler Z. 2006).

12 Obr. 2 Potenciální periferní mediátory nociceptivního procesu. Upraveno podle (Meyer R.A. et al. 2005).

13 Adenosin a adenosinfosfáty v průběhu zánětu nebo při tkáňovém poškození může docházet k aktivaci nociceptorů pomocí adenosinu a jeho mono či polyfosfátů (AMP, ADP a ATP) (Hamilton and McMahon 2000;Ralevic and Burnstock 1998). Intraarteriální nebo intradermální aplikace adenosinu způsobuje bolest a intravenózní nebo intrakoronární infuze adenosinu navozuje u člověka symptomy anginy pectoris (Sylven et al. 1986). U zvířat bylo prokázáno, že adenosin působí hlavně přes A2 receptor. Zvířata, kterým tento receptor chybí, pak mají snížené vnímání bolesti (Ledent et al. 1997). Receptory pro ATP byly prokázány jak v zadních rozích míšních, tak na periferii a dělí se na dvě hlavní skupiny P2X a P2Y (Abbracchio and Burnstock 1994). Cytokiny - během zánětu dochází k uvolňování specifických cytokinů (IL-1β, TNF-α a IL-6), které se podílejí na regulaci zánětlivé odpovědi (Cunha and Ferreira 2003). V klinických studiích bylo prokázáno, že pacienti se zánětlivými onemocněními kloubů, mají v synoviální tekutině zvýšené hladiny TNF-α (Shafer et al. 1994) a při léčbě pacientů s revmatoidní artritidou pomocí TNF-α specifických protilátek dochází ke zlepšení jejich symptomů včetně pozitivního ovlivnění bolesti (Elliott et al. 1994). Při studiích na zvířatech byla po systémové nebo i lokální injekci IL-1β, IL-6 a TNF-α prokázána mechanická a tepelná hyperalgezie (Woolf et al. 1997). Cytokiny mohou stimulovat nociceptory buď přímo, nebo nepřímo zvýšeným uvolňováním jiných mediátorů, jakými jsou např. prostaglandiny. Přímé podráždění a senzitizace aferentních nociceptivních vláken na tepelný či mechanický podnět byla prokázána u IL-1β a TNF-α (Fukuoka et al. 1994). Excitační aminokyseliny při nocicepci nebo u zánětlivé bolesti hraje z excitačních aminokyselin nejdůležitější roli glutamát, který se může vázat na ionotropní glutamátové receptory (iglu) nebo na metabotropní receptory spřažené s G-proteinem (mglu). Metabotropní glutamátové receptory vyskytující se na periferii se ještě dále dělí na 2 základní typy, a to mglur1 a mglur5. Periferní podání glutamátu způsobuje aktivaci nociceptorů a periferní podání ligandů vážících se na glutamátové receptory vyvolává bolest. 7

14 Nervový růstový faktor při chronické bolestivé stimulaci dochází ke zvýšenému vyplavování nervového růstového faktoru (NGF). NGF může indukovat tepelnou hyperalgezii přímým působením na periferní zakončení primárních aferentních vláken (Chuang et al. 2001). V zánětlivých tkáních byly nalezeny zvýšené hladiny nervového růstového faktoru a po lokálním či systémovém podání NGF dochází ke vzniku hyperalgezie, a to jak u lidí, tak i u zvířat (McMahon 1996). NGF stimuluje také žírné buňky, čímž zvyšuje uvolňování histaminu a serotoninu. Opioidy kromě svého centrálního analgetického účinku, mohou opioidy vyvolávat analgesii svým periferním účinkem (Machelska and Stein 2000), neboť na zakončeních pr. aferentních vláken byly prokázány µ, κ i δ opioidní receptory. Také velké množství dalších receptorových systémů může hrát důležitou úlohu při modulaci bolestivého přenosu na periferii. Mezi tyto receptory mohou patřit například: Vaniloidní receptory vaniloidní receptory (kapsaicinové receptory, TRPV receptory) se nachází na periferních zakončeních primárních aferentních vláken nebo centrálně. Mezi hlavního zástupce této skupiny patří TRPV1 receptor. Kromě možnosti aktivace tohoto receptoru kapsaicinem, lze tento iontový kanál aktivovat také sníženým ph (snížením ph vnějšího prostředí pod 6,5) nebo teplem (zvýšením teploty nad 43 C). Prozánětlivé mediátory aktivují nebo senzitizují TRPV1 receptor prostřednictvím druhých poslů. Například tepelná hyperalgezie vyvolaná bradykininem či nervovým růstovým faktorem se považuje za zprostředkovanou, neboť k ní dochází na základě fosforylace TRPV1 způsobenou pomocí proteinkinázy C (Chuang et al. 2001). Důležitou roli zde však může hrát i proteinkináza A (Rathee et al. 2002). Cholinergní receptory nikotin má slabý excitační účinek na periferní nociceptory a způsobuje mírnou senzitizaci na tepelný, ale ne na mechanický podnět. Naproti tomu muskarin, snižuje citlivost nociceptorů jak na chemické, tak i na mechanické podněty (Bernardini et al. 2001). 8

15 GABA receptory na zakončeních primárních aferentních vláken byly popsány také GABA A receptory. Behaviorální studie naznačily různou úlohu těchto receptorů při modulaci bolesti. Podání nízkých koncentrací agonistů GABA A receptorů snižuje a naopak podání vysokých koncentrací agonistů GABA A receptorů zvyšuje formalinem indukovanou bolest (Carlton et al. 1999). Receptory pro somatostatin periferně se v největší míře vyskytují somatostatinové (SSTR2A) receptory (Carlton et al. 2001). Analgetický účinek agonistů somatostatinu byl potvrzen po jejich intraplantárním podání, kdy dochází ke snížení odpovědi ve 2. fázi formalinového testu. Deriváty kyseliny arachidonové mezi deriváty kyseliny arachidonové patří prostaglandiny, tromboxany a leukotrieny. Při tkáňovém poškození dochází k aktivaci fosfolipázy A 2 (PLA 2 ), která produkuje kyselinu arachidonovou. Ta je následně substrátem pro cyklooxygenázu (COX), výchozí enzym při produkci prostaglandinů a tromboxanů. O těchto látkách se obecně uvažuje jako o látkách, které neaktivují nociceptory přímo, ale jako o substancích, které způsobují senzitizaci nociceptorů na tepelné a mechanické stimuly (Cunha and Ferreira 2003;Schaible et al. 2002). Při zánětu a hyperalgezii mají nejvýznamnější roli prostaglandin I 2, prostaglandin E 2 a prostaglandin D 2. Z leukotrienů hrají nejdůležitější roli leukotrien D 4 a leukotrien B 4, který při intradermální aplikaci vyvolává velmi výraznou hyperalgezii (Levine et al. 1984). Vlivem poranění nebo při zánětu dochází k poškození buněčné membrány a k aktivaci fosfolipázy A 2, která zvýší uvolňování kyseliny arachidonové. Ta je substrátem pro cyklooxygenázu (COX), která je klíčovým enzymem při syntéze prostaglandinů. Cyklooxygenáza katalyzuje první dva kroky při biosyntéze prostaglandinů. Syntéza prostaglandinů je zahájena konverzí kyseliny arachidonové na PGH 2. Tento proces je katalyzován cyklooxygenázou (prostaglandin H 2 syntázou), což je enzym s dvojí katalytickou aktivitou. Pomocí cyklooxygenázové aktivity konvertuje kyselinu arachidonovou 9

16 na PGG 2. PGG 2 je poté peroxidázovou aktivitou cyklooxygenázy redukován na PGH 2. Z PGH 2 poté pomocí různých tkáňově specifických izomeráz vzniká prostaglandin I 2 (prostacyklín), prostaglandin E 2, prostaglandin D 2, prostaglandin F 2α a tromboxan A 2 (Obr. 3) (Marnett et al. 1999;Otto and Smith 1995;Vane 1971). Obr. 3 Vznik a lokalizace prostaglandinů, prostacyklínu a tromboxanu A 2. Upraveno podle (Doležal T. and Kršiak M. 2006). Zhruba od 90. let minulého století jsou známy 2 izoformy cyklooxygenázy - cyklooxygenáza 1 a cyklooxygenáza 2. COX-1 je zodpovědná za syntézu cytoprotektivních prostaglandinů ve sliznici gastrointestinálního traktu (především v žaludeční sliznici), hraje významnou roli v hemodynamické regulaci ledvin a v syntéze tromboxanu A 2 v krevních destičkách. COX-1 působí také během indukce děložních kontrakcí při porodu. COX-2 je produkována v místě zánětu imunitními buňkami a buňkami cévního endotelu po expozici 10

17 bakteriálním lipopolysacharidem nebo prozánětlivými cytokiny (IL-1, IL-2, TNF-α). Naopak protizánětlivé cytokiny (IL-4, IL-10, IL-13) a kortikosteroidy produkci COX-2 snižují (Herschman 1996;Vane et al. 1998). Obě cyklooxygenázy jsou membránově vázané enzymy, které tvoří úzký a dlouhý hydrofobní kanál, do kterého vstupuje kyselina arachidonová uvolněná z poškozené membrány. Mají stejnou molekulovou hmotnost (72 kda) a vykazují 63% homologii v sekvenci aminokyselin (Vane et al. 1998). COX-1 vzniká expresí genu o velikosti 22 kb na chromozomu 2 nebo 9. COX-2 je kódována genem o velikosti 8,3 kb lokalizovaném na chromosomu 1. Vazebným místem pro neselektivní inhibitory cyklooxygenázy je u obou izoforem arginin v pozici 120, na který se léčivo váže prostřednictvím vodíkového můstku. Rozdílná míra inhibice různými nesteroidními antirevmatiky (NSA) je dána záměnou jedné aminokyseliny (v molekule COX-2 je na pozici 523 valin místo izoleucinu). Menší valinový zbytek otevírá ve stěně kanálu přístup do postranní kapsy, která je považována za vazebné místo pro léčiva selektivně ovlivňující COX-2. V molekule COX-1 je toto místo blokováno větším zbytkem izoleucinu (Hawkey 1999). Odlišná je také kinetika inhibice obou izoforem cyklooxygenázy. Zatímco inhibice COX-1 je na základě tvorby vodíkového můstku kompetitivně reverzibilní a nastává okamžitě, v případě COX-2 se jedná o kovalentní ireversibilní vazbu a inhibice se dostavuje během minut. Struktura, lokalizace a regulace COX-1 a COX-2 je uvedena v tabulce 1 (Tab. 1). V nedávné době se pak objevily práce popisující výskyt nové izoformy cyklooxygenázy COX-3. Toto označení se vyskytovalo v prvních článcích, ve kterých se o této nové izoformě informovalo, ve skutečnosti se však jedná o splicovou variantu COX-1. Proto můžeme někde najít označení jako COX-1b. COX-3 mrna byla nalezena v mozkové kůře u psů a v menších množstvích pak i v jiných tkáních. U člověka byl výskyt této izoformy potvrzen v mozkové kůře a srdci (Chandrasekharan et al. 2002). 11

18 Regulace Vlastnosti Lokalizace Struktura, lokalizace a regulace cyklooxygenáz COX-1 konstitutivní forma cyklooxygenázy housekeeping gene syntetizující cytoprotektivní prostaglandiny ve sliznici GIT, regulující hemodynamiku ledvin, ovlivňující syntézu tromboxanu A 2 žaludek, střevo, ledviny, trombocyty, lumen endoplazmatického retikula COX-2 inducibilní forma cyklooxygenázy inflammation response gene vznikající během zánětu místo zánětu, makrofágy, synoviocyty, endothel, endoplazmatické retikulum, buněčný obal Velikost genu 22 kb s 11 exony 8,3 kb s 10 exony Chromosom 2 nebo 9 1 mrna 2,8 kb 4,5 kb Protein 72 kda 72 kda Počet aminokyselin Molekulová hmotnost Tab. 1 - Charakteristika jednotlivých izoforem cyklooxygenázy 1.2 Vedení bolestivých impulzů z nociceptorů do míchy Nociceptivní aferentní vlákna jsou výběžky neuronů, jejichž těla jsou uložena v zadních rozích míšních. Tato vlákna se nejčastěji dělí podle velikosti a rychlosti přenosu bolestivého vzruchu (oba výše zmíněné parametry se však liší u člověka a u různých živočišných druhů): Vlákna Aß nejsilnější vlákna, silně myelinizovaná, reagující na dotek, vibrace či chlad. Vlákna A - středně silná vlákna, slabě myelinizovaná, reagující na mechanické podněty vysoké intenzity, vzruch vedou rychlostí m/sec. Zprostředkovávají vedení ostré a dobře lokalizovatelné bolesti. Vlákna C tenká vlákna bez myelinové pochvy, aktivovaná mechanickými, chemickými i tepelnými podněty. Pomocí těchto vláken dochází k pomalému šíření bolestivého vzruchu 12

19 (rychlostí 0,5 2 m/sec.). Zprostředkovávají vedení hluboké, špatně lokalizované bolesti (Obr. 4). 13

20 Obr. 4 - Typy nociceptivních aferentních vláken. Upraveno podle (Stahl S.M. 2008).

21 1.3 Přenos a modulace bolesti v míše Přenos a modulace bolesti v zadních rozích míšních Mícha je prvním místem, kde dochází ke komplexnímu ovlivňování přenosu bolesti z periferie do vyšších oddílů CNS. Za pomoci různých neurotransmiterů zde dochází k modulaci nociceptivních impulzů a jejich přenosu do vyšších částí CNS. Jak bylo výše uvedeno (Obr. 4) nociceptivní signály přicházejí do míchy pomocí dvou typů nervových vláken. Slabě myelinizovými vlákny A-delta, která vedou impulsy vyšší rychlostí a vlákny typu C, která jsou tenčí, nemyelinizovaná a vedou impulsy pomaleji. Vlákna vedoucí bolestivý impuls přicházejí do zadních rohů míšních zadními kořeny. Mícha se dělí podle Rexeda do několika zón (I-X) (Obr. 5). Obr. 5 Rexedovy zóny. Upraveno podle (Todd A.J. and Koerber H.R. 2005). 15

22 Vlákna C, někdy též vlákna A-delta, končí v povrchových Rexedových zónách (I a II tzv. substantia gelatinosa Rolandi), eventuálně v zóně III. Z tohoto místa přechází bolestivá informace do Lissauerova traktu. Zde se projikuje hlavně akutní, povrchová bolest. Bolest hluboká, viscerální je vedena převážně A-delta vlákny (zřídka vlákny C) do hlubších Rexedových zón, konkrétně do zóny V, VII, VIII a X Úloha mediátorů a receptorů v přenosu bolesti v míše Na přenosu a modulaci bolesti z periferie do míchy se podílí řada neurotransmiterů, které se uplatňují i na jiných místech - na periferii nebo v centrálním nervovém systému. Množství různých neurotransmiterů, které se v zadních rozích míšních vyskytují, poskytuje možnost farmakologického zásahu na těchto místech např. selektivně blokovat uvolňování excitačních neurotransmiterů nebo naopak zvýšit efekt látek, které jsou schopny navodit analgesii. Přenos bolesti v těchto místech spočívá v uvolnění neurotransmiterů ze zakončení primárních aferentních neuronů, které pak mohou aktivovat receptory na dalším neuronu dráhy bolesti, který začíná v zadním rohu míšním a pokračuje do vyšších center centrálního nervového systému. Při přenosu nociceptivních informací jsou důležité jak excitační, tak inhibiční neurotransmitery. Z excitačních hrají nejdůležitější roli excitační aminokyseliny a neuropeptidy (zejména substance P a neurokinin A). Z inhibičních neurotransmiterů je to pak GABA a glycin. Modulační roli zde má také opioidní, serotoninergní, adrenergní a cholinergní systém. Excitační aminokyseliny - z excitačních neurotransmiterů přítomných v zadních rozích míšních je v největší míře zastoupen glutamát, méně pak aspartát. Glutamát patří k neurotransmiterům, který je spojován s rychlým přenosem bolestivé informace z nociceptorů 16

23 na míšní neurony. Zvýšené uvolňování excitačních aminokyselin bylo pozorováno po podání kapsaicinu (Jeftinija et al. 1991). Několikanásobně zvýšené hladiny glutamátu a aspartátu byly také pozorovány v míšních dialyzátech, které byly získány po aplikaci prozánětlivých mediátorů na periferii (Skilling et al. 1988;Sluka and Westlund 1992). Důležitá úloha glutamátu při přenosu bolesti byla také potvrzena při studiích, ve kterých se zjistilo, že inhibicí glutamátového transportéru GLT-1 dochází k signifikantnímu snížení nocicepce ve formalínovém testu (Niederberger et al. 2003). Postsynaptický efekt excitačních aminokyselin je zprostředkován pomocí vazby na specifické receptory. Peptidy - mezi peptidy, které se podílí na míšní neurotransmisi, patří kalcitonin gene-related peptid (CGRP), substance P, neurokinin A, somatostatin, vazoaktivní intestinální peptid a galanin. Kalcitonin gene-related peptid ke zvýšenému uvolňování CGRP dochází při bolestivém stimulu (tepelném, chemickém i mechanickém) (Garry and Hargreaves 1992;Morton and Hutchison 1989). Substance P a neurokinin A extracelulární hladiny substance P se v míše zvyšují v závislosti na bolestivém stimulu a k jejímu zvýšenému uvolňování dochází po mechanické nebo chladné stimulaci na periferii (Duggan et al. 1988;Oku et al. 1987;Tiseo et al. 1990). Protože je neurokinin A syntetizován z prekurzorů, které se podílejí i na vzniku substance P, není proto překvapením, že neurokinin A se uvolňuje na míšní úrovni při stejných situacích jako substance P (Duggan et al. 1990). Somatostatin uvolňování somatostatinu v zadních rozích míšních nastává v závislosti na specifickém stimulu, který přichází z periferie. Somatostatin se uvolňuje při bolestivém stimulu, který je vyvolán tepelně, ne však mechanicky (Kuraishi et al. 1985a;Morton et al. 1989;Tiseo et al. 1990). 17

24 Vazoaktivní intestinální peptid neurony u nichž byla imunologicky potvrzena přítomnost vazoaktivního intestinálního peptidu se vyskytují v oblasti torakální a částečně i sakrální míchy nebo pak v oblasti kraniálních nervů (Honda et al. 1983;Yaksh et al. 1988). Galanin žádné změny v uvolňování galaninu nebyly pozorovány po zvýšené tepelné nebo mechanické stimulaci (Morton and Hutchison 1989). Na postsynaptické membráně zadních rohů míšních nacházíme několik typů receptorů. Tyto receptory jsou ionotropní (NMDA, AMPA a kainátové) nebo metabotropní, spřažené s G proteiny. NMDA receptory NMDA receptory se mohou vyskytovat na zakončeních primárních aferentních neuronů, ale převážně jsou umístěny postsynapticky (Liu et al. 1994). Intrathekální podání NMDA způsobuje hyperalgezii v testu švihnutí ocasem a na horké plotně (Aanonsen and Wilcox 1987). Klinicky se při terapii bolesti využívají NMDA antagonisté, zejména pak ketamin. NMDA receptory hrají také velmi důležitou roli v procesu centrální senzitizace, neboť po opakované stimulaci těchto receptorů, dochází k jejich senzitizaci a tím k hyperalgezii - tzv. wind up fenoménu (Ferreira and Lorenzetti 1994). AMPA a kainátové receptory skupina AMPA a kainátových receptorů je zapojena zejména při přenosu neuropatické bolesti. AMPA receptory jsou lokalizovány v superficiální části zadního rohu míšního, kde jsou umístěny postsynapticky. Experimentálně bylo zjištěno, že po intrathekálním podání agonistů AMPA receptorů může docházet k simulaci bolestivé stimulace (Aanonsen and Wilcox 1986;Aanonsen and Wilcox 1987). Neurokininové receptory do skupiny neurokininových receptorů patří NK1, NK2 a NK3 receptory, ke kterým mají nejvyšší afinitu substance P, neurokinin A a neurokinin B. Všechny tři neurokininové receptory mají sedm transmembránově uložených domén a stejný mechanizmus přenosu signálu, založený na aktivaci fosfolipázy C pomocí G-proteinů. Vaniloidní receptory vazbou na vaniloidní receptor působí kapsaicin (Jeftinija et al. 1992). Jestliže dochází k aktivaci toho receptoru kapsaicinem (příp. působením nízkého ph 18

25 či zvýšenou teplotou) dochází ke vstupu kalcia a ostatních kationtů do C vláken, k depolarizaci a ke zvýšení intracelulární hladiny vápníku. Depolarizace a zvýšené hladiny intracelulárního vápníku vedou k uvolnění neurotransmiterů, jakými jsou např. substance P. Vysoké dávky kapsaicinu desenzitizují nervová vlákna, což je výhodné z hlediska tlumení bolesti a jeho protizánětlivé působení je zajištěno blokádou excitace v nervových zakončeních (Lynn 1990;Szallasi 1994). Opioidní receptory k centrálním inhibičním látkám v zadních rozích míšních patří opioidy. Endogenní i exogenní opioidy působí především přes, ale také prostřednictvím a receptorů. Opioidy na míšní úrovni snižují uvolňování neurotransmiterů z nociceptivních vláken a inhibují tak postsynaptické neurony, čímž zabraňují šíření bolestivého signálu z periferie do vyšších center centrálního nervového systému. Opioidní receptory se zde mohou vyskytovat jak presynapticky, tak postsynapticky. presynaptické opioidní receptory imunohistochemickými studiemi bylo zjištěno, že presynapticky se vyskytují μ a δ receptory (Arvidsson et al. 1995a;Arvidsson et al. 1995b). Působení agonistů μ a δ opioidních receptorů redukuje trvání akčních potenciálů v zadních rozích míšních buď zvýšením vodivosti pro K + nebo přímou inhibicí N a P typu kalciového kanálu (Moises et al. 1994;Werz et al. 1987). V konečném výsledku těchto presynaptických dějů tak dochází ke sníženému uvolňování excitačních neurotransmiterů a k redukci excitačních postsynaptických potenciálů. postsynaptické opioidní receptory μ a κ opioidní receptory se mohou nacházet také postsynapticky, a to jak v tělech, tak i dendritech neuronů zadních rohů míšních (Arvidsson et al. 1995b;Arvidsson et al. 1995c). δ opioidní receptory se vyskytují postsynapticky jen velmi zřídka. 19

26 Všechny tři typy opioidních receptorů působí přes G proteiny a vedou k inhibici adenylátcyklázy nebo influxu kalcia, případně aktivují eflux draslíku. Postsynapticky vedou k hyperpolarizaci (Jeftinija 1988;Yoshimura and North 1983). α adrenergní receptory na přenosu bolesti se podílí hlavně α 2 receptory, α 1 receptory jsou v zadních rozích míšních zastoupeny jen ve velmi malé koncentraci. Spinální podání 2 agonistů vyvolává analgesii, a to jak v akutních, tak i v chronických modelech bolesti (Ossipov et al. 1997;Xu et al. 1992;Yaksh 1985). Výsledkem aplikace agonistů 2 receptorů je blokáda excitace postsynaptického neuronu. Účinnost agonistů 2 receptorů (zejména pak klonidinu nebo dexmedetomidinu) byla potvrzena jak v modelech zánětlivé, tak i neuropatické bolesti (Rokyta R. et al. 2006). presynaptické α 2 adrenergní receptory u člověka, ale také u zvířat, byly nalezeny 3 základní typy těchto receptorů α 2a, α 2b a α 2c. Z důvodu nedostatku selektivních látek, které by ovlivňovaly jednotlivé typy těchto receptorů, je těžké usuzovat, do jaké míry se jednotlivé subtypy receptorů při modulaci bolestivého přenosu podílejí. Míšní α 2a adrenergní receptory se vyskytují na zakončení primárních aferentních vláken (Stone et al. 1998) a způsobují inhibici bolestivého přenosu (Kuraishi et al. 1985b;Pang and Vasko 1986). postsynaptické α 2 adrenergní receptory na rozdíl od α 2a receptorů, které se nacházejí pouze presynapticky, α 2c receptory se v míše vyskytují i postsynapticky. GABA receptory - existují 3 subtypy GABA receptorů GABA A, GABA B, GABA C. Na míšní úrovni je nevyšší hustota GABA A a GABA B receptorů (Malcangio and Bowery 1996). Stimulace GABA receptorů vede k hyperpolarizaci jak presynaptické, tak i postsynaptické membrány a výsledkem této hyperpolarizace je inhibice uvolňování excitačních neurotransmiterů a snížení vnímavosti postsynaptické membrány. Stimulace GABA A receptorů zajišťuje rychlý přenos, zatímco stimulace GABA B receptorů vede k pomalé 20

27 reakci, která je zároveň spojena s aktivací G proteinů (Bowery 1993;Kerr and Ong 1995). GABAergní systém hraje úlohu v ovlivnění akutní, chronické, neuropatické i centrální bolesti. Agonista GABA B receptorů baklofen je účinný v terapii neuropatické bolesti, kde dosahuje lepších výsledků než agonista GABA A receptorů muscimol (Hao et al. 1992). Glycinové receptory glycinové receptory patří do skupiny ligandem otevíraných iontových kanálů a hrají důležitou roli v regulaci přicházejících aferentních stimulů. Serotoninové receptory serotoninem zprostředkovaná inhibice bolesti byla na míšní úrovni popsána již v roce 1978 (Basbaum and Fields 1978). Intrathekálně podávaný serotonin může v závislosti na dávce buď inhibovat (Hylden and Wilcox 1983;Yaksh and Wilson 1979) nebo stimulovat (Clatworthy et al. 1988) přenos bolesti. Na výsledném efektu se mohou podílet 3 různé typy serotoninových receptorů. Patří mezi ně receptory 5HT 1B (5-HT 1D u člověka), 5HT 2 a 5HT 3. Většina prací se shoduje na tom, že na selektivní inhibici nocicepce se podílí 5-HT 1B/D receptor (Alhaider and Wilcox 1993;el-Yassir et al. 1988). Aktivace 5HT 2C receptorů může vést k pro nebo i antinocicepčnímu působení (Hylden and Wilcox 1983;Yaksh and Wilson 1979). Adenosinové receptory - předpokládá se, že jak A1, tak i A2 adenosinové receptory se účastní nociceptivního přenosu na míšní úrovni (Sawynok and Sweeney 1989). A1 adenosinové receptory hrají dominantní roli při analgetickém působení (Karlsten et al. 1991). Intrathekálně podávané analogy adenosinu inhibují nociceptivní děje (DeLander and Wahl 1988). Kanabinoidní receptory (CB) do skupiny kanabinoidních receptorů patří CB 1 a CB 2 receptory, oba typy spřažené s G-proteiny. CB 1 receptory se vyskytují zejména centrálně, ale nalezneme je také v srdci, cévách či varlatech. CB 2 receptory se nacházejí především v leukocytech, monocytech či makrofázích. Látky stimulující CB 1 receptory mají silný analgetický účinek, uvádí se, že srovnatelný s účinkem opioidů. Kanabinoidy pak v kombinaci s opioidy (zejména morfinem a kodeinem) vykazují významný synergický antinociceptivní 21

28 účinek. Tento synergní účinek je možné potlačit podáním antagonistů kanabinoidů nebo antagonistů opioidních receptorů (Welch and Eads 1999) Kaskáda dějů na míšní úrovni aktivovaná tkáňovým poškozením Kaskáda dějů (aktivovaná tkáňovým poškozením nebo zánětem) je na míšní úrovni vyvolaná uvolněním aminokyselin (glutamátu a aspartátu) a peptidů (substance P) aktivujících NMDA, AMPA/kainátové a NK1 receptory. Stimulací těchto receptorů dochází k aktivaci míšních kináz, fosfolipáz a syntetáz. Při tkáňovém poranění (nebo při zánětu) může také docházet k uvolnění cytokinů, jakými jsou např. TNF-α nebo IL-1ß. V případě systémového nebo intrathekálního podání těchto substancí můžeme v organismu navodit hyperalgezii (Reeve et al. 2000;Watkins et al. 1995). Příchozí bolestivý stimul může být zároveň v míše modulován prostřednictvím dalších systémů (opioidní, GABAergní, serotoninový, adrenergní, adenosinový či cholinergní). Aktivace C vláken vede k depolarizaci a zvýšení intracelulární hladiny vápníku, což aktivuje mimo jiné fosfolipázu A 2, která zvyšuje hladinu kyseliny arachidonové a spouští tak kaskádu vedoucí k formaci různých druhů prostaglandinů. V míše jsou zastoupeny především fosfolipázy A 2 (PLA 2 ) (případně fosfolipáza C), které mohou být dále vzhledem ke své primární struktuře, ale i dalším charakteristikám, řazeny do dalších skupin. V praxi však bývají tyto fosfolipázy děleny pouze do tří podskupin: kalcium-dependentní cytosolická PLA 2 (cpla 2 ) kalcium-independentní cytosolická PLA 2 (ipla 2 ) sekretorická PLA 2 (spla 2 ) (Dennis 1997). Přítomnost fosfolipázy A 2 v zadních rozích míšních a motoneuronech byla potvrzena pomocí imunologických metod např. u potkanů nebo u opic (Ong et al. 1999) a pomocí Western blottingu pak v míše potkanů (Samad et al. 2001). Zatímco u potkana byla prokázána 22

29 konstituční exprese všech fosfolipázových forem, u člověka byla zatím prokázána konstituční přítomnost pouze ipla 2 (Larsson Forsell et al. 1999) Úloha prostaglandinů v přenosu bolesti v míše Prostaglandiny (PGD 2, PGE 2, PGF 2alfa a PGI 2 ) jsou finální produkty metabolismu kyseliny arachidonové, vznikající pomocí cyklooxygenáz a posléze reduktáz či izomeráz, mající v organismu širokou škálu fyziologických a patofyziologických účinků (Smith 1989). Po uvolnění se váží na specifické receptory označované jako DP, EP, FP, IP, tedy specifické receptory pro PGD 2, PGE 2, PGF 2alfa a PGI 2. Tyto receptory se nachází v plazmatické membráně a jsou spřaženy s G proteiny (Armstrong and Wilson 1995;Negishi et al. 1995;Schuster 1998;Versteeg et al. 1999). Aktivace prostaglandinových receptorů spouští celou řadu vnitrobuněčných signálů, které mohou být stimulační stimulace adenylátcyklázy (Narumiya et al. 1999;Negishi et al. 1995) případně fosfolipázy C (Yousufzai et al. 1988) nebo inhibiční (snížení tvorby camp). Pomocí in situ hybridizace a některých imunohistochemických metod byla prokázána přesná lokalizace prostaglandinových receptorů. EP 1, EP 2, EP 3, EP 4 (Donaldson et al. 2001;Kawamura et al. 1997) a IP (Matsumura et al. 1995) receptory se nacházejí v superficiálních vrstvách míchy a DP, EP 1, EP 3 a IP receptory v neuronech zadních rohů míšních (Oida et al. 1995;Wright et al. 1999). Uvolňování prostaglandinů na míšní úrovni K uvolňování prostaglandinů na míšní úrovni může docházet buď za bazálních podmínek, nebo může být jejich uvolňování indukováno akutním bolestivým stimulem, periferním zánětem, podáním některých mediátorů nebo poškozením míchy. 23

30 a) Bazální uvolňování - bazální uvolňování prostaglandinu E a F bylo poprvé prokázáno u žab (Ramwell et al. 1966). U psů byly za bazálních podmínek prokázány vyšší koncentrace PGE 2 a PGI 2 v porovnání s PGF 2alfa. U člověka byly v mozkomíšním moku zjištěny vyšší koncentrace PGI 2, středně vysoké hladiny PGF 2alfa a nízké hladiny PGE 2 a celkově byly tyto hladiny mnohem nižší, než ty, které byly nalezeny u zvířat (Nishisho et al. 1996). Studie zkoumající bazální uvolňování prostaglandinů v zadních rozích míšních u potkanů prokázaly spontánní uvolňování PGE 2, v menší míře pak uvolňování PGI 2 (Dirig et al. 1997;Malmberg and Yaksh 1994). Bazální uvolňování míšního PGE 2 bylo také prokázáno u laboratorních myší (Guhring et al. 2000). b) Indukované uvolňování prostaglandinů: akutní nociceptivní stimulace po tepelné stimulaci (50 C) zadních tlapek potkanů dochází na míšní úrovni ke zvýšenému uvolňování PGE 2, ale ne PGF 2alfa či PGI 2 (Coderre et al. 1990). Po s.c. injekci formalínu do zadní tlapky dochází v lumbální části míchy ke zvýšení hladiny PGE 2. Formalín ovlivňuje nociceptivní chování (lízání a zvedání packy), a to jak v časné fázi (0-10 minut), tak i v pozdní části stejnojmenného testu (15-60 minut) (Porro and Cavazzuti 1993). Při podávání 5% formalínu, bylo pozorováno výrazně vyšší uvolňování PGE 2, a to jak v časné, tak i v pozdní fázi formalínového testu (Malmberg and Yaksh 1995a;Malmberg and Yaksh 1995b;Muth- Selbach et al. 1999). Jestliže je ale formalín podáván v nižších koncentracích (0,5%) dochází k signifikantnímu navýšení PGE 2 jen v časné fázi tohoto testu (Hua et al. 1997). Zvýšené množství PGE 2 v časné fázi formalínového testu je doprovázeno zvýšeným uvolňováním excitačních aminokyselin - glutamátu a aspartátu, ale i inhibičního glycinu a taurinu (Malmberg and Yaksh 1995a;Malmberg and Yaksh 1995b). S.c. podání morfinu v rámci tohoto testu snižuje nociceptivní chování a zároveň vede k menšímu uvolňování prostaglandinů a některých excitačních aminokyselin 24

31 (Malmberg and Yaksh 1995b). Otok tlapky, bolestivé chování a uvolňování PGE 2 spojené s podáním formalínu je také výrazně redukováno po podání kapsaicinu (Hua et al. 1997). periferní zánět injekce kaolinu spolu s karageninem do kolenního kloubu potkanů způsobí během 10 minut signifikantní navýšení uvolňování PGE 2 v lumbální části míchy, doprovázené zvýšeným uvolňováním glutamátu, aspartátu, serinu a citrulinu (Yang et al. 1996a). Toto zvýšené zvolňování PGE 2 je doprovázeno zvýšeným množstvím COX-2 proteinu (ne však COX-1 proteinu) (Ebersberger et al. 1999). Injekční podání Freundova adjuvans do zadní tlapky způsobuje zvýšené uvolňování PGI 2, méně pak PGE 2, s maximem ve dvou různých časových intervalech - 8 hodin a 7 dní po podání adjuvans (Hay and de Belleroche 1998). synaptické mediátory intrathekální podání NMDA vede u potkanů během 30 minut po podání ke zvýšenému uvolňování PGE 2, glutamátu, aspartátu a taurinu v zadních rozích míšních (Koetzner et al. 2004). Intrathekální aplikace kainátu indukuje zvýšené uvolňování PGE 2, glutamátu a aspartátu (Yang et al. 1996b). Intrathekální podání substance P, vede ke zvýšenému uvolňování míšních PGE 2 v průběhu pěti minut od podání a je doprovázeno tepelnou hyperalgezií, zvýšeným uvolňováním glutamátu a taurinu (Hua et al. 1999). Podání antagonistů NK1 receptoru, RP67580 a SR140333, dokáže zabránit rozvoji hyperalgezie a zvýšenému uvolňování PGE 2, tyto látky však neovlivňují uvolňování excitačních aminokyselin. mechanické poškození míchy poškození míchy in vivo vyvolává zvýšené uvolňování PGI 2 u psů, s maximem 3 hodiny po poškození (Nishisho et al. 1996). Stejný efekt byl pozorován i u potkanů, s maximem uvolňování PGI 2 ve dvou různých časových intervalech, po 15 minutách a poté 8 hodinách od poškození (Tonai et al. 1999). Kromě zvýšeného uvolňování PGI 2 byla u těchto zvířat také zaznamenána zvýšená exprese mrna pro IL1α, IL-1ß a COX-2. 25

32 Účinky prostaglandinů na míšní úrovni Intrathekální podání prostaglandinů nebo agonistů prostaglandinů vede ke vzniku dvou různých fenoménů. Po intrathekálním podání prostaglandinů může docházet ke zvýšení odpovědi na bolestivý stimul a ke vzniku hyperalgezie. Takto navozená hyperalgezie je charakterizovaná snížením doby, po kterou si zvířata lížou postiženou tlapku nebo vyskakují po umístění na horkou plotnu (50 C), švihají ocasem při tepelném stimulu nebo odtahují tlapku při bolestivém tlaku. K velmi výraznému navýšení počtu protažení dochází u myší ve writhing testu, tedy po aplikaci kyseliny octové do peritonea. Na druhé straně, intrathekální aplikace prostaglandinů vyvolává allodynii, tedy stav, kdy je bolest vnímána i při stimulech, které bolest za normálních okolností nevyvolávají. K rozvoji hyperalgezie i allodynie dochází během několika minut po intrathekálním podání prostaglandinů a trvá obvykle kolem 1 hodiny. Hyperalgezie i allodynie, navozené pomocí intrathekálního podání PGE 2, mohou být velmi výrazně zmírněny u zvířat, kterým byl injikován kapsaicin. Po podání PGD 2 je také možné navodit hyperalgezii (a v malé míře také allodynii), která je citlivá k podání kapsaicinu. Oproti tomu podání PGF 2α vyvolává pouze allodynii a jejímu vzniku nelze předcházet pomocí kapsaicinu (Ferreira and Lorenzetti 1996;Malmberg et al. 1995;Minami et al. 1995a;Minami et al. 1994a;Minami et al. 1994b;Minami et al. 1996;Minami et al. 1995b;Minami et al. 1992;Minami et al. 1994c;Nishihara et al. 1995;Taiwo and Levine 1988;Uda et al. 1990). Hyperalgezie indukovaná podáním PGE 2 může být simulovaná podáním agonistů EP 1 a EP 3 receptoru a blokována podáním antagonisty EP 2 receptoru a antagonisty NMDA receptorů. Na rozdíl od hyperalgezie vyvolané podáním PGE 2, hyperalgezie vyvolaná podáním PGD 2 je blokovatelná podáním antagonistů NK1 receptoru. Jak již bylo uvedeno výše, podání PGE 2 vyvolává kromě hyperalgezie také allodynii, která může být simulována podáním agonistů EP 1 a EP 3 receptoru. Na rozdíl od allodynie vyvolané podáním PGE 2, allodynie vyvolaná PGF 2α není ovlivněna podáním kapsaicinu, 26

33 ale může být zeslabena podáním agonistů α1, α2 nebo GABA B receptorů (Ferreira and Lorenzetti 1996;Minami et al. 1995a;Minami et al. 1994a;Minami et al. 1994b;Minami et al. 1996;Minami et al. 1995b;Minami et al. 1992;Minami et al. 1994c;Narumiya et al. 1999;Nishihara et al. 1995;Taiwo and Levine 1988;Uda et al. 1990). 1.4 Vedení bolestivých impulzů z míchy Periferní dráha bolesti končí synapsí na neuronech zadních rohů míšních. Z nich vedou bolestivé dráhy pomocí tractus spinothalamicus nebo tractus spinoreticulothalamicus do thalamu a poté do podkorových a korových center. Tractus spinothalamicus vede bolest z povrchových Rexedových zón (I-III) do thalamu (do tzv. ventrobazálního komplexu), odkud se bolestivý impuls projikuje do somatosenzorické kůry (gyrus postcentralis). Tyto dráhy vedou převážně ostrou, akutní bolest. Tractus spinoreticulothalamicus je fylogeneticky starší dráha, přenášející tupou, špatně lokalizovanou bolest. Tato dráha vede bolest nejprve do retikulární formace a odtud do thalamu, konkrétně do mediálních thalamických jader (centrum medianum). Odtud je pak bolest vedena do prefrontální mozkové kůry. Další dvě dráhy mohou vést bolest přes nucleus parabrachialis do hypothalamu nebo do amygdaly (Obr. 6) (Rokyta R. 2006). 27

34 Obr. 6 Dráhy bolesti. Upraveno podle (Rokyta R. 2006).

35 1.5 Animální modely bolesti Obecně se modely bolestí u zvířat rozdělují do dvou velkých skupin modelů bolesti akutní a chronické. Základním dělícím parametrem je doba trvání bolesti. V modelech akutní bolesti se jedná o sekundy, maximálně však o 1 den trvání bolesti a bolest bývá vyvolaná přesně definovanou, krátkodobou stimulací (teplo, chlad, tlak atd.). Odpovědí na takovouto krátkodobou stimulaci je pozorování typických projevů bolestivého chování (olizování nebo zvedání tlapky, třepání, vyskakování atp.), případně sledování tzv. únikové reakce zvířete. Pokud hovoříme o modelech chronické bolesti, takto vyvolaná bolest přetrvává nejméně po dobu několika dnů. Zvláštní (samostatnou) skupinu pak tvoří modely neuropatické bolesti (Franěk M. 2006) Modely akutní bolesti 1/ Tail-flick test (test švihnutí ocasem) Test švihnutí ocasem patří mezi nejstarší modely bolesti poprvé byl popsán téměř před 70 lety (D Amour F.E.and Smith D.L. 1941). Test spočívá v tom, že špička ocasu fixovaného zvířete je zahřívána a sleduje se rychlost (v sekundách) jakým zvíře ocas od tepelného zdroje odtáhne. Intenzita tepelného stimulu se nastavuje před začátkem experimentu a v průměru bývá dosahováno času v rozmezí od 7 do 10 sekund (prodlužování tohoto času je pak interpretováno jako analgetický efekt). 2/ Hot-plate test (test na horké plotně) Tento test byl poprvé popsán v roce 1944 a spolu s tail-flick testem patří mezi nejvíce používané testy pro zjišťování akutní bolesti u zvířat (Woolfe G 1944). Test se provádí na horké kovové plotně, která je postupně zahřívána. Na začátku experimentu, bývá plotna zahřáta na C, tedy na teplotu, která nevyvolává žádné bolestivé stimuly. Postupně je teplota zvyšována, s maximem v rozmezí mezi C. Zvíře, které se na takto zahřátou 29

36 plotnu umístí, je sledováno do té doby, dokud se u něho nezačne projevovat bolestivé chování olizování, třepání, odlehčování tlapky či poskakování. Při uspořádání tohoto testu je možné používat různé teploty, na které je plotna zahřívána. Teploty okolo 55 C se používají při testování silných analgetik, zatímco teploty okolo 50 C se používají ke sledování účinku slabších (neopioidních) analgetik. Existuje i modifikace tohoto testu, kdy se namísto zahřívání využívá ochlazování plotny. 3/ Formalínový test Formalínový test spočívá v podkožní aplikaci zředěného formalínu do zadní tlapky laboratorního zvířete. Poprvé byl proveden v roce 1977 Dubuissonem (Dubuisson and Dennis 1977) a je zajímavý v tom, že v jeho průběhu je možné sledovat bifazický efekt (Abbott et al. 1995;Tjolsen et al. 1992). Formalín se v tomto testu podává s.c., a to v různých koncentracích, nejčastěji však v rozmezí mezi 2,5-5%. Okamžitě po podání se u zvířat rozvíjí akutní bolest a zvířata začínají s poměrně vysokou frekvencí s postiženou tlapkou cukat nebo třepat. Tato fáze trvá obvykle 5 minut a bývá označována jako 1. fáze formalínového testu a je při ní možné sledovat např. účinek léčiv na akutní bolest v důsledku dráždění nociceptorů. Po této fázi nastává doba, kdy dochází pouze k nepatrnému nebo vůbec žádnému cukání packou. Tato fáze bývá také někdy nazývána jako Q neboli klidová fáze. Po ní následuje fáze č. 2, ve které zvířata opět začínají s postiženou packou cukat. Tato fáze trvá v rozmezí od minut od aplikace formalínu a v rámci ní můžeme sledovat zánětlivou odpověď. 4/ Paw-flick test (plantar test) Hargreaves (Hargreaves et al. 1988) provedl v roce 1988 jednoduchou modifikaci testu škubnutí ocasem tím způsobem, že tento test zaměřil na cukání zadní tlapky laboratorního zvířete. Potkan (případně myš) je při tomto testu uzavřen v malém prostoru, který je vyroben z plastu a má průhledné dno. K této aparatuře je napojen zdroj, vysílající tepelný paprsek, který je namířen na povrch zadní tlapky pozorovaného zvířete. Automatizovaný detektor pak 30

37 po zapnutí měří dobu latence, za kterou zvíře s danou tlapkou ucukne a přeruší zdroj tepla. Tato doba je zaznamenávána v sekundách. Tato zdánlivě nepatrná modifikace tail-flick testu se nakonec ukázala jako velmi přínosná. Na rozdíl od tail-flick testu lze v tomto testu využít toho, že mohou být měřeny obě zadní tlapky laboratorního zvířete druhou tlapku lze tedy použít jako kontrolní. Provádění tail-flick testu může být navíc pro fixované zvíře velmi stresující. Při plantar testu je laboratorní zvíře umístěno do vymezeného prostoru, ve kterém se může volně pohybovat (zároveň se doporučuje do tohoto prostoru zvíře umístit i několikrát před samotným počátkem experimentu, aby mohlo dojít u zvířete k adaptaci na dané prostředí). Poslední výhodou tohoto testu je pak bezesporu i to, že v jeho průběhu lze velmi dobře rozlišit, zda se jedná o únikovou reakci zvířete od zdroje tepelného paprsku nebo zda se jedná jen o náhodné odstoupení sledovaného zvířete. 5/ Immersion test for thermal hypersensitivity (ponorný test tepelné hypersenzitivity) Tento test je velmi podobný tail-flick testu, s jediným rozdílem, že ocas nebo zadní tlapka laboratorního zvířete je zahříván(a) pomocí cirkulující teplé vody. Tímto testem je tedy možné zjistit, hranici tepelné bolesti u zvířat po ponoření ocasu nebo tlapky do horké vody. V tomto testu se zaznamenává doba, za kterou dojde k odtažení ocasu nebo tlapky z teplé vody nebo je možné tento test vyjádřit i v procentech, kdy se vyjadřuje % zvířat, u kterých byla daná reakce horkou vodou vyvolaná. Podobně může být také sledována hranice pro vyvolání bolesti chladem. Test probíhá stejně, jen je ocas či tlapka pozorovaného zvířete ponořena do studené vody. 6/ Cold-allodynia test (test allodynie způsobené chladem) Další metoda může být použita pro detekci allodynie způsobené chladem tzn., že k obrané reakci zvířete dochází na základě chladu, který by za normálních okolností tuto reakci nevyvolal. Metoda je založena na umístění zvířete na kovovou podložku, která 31

38 je neustále chlazena studenou vodou. U kontrolních zvířat nedochází u této metody k žádným změnám, ovšem u zvířat, která mají nervové poškození, dochází k trvalému držení postižené tlapky nad chlazeným povrchem (Bennett and Xie 1988). Dokonalejší metoda je založena na aplikaci acetonu na kůži zvířete (Choi et al. 1994). Aceton se z plochy končetiny velmi rychlo odpařuje a přitom dochází k ochlazování končetiny. U normálních zvířat buď nedochází po aplikaci acetonu k žádným změnám, nebo krátce po aplikaci acetonu dojde k záškubu dané packy. U zvířat, která mají nějakým způsobem poškozený nervový systém, dochází k opakovaným odtažením packy, která se dají velmi snadno spočítat a zároveň se dá měřit i doba jejich trvání. 7/ Randall-Sellito paw pressure test (Randall-Sellito tlakový test) V tomto testu měření mechanického prahu bolesti (Randall and Sellito 1957) je využíván řízený hrot, který je spojen se závažím a který je pomalu sunut oproti ocasu nebo tlapce testovaného zvířete, které je umístěno na podložce. Kontinuálním zvyšováním tlaku, kterým hrot na tlapku nebo ocas zvířete působí, dochází k obranné reakci zvířete. 8/ von Freyova filamenta (vlákna) Test na sledování mechanické allodynie u laboratorních zvířat vychází z použití několika různě silných vláken tzv. von Freyových filament. Při tomto testu jsou zvířata umístěna v uzavřeném prostoru tak, aby spodní část tohoto prostoru byla volně prostupná pro daná filamenta. Po nastavení určité síly, kterou budou filamenta oproti měřené tlapce zvířete působit, se měří doba, za kterou zvíře s danou tlapkou ucukne. V tomto testu je několik možností, jak jej provést. První možností je, že se vezme střední filamentum. Pokud zvíře ucukne, střední filamentum se vymění za tenčí, pokud zvíře neucukne, filamentum se naopak vymění za silnější, a tak se pokračuje až do doby reakce testovaného zvířete (Tal and Bennett 1994). Další možností jak tento test provést, je vypočítání rozdílu mezi zvířaty, která na daný stimul reagovala a mezi těmi, která nereagovala (Chaplan et al. 1994). Třetí možností 32

39 je testování 3-4 filament a vypočítat procento odpovědí u daných zvířat po 10 aplikacích daného filamenta (Kim and Chung 1992). Von Freyova filamenta patří mezi metody, které se používají i při testování citlivosti na mechanický stimul v humánní medicíně. 9/ Writhing test (test peritoneálního dráždění) Nejstarší test pro měření akutní viscerální bolesti využívá intraperitoneální aplikace zředěné (0.7%) kyseliny octové. Tento test bývá nejčastěji prováděn na myších. Odpovědí na podání kyseliny octové jsou velmi silné kontrakce abdominálního svalstva, které jsou následovány protažením zadních končetin zvířete. Během 20 minut (v intervalech po 5 minutách) je sledována a hodnocena bolestivá odpověď ve formě počtu kontrakcí břišního svalstva. Kromě celkového počtu protažení v průběhu tohoto testu se zaznamenává i doba do prvního protažení. 10/ Distenzní modely Novější testy zkoumající akutní viscerální bolest využívají rozšíření vnitřních orgánů (dělohy nebo močového měchýře) pomocí tzv. balónkové techniky, která spočívá ve vložení balónku do konkrétního orgánu a v jeho nafouknutí vyvolávající bolest Modely chronické bolesti 1/ Adjuvancii navozená artritida Intravenózní aplikace Freundova adjuvans (CFA complete Freund s adjuvant, emulze obsahující usmrcené a vysušené Mycobacterium tuberculosis) vyvolává u zvířat mnohočetnou artritidu. Tento stav nastává s odstupem několika dnů, je však velmi progresivní a vede k výrazným otokům a pernamentnímu poškození kloubní tkáně spojeným s poklesem prahu bolesti jak na tepelný, tak i na mechanický podnět (Colpaert 1987). Alternativou k tomuto modelu je model unilaterální artritidy. Při něm dochází pomocí podkožní injekce CFA do zadní 33

40 končetiny k rozvoji jednostranné artritidy (Iadarola et al. 1988;Stein et al. 1988). Končetina, do které je CFA aplikován, je extrémně citlivá na tepelnou i na mechanickou stimulaci (na rozdíl od intaktní zadní končetiny). 2/ Zánět vnitřních orgánů Podáním iritačních látek (hořčičný olej, terpentýn) do vnitřních orgánů laboratorních zvířat je možné vyvolat zánětlivé změny trvající po dobu několika dnů. Nejvíce studií bylo provedeno u zvířat, kterým byl vyvolán zánět dělohy, střeva nebo močového měchýře (Coutinho et al. 1996;McMahon and Abel 1987;Wesselmann et al. 1998). 3/ Kalkulóza močovodu Giamberardino a kolegové (Giamberardino et al. 1995) vyvolávali kalkulózu močovodu u potkanů pomocí aplikace malého množství zubního cementu do močovodu laboratorních potkanů, který po ztuhnutí vytváří útvar podobný močovému kameni u lidí. Při pozorování těchto zvířat docházelo k opakovaným epizodám svíjivého chování, podobnému tomu, které je možné pozorovat po i.p. aplikaci kyseliny octové ve writhing testu. Každá taková epizoda trvala nejméně po dobu několika minut, s maximem trvání okolo 45 minut. Výskyt těchto bolestivých epizod byl nejčetnější po dobu prvních 3 dnů po podání zubního cementu a jejich výskyt i intenzita se postupem času snižovaly Modely neuropatické bolesti 1/ Chronic Constriction Injury (CCI model, model chronické konstrikce sedacího nervu) Tento model neuropatické bolesti byl poprvé popsán Bennetem a Xie v roce 1988 (Bennett and Xie 1988) a spočívá v provedení 4 ligatur na sedacím nervu. K rozvoji neuropatie dochází v průběhu 2-5 dnů od operace a tento stav přetrvává více než 2 měsíce. Podvázání sedacího nervu na několika místech navodí konstrikci a otok, ne však v takové míře, aby došlo 34

41 k úplné denervaci končetiny. Výsledkem CCI modelu je závažné poškození myelinyzovaných a signifikantní narušení nemyelinyzovaných nervových vláken. V tomto modelu neuropatické bolesti je u operovaných zvířat navozena tepelná i mechanická hyperalgezie a allodynie. 2/ Partial Sciatic Nerve Ligation (PSNL model, model částečné ligace sedacího nervu) Dalším modelem neuropatické bolesti je částečná ligatura sedacího nervu. V tomto modelu se provádí ligatura 1/3 až 1/2 nervus ischiadicus (Seltzer et al. 1990). K rozvoji neuropatie dochází 1-2 dny po operaci. Tímto modelem lze navodit jak mechanickou allodynii, tak i tepelnou a mechanickou hyperalgezii. 3/ Spinal Nerve Ligation (SNL model, model ligace míšních nervů) Tento model neuropatické bolesti byl popsán Kimem a Chungem (Kim and Chung 1992) a jeho podstatou je ligace míšních nervů v oblasti L5 a L6. V tomto modelu je u operovaných zvířat dosaženo mechanické allodynie a tepelné hyperalgezie. 4/ Spared nerve injury (SNI model, model částečného poranění nervu) V tomto modelu jsou nejprve provedeny dvě pevné ligatury s následným odstraněním dvou ze tří terminálních větví nervus ischiadicus (Decosterd and Woolf 2000) (Obr. 7). 5/ Experimentální modely diabetické neuropatie Nejvíce prostudovaným modelem diabetické neuropatie je model, ve kterém dochází k destrukci buněk pankreatu pomocí aplikace streptozocinu (Calcutt et al. 1996;Courteix et al. 1994;Courteix et al. 1993). Streptozocin selektivně destruuje ß buňky Langerhansových ostrůvků (Junod et al. 1967). Rychlost nástupu účinku streptozocinu je závislá na živočišném druhu, nejrychleji se změny objevují v pankreatu laboratorních potkanů, u kterých již dvě hodiny po aplikaci streptozocinu dochází k výraznému snížení citlivosti ß buněk ke glukóze. V následujících několika hodinách pak k výraznému úbytku a zničení těchto buněk. Již druhý den po aplikaci streptozocinu potkani vykazují charakteristické známky diabetu 1. typu 35

42 výraznou hyperglykémii (doprovázenou vznikem hyperalgezie a allodynie), glykosurii, polyurii a pokles koncentrace inzulinu v séru. 6/ Experimentální model postherpetické neuropatie Akutní bolest spojená s virem varicela-zoster je zkoumána na zvířatech, kterým je aplikován herpes virus do nervového systému (Fleetwood-Walker et al. 1999;Takasaki et al. 2000). U těchto zvířat pak dochází k rozvoji hyperalgezie a allodynie. 7/ Chemoterapií navozená periferní neuropatie Bolestivá periferní neuropatie bývá často vedlejší účinkem chemoterapie. Existuje mnoho experimentálních studií, ve kterých je zkoumán neurotoxický efekt chemoterapeutik, hlavně paclitaxelu, vinkristinu a cisplatiny. V těchto studiích bývají používány dávky způsobující nervové poškození (axonální degeneraci) a paralýzu. V některých případech bývá použito dávek, které se blíží dávce letální. U zvířat, kterým je paclitaxel nebo vinkristin aplikován dochází k rozvoji hyperalgezie a allodynie (Aley et al. 1996;Authier et al. 1999;Polomano et al. 2001). 36

43 Obr. 7 Modely neuropatické bolesti. Upraveno podle (Ossipov et al. 2005).

44 1.6 Současné poznatky o expresi a produkci cyklooxygenáz na míšní úrovni Modely zánětlivé bolesti K experimentálnímu navození zánětlivé bolesti dochází s.c. aplikací Freundova adjuvans (CFA), karageninu (KAR) nebo zymosanu do planty zadní tlapky laboratorních zvířat. Vývoj zánětu lze sledovat pravidelným měřením objemu postižené vs. kontrolní tlapky a za využití různých behaviorálních testů. Díky molekulárně-biologickým metodám lze měřit expresi a produkci vybraných genů. Mezi základní díla popisující expresi cyklooxygenáz na míšní úrovni patří bezesporu práce německé autorky Flory Beiche. V jejích studiích se k vyvolání periferního zánětu používalo CFA. Vývoj zánětu byl sledován zvýšením objemu zadní tlapky. Tlapky byly zřetelně oteklé po 6 hodinách od aplikace CFA. K dvojnásobnému navýšení oproti normálu docházelo během prvních tří dnů, s maximem 7. den po podání Freundova adjuvans. Kromě otoku, byla v této práci sledována exprese cyklooxygenáz. V lumbální míše byla prokázána konstitutivní exprese obou izoforem cyklooxygenázy, jak COX-1, tak COX-2. Šest hodin po podání CFA docházelo k signifikantnímu navýšení exprese COX-2 mrna oproti kontrolním zvířatům. Pokles exprese COX-2 mrna (k bazálním hladinám) byl zaznamenán během tří následujících dnů. Exprese COX-1 mrna zůstávala během celého experimentu konstantní (Beiche et al. 1996). V další práci této autorky byla zánětlivá reakce vyvolána opět intraplantárním podáním CFA a vývoj zánětlivé reakce byl sledován stejným způsobem jako v předchozí studii, pouze v rozdílných časových intervalech od podání CFA. K signifikantnímu navýšení objemu tlapek, do kterých byl CFA aplikován, docházelo v průběhu celého experimentu (se začátkem 3 hodiny a s maximem 22. den po podání CFA). Exprese cyklooxygenáz byla sledována v lumbální a cervikální míše pomocí RT-PCR. Exprese COX-1 mrna zůstávala téměř neměnná během prvního týdne po aplikaci CFA a k jejímu nárůstu nedocházelo ani při vzniku chronického zánětu den 22. Podobně tomu bylo i ve skupině kontrolních zvířat, kterým byl 38

45 namísto CFA podán fyziologický roztok. Signifikantní navýšení exprese COX-2 mrna bylo detekováno po 6 hodinách od vyvolání zánětu, s návratem k normálu během tří následujících dnů. V chronické fázi pokusu pak docházelo k opětovnému navýšení exprese COX-2 mrna. V této práci byla také popsána produkce obou cyklooxygenáz na míšní úrovni, která korespondovala s expresí obou izoenzymů. V průběhu experimentu nedocházelo na míšní úrovni k žádným výrazným změnám v produkci COX-1 proteinu. Ke statisticky signifikantnímu zvýšení produkce COX-2 proteinu však docházelo v čase, s maximem 22. den po podání CFA (Beiche et al. 1998). K potvrzení rychlého vzniku otoku po jednostranném podání CFA do planty zadní tlapky potkanů docházelo ve studiích Haye a jeho spolupracovníků, kteří popsali časově závislý nárůst objemu ipsilaternální vs. kontralaterální tlapky po podání CFA, evidentní již v rozmezí 1-2 hodin po podání a přetrvávající po dobu 14 dnů. V těchto studiích byla také potvrzena konstitutivní exprese obou izoforem cyklooxygenáz. Po podání CFA bylo pozorováno signifikantní navýšení exprese COX-2 mrna v lumbální části míchy, s maximem okolo 4. hodiny po podání CFA. Poté hladiny COX-2 mrna klesají a během 7 dnů se vrací k bazálním hodnotám. Na rozdíl od COX-2 mrna, nebyla v průběhu celé studie zaznamenána žádná indukce exprese COX-1 mrna (Hay et al. 1997). S.c. podání dexametazonu 30 minut před podáním CFA signifikantně snižovalo jak otok ipsilaterání tlapky, tak zvýšenou expresi COX-2 mrna po intraplantárním podání CFA (Hay and de Belleroche 1998). V souladu s konstitutivní expresí COX-1 a COX-2 mrna, byla na míšní úrovni popsána i konstitutivní produkce obou cyklooxygenázových proteinů (Willingale et al. 1997;Yaksh et al. 2001). V roce 2003 byla po podání CFA popsána zvýšená produkce COX-2 proteinu v lumbální části míchy, beze změn v produkci COX-1 proteinu (Seybold et al. 2003). Pokud je Freundovo adjuvans podáváno laboratorním myším, dochází k signifikantnímu navýšení exprese COX-2 mrna v lumbální části míchy v průběhu 6 hodin po podání a tento jev je možné pozorovat do 3. dne po podání CFA. K velmi výraznému analgetickému efektu 39

46 dochází při opakovaném preventivním intrathekálním podávání etodolaku (preferenčního COX-2 inhibitoru), ale ne po podání COX-1 selektivního inhibitoru mofezolaku. Po jednorázové intrathekální aplikaci IL-1ß nebo TNF-α dochází k indukci exprese COX-2 mrna a perzistentní hyperalgezii (Narita et al. 2008). V jiných animálních modelech dochází k vyvolání periferního zánětu pomocí intraplantární aplikace karageninu. Exprese obou izoforem cyklooxygenázy byla zkoumána jak v samotné tlapce, tak i v různých jiných tkáních. Před podáním karageninu byla COX-1 mrna snadno detekovatelná v plicích, játrech, slezině, ledvinách a v žaludku, zatímco hladiny COX-2 mrna byly ve sledovaných orgánech podstatně nižší, s výjimkou mozku. Po aplikaci karageninu nebyly zaznamenány žádné výrazné změny v expresi COX-1 mrna. K navýšení exprese COX-2 mrna v postižených tlapkách docházelo již během prvních 60 minut po aplikaci karageninu, s maximálním navýšením ve 3. hodině po podání karageninu (Seibert et al. 1994). V tomto modelu zánětlivé bolesti docházelo po profylaktickém podání COX-2 selektivního inhibitoru (SC-58125) k výraznému snížení otoku postižené tlapky. Vliv COX-1 a COX-2 selektivních či neselektivních inhibitorů na vznik hyperalgezie po podání karageninu byl také sledován po jejich intraperitoneální nebo intrathekální aplikaci. Tepelná hyperalgezie pozorovaná během prvních 170 minut po podání karageninu byla potlačena preventivním podáním (i.p. nebo i.t.) S-ibuprofenu a COX-2 selektivního inhibitoru SC Pouze intraperitoneální (ne však intrathekální) podání těchto látek dokáže zmírnit tepelnou hyperalgezii, pokud jsou podány až po aplikaci karageninu (Dirig et al. 1998). Zánětlivá reakce v kolenním kloubu potkanů může být navozena také podáním kombinace kaolinu (4%) s karageninem (2%). Po odebrání lumbální míchy (ve 3., 6. a 12. hodině) a provedení Western blottingu nebyla prokázána téměř žádná změna v produkci COX-1 proteinu ve všech pozorovaných časech po indukci zánětu. Oproti tomu produkce COX-2 proteinu byla signifikantně zvýšena ve všech sledovaných časech (Ebersberger et al. 1999). 40

47 Zvýšené množství COX-2 po intraplantárním podání karageninu bylo také zaznamenáno v centrálním nervovém systému (mozku a míše). K tomuto nárůstu docházelo pozvolna od 3. hodiny po podání karageninu, s maximem 6 hodinu po podání karageninu. Toto zvýšené množství COX-2 bylo doprovázeno zvýšeným uvolňování PGE 2, které bylo blokovatelené podáním COX-2 selektivního inhibitoru NS-398. Tepelná hyperalgezie, evidentní od 1. hodiny po podání karageninu a přetrvávající až do 6 hodiny, byla snížena intrathekálním podáním COX-2 selektivního inhibitoru NS hodiny po podání karageninu (Ibuki et al. 2003). Po intraplantárním podání zymosanu (0.5, 1 nebo 2%) do planty zadní tlapky laboratorních myší dochází podobně jako po podání karageninu nebo CFA k rozvoji edému a tepelné hyperalgezie. Preventivní podání COX-2 selektivního inhibitoru parecoxibu nemělo vliv na rozvoj tepelné hyperalgezie, ale mělo vliv na výsledky v tail-flick testu. Ve studii byla také zaznamenána zvýšená exprese COX-2 mrna v postižené tkáni, míše a mozku. Maximum exprese bylo zaznamenáno v rozmezí mezi 12 a 24 hodinou po podání zymosanu, v případě COX-2 proteinu bylo maximální produkce dosaženo po 6 hodinách od podání zymosanu (Jain et al. 2008) Model pooperační bolesti Model pooperační bolesti byl poprvé popsán v roce 1996 (Brennan et al. 1996). V rámci tohoto modelu se experimentálním zvířatům v anestezii provede na platně zadní tlapky 1 cm dlouhý řez protínající kůži, fascii a sval. Po zákroku je rána sešita 1-2 stehy. Na rozdíl od modelu zánětlivé bolesti, byla v modelu pooperační bolesti zjištěna důležitá úloha COX-1. V tomto modelu incize zadní tlapky byla na míšní úrovni prokázána konstitutivní exprese COX-1. K navýšení množství COX-1 docházelo jeden den po operaci, k maximálním hodnotám však docházelo 2 dny po incizi. Intrathekální podání COX-1 inhibitorů (ketorolaku nebo SC-560) zmírňovalo mechanickou allodynii (zvyšovalo práh 41

48 citlivosti po mechanickém dráždění von Freyovými filamenty), zatímco NS-398, selektivní inhibitor COX-2, tento účinek postrádal (Zhu et al. 2003). K podobným výsledkům docházelo při preventivním intrathekálním podání stejných COX-1 inhibitorů 15 minut před vlastní incizí zadní tlapky. Analgetický efekt podávaných látek byl sledován od 2. hodiny po operaci do 5. dne od operace. Ve všech sledovaných intervalech byl prokázán analgetický účinek COX-1 selektivních inhibitorů, zatímco COX-2 selektivní inhibitor (NS-398) tento efekt postrádal (Zhu et al. 2005). Podobné výsledky ukazující na důležitou roli COX-1 při pooperační bolesti byly pozorovány u potkanů, kterým byla provedena laparotomie, kde byl pozorován výrazný efekt selektivního inhibitoru COX-1 SC-560, ale k žádným výrazným změnám nedocházelo po podání COX-2 selektivního inhibitoru NS-398 (Martin et al. 2006). Systémové a intrathekální podání COX-1 selektivního inhibitoru SC-560 zároveň snižovalo hypersenzitivitu na mechanický podnět u 4 týdnů starých laboratorních potkanů v tomto modelu pooperační bolesti. Zároveň u těchto potkanů docházelo k signifikantnímu navýšení exprese COX-1 mrna po 6 a 24 hodinách od operace. K signifikantnímu navýšení docházelo i v případě produkce COX-1 proteinu (Ririe et al. 2006). Produkce COX-2 proteinu po incizi zadních tlapek byla popsána v roce 2004 (Kroin et al. 2004). K minimálním změnám v produkci COX-2 proteinu dochází 3 a 6 hodin po operaci, tyto změny však nejsou v porovnání s kontrolními zvířaty statisticky signifikantní Model osteoartrózy Experimentální model osteoartrózy související s podáním monojódacetátu (MIA) byl popsán již v roce 1987 (Kalbhen 1987). Monojódacetát jako inhibitor glykolýzy v chondrocytech působí jejich zánik a vede k rychlé degeneraci kloubní chrupavky. Tento experimentální model svými patofyziologickými a histologickými vlastnostmi nejvěrněji napodobuje humánní osteoartrózu (Guingamp et al. 1997). Detailněji byl prozkoumán v roce 42

49 2003 (Guzman et al. 2003), kdy byla experimentální zvířata pozorována v průběhu 56 dnů po podání MIA do kolenního kloubu. Již v průběhu prvních 7 dnů po podání MIA docházelo k degeneraci, případně nekróze chondrocytů. Zároveň bylo zaznamenáno navyšování počtu osteoklastů. Od 28. dne po podání MIA docházelo k velmi výraznému navýšení aktivity osteoklastů, k fibróze a prokazatelnému narušení kostní trámčiny. 56. den po podání již byly zřetelně viditelné oblasti, ve kterých docházelo ke kostní remodelaci a resorpci. Z farmakologické stránky byl model prozkoumán v následujících letech, kdy byla po podání MIA prokázána výrazná allodynie po mechanickém stimulu měřená pomocí von Freyových filament. Tato allodynie byla pozorována po celou dobu 10 týdnů, po kterou daná studie trvala, s počátkem od 7. dne a s maximem mezi dnem po podání MIA. S.c. podání morfinu nebo perorální (p.o.) podání tramadolu inhibovalo vznik allodynie spojené s intraartikulárním podáním MIA (Combe et al. 2004). Účinnost morfinu v tomto modelu osteoartrózy byla potvrzena i v další práci, kde svůj efekt prokázaly také p.o. podaný paracetamol nebo s.c. podaný diklofenak. Zatímco účinek morfinu přetrvával po dobu 28 dnů po podání MIA, účinek diklofenaku a paracetamolu byl zřetelný pouze na začátku experimentu (3. den po podání MIA) (Fernihough et al. 2004). Z dalších farmak se jako efektivní v tomto modelu jeví celecoxib, který však není účinný po jednorázovém podání, ale po podáním opakovaném (30 mg/kg p.o. 2x denně po dobu 10 dnů)(pomonis et al. 2005). V novějších studiích byl pak model osteoartrózy zkoumán z hlediska bolesti, která se u zvířat projevuje při chůzi pomocí CatWalk systému (Ferreira-Gomes et al. 2008). Tento experimentální model osteoartrózy nebyl doposud charakterizován z pohledu exprese ani produkce COX-1 a COX-2 na míšní úrovni. Expresní studie byly prozatím popsány pouze v patele a synoviu. V roce 1998 byla publikována práce, ve které byla zkoumána exprese obou izoforem cyklooxygenáz v synoviální tkáni pacientů s osteoartózou. Zvýšená exprese byla zaznamenána pouze u COX-2 mrna, ne však u COX-1 mrna (Siegle et al. 1998). V jiné studii, provedené již na laboratorních potkanech, byla zkoumána exprese COX-2 mrna 43

50 v patele a synoviu. V patele docházelo již druhý den po podání MIA k více než dvojnásobnému navýšení exprese COX-2 mrna. Tato exprese se však časem snižovala a 5. a 10. den po podání MIA byla na úrovni kontrolních zvířat. 2. den po podání MIA docházelo také ke zvýšené expresi COX-2 mrna v synoviu. Pokles exprese byl zaznamenán 5. den, ale k opětovnému navýšení v expresi docházelo 10. den po aplikaci MIA (Dumond et al. 2004) Modely neuropatické bolesti Rozporuplné výsledky týkající se exprese a produkce cykloxooxygenáz v míše byly popsány v různých modelech neuropatické bolesti. V modelu dle Kima a Chunga byla popsána důležitá úloha COX-1 během prvních 4-8 hodin po ligaci míšních nervů v oblasti L5 a L6 (Hefferan et al. 2003). Pomocí imunohistochemických metod byla v zadních rozích míšních detekována COX-1. K jejímu signifikantnímu navýšení docházelo 4. a 14. den po ligaci (Zhu et al. 2003). Nutno ovšem podotknout, že v této studii nebyla sledována přítomnost COX-2. V jiné práci, kde už byly sledovány obě izoformy cyklooxygenázy bylo pomocí Western blot analýzy již druhý den po ligaci pozorováno signifikantní navýšení COX-2 proteinu v míše a thalamu. 3. a 14. den po ligaci však došlo k poklesu hladiny COX-2 proteinu na úroveň srovnatelnou s kontrolní skupinou. Na rozdíl od COX-2, přítomnost COX-1 proteinu nebyla na míšní úrovni vůbec zaznamenána (Zhao et al. 2000). V této studii bylo také prokázáno, že intrathekální podání indometacinu 2 hodiny nebo 1 den po ligaci míšních nervů zmírňuje rozvoj mechanické allodynie. V případě, že byl indometacin podán delší dobu po ligaci (14 dní), k rozvoji analgetického účinku nedocházelo. K podobným výsledkům dospěla i jiná studie, ve které byl zkoumán účinek intrathekálně podaného meloxikamu. Stejně jako v předchozí práci, pokud byl meloxikam podán okamžitě po ligaci míšních nervů docházelo k potlačení rozvoje 44

51 mechanické allodynie i tepelné hyperalgezie. Pokud byl ale meloxikam podán pooperačně (7 dnů po ligaci míšních nervů) jeho účinek byl velmi nevýrazný (Takeda et al. 2005). Zvýšená produkce COX-2 proteinu, neuronální NO syntázy (nnos) a inducibilní NO syntázy (inos) v porovnání s kontrolní skupinou byla zaznamenána po 3 dnech od ligace míšních nervů (O'Rielly and Loomis 2006). Ve stejné době docházelo i k mírnému navýšení produkce COX-1, její množství však bylo srovnatelné s kontrolní skupinou. V modelu částečné ligace sedacího nervu byla v roce 2002 popsána rozporuplná účinnost nesteroidních antiflogistik podaných 4 týdny po provedení částečné ligace sedacího nervu. V této práci byl popsán antiallodynický účinek COX-1 inhibitoru ketorolaku. Po jeho intrathekálním podání byl již po 2 hodinách zaznamenán antiallodynický efekt, který přetrvával po dobu 6 dnů. Účinek COX-2 selektivního inhibitoru (NS-398) byl pozorován také po 2 hodinách od i.t. podání, jeho účinek byl však několikanásobně kratší (pouze 24 hodin). Žádný efekt nebyl pozorován po podání piroxicamu (Ma et al. 2002). Významná úloha COX-1 v tomto modelu byla zaznamenána v roce 2003 (Zhu et al. 2003). V nedávné době byl u myší, u kterých byla provedena částečná ligace sedacího nervu, popsán antiallodynický účinek etodolaku (COX-2 preferenčního inhibitoru). Zajímavé však je, že ve stejné studii nebyl prokázán analgetický účinek COX-2 selektivního inhibitoru celecoxibu (Inoue et al. 2009). Rozdílné jsou i výsledky při chronické konstrikci sedacího nervu. Některé práce popisují účinnost selektivních COX-2 inhibitorů v tomto modelu neuropatické bolesti (Suyama et al. 2004), jiné práce však tyto výsledky vyvracejí (Padi and Kulkarni 2004). Při částečném poranění nervu (SNI model neuropatické bolesti) byla zjištěna mírně zvýšená exprese míšní COX-2 mrna. K nesignifikantnímu navýšení exprese docházelo již po 12 hodinách, s maximálním navýšením po 24 hodinách od operace. Pokles exprese COX-2 mrna na kontrolní úroveň byl zaznamenán v průběhu 72 hodin (Broom et al. 2004). V tomto modelu ale nebyla sledována exprese COX-1 mrna, její úloha v tomto modelu tedy zůstává i nadále nejasná. 45

52 Výskyt COX-1 i COX-2 proteinu v lumbální části míchy byl prokázán v modelu diabetické neuropatie. U laboratorních potkanů, u kterých byl diabetes vyvolán intraperitoneálním podáním streptozocinu, docházelo v porovnání s kontrolami, k signifikantnímu snížení produkce COX-1 proteinu a k signifikantnímu zvýšení produkce COX-2 proteinu (Freshwater et al. 2002). Zvýšené množství COX-2 proteinu bylo pozorováno i v jiné práci, kde bylo zaznamenáno signifikantní navýšení COX-2 proteinu již od prvního týdne po rozvoji diabetu a toto zvýšené množství zůstávalo neměnné i po 2. a 4. týdnech od začátku experimentu. Pokud byl u těchto diabetických zvířat proveden formalínový test, docházelo k navození analgetického účinku při preventivním intrathekálním podání indometacinu nebo antagonistů prostaglandinových receptorů (Ramos et al. 2007). Analgetický účinek intrathekálně podaných COX-2 selektivních inhibitorů byl potvrzen v jiné práci, kde bylo zároveň prokázáno, že v tomto modelu neuropatické bolesti COX-1 selektivní nebo i neselektivní COX inhibitory zůstávají neúčinné (Matsunaga et al. 2007). Aktuálně byl antiallodynický účinek COX-2 preferenčního inhibitoru meloxikamu prokázán i u diabetických myší (Kimura and Kontani 2009). Přehledová tabulka uvádějící expresi a produkci jednotlivých izoforem cyklooxygenáz na míšní úrovni v různých modelech bolesti na experimentálních potkanech je uvedena níže (Tab. 2). zánět COX-1 exprese COX-1 produkce COX-2 exprese COX-2 produkce nemění se a,b,c,f nemění se b,e,g a,b,c,d,f b,e,g a Beiche1996, b Beiche 1998, c Hay 1997, d Hay 1998, e Seybold 2003, f Seibert 1994, g Ebersberger 1999 operace i h,i? nemění se j h Zhu 2003, i Ririe 2006, j Kroin 2004 osteoartróza???? neuropatie?? nemění se k? k Broom 2004 Tab. 2 - Exprese a produkce COX-1 a COX-2 na míšní úrovni v různých modelech bolesti ( =zvýšení, = snížení,? = nebylo testováno). 46

53 2 Cíle práce S ohledem na výše uvedený literární přehled (zejména na dosavadní poznatky o expresi a produkci cyklooxygenáz na míšní úrovni uvedené v části 1.6) měla tato dizertace dva hlavní cíle: 1/ Zjistit zda, případně jak, se mění exprese a produkce COX-1 a COX-2 v míše u různých typů bolestí. Je známo, že u zánětlivé bolesti dochází na míšní úrovni ke zvýšení exprese a produkce COX-2, nikoliv však COX-1. Snažili jsme se proto zjistit, zda je tomu tak i u jiných typů bolestí. Změny exprese a produkce míšní COX-1 a COX-2 jsme zjišťovali v experimentálních modelech: a/ zánětlivé bolesti, b/ pooperační bolesti, c/ osteoartrózy, d/ neuropatické bolesti. 2/ Zjistit jak působí různá analgetika v ekvipotentních dávkách na expresi a produkci COX-1 a COX-2 v míše u zánětlivé bolesti. Údaje o účinku farmak, včetně analgetik, na expresi a produkci COX-1 a COX-2 v míše u různých typů bolestí jsou zcela ojedinělé a neposkytují žádnou ucelenější informaci. Proto jsme se snažili zjistit a porovnat účinky šesti neopioidních a jednoho opioidního analgetika ve srovnatelných ekvianalgetických dávkách na expresi a produkci COX-1 a COX-2 v míše u zánětlivé bolesti (v experimentálním modelu, který je zatím nejpropracovanějším v této oblasti). 47

54 3 Použité metody 3.1 Experimentální zvířata Ve všech experimentech, které byly provedeny v rámci této disertační práce, jsme používali potkaní samce kmene Wistar albino (VÚFB Konárovice). Zvířata byla chována za standardních laboratorních podmínek (při kontrolované teplotě C) v místnosti s řízeným denním režimem 12 hodin světlo/12 hodin tma. Zvířata byla krmena standardní stravou (Pelet, St1; VELAZ, Česká republika) a měla neomezený přístup k vodě. Vždy před pokusem byla zvířata adaptována na podmínky laboratoře minimálně 1 hodinu před začátkem vlastní práce. Všechny experimenty byly schváleny etickou komisí pro laboratorní zvířata při 3. LF UK. 3.2 Použité experimentální modely bolesti Model zánětlivé bolesti k vyvolání zánětlivé bolesti docházelo po intraplantárním podání 150 µl 1% λ-karageninu (Sigma-Aldrich) do pravé zadní tlapky experimentálních zvířat. Jako kontrolní byla použita skupina zvířat, kterým byl intraplantárně podán stejný objem fyziologického roztoku a zároveň byla sledována odpověď na bolestivý stimul i v intaktní (levé) zadní tlapce. Model pooperační bolesti model pooperační bolesti byl proveden dle Brennana (Brennan et al. 1996). V anestezii (navozené podáním kombinace ketaminu a xylazinu) byl experimentálním zvířatům proveden podélný řez na plantě zadní tlapky, protínající kůži, fascii a sval, který byl následně sešit pomocí 1-2 stehů. Po provedení tohoto zákroku byla zvířata jednotlivě sledována, až do doby probuzení z anestezie. Jako kontrolní byla použita skupina zvířat, které nebyla incize tlapky provedena a zároveň byla sledována odpověď i v kontralaterální (levé) zadní tlapce. 48

55 Model osteoartrózy osteoartróza byla navozena pomocí intraartikulárního podání monojódacetátu (2 mg/25 µl) (Sigma-Aldrich) do pravého kolene anestetizovaných (pomocí halothanu) zvířat. Kontrolní skupině byl do pravého kolenního kloubu injikován fyziologický roztok. Mimo kontrolní skupiny byl sledován vliv experimentálně navozené osteoartrózy i na neporušenou (levou) zadní tlapku. Model neuropatické bolesti pro naše experimenty jsme zvolili model částečného poranění nervu (SNI) dle Decosterd a Woolfa (Decosterd and Woolf 2000). V tomto modelu je v průběhu anestezie experimentálním zvířatům provedeno podvázání a následné odstranění dvou ze tří koncových částí sedacího nervu. U kontrolních zvířat je proveden podobný zákrok s tím rozdílem, že sedací nerv je pouze stlačen pomocí pinzety (zhruba na dobu 30 sekund). Po ošetření je rána sešita několika stehy. 3.3 Metody měření bolesti Plantar test testování nocicepční citlivosti zadních končetin na tepelný podnět bylo prováděno pomocí plantar testu (Plantar test 7371, Ugo Basile, Itálie) před a ve vybraných časech po indukci bolesti dle postupu, který byl popsán v roce 1988 (Hargreaves et al. 1988). Při tomto testu jsou zvířata umístěna do plexisklových boxů o velikosti cm, které jim umožňují volný pohyb. Po 15 minutové adaptaci na toto prostředí, je pomocí pohyblivého zdroje infračerveného záření možné nastavit teplený paprsek pod testovanou končetinu a následně spustit. V okamžiku, kdy tepelná stimulace nabývá nociceptivního charakteru, se u experimentálních zvířat aktivuje obranný flexní reflex s odtažením končetiny od tepelného zdroje. Zaznamenáván je čas od spuštění do přerušení tepelného stimulu. V našich experimentech jsme použili desetiminutové intervaly mezi jednotlivými stimulacemi. Práh bolesti byl měřen opakovaně (celkem 3x v rámci jedné skupiny) s nastaveným cut-off časem 20 sekund. Dle jednotlivých modelů bolesti se lišily intervaly, ve kterých byla zvířata pomocí plantar testu měřena, v rámci každého modelu bolesti však byla provedena kontrolní měření 49

56 před aplikací látky. V modelu zánětlivé a pooperační bolesti byla kromě výchozích hodnot zvířata shodně sledována ve dvou časových intervalech, a to 2 a 6 hodin po podání karageninu nebo od provedení operace. V modelu pooperační bolesti byl plantar test navíc měřen 12 a 24 hodin od provedení operace. V modelu osteoartrózy byla zvířata pomocí plantar testu měřena před a poté v různých časových intervalech od intraartikulární injekce monojódacetátu. von Freyova filamenta - testování nocicepční citlivosti zadních končetin na mechanický podnět bylo provedeno pomocí von Freyových filament (Ugo Basile, Itálie) před a ve vybraných časech po navození osteoartrózy. Zvířata byla umístěna do plexisklových boxů, umožňující jim volný pohyb, ve kterých je dno boxu vyrobeno z drátěného pletiva. Po 15 minutové aklimatizaci byla citlivost zadních končetin sledována pomocí filament, která jsou testována se vzestupnou silou do doby vyvolání reakce zadní končetiny zvířete. Nejnižší síla potřebná k vyvolání reakce byla zaznamenána v gramech. Práh bolesti byl měřen opakovaně (celkem 3x v rámci jedné skupiny) s nastaveným cut-off časem 15 sekund. V modelu osteoartrózy byla zvířata pomocí von Freyových filament měřena před a poté v různých časových intervalech po podání monojódacetátu. 3.4 Molekulárně-biologické metody Příprava tkání v rámci jednotlivých modelů bolesti byla experimentální zvířata usmrcena v různých časových intervalech od začátku experimentu a následně jim byla odebrána lumbální část míchy. Ta byla umístěna do RNA stabilizačního roztoku (RNAlater, Qiagen) bránící degradaci nukleových kyselin. Takto připravené vzorky byly zmraženy na -70 C do té doby, než byly použity na expresní studie nebo pro detekci bílkovin. Izolace RNA jednotlivé části lumbální části míchy, stabilizované v RNAlater roztoku, byly homogenizovány pomocí mechanického homogenizátoru Ultra-Turrax T8 (Ika). RNA byla izolována pomocí Rneasy Mini kitu (Qiagen) v souladu s instrukcemi od výrobce. Integrita 50

57 RNA byla ověřena pomocí elektroforézy na 2% agarózovém gelu. Koncentrace a čistota RNA byla stanovena spektrofotometricky. Izolovaná RNA byla skladována při -70 C. Reverzní transkripce RNA vzorky byly reverzní transkripcí za použití RT pufru, nukleotidů, MgCl 2, náhodných hexametrů, Rnázového inhibitoru a reverzní transkriptázy (vše Applied Biosystems) přepsány do komplementární DNA (cdna), která byla použita jako templát pro kvantitativní PCR reakci. Polymerázová řetězová reakce (PCR) detekce COX-1 a COX-2 byla provedena pomocí PCR na termocykleru MJ Research PTC-200 za použití sekvenčně specifických forward a reverse primerů: COX-1 forward: TTCCAGGAGTTCACAGGAGAGAAG COX-1 reverse: AGAAAGGAGCC-CCCATCTCTATC COX-2 forward: TCAAGACAGATCAGAAGCGAGGA COX-2 reverse: CCTCTCCACCGATGACCTGATAT Kvantitativní PCR v reálném čase kvantifikace množství transkriptu vybraných genů v jednotlivých vzorcích byla provedena pomocí PCR v reálném čase. Exprese jednotlivých genů byla měřena na přístroji Real-time PCR 7300 (Applied Biosystems). Analýza změn exprese jednotlivých genů byla provedena pomocí relativní kvantifikace, která porovnává relativní změnu genové exprese v testovaném vzorku oproti kontrolnímu vzorku. ELISA produkce COX-1 a COX-2 proteinu byla stanovena za použití specifických primárních monoklonnálních (Alpha Diagnostic a Kamiya Biomedical Company) a sekundárních polyklonnálních protilátek (Acris Antibodies) metodou ELISA. Výsledná data byla měřena pomocí elisa readeru (Tucan) při 450 nm. 51

58 3.5 Použitá analgetika V rámci této disertační práce byla použita následující analgetika: paracetamol, diklofenak, meloxikam, celecoxib, FR122047, tramadol a metamizol. Paracetamol paracetamol (PAR) patří mezi běžně užívaná analgetika a antipyretika, postrádá však protizánětlivý účinek. Přesný mechanismus jeho analgetického účinku je stále ještě nejasný, nejpravděpodobnějším mechanismem působení této látky bude inhibice cyklooxygenázy na spinální či supraspinální úrovni. Výhodou paracetamolu je jeho velmi dobrá snášenlivost, všeobecně je považován za nejbezpečnější z analgetik. Oproti nesteroidním antirevmatikům má nižší riziko gastro i nefrotoxicity. Jedním z mála rizik paracetamolu je nebezpečí hepatotoxicity při předávkování, tvorbou toxického N-acetylbenzochinoniminu. Diklofenak diklofenak (DIKLO) je nesteroidní antirevmatikum patřící do skupiny derivátů kyseliny octové. Vyznačuje se výraznými protizánětlivými, analgetickými a antipyretickými účinky. Kombinace těchto vlastností umožňuje jeho použití u zánětlivých a bolestivých postižení pohybového aparátu. Výhodou tohoto léčiva je možnost aplikace v různých lékových formách, včetně lokálních a jeho relativně vysoká bezpečnost. Mechanismus účinku diklofenaku spočívá v neselektivní inhibici obou izoforem cyklooxygenázy a inhibici syntézy prostaglandinů. Meloxikam meloxikam (MEL) patří do skupiny preferenčních COX-2 inhibitorů, což jsou látky, poskytující oproti klasickým neselektivním nesteroidním antirevmatikům lepší gastrointestinální snášenlivost. Jako ostatní nesteroidní antirevmatika působí protizánětlivě, analgeticky a antipyreticky. Mechanismem jeho účinku je reverzibilní inhibice cyklooxygenázy, s preferenční inhibicí inducibilní izoformy COX-2. Používá se při osteoartróze, revmatoidní artritidě či ankylozující spondylitidě. Celecoxib celecoxib (CEL) patří mezi první COX-2 selektivní inhibitor zavedený do klinické praxe. Základem jeho protizánětlivého, analgetického a antirevmatického účinku je selektivní 52

59 inhibice cyklooxygenázy 2. Používá se pro léčbu osteoartrózy, revmatoidní artritidy a pro léčbu familiární adenomatózní polypózy. FR látka používaná v experimentální farmakologii jako selektivní inhibitor COX-1. Po perorálním podání této látky v různých modelech bolesti byly prokázány její analgetické a antiagregační vlastnosti. Tramadol je centrálně působící analgetikum patřící do skupiny slabých opioidů. Používá se při tlumení středně silných až silných bolestí. Tramadol (TRAM) je racemát, skládající se ze dvou enantiomerů s odlišným mechanismem účinku. (+) izomer působí jako selektivní agonista μ opioidních receptorů a zároveň inhibuje zpětné vychytávání serotoninu. (-) izomer pak blokuje zpětné vychytávání (reuptake) noradrenalinu na synapsích neuronů CNS, čímž potencuje antinociceptivní účinek (+) izomeru. Nežádoucí účinky po podání tramadolu bývají velmi mírné, jedná se nejvíce o nauzeu, zvracení a zácpu. Metamizol známý také pod názvem dipyron, patří do skupiny pyrazolonů. Má silné analgetické, antipyretické a zároveň i spazmolytické účinky. Jeho protizánětlivý účinek je však v porovnání s ostatními nesteroidními antirevmatiky nižší. Mechanismem účinku metamizolu (MET) je inhibice syntézy prostaglandinů, a to jak na periferii, tak i v centrálním nervovém systému. Při svém působení inhibuje jak COX-1, tak COX-2. Metamizol je velmi účinný při tlumení akutních bolestí. Vhodný je též v terapii kolikovitých bolestí. Ve srovnání s nesteroidními antirevmatiky má příznivý bezpečnostní profil. Jediným možným rizikem podávání tohoto přípravku je vzácně se vyskytující agranulóza. Všechna výše uvedená analgetika pocházela z Ústavní lékárny FN Královské Vinohrady s výjimkou látky FR122047, která byla objednána z firmy Sigma-Aldrich. 53

60 3.6 Statistická analýza Výsledky získané v plantar testu (PWL= latence odtažení tlapky) jsou vyjádřeny jako průměrné hodnoty ± S.E.M. (střední chyba průměru). Statistická analýza byla provedena pomocí analýzy rozptylu pro opakované měření. Výpočet hodnot ED 50 Na základně hodnot naměřených v plantar testu jsme pomocí vzorce pro výpočet %MPE a následné lineární regrese získali (v různých časových intervalech od podání) pro jednotlivá analgetika hodnoty ED 50. %MPE jsme počítali podle vzorce: %MPE PWL zánět léčené PWL zánět neléčené PWL kontroly PWL zánět neléčené. 100 Změna genové exprese byla měřena pomocí real-time PCR. Získaná data byla analyzována metodou relativní kvantifikace (2 -ΔΔCt ). cílový gen kontrolní gen cílový gen kalibrátor Statisticky významné změny genové exprese byly testovány pomocí analýzy rozptylu nebo t-testu. Výsledná data jsou vyjádřena jako průměrné hodnoty ± S.E.M. (střední chyba průměru). Výsledky získané pomocí metody ELISA jsou vyjádřeny pomocí OD nebo stimulačních indexů (optická denzita testované skupiny vs. optická denzita kontrol) ± S.E.M. (střední chyba průměru). Statistická analýza byla provedena pomocí analýzy rozptylu nebo nepárového t-testu. Statistická významnost byla definována v případě, že hodnota p byla menší než 0,05 (*p<0,05; **p<0,01; p<0,001). 54

61 4 Výsledky 4.1 Změny exprese a produkce míšní COX-1 a COX-2 u různých typů bolestí Změny míšní COX u zánětlivé bolesti K navození zánětlivé bolesti docházelo po intraplantárním podání 1% karageninu do pravých zadních tlapek experimentálních zvířat. Zánětlivá reakce byla charakterizována otokem, zčervenáním a zvětšením objemu postižené tlapky. Testování citlivosti zadních končetin na tepelný podnět bylo provedeno jak před, tak i po podání karageninu. Intraplantární injekce karageninu navodila výraznou hyperalgezii ipsilaterální tlapky, bez výrazných změn v latenci odtažení tlapky levé, kontralaterální. Druhou a šestou hodinu po podání karageninu byly latence odtažení pravé tlapky signifikantně sníženy, a to jak v porovnání s výchozími hodnotami před podáním karageninu, tak v porovnání s kontrolní skupinou zvířat, které byl namísto karageninu intraplantárně podán fyziologický roztok (p<0,001) (Obr. 8) Pravá Levá Kontroly PWL (s) p<0.001 vs. před podáním +++ p<0.001 vs. kontroly 2 0 před podáním 2 6 hodiny po podání karageninu Obr. 8 Latence odtažení tlapky v modelu zánětlivé bolesti (navozené intraplantární aplikací karageninu do pravé zadní tlapky). Každý bod na grafu odpovídá průměru 55

62 z 8 zvířat s vyjádřením střední chyby průměru (S.E.M.). Hvězdičky vyjadřují statisticky signifikantní rozdíl v porovnání s výchozími hodnotami naměřenými před podáním karageninu. Křížky vyjadřují statisticky signifikantní rozdíl v porovnání s kontrolní skupinou, které byl intraplantárně podán fyziologický roztok. Exprese COX-1 a COX-2 mrna byla v modelu zánětlivé bolesti nejprve detekována pomocí PCR. Po zhodnocení PCR výsledků jsme předpokládali, že v porovnání s kontrolní skupinou, dochází 6 hodin po podání karageninu k navýšení exprese COX-2 mrna, bez výraznějších změn v expresi COX-1 mrna (Obr. 9). Tyto výsledky byly později potvrzeny pomocí real-time PCR analýzy. Obr. 9 2% agarózový gel po PCR. Analýza exprese COX-1 a COX-2 mrna v lumbální části míchy. Obrázek ukazuje expresi obou cyklooxygenáz 6 hodin po intraplantárním podání karageninu, v případě kontrol 6 hodin po intraplantárním podání fyziologického roztoku. Pro ukázku jsou znázorněny vždy 2 vzorky z dané skupiny. Výsledky real-time PCR analýzy byly normalizovány s kontrolní skupinou. Dvě hodiny po podání karageninu nedocházelo v modelu zánětlivé bolesti k žádným změnám v expresi míšní COX-1 mrna a exprese této izoformy cyklooxygenázy byla srovnatelná s kontrolní skupinou, které byl intraplantárně podán fyziologický roztok. Exprese COX-2 mrna však byla v porovnání jak s kontrolní skupinou, tak v porovnání s expresí COX-1 mrna, signifikantně zvýšena (p<0,001) (Obr. 10). 56

63 20 relativní exprese mrna Kontroly COX-1 COX-2 Obr. 10 Exprese COX-1 a COX-2 mrna v lumbální části míchy 2 hodiny po indukci zánětlivé reakce. Každý sloupec vyjadřuje průměr z 8 zvířat s vyjádřením střední chyby průměru (S.E.M.). Hvězdičky znázorňují signifikantní rozdíly mezi jednotlivými skupinami (p<0,001). Šest hodin po podání karageninu docházelo k dalšímu navýšení exprese COX-2 mrna, a to jak v porovnání s kontrolní skupinou zvířat, tak v porovnání s expresí COX-1 mrna (p<0,001), která zůstávala i po 6 hodinách po indukci zánětlivé reakce neměnná, srovnatelná s kontrolní skupinou (Obr. 11). 20 relativní exprese mrna Kontroly COX-1 COX-2 Obr Exprese COX-1 a COX-2 mrna v lumbální části míchy 6 hodin po indukci zánětlivé reakce. Každý sloupec vyjadřuje průměr z 8 zvířat s vyjádřením střední chyby průměru (S.E.M.). Hvězdičky vyjadřují signifikantní rozdíly mezi sledovanými skupinami (p<0,001). 57

64 4.1.2 Porovnání změn míšních COX u zánětlivé a pooperační bolesti Na základě již zjištěných údajů o expresi obou cyklooxygenáz na míšní úrovni v modelu zánětlivé bolesti jsme chtěli zjistit, zda je tato exprese podobná či odlišná i v jiných modelech bolesti. Pro srovnání jsme vybrali model pooperační bolesti, který byl popsán v roce 1996 Brennanem (Brennan et al. 1996). V tomto modelu je v anestezii (kombinace ketaminu a xylazinu) proveden 1 cm dlouhý řez protínající kůži, fascii a sval, bez zasažení šlach. Po zákroku je rána sešita jedním až dvěma stehy. Kromě behaviorálních testů jsme v obou modelech bolesti pomocí real-time PCR analýzy sledovali expresi mrna kódující jednotlivé izoformy cyklooxygenáz v oblasti lumbální míchy. Dvě hodiny po indukci zánětu nebo po operaci byla exprese mrna pro COX-1 srovnatelná s kontrolní skupinou zvířat. 6 hodin po operaci však docházelo k signifikantnímu navýšení exprese COX-1 mrna v porovnání s kontrolními zvířaty (p<0,001). V modelu zánětlivé bolesti jsme však žádný nárůst exprese COX-1 mrna nezaznamenali. Dvě hodiny po indukci zánětu nebo i pooperačně docházelo ke zvýšení exprese COX-2 mrna (p<0,001). Ještě výraznější rozdíl v expresi COX-2 mrna v porovnání s kontrolami byl zaznamenán 6 hodin po indukci zánětu (p<0,001). Po 6 hodinách od operace však nebyly v porovnání s kontrolami zaznamenány žádné statisticky signifikantní rozdíly v expresi COX-2 mrna (Obr. 12). 58

65 2 hodiny relativní exprese COX-1 mrna relativní exprese COX-2 mrna Kontroly Zánět Operace 0 Kontroly Zánět Operace 20 6 hodin 20 relativní exprese COX-1 mrna relativní exprese COX-2 mrna Kontroly Zánět Operace 0 Kontroly Zánět Operace Obr Relativní exprese COX-1 a COX-2 mrna v lumbální části míchy 2 a 6 hodin po intraplantární aplikaci karageninu nebo po operaci. Údaje znázorňují průměrné exprese z 8 zvířat spolu s vyjádřením střední chyby průměru (S.E.M.). Hvězdičky znázorňují statisticky signifikantní rozdíl v porovnání s kontrolní skupinou (p<0,001). Mezi další modely bolesti, ve kterých jsme se snažili objasnit expresi a produkci cyklooxygenáz na míšní úrovni, patřil model osteoartrózy a model neuropatické bolesti Změny míšní COX u osteoartrózy Osteoartróza byla navozena intraartikulární aplikací monojódacetátu (2 mg/25 µl) do pravého kolene experimentálních zvířat. Kontrolní skupině byl do pravého kolenního kloubu injikován stejný objem fyziologického roztoku. Mimo kontrolní skupiny byl sledován i vliv experimentálně navozené osteoartrózy na neporušenou (levou) zadní tlapku. Kromě zjišťování exprese a produkce obou izoforem cyklooxygenáz na míšní úrovni jsme se v tomto modelu bolesti zaměřili i na behaviorální testování citlivosti zadních končetin 59

66 na tepelný (plantar test) a na mechanický podnět (von Freyova filamenta) před a ve vybraných časech po navození osteoartrózy. Intraartikulární aplikace monojódoacetátu do pravého kolenního kloubu navodila výraznou termální hyperalgezii v ipsilaterální tlapce, zřejmou již od prvního dne experimentu, s maximem 5. den po podání monojódacetátu. Ve všech sledovaných časech od počátku pokusu docházelo v porovnání s kontrolní skupinou k signifikantnímu zvýšení citlivosti zadních končetin na tepelný stimul a latence obranné reakce v plantar testu byly signifikantně sníženy (p<0,001). K žádným výrazným změnám však nedocházelo v kontralaterální tlapce, kde byly hodnoty PWL srovnatelné s kontrolní skupinou (Obr. 13) PWL (s) 10 9 Pravá Levá Kontrola 8 7 před podáním Dny po aplikaci monojódacetátu Obr Změny nocicepce v plantar testu před a ve vybraných časech po navození osteoartrózy v pravé zadní končetině experimentálních zvířat. Výsledky jsou vyjádřeny jako průměr ± S.E.M. (p<0,001 ve všech sledovaných časech v porovnání s kontrolní skupinou). Reakce zadních končetin na mechanické dráždění byla měřena pomocí von Freyových vláken před a v různých časech po navození osteoartrózy. Intraartikulární injekce monojódoacetátu do pravého kolenního kloubu způsobila výraznou allodynii, s nástupem již od prvního dne po podání monojódoacetátu. Výrazné zvýšení citlivosti zadních končetin 60

67 na mechanický stimul bylo pozorováno v průběhu 31 dní (p<0,001), s maximem 5. den od počátku experimentu. Žádné výrazné změny nebyly pozorovány v kontralaterální (levé) tlapce, kde byly hodnoty PWT srovnatelné s kontrolní skupinou (Obr. 14). 25 PWT (g) Pravá Levá Kontrola 5 0 před podáním Dny po aplikaci monojódacetátu Obr Změny nocicepce měřené pomocí von Freyových filament před a ve vybraných časech po navození osteoartrózy. Výsledky jsou vyjádřeny jako průměr ± S.E.M. (p<0,001 ve všech sledovaných časech v porovnání s kontrolní skupinou). Relativní exprese COX-1 a COX-2 mrna byla sledována ve 4 různých časových intervalech od navození osteoartrózy a byla normalizována s kontrolní skupinou. První den po aplikaci monojódacetátu byly hladiny míšních COX-1 a COX-2 mrna mírně zvýšeny (p<0,05). Exprese míšní COX-2 mrna byla několikanásobně zvýšena 5. den po aplikaci monojódacetátu (p<0,001) a tato exprese zůstávala téměř neměnná až do 31. dne experimentu (p<0,001). Exprese míšní COX-1 mrna se během pokusu postupně zvyšovala, s maximálními hladinami 31. den po aplikaci monojódacetátu (p<0,001). Měsíc po aplikaci monojódacetátu byla exprese obou izoforem cyklooxygenáz téměř vyrovnaná (Obr. 15). 61

68 relativní exprese mrna * * ** COX-1 COX-2 kontroly Dny po aplikaci monojódacetátu Obr Relativní exprese COX-1 a COX-2 mrna v lumbální části míchy u kontrolní skupiny a u zvířat, kterým byl aplikován do pravého kolenního kloubu monojódacetát. Každý sloupec vyjadřuje průměr z 8 zvířat s vyjádřením střední chyby průměru (S.E.M.). Hvězdičky znázorňují signifikantní rozdíly mezi osteoartritickými a kontrolními zvířaty (p<0,05, p<0,01, p<0,001). Produkce míšních COX proteinů byla porovnatelná s jejich expresí. Produkce obou proteinů byla zvýšená již na začátku experimentu (p<0,001). Nejvýraznější produkce COX-2 proteinu byla zaznamenána 5. den po indukci osteoartrózy (p<0,001). Nejvyšší produkce COX-1 proteinu byla zaznamenána 31. den po aplikaci monojódacetátu (p<0,001) (Obr. 16). 7 6 COX-1 COX-2 5 SI kontroly Dny po aplikaci monojódacetátu Obr Produkce COX-1 a COX-2 proteinu v lumbální části míchy u kontrolní skupiny a u zvířat, kterým byl aplikován do pravého kolenního kloubu monojódacetát. Každý sloupec vyjadřuje průměr z 8 zvířat. Výsledky jsou vyjádřeny jako stimulační index 62

69 ± S.E.M. Hvězdičky znázorňují signifikantní rozdíly mezi osteoartritickými a kontrolními zvířaty (p<0,001) Změny míšní COX u neuropatické bolesti Z velké škály modelů neuropatické bolesti jsme se na našem pracovišti zaměřili na SNI (spinal nerve injury) model neuropatické bolesti, který byl poprvé popsán v časopise Pain (Decosterd and Woolf 2000). Při tomto modelu je experimentálním zvířatům proveden v anestezii (kombinace ketaminu a xylazinu) řez na stehně. Po odkrytí svaloviny a odhalení samotného sedacího nervu dochází nejprve k ligaci a následně k odstranění dvou ze tří větví sedacího nervu (holenního a lýtkového). Po zákroku je rána ošetřena antibiotiky a sešita. Kontrolním skupinám je proveden podobný zákrok, u těchto zvířat však dochází pouze ke stlačení sedacího nervu, bez ligace a následného odstranění 2 ze 3 větví tohoto nervu. Exprese a produkce míšních cyklooxygenáz byla v tomto modelu neuropatické bolesti sledována 7., 14. a 21. den po provedení operace. Po jednom týdnu od provedení operace nebyly v porovnání s kontrolní skupinou pozorovány žádné signifikantní rozdíly v expresi, ani v produkci COX-1 a COX-2 (Obr. 17). 63

70 Real-time PCR ELISA 2.0 Kontroly SNI 0.15 Kontroly SNI relativní exprese mrna OD COX COX Kontroly SNI 0.15 Kontroly SNI relativní exprese mrna OD COX COX-2 Obr. 17 Exprese a produkce míšních cyklooxygenáz 7 dní po SNI. Každý sloupec vyjadřuje průměr ze 6 zvířat s vyjádřením střední chyby průměru (S.E.M.). Žádné signifikantní rozdíly v expresi obou cyklooxygenáz a snížená produkce COX-2 proteinu (p<0,05) v porovnání s kontrolní skupinou byla zaznamenána 14 dní po SNI operaci (Obr. 18). 64

71 Real-time PCR ELISA relativní exprese mrna Kontroly SNI OD Kontroly SNI 0.0 COX COX-1 relativní exprese mrna Kontroly SNI OD * Kontroly SNI 0.0 COX COX-2 Obr. 18 Exprese a produkce míšních cyklooxygenáz 14 dní po SNI operaci. Každý sloupec vyjadřuje průměr ze 6 zvířat s vyjádřením střední chyby průměru (S.E.M.). V porovnání s kontrolními zvířaty, byla ve skupině SNI zaznamenána snížená produkce COX-2 proteinu (p<0,05). Signifikantně zvýšené hladiny COX-1 mrna (p=0,001) v porovnání s kontrolní skupinou byly zaznamenány 21 dní po SNI operaci. Exprese COX-2 mrna zůstávala neměnná a byla srovnatelná s kontrolní skupinou. Produkce COX proteinu korespondovala s expresí (Obr. 19). 65

72 Real-time PCR ELISA relativní exprese mrna 15 p=0, Kontroly SNI OD Kontroly SNI 0 COX COX-1 15 Kontroly SNI 0.20 Kontroly SNI relativní exprese mrna 10 5 OD COX COX-2 Obr. 19 Exprese a produkce míšních cyklooxygenáz 21 dní po SNI operaci. Každý sloupec vyjadřuje průměr ze 6 zvířat s vyjádřením střední chyby průměru (S.E.M.). Ve skupině SNI docházelo při srovnání s kontrolními zvířaty k signifikantnímu navýšení exprese COX-1 mrna (p=0,001), bez významných změn v expresi COX-2 mrna. 4.2 Účinek farmak na expresi a produkci míšní COX-1 a COX-2 u zánětlivé bolesti Na modelu karageninem indukované zánětlivé bolesti jsme testovali různá analgetika, u kterých jsme v různých časových intervalech po perorálním (p.o.) podání sledovali závislost účinku na dávce podaného analgetika a následně pomocí výpočtu %MPE a lineární regrese zjišťovali hodnoty ED 50 v různých časových intervalech od jejich p.o. podání. Mezi vybraná analgetika patřil: paracetamol, selektivní COX-1 inhibitor FR122047, neselektivní COX-1, 2 inhibitor diklofenak a metamizol, preferenční COX-2 inhibitor meloxikam, selektivní COX-2 inhibitor celecoxib, z opioidních analgetik tramadol. 66

73 Schéma pokusu bylo shodné pro všechna analgetika. Po změření výchozích hodnot citlivosti zadních končetin na tepelný podnět v plantar testu byl intraplantárně podán karagenin do pravé tlapky (v případě kontrolních zvířat fyziologický roztok) a jednu hodinu poté byly p.o. podány různé dávky sledovaných analgetik (v případě kontrol byla p.o. podána destilovaná voda). Měření citlivosti zadních končetin na tepelný podnět bylo poté provedeno pomocí plantar testu 1., 3. a 5. hodinu po p.o. podání. Prvním analgetikem, které jsme v modelu zánětlivé bolesti testovali, byl paracetamol. Pro zjištění hodnot ED 50 byly experimentálním zvířatům podány 4 různé dávky tohoto léčiva 10, 30, 100 a 1000 mg/kg. Při srovnání se skupinou zvířat, které byl intraplantárně podán karagenin a 1 hodinu poté destilovaná voda, docházelo k signifikantnímu snížení citlivosti zadních končetin na tepelný stimul 1 hodinu po podání paracetamolu v dávce 30 mg/kg (p<0,01). Výraznějších analgetických účinků paracetamolu pak bylo dosaženo po podání vyšších dávek a 1000 mg/kg (p<0,001) (Obr. 20). PWL (s) ** Kontroly Karagenin PAR 10 mg/kg PAR 30 mg/kg PAR 100 mg/kg PAR 1000 mg/kg **p<0.01, p<0.001 vs. karagenin před podáním hodiny po podání karageninu Obr Účinek různých dávek paracetamolu ( mg/kg), aplikovaných 1 hodinu po intraplantárním podání karageninu, na latenci odtažení zadních končetin (PWL) v plantar testu před a ve vybraných časech po p.o. podání paracetamolu. Každý bod 67

74 na grafu odpovídá průměru ze 6 zvířat s vyjádřením střední chyby průměru (S.E.M.). Hvězdičky vyjadřují statisticky signifikantní rozdíl v porovnání se skupinou zvířat, které byl intraplantárně podán karagenin a 1 hodinu poté p.o. destilovaná voda. Dalším analgetikem, u kterého jsme v modelu zánětlivé bolesti zjišťovali hodnoty PWL po jeho p.o. podání byl diklofenak. Tato látka byla podávána experimentálním zvířatům 1 hodinu po intraplantárním podání karageninu ve třech různých dávkách 1, 10 a 100 mg/kg. Při srovnání účinku diklofenaku se skupinou zvířat, které byl intraplantárně podán karagenin a 1 hodinu poté p.o. destilovaná voda, docházelo ve skupině zvířat, které byl podán karagenin a 1 hodinu poté různé dávky diklofenaku, k signifikantnímu snížení citlivosti zadních končetin na teplený podnět, a to již první hodinu po p.o. podání diklofenaku (ve všech třech sledovaných dávkách) (p<0,001). Tato změna nocicepce byla statisticky významná u všech dávek diklofenaku i po 3 hodinách po podání (p<0,001), v 5. hodině po aplikaci byl statisticky signifikantní výsledek zaznamenán pouze při podání nejvyšší dávky diklofenaku (100 mg) (p<0,05) (Obr. 21). PWL (s) * Kontroly Karagenin DIKLO 1 mg/kg DIKLO 10 mg/kg DIKLO 100 mg/kg *p<0.05, p<0.001 vs. karagenin před podáním hodiny po podání karageninu Obr. 21 Změny latence odtažení zadních končetin (PWL) v plantar testu před a po p.o. podání různých dávek diklofenaku (1, 10 a 100 mg/kg) aplikovaných 1 hodinu po intraplantárním podání karageninu. Změny v latenci zadních končetin byly pozorovány před a 1., 3. a 5. hodinu po podání diklofenaku. Každý bod na grafu 68

75 odpovídá průměru ze 6 zvířat s vyjádřením střední chyby průměru (S.E.M.). Hvězdičky vyjadřují statisticky signifikantní rozdíl v porovnání se skupinou zvířat, které byl intraplantárně podán karagenin a 1 hodinu poté p.o. destilovaná voda. Mezi další látku, kterou jsme v modelu zánětlivé bolesti testovali, patřil preferenční COX-2 inhibitor, meloxikam. Stejně jako v případě předchozích analgetik, jeho analgetická účinnost byla testována v plantar testu. Meloxikam byl podáván ve 4 různých dávkách, konkrétně 3, 10, 30 a 100 mg/kg. Jednotlivé dávky byly podávány p.o., vždy 1 hodinu po intraplantárním podání karageninu. Při srovnání účinku podaného meloxikamu se skupinou, které byl intraplantárně podán karagenin a následně p.o. destilovaná voda, působil meloxikam analgeticky již v dávce 3 mg/kg 3. hodinu po jeho p.o. podání (p<0,01). Výraznější analgetické účinky meloxikamu pak byly zaznamenány při podání vyšších dávek (p<0,001) (Obr. 22). PWL (s) ** Kontroly Karagenin MEL 3 mg/kg MEL 10 mg/kg MEL 30 mg/kg MEL 100 mg/kg **p<0.01, p<0.001 vs. karagenin před podáním hodiny po podání karageninu Obr Efekt různých dávek meloxikamu (3, 10, 30 a 100 mg/kg) podaných 1 hodinu po intraplantárním podání karageninu na latenci odtažení zadních končetin (PWL) na tepelný stimul před a 1, 3 a 5 hodin po p.o. podání meloxikamu. Každý bod na grafu odpovídá průměru ze 6 zvířat s vyjádřením střední chyby průměru (S.E.M.). Hvězdičky vyjadřují statisticky signifikantní rozdíl v porovnání se skupinou zvířat, které byl intraplantárně podán karagenin a 1 hodinu poté p.o. destilovaná voda. Z látek selektivních ke COX-2 jsme testovali celecoxib. Schéma pokusu bylo shodné jako u předchozích látek. Různé dávky celecoxibu byly podávány per os 1 hodinu 69

76 po intraplantárním podání karageninu. V případě kontrol byla 1 hodinu po intraplantárním podání fyziologického roztoku podávána p.o. destilovaná voda. Testované dávky celecoxibu byly následující: 1, 5, 10 a 50 mg/kg. Při srovnání se skupinou zvířat, které byl intraplantárně podán karagenin a 1 hodinu poté p.o. destilovaná voda, docházelo ve skupině, které byl nejprve podán karagenin a následně celecoxib v dávce 1 mg/kg, k analgetickému účinku 3. hodinu po p.o. podání celecoxibu (p<0,01). Výrazné analgetické účinky celecoxibu byly pozorovány u všech ostatních dávek (p<0,001) (Obr. 23) Kontroly Karagenin CEL 1 mg/kg CEL 5 mg/kg CEL 10 mg/kg CEL 50 mg/kg PWL (s) 8 6 ** **p<0.01, p<0.001 vs. karagenin před podáním hodiny po podání karageninu Obr. 23 Změny nociceptivní citlivosti zadních končetin na tepelný stimul před a 1., 3. a 5. hodinu po p.o. podání různých dávek celecoxibu. Podání celecoxibu následovalo 1 hodinu po intraplantárním podání karageninu. Každý bod na grafu odpovídá průměru ze 6 zvířat s vyjádřením střední chyby průměru (S.E.M.). Hvězdičky vyjadřují statisticky signifikantní rozdíl v porovnání se skupinou zvířat, které byl intraplantárně podán karagenin a 1 hodinu poté p.o. destilovaná voda. V modelu karageninem indukované zánětlivé bolesti byl dále testován analgetický potenciál COX-1 selektivního inhibitoru FR Tato látka byla v kombinaci s karageninem podávána ve 3 různých dávkách 2, 10 a 20 mg/kg. 70

77 Při srovnání účinku různých dávek FR se skupinou zvířat, které byl intraplantárně podán karagenin a následně destilovaná voda, byl analgetický účinek FR zaznamenán 3 hodiny po podání dávky 2 mg/kg (p<0,01), tento efekt však nebyl pozorován v jiných časových intervalech po podání této dávky. Výraznější analgetický účinek FR byl zaznamenán u dávky 10 a 20 mg/kg v prvních dvou časových intervalech po podání (p<0,001) (Obr. 24) Kontroly Karagenin FR mg/kg FR mg/kg FR mg/kg PWL (s) 10 8 ** p<0.01, p<0.001 vs. karagenin 6 ** před podáním hodiny po podání karageninu Obr. 24 Latence odtažení zadních končetin na tepelný podnět v plantar testu před a v různých časových intervalech od p.o. podání různých dávek FR nebo destilované vody (v případě kontrol), které následovaly 1 hodinu po intraplantárním podání karageninu nebo fyziologického roztoku (v případě kontrol). Každý bod na grafu odpovídá průměru ze 6 zvířat s vyjádřením střední chyby průměru (S.E.M.). Hvězdičky vyjadřují statisticky signifikantní rozdíl v porovnání se skupinou zvířat, které byl intraplantárně podán karagenin a 1 hodinu poté p.o. destilovaná voda. Předposlední látkou, kterou jsme testovali v modelu zánětlivé bolesti, byl tramadol. Tato látka byla podávána ve třech různých dávkách. Dávky 5, 10 nebo 50 mg/kg byly podávány p.o. vždy 1 hodinu po intraplantárním podání karageninu. V porovnání se skupinou, které byl intraplantárně podán karagenin a 1 hodinu poté p.o. destilovaná voda, systémové podání tramadolu v dávce 5 mg/kg, působilo v modelu zánětlivé 71

78 bolesti výraznou analgezii 3 hodiny po jeho p.o. podání (p<0,001). Vyšší dávky tramadolu pak působily v tlumení zánětlivé bolesti mnohem intenzivněji (p<0,001) (Obr. 25). PWL (s) Kontroly Karagenin TRAM 5 mg/kg TRAM 10 mg/kg TRAM 50 mg/kg p<0.001 vs. karagenin 0 před podáním hodiny po podání karageninu Obr. 25 Efekt různých dávek tramadolu na nociceptivní citlivost zadních končetin v plantar testu. Změny latence byly měřeny před a po p.o. podání různých dávek tramadolu aplikovaných 1 hodinu po intraplantárním podání karageninu. Změny v latenci odtažení zadních končetin byly pozorovány před a 1., 3. a 5. hodinu po p.o. podání tramadolu. Každý bod na grafu odpovídá průměru ze 6 zvířat s vyjádřením střední chyby průměru (S.E.M.). Hvězdičky vyjadřují statisticky signifikantní rozdíl v porovnání se skupinou zvířat, které byl intraplantárně podán karagenin a 1 hodinu poté p.o. destilovaná voda. Poslední látkou, která byla v modelu zánětlivé bolesti testována, byl metamizol. Metamizol byl podáván v 5 různých dávkách, konkrétně 30, 60, 100, 300 a 600 mg/kg. Tyto dávky byly podávány p.o., vždy 1 hodinu po intraplantárním podání karageninu. Při srovnání se skupinou zvířat, které byl intraplantárně podán karagenin a 1 hodinu poté p.o. destilovaná voda, působil metamizol analgeticky již v nejnižší dávce, tzn. 30 mg/kg 3. hodinu po podání (p<0,001). Se zvyšujícími se dávkami metamizolu se zvyšoval i jejich efekt na snižování citlivosti končetin na tepelný stimul (Obr. 26). 72

79 PWL (s) Kontroly Karagenin MET 30 mg/kg MET 60 mg/kg MET 100 mg/kg MET 300 mg/kg MET 600 mg/kg p<0.001 vs. karagenin před podáním hodiny po podání karageninu Obr Změny nocicepce v plantar testu před a ve vybraných časech po podání různých dávek metamizolu. Metamizol byl podán vždy 1 hodinu po intraplantárním podání karageninu. Experimentální zvířata pak byla měřena 1., 3. a 5. hodinu po p.o. podání různých dávek metamizolu. Výsledky jsou vyjádřeny jako průměr ± S.E.M. Hvězdičky vyjadřují statisticky signifikantní rozdíl v porovnání se skupinou zvířat, které byl intraplantárně podán karagenin a 1 hodinu poté p.o. destilovaná voda. Na základě výše uvedených hodnot PWL, získaných měřením sledovaných látek v plantar testu, jsme pomocí vzorce pro výpočet %MPE a následné lineární regrese vypočítali hodnoty ED 50 v různých časových intervalech po jejich p.o. podání. Hodnoty ED 50 jednotlivých analgetik 5. hodinu po jejich p.o. podání, tak jak byly použity pro další experimenty uvádí tabulka 3 (Tab. 3). Analgetikum ED 50 (mg/kg), p.o. Paracetamol 89.1 Diklofenak 8.7 Meloxikam 20.4 Tramadol 18.6 FR Metamizol 204 Celecoxib 9.1 Tab. 3 Hodnoty ED 50 jednotlivých analgetik 5. hodinu po jejich p.o. podání v modelu karageninem indukované zánětlivé bolesti 73

80 Na základě takto získaných hodnot ED 50, jsme v modelu karageninem indukované zánětlivé bolesti testovali vliv podaných ED 50 na expresi a produkci jednotlivých izoforem cyklooxygenáz na míšní úrovni. Jednu hodinu po intraplantráním podání karageninu bylo p.o. podáno analgetikum (dávka rovnající se hodnotě ED 50 v 5. hodině po p.o. podání zjištěná na základě předchozích experimentů Tab. 3). Po 6 hodinách po podání karageninu (resp. 5 hodin po podání léčiva) byla zvířata usmrcena a následně byla jim vyjmuta lumbální část míchy, která sloužila jako výchozí materiál pro stanovení exprese a produkce COX-1 a COX-2. Jako kontroly byly použity 2 skupiny zvířat. První skupina sloužila jako negativní kontrola, které byl intraplantárně podán fyziologický roztok a 1 hodinu poté p.o. destilovaná voda. Pro kontrolu navození zánětlivé reakce byla použita skupina zvířat, které byl intraplantárně podán karagenin a 1 hodinu poté destilovaná voda. V porovnání se zdravými kontrolami, nedocházelo na míšní úrovni k výrazným změnám v expresi COX-1 mrna, s výjimkou skupiny, které byl po vyvolání zánětlivé reakce podán selektivní COX-1 inhibitor FR U této skupiny zvířat docházelo k signifikantnímu snížení exprese COX-1 mrna (p<0,05). K signifikantnímu snížení exprese COX-1 mrna docházelo také ve srovnání se skupinou, které byl intraplantárně podán karagenin a následně p.o. destilovaná voda nebo metamizol (Obr. 27) relativní exprese mrna 1.5 kontrola 0.5 * 0.0 KAR PAR DIKLO MEL TRAM MET CEL FR 74

81 Obr. 27 Relativní exprese míšní COX-1 mrna při zánětu ovlivněném p.o. podáním různých analgetik. Jednotlivé sloupce znázorňují průměrné exprese ze 6 zvířat spolu s vyjádřením střední chyby (S.E.M.). Hvězdičky znázorňují statisticky signifikantní rozdíl v porovnání s kontrolní skupinou (p<0,05). Křížky znázorňují signifikantní rozdíly mezi jednotlivými skupinami (p<0,05). Produkce COX-1 proteinu korespondovala s výsledky z real-time PCR analýzy. V porovnání s kontrolními zvířaty, docházelo k signifikantnímu snížení tvorby COX-1 proteinu ve skupině zvířat, kterým byl po karageninu podán COX-1 selektivní inhibitor FR (p<0,01) (Obr. 28) SI kontroly 0.5 ** 0.0 KAR PAR DIKLO MEL TRAM MET CEL FR Obr. 28 Produkce COX-1 proteinu v lumbální části míchy v modelu zánětlivé bolesti po podání různých analgetik. Výsledky jsou vyjádřeny jako stimulační index ± S.E.M. Hvězdičky znázorňují statisticky signifikantní rozdíl v porovnání s kontrolní skupinou (p<0,01). Exprese COX-2 mrna byla v porovnání s kontrolní skupinou zvířat zvýšena nejen po intraplantráním podání karageninu, což bylo potvrzeno již v našich předchozích experimentech, ale k statisticky významnému navýšení exprese COX-2 mrna na míšní úrovni docházelo i ve skupinách, kterým byl 1 hodinu po karageninu p.o. podán paracetamol, diklofenak, meloxikam, tramadol či metamizol (p<0,01, p<0,001). Statisticky signifikantní navýšení exprese COX-2 mrna po podání meloxikamu při periferně navozeném zánětu bylo zaznamenáno i v porovnání se skupinou paracetamolu či celecoxibu (p<0,05, p<0,01) (Obr. 29). 75

82 relativní exprese mrna ** kontroly 0 KAR PAR DIKLO MEL TRAM MET CEL FR Obr. 29 Relativní exprese COX-2 mrna v lumbální části míchy u kontrolní skupiny a u zvířat, kterým byl intraplantárně aplikován karagenin a 1 hodinu poté byla p.o. podána různá analgetika. Jednotlivé sloupce znázorňují průměrné exprese ze 6 zvířat spolu s vyjádřením střední chyby (S.E.M.). Hvězdičky znázorňují statisticky signifikantní rozdíl v porovnání s kontrolní skupinou (p<0,01, p<0,001). Křížky znázorňují signifikantní rozdíly mezi jednotlivými skupinami (p<0,05, p<0,01). Pomoci ELISA metody jsme v porovnání s kontrolní skupinou zaznamenali zvýšenou produkci COX-2 proteinu ve skupině zvířat, které byl podán samotný karagenin nebo ve skupinách, kdy byl po karageninu podán paracetamol a tramadol (p<0,01, p<0,001). K statisticky signifikantnímu navýšení produkce COX-2 proteinu ve skupině tramadolu docházelo i ve srovnání se skupinou zvířat, které byl p.o. podán diklofenak, meloxikam, metamizol či celecoxib (p<0,05, p<0,01, p<0,001). Signifikantně snížená tvorba COX-2 proteinu byla zaznamenána po podání celecoxibu, a to jak v porovnání s kontrolní skupinou zvířat (p<0,05), tak v porovnání se skupinou zvířat, které byl podán karagenin a následně destilovaná voda nebo paracetamol (p<0,05, p<0,001) (Obr. 30). 76

83 SI kontroly ** * 0 CAR PAR DICLO MEL TRAM MET CEL FR Obr. 30 Produkce COX-2 proteinu v lumbální části míchy v modelu zánětlivé bolesti po podání různých analgetik. Výsledky jsou vyjádřeny jako stimulační index ± S.E.M. Hvězdičky znázorňují statisticky signifikantní rozdíl v porovnání s kontrolní skupinou (p<0,05, p<0,01, p<0,001). Křížky znázorňují signifikantní rozdíly mezi jednotlivými skupinami (p<0,05, p<0,01, p<0,001). 77

84 5 Diskuse 5.1 Diskuse ke změnám míšní COX u různých typů bolestí Diskuse ke změnám míšní COX v modelu zánětlivé a pooperační bolesti Intraplantární injekce karageninu do zadních tlapek experimentálních zvířat se běžně používá při studiu zánětlivé bolesti a patří mezi modely často a dlouho používané (Di 1972). V rámci našich výsledků jsme po intraplantárním podání 1% karageninu mohli pozorovat výrazný otok a zvětšení objemu postižených tlapek. Tyto výsledky korespondují s již dříve publikovanými pracemi, kde byl popisován tento efekt karageninu po jeho intraplantárním podání (Morris 2003;Seibert et al. 1994;Winter et al. 1962). V rámci měření citlivosti zadních končetin v plantar testu, docházelo v porovnání s kontrolní skupinou, k signifikantnímu zkrácení latence odtažení tlapky na tepelný stimul. Vznik této tepelné hyperalgezie bylo možné potlačit preventivním intrathekálním či intraperitoneálním podáním nesteroidních antirevmatik (Dirig et al. 1998). Zvýšené hladiny COX-2 mrna na míšní úrovni v modelu zánětlivé bolesti, popsané v rámci této disertační práce, jsou v souladu s výsledky, které popisují zvýšenou expresi COX-2 mrna v míše po zánětu vyvolaném intraplantárním podáním Freundova adjuvans do zadních tlapek experimentálních zvířat (Beiche et al. 1998;Beiche et al. 1996;Hay et al. 1997). Spolu se zvýšenou expresí COX-2 mrna byla při zánětlivé bolesti na míšní úrovni popsána také zvýšená produkce COX-2 proteinu. K minimálním změnám pak na míšní úrovni dochází v produkci COX-1 proteinu (Beiche et al. 1998;Ebersberger et al. 1999;Seybold et al. 2003). Incize zadních tlapek experimentálních zvířat patří mezi dobře popsaný model pooperační bolesti, při kterém dochází k rozvoji mechanické hyperalgezie, která přetrvává po dobu několika dnů po chirurgickém zákroku (Brennan et al. 1996). V rámci našich pozorování jsme 78

85 v tomto modelu bolesti mohli pozorovat výraznou hyperalgezii ipsilaterální tlapky na tepelný podnět, a to jak v porovnání s kontrolní skupinou, tak s výchozími hodnotami latencí zadních končetin v plantar testu, které byly změřeny před vlastní operací. Tuto změnu nociceptivního chování bylo možné pozorovat po dobu 24 hodin. Výrazné rozdíly jsme zaznamenali při porovnání exprese cyklooxygenáz v tomto modelu bolesti s modelem zánětlivé bolesti. Pomocí real-time PCR jsme sledovali expresi mrna kódující jednotlivé izoformy cyklooxygenáz v lumbální části míchy. V obou modelech bolesti dochází shodně ke konstitutivní expresi COX-1 i COX-2 mrna. Výraznou up-regulaci COX-2 mrna jsme zaznamenali po indukci zánětlivé reakce (s maximem 6 hodin od intraplantárního podání karageninu), ovšem bez výrazných změn v expresi COX-1 mrna. V modelu pooperační bolesti docházelo k výraznému navýšení exprese COX-1 mrna v čase a v porovnání se zánětlivou bolestí k několikanásobnému snížení exprese COX-2 mrna. Zvýšená exprese COX-1 mrna, kterou jsme zaznamenali po incizi zadních končetin, je v souladu pracemi, ve kterých byla současně s námi (Prochazkova et al. 2006) popsána důležitá úloha COX-1 v rámci tohoto modelu bolesti (Ririe et al. 2006;Zhu et al. 2003). Profylaktické intrathekální podání selektivních inhibitorů COX-1 zvyšuje nociceptivní práh na mechanický podnět, kdežto selektivní inhibitory COX-2 tento efekt postrádají (Zhu et al. 2005). Stejná efektivita COX-1 a COX-2 inhibitorů byla prokázána i v případě, jsou-li podána pooperačně (Yamamoto and Sakashita 1999;Zhu et al. 2003). Účinnost intrathekálně podaných COX-1, ale ne COX-2 inhibitorů, byla prokázána i po laparotomii (Martin et al. 2006). Zvýšená exprese COX-1 byla také zaznamenána v míšních mikrogliích (Zhu et al. 2006) či v některých modelech neuropatické bolesti (Zhu and Eisenach 2003). V rámci naší práce jsme v modelu pooperační bolesti neměřili produkci míšních COX-1 a COX-2 proteinů. Předpokládáme však, že produkce COX-1 proteinu bude v souladu s jeho expresí, tedy, že bude zvýšena. Zvýšená COX-1 imunoreaktivita byla již v rámci tohoto modelu popsána (Zhu et al. 2003). Důležitou úlohu COX-1 v modelu pooperační bolesti 79

86 podporuje i zjištění, že v rámci tohoto modelu dochází pouze k nevýrazným změnám v produkci COX-2 proteinu, a to jak po 3, tak i po 6 hodinách od operace a popsané změny jsou několikanásobně nižší, než které byly pozorovány v modelu karageninem indukované zánětlivé bolesti (Kroin et al. 2004) Diskuse ke změnám míšní COX v modelu osteoartrózy Osteoartróza byla navozena intraartikulární aplikací monojódacetátu do pravého kolenenního kloubu experimentálních zvířat. Injekce monojódacetátu způsobila v postižených končetinách výraznou termální hyperalgezii a mechanickou allodynii. Latence obranné reakce na tepelný či mechanický podnět byly signifikantně sníženy již od prvního dne od začátku experimentu, s minimem 5. den od podání monojódacetátu a snížení nociceptivního prahu na bolestivé stimuly bylo možné pozorovat po celou dobu 31 dní. Relativní exprese míšních cyklooxygenáz se měnila v závislosti na čase. Na počátku experimentu (1. den po podání monojódacetátu) docházelo k nárůstu exprese COX-1 i COX-2 mrna. Několikanásobně zvýšená exprese COX-2 mrna byla zaznamenána 5. den po indukci osteoartrózy a tato exprese zůstávala téměř neměnná po celou dobu experimentu. Exprese COX-1 mrna se naopak v čase zvyšovala s maximálními hodnotami 31. den od intraartikulárního podání monojódacetátu. Produkce míšních COX proteinů zcela korespondovala s jejich expresí. Výše zmíněné výsledky ukazují, že v modelu experimentálně navozené osteoartrózy dochází v lumbální části míchy k signifikantnímu navýšení obou izoforem cyklooxygenáz, tedy, že se expresní profil obou genů liší od modelu zánětlivé nebo pooperační bolesti. Tento experimentální model osteoartrózy nebyl doposud charakterizován z pohledu exprese ani produkce COX-1 a COX-2 na míšní úrovni. Srovnatelná exprese obou cyklooxygenáz byla ale prokázána v synoviálních tekutinách pacientů s akutní a chronickou 80

87 artrózou. Významné rozdíly mezi jednotlivými izoformami však byly zaznamenány v rámci imunoreaktivity a Western blottingu, kde jednoznačně dominovala úloha COX-1 (Iniguez et al. 1998). Významná role COX-1 byla popsána v synoviální tekutině u pacientů s osteoartrózou (Knorth et al. 2004). Srovnatelná exprese obou izoforem cyklooxygenáz byla popsána v synoviálních tkáních pacientů s revmatoidní artritidou a osteoartrózou (Lee et al. 2000), v jiné práci však byla u pacientů s revmatoidní artritidou zjištěna zvýšená exprese COX-2 mrna (Siegle et al. 1998). Zvýšená exprese COX-2 mrna v patele a synoviu byla zaznamenána 2. den po intraartikulárním podání monojódacetátu do kolenního kloubu experimentálních zvířat. 5. a 10. den však docházelo k jejímu snížení a celkové množství bylo porovnatelné s kontrolní skupinou (Dumond et al. 2004) Diskuse ke změnám míšní COX v modelu neuropatické bolesti Objasnit úlohu obou izoforem cyklooxygenázy jsme se pokusili i v modelu neuropatické bolesti. Z široké nabídky různých animálních modelů tohoto typu bolesti jsme si vybraly model částečného poranění nervu (SNI - spared nerve injury) (Decosterd and Woolf 2000), který je způsoben ligací a následným odstraněním dvou ze tří větví sedacího nervu. K žádným výrazným změnám v expresi ani produkci míšních cyklooxygenáz nedocházelo 7 dní od začátku experimentu. Po 14 dnech od SNI operace jsme nezaznamenali žádné změny v expresi obou cyklooxygenáz, v tomto časovém intervalu však docházelo, v porovnání s kontrolami, ke snížení produkce COX-2 proteinu. Výrazné změny v expresi COX-1 mrna jsme zjistili po 21 dnech od chirurgického zákroku, kdy docházelo k signifikantnímu navýšení exprese COX-1 mrna, bez výrazných změn v expresi COX-2 mrna. 81

88 Expresí COX na míšní úrovni v rámci SNI modelu neuropatické bolesti se zabývala pouze jedna práce, ve které bylo popsáno nesignifikantní navýšení exprese COX-2 mrna po 12 a 24 hodinách od SNI operace (Broom et al. 2004). Pokles exprese COX-2 mrna byl však zaznamenán po 72 hodinách a 7 dnech po zákroku, kdy byly hladiny COX-2 mrna sníženy v porovnání s kontrolní skupinou. V této studii ale nebyla sledována exprese COX-1 mrna. Navíc, různé dávky rofecoxibu neměly vliv na rozvoj allodynie a hyperalgezie, která je v rámci tohoto modelu popisována. V jiných modelech neuropatické bolesti byla zaznamenána dynamika v produkci COX-1 na míšní úrovni. Výrazných změn v imunoreaktivitě COX-1 bylo dosahováno po ligaci míšních nervů a v modelu částečné ligace sedacího nervu (Zhu and Eisenach 2003). Důležitá úloha COX-1 byla popsána také během prvních 8 hodin po ligaci míšních nervů v oblasti L5 a L6 (Hefferan et al. 2003) Shrnutí diskuse ke změnám míšní COX u různých typů bolestí Naše výsledky ukazují zejména, že: a/ při periferní bolesti může být v míše zvýšena exprese a produkce nejen COX-2, ale i COX-1, b/ profil změn exprese a produkce COX-1 a COX-2 v míše je u různých typů bolestí různý, c/ změny exprese a produkce COX-1 a COX-2 v míše nejsou statické, ale vyvíjejí se v čase. Podařilo se nám doplnit bílá místa v tabulce změn exprese a produkce COX-1 a COX-2 v míše u vybraných modelů bolesti (Tab. 4). Úloha míšní COX-1 a COX-2 v přenosu bolesti je málo známa a ještě méně jsou známy účinky farmak na COX-1 a COX-2 v míše. V druhé části naší dizertace jsme se proto snažili zjistit účinky vybraných analgetik na expresi a produkci COX-1 a COX-2 v míše u zánětlivé bolesti. 82

89 5.2 Diskuse k účinkům analgetik na míšní COX u zánětlivé bolesti Diskuse k analgetickým účinkům testovaných farmak Paracetamol patří mezi široce používané analgetikum v terapii jak akutních, tak chronických bolestí. Přesný mechanismus jeho účinku prozatím není známý. Možným mechanismem jeho působení může být inhibice cyklooxygenázy na spinální či supraspinální úrovni. Zároveň s touto hypotézou se ale také objevují práce, naznačující ovlivnění i jiných neurotransmiterových systémů např. endokanabinoidního nebo serotoninergního (Mallet et al. 2008;Smith 2009), případně další, které ukazují na účinnost metabolitu paracetamolu látku AM404, pro jejíž vznik je nezbytná přítomnost FAAH systému (Hogestatt et al. 2005;Mallet et al. 2008). U paracetamolu byla dostatečně prozkoumána jeho účinnost v různých preklinických modelech hyperalgezie. V dávkách od 25 do 100 mg/kg dochází při jeho preventivním p.o. podání v modelu zánětlivé bolesti k potlačení hyperalgezie, ovšem jeho podání nemá vliv na vznik otoku postižené tlapky (Bianchi and Panerai 1996). Paracetamol potlačuje také centrálně navozenou hyperalgezii, vyvolanou např. spinálním podáním substance P. Tento efekt paracetamolu byl zaznamenán při jeho preventivním podání, a to v dávce 300 mg/kg p.o. nebo 100 a 200 µg v případě intrathekální aplikace. Po p.o. podání paracetamolu byl také zaznamenán jeho inhibiční vliv na uvolňování PGE 2 v míše (Crawley et al. 2008). Preventivní podání paracetamolu v dávkách mg/kg inhibuje vznik hyperalgezie, která vzniká v modelu karageninem indukované zánětlivé bolesti a vyšší dávky zvyšují nociceptivní práh v zanícené tlapce nad úroveň kontrolních zvířat a působí tak hypoalgesii. Zároveň paracetamol zvyšuje nociceptivní práh i v kontralaterálních tlapkách (Rezende et al. 2008). Podobné účinky paracetamolu jsme pozorovali i v naší práci. Nízké dávky paracetamolu nedokázaly zabránit výrazné tepelné hyperalgezii po karageninu, vyšší dávky paracetamolu však snižovaly 83

90 nociceptivní citlivost zadních končetin na tepelný podnět a působily hypoalgesicky. První signifikantní rozdíl v porovnání se skupinou, které byl intraplantárně karagenin a následně p.o. destilovaná voda, byl zaznamenán při podání paracetamolu v dávce 30 mg/kg 1 hodinu po intraplantárním podání karageninu. Se zvyšováním dávek docházelo i k navyšování délky i míry analgetického účinku paracetamolu. K mírnému navýšení latencí zadních končetin na tepelný stimul zároveň docházelo i v kontralaterálních, tedy zdravých tlapkách. Tato navýšení však nebyla v porovnání s kontrolními zvířaty statisticky signifikantní. Námi zjištěné hodnoty ED 50 paracetamolu v modelu karageninem indukované zánětlivé bolesti se liší v závislosti na čase od indukce zánětlivé reakce a jsou ve všeobecném souladu s dávkami, které se běžně používají při studování účinku paracetamolu v různých animálních modelech bolesti. Mechanismus účinku dalšího, velmi často používaného analgetika - diklofenaku, je dobře znám. Diklofenak působí jako neselektivní inhibitor cyklooxygenázy 1 a cyklooxygenázy 2. V modelu karageninem indukované zánětlivé bolesti dochází po jeho preventivním i.p. podání (v dávce 25 mg/kg) 1 hodinu před vlastním podáním karageninu, k výraznému snížení otoku zánětem postižených tlapek (o více než 50% v prvních třech hodinách od počátku experimentu)(al-majed et al. 2003). Ve stejném modelu zánětlivé bolesti byla popsána dávka diklofenaku, která je schopna navodit 40% inhibici otoku zadní tlapky experimentálních zvířat. Zjištěná hodnota = 2 mg/kg (Scholer et al. 1986). V případě chronického zánětu (při opakovaném intraplantárním podání karageninu) a podávání diklofenaku p.o. po dobu 15 dní v dávce 3 mg/kg, nebyl zaznamenán žádný vliv na tepelnou hyperalgezii (žádné signifikantní rozdíly oproti kontrolní skupině), podání této dávky diklofenaku však bylo postačující pro potlačení edému navozeného aplikací karageninu (Peter- Szabo et al. 2007). V rámci našich experimentů jsme zaznamenali analgetické účinky všech tří podávaných dávek diklofenaku (1, 10 a 100 mg/kg p.o.) 1. a 3. hodinu po p.o. podání, resp. 84

91 2. a 4. hodinu po intraplantárním podání karageninu. 5 hodinu po p.o. podání diklofenaku byl jeho analgetický účinek snížen. Námi zjištěné hodnoty ED 50 korespondují s prací, kde byla ED 50 diklofenaku zkoumána na stejném modelu bolesti. Diklofenak byl podáván p.o. v různých dávkách 1 hodinu před podáním karageninu. ED 50 diklofenaku 3 hodiny po intraplantárním podání karageninu měla hodnot u 9.1 mg/kg (Noguchi Y. 1984). Meloxikam patří do skupiny preferenčních inhibitorů cyklooxygenázy-2. Mechanismem jeho účinku je tedy relativně selektivní inhibice COX-2, ve vyšších dávkách však dochází i k inhibici COX-1. Svými vlastnostmi, ve vztahu k jednotlivým izoformám cyklooxygenázy, se tedy řadí mezi skupinu neselektivních a selektivních NSA (tzv. koxibů). Výhodou preferenční inhibice COX-2 je nižší riziko gastrointestinálního poškození a menší ovlivnění agregace trombocytů a tím i rizika krvácení. V rámci preklinického testování byl účinek meloxikamu zkoumán v různých modelech bolesti. Při testování v modelu zánětlivé bolesti (vyvolané podáním suspenze kvasinek) vykazoval meloxikam 90 minut po p.o. podání velmi dobrý analgetický účinek v tlumení mechanického prahu bolesti (Engelhardt et al. 1996). Protizánětlivý účinek meloxikamu, byl také testován v modelu karageninem navozené pleuritidy. Meloxikam, v dávce 1 a 3 mg/kg, vykazoval dobrou protizánětlivou odpověď 5 hodin po podání karageninu, kdy dochází k vrcholu exsudace (Ogino et al. 1997). Mohutný protizánětlivý účinek byl pozorován také u karageninem navozeného otoku zadní tlapky a účinnost meloxikamu byla v tomto modelu několikanásobně vyšší v porovnání s piroxicamem, indometacinem nebo diklofenakem (Engelhardt et al. 1995). Na dávce závislý účinek v tlumení otoku zadní tlapky, do které byl intraplantárně podán karagenin, byl popsán ve studii, kdy byl meloxikam p.o. podán v dávkách 3, 10 a 30 mg/kg 1 hodinu před intraplantárním podáním karageninu (Dudhgaonkar et al. 2006). K výraznému snížení otoku postižených tlapek docházelo 5. a 7. hodinu po podání karageninu. Po podání 85

92 vyšších dávek meloxikamu (10 a 30 mg/kg) docházelo k potlačení edému tlapek již 3 hodiny po indukci zánětu. V rámci našich experimentů v modelu karageninem navozené zánětlivé bolesti, docházelo při srovnání se skupinou zvířat, které byl intraplantárně podán karagenin a následně p.o. destilovaná voda, k analgetickému účinku meloxikamu již po podání dávky 3 mg/kg p.o. 3 hodinu po jeho podání. Výraznější analgetické účinky jsme pak zaznamenali při podání vyšších dávek meloxikamu (10, 30 a 100 mg/kg). V modelu chronické konstrikce sedacího nervu byla stanovena hodnota ED 50 meloxikamu na 12.3 mg/kg (Dudhgaonkar et al. 2007). V případě selektivního COX-2 inhibitoru celecoxibu, byl v preklinických modelech bolesti prokázán jeho velmi dobrý protizánětlivý a analgetický účinek. Preventivní p.o. podání celecoxibu v dávce 30 mg/kg snižuje otok a hyperalgezii zadních končetin v modelu karageninem navozeného akutního zánětu. Stejná dávka celecoxibu je účinná i v redukci karageninem zvýšené hladiny PGE 2 na úroveň kontrol, a to v případě, je-li celecoxib podán profylakticky nebo terapeuticky (2 hodiny před nebo 3 hodiny po intraplantární injekci karageninu)(smith et al. 1998). Stejného účinku lze dosáhnout i při profylaktickém lokálním podání celecoxibu přímo do místa zánětlivé reakce. Zároveň lze po systémovém podání celecoxibu v modelu karageninem indukované zánětlivé bolesti pozorovat vznik hypoalgesie postižených tlapek (Francischi et al. 2002). Schopnost celecoxibu redukovat otok zadních tlapek se ukázala jako na dávce závislá. 10 mg/kg celecoxibu navodí 22% redukci otoku tlapky, kdežto dávka 25 mg/kg sníží otok zadní tlapky o 27.9% (Suleyman et al. 2004). V některých pracech, které potvrzují inhibiční efekt celecoxibu na hyperalgezii navozenou podáním karageninu a jeho hypoalgesické působení v tomto modelu zánětlivé bolesti, diskutují i mechanismus analgetického působení celecoxibu, který by mohl být mimo jiného, zprostředkován i endogenními opioidy (Franca et al. 2006;Rezende et al. 2009). V rámci našich pozorování, p.o. podání celecoxibu 1 hodinu po intraplantárním podání karageninu, v závislosti na dávce, redukovalo tepelnou hyperalgezii. První statisticky 86

93 významné hodnoty (v porovnání se skupinou, které byl intraplantárně podán karagenin a hodinu poté p.o. destilovaná voda) jsme zaznamenali již při podání celcecoxibu v dávce 1 mg/kg 3 hodiny po p.o. podání. Analgetický účinek se zvyšoval s podanou dávkou a při porovnání s kontrolami, kterým byl intraplantárně podán fyziologický roztok a následně p.o. destilovaná voda, jsme mohli pozorovat i hypoalgesický efekt celecoxibu. Námi zjištěné hodnoty ED 50 v různých časových intervalech od podání celecoxibu jsou v souladu s ED 50 celecoxibu uváděnými pro model karageninem indukované zánětlivé bolesti (Penning et al. 1997). Účinek FR122047, selektivního COX-1 inhibitoru, byl popsán jen v několika studiích. Analgetický účinek této látky byl zaznamenán při jejím preventivním podání ve 2. fázi formalínového testu s hodnotou ED mg/kg p.o. K podobnému efektu docházelo i při profylaktickém podání této látky ve writhing testu, kdy v závislosti na podané dávce docházelo ke snižování počtu protažení po podání kyseliny octové s hodnotou ED mg/kg p.o. (Ochi et al. 2000). Účinnost této látky byla potvrzena také v modelu kolagenem navozené artrózy (Ochi and Goto 2002). Analgetické účinky FR jsme zaznamenali i v naší práci. Při porovnání s kontrolní skupinou zvířat, které byl intraplantárně podán karagenin a p.o. destilovaná voda, jsme první analgetické účinky této látky zaznamenaly 3 hodiny po p.o. podání dávky 2 mg/kg. Výraznější analgetické účinky této látky jsme však pozorovali při podání vyšších dávek, přičemž další zvyšování dávek nevedlo k navyšování analgetického účinku. Hodnoty ED 50 pro tuto látku byly zjišťovány ve třech různých časových intervalech od p.o. podání a pohybovaly se v rozmezí od 5.4 do 10 mg/kg. Tramadol patří mezi slabá opioidní analgetika. Užívá se pro tišení středně silných, silných nebo dlouhotrvajících bolestí. Působí jako selektivní agonista na opioidních receptorech a jeho analgetický účinek je potencován inhibicí zpětného vychytávání (reuptake) serotoninu a noradrenalinu na synapsích CNS. Z preklinických dat je zjevné, že tramadol, 87

94 v závislosti na dávce, signifikantně redukuje otok a snižuje citlivost zadních končetin na mechanický podnět v modelu zánětlivé bolesti indukované intraplantárním podáním kvasinek (Bianchi et al. 1999). Potlačení edému tlapek bylo pozorované i po i.p. podání tramadolu v modelu karageninem indukované zánětlivé bolesti a zároveň po jeho podání docházelo, v závislosti na podané dávce, k útlumu produkce PGE 2 v exudátech odebraných z postižených končetin (Bianchi et al. 1999). Analgetický účinek tramadolu byl zaznamenán i po intraplantárním podání CFA do zadních tlapek experimentálních zvířat, kdy p.o. podání tramadolu zvyšovalo nociceptivní práh na mechanický podnět, a to jak v porovnání se skupinou zvířat, které bylo podáno pouze CFA, tak i v porovnání se skupinou kontrol, které byl podán fyziologický roztok a p.o. destilovaná voda (Bianchi et al. 2007). Účinnost tramadolu v plantar testu byla potvrzena i po jeho lokálním podání. Intraplantární podání tramadolu zvyšovalo nociceptivní práh na tepelné stimuly a tento účinek tramadolu byl výrazně potencován podáním extracelulárního vápníku (Mert et al. 2007). Výrazný analgetický účinek tramadolu byl popsán také v modelu karaganinem indukované artritidy, kdy jak po profylaktickém, tak i po terapeutickém intraartikulárním podání tramadolu docházelo k výraznému potlačení otoku kolenního kloubu, ke zvyšování nociceptivního prahu postižených končetin na tepelný podnět a k výraznému zlepšení mobility experimentálních zvířat (Garlicki et al. 2006). Podobný efekt tramadolu byl zaznamenán i u artrózy indukované podáním Freundova adjuvans (Xie et al. 2008). V rámci našeho testování jsme po p.o. podání nízkých dávek tramadolu 1 hodinu po intraplantárním podání karageninu mohli pozorovat signifikantní zvýšení citlivosti zadních končetin na tepelný podnět v porovnání se skupinou, které byl intraplantárně podán fyziologický roztok a následně p.o. destilovaná voda. Vyšší dávka tramadolu však v porovnání se stejnou skupinou zvířat zvyšovala latence zadních končetin na tepelný podnět. 88

95 První analgetický účinek tramadolu, v porovnání se skupinou, které byl intraplantárně podán karagenin a 1 hodinu poté p.o. destilovaná voda, jsme mohli pozorovat 3 hodiny po p.o podání tramadolu v dávce 5 mg/kg. Vyšší dávky tramadolu pak působily v tlumení zánětlivé bolesti mnohem intenzivněji. Metamizol (dipyron) je pyrazolonové spazmoanalgetikum a antipyretikum, které se využívá zejména v terapii akutních bolestí. Metamizol má i protizánětlivý účinek, ten je však v porovnání s ostatními nesteroidními antirevmatiky nižší. Mechanismem jeho účinku je blokáda produkce prostaglandinů, a to jak na periferii, tak v CNS, způsobená neselektivní inhibicí obou izoforem cyklooxygenázy. Preklinické studie potvrzují velmi dobrý analgetický účinek této látky. Metamizol v závislosti na podané dávce snižuje otok a hyperalgezii navozenou intraplantárním podáním karageninu (Lorenzetti and Ferreira 1985). Profylaktické s.c. či intraplantární podání metamizolu potlačuje vznik hyperalgezie navozené intraplantárním podáním karageninu a zvyšuje nociceptivní práh na mechanické stimuly čímž navozuje hypoalgezii (Rezende et al. 2008). Analgetický účinek metamizolu byl prokázán i v modelu adjuvancii navozené artritidy, kdy po jeho podání dochází v závislosti na podané dávce ke snížení otoku (o 33%) a hyperalgezie (o 55%)(Tatsuo et al. 1994). Svou účinnost potvrdil metamizol i ve formalínovém testu, kde může být jeho účinek potencován gabapentinem (Ortega-Varela et al. 2007;Ortega-Varela et al. 2004) nebo v modelu dysfunkce končetin (intraartikulární podání kyseliny močové), kde je antinociceptivní účinek metamizolu potencován morfinem (Lopez-Munoz et al. 2008). V průběhu našich experimentů, zvyšovalo p.o. podání metamizolu již v nejnižší dávce (30 mg/kg) hyperalgezii navozenou intraplantárním podáním karageninu. V případě vyšších dávek metamizolu byl tento účinek ještě více zesílen a byl pozorován po celou dobu experimentu. Získané hodnoty ED 50 v různých časových intervalech od jejich p.o. podání v modelu karageninem indukované zánětlivé bolesti se pohybovaly v rozmezí od do mg/kg. 89

96 Z literatury je dostupná porovnatelná hodnota ED 30 metamizolu, která činí 139.2±6.2 mg/kg (Ortega-Varela et al. 2007;Ortega-Varela et al. 2004) Diskuse k účinkům zvolených analgetik na míšní COX Zajímavé výsledky jsme získali po podání výše zmíněných analgetik v modelu zánětlivé bolesti. Ve shodě s předcházejícími experimenty (viz ) a publikovanými údaji (Tab. 1) došlo i zde při periferní zánětlivé bolesti vyvolané intraplantární injekcí karageninu ke zvýšení exprese i produkce míšní COX-2, nikoliv však míšní COX-1. Ze sedmi testovaných analgetik v ekvipotentních dávkách (analgetických ED 50 ) neovlivnil expresi nebo produkci míšní COX-1 nebo 2 pouze tramadol a paracetamol. Naproti tomu inhibitory COX vykazovaly v některých ohledech signifikantní účinky. Všechny inhibitory COX (diklofenak, meloxikam, metamizol, celecoxib a FR122407) zabránily zvýšení produkce COX-2 v míše při zánětlivé bolesti po intraplantární aplikaci karageninu. Selektivní inhibitor COX-1 látka FR signifikantně snížil expresi i produkci COX-1 v míše a selektivní inhibitor COX-2 zabránil zvýšení exprese a signifikantně snížil produkci COX-2 v míše při zánětlivé bolesti po intraplantární aplikaci karageninu. Zdá se, že selektivní inhibitory COX působí již na úrovni exprese cyklooxygenáz, zatímco neselektivní či preferenční COX-2 látky blokují až následnou produkci bílkovin. Naše zjištění, že inhibitory COX mohou nejen tlumit aktivitu cyklooxygenáz, ale i jejich syntézu považujeme za velmi závažné. Otázkou je, zda je to účinek přímý nebo nepřímo zprostředkovaný např. cytokiny uvolňovanými při zánětu na periferii (jejichž tvorbu mohou inhibitory COX tlumit). Další výzkum této problematiky by mohl být velmi zajímavý a přínosný. Míra exprese a produkce míšních cyklooxygenáz po podání různých nesteroidních antirevmatik není dostatečně prozkoumána. V literatuře je dostupných jen několik studií, sledujících vliv podaných léčiv na expresi případně produkci COX-1 nebo COX-2 v míše. 90

97 Zvýšená produkce COX-2 proteinu v míše byla zaznamenána po podání CFA do zadních tlapek experimentálních zvířat. Jak po i.t. podání ketorolaku jako neselektivního COX inhibitoru, tak po podání celecoxibu jako selektivního COX-2 inhibitoru, docházelo nejprve k navýšení produkce COX-2 proteinu, s návratem ke kontrolním hodnotám 6 hodin po intraplantárním podání CFA (Hsueh et al. 2004). K ovlivnění exprese COX-2 mrna docházelo také po preventivním podání dexametazonu v modelu experimentálně navozeného zánětu pomocí CFA. K signifikantnímu snížení exprese COX-2 mrna v lumbální části míchy na nebo i dokonce pod úroveň kontrol docházelo 2 a 4 hodiny po podání dexametazonu (Hay and de Belleroche 1998). Změny exprese c-fos proteinu (jako markeru, jehož koncentrace se zvyšuje úměrně intenzitě zánětlivého či bolestivého podnětu) v lumbální části míchy v modelu karageninem navozené zánětlivé bolesti byly sledovány po podání ketoprofenu jako preferenčního COX-1 inhibitoru a COX-2 selektivního inhibitoru parecoxibu. Po intraplantárním podání karageninu byla zaznamenána exprese c-fos proteinu v ipsilaterální části lumbální míchy, která byla různě ovlivněna podáním výše zmíněných analgetik. Po podání ketoprofenu docházelo na míšní úrovni ke snížení exprese c-fos proteinu a tento účinek byl pozorován jak při podání ketoprofenu před, tak i po podání karageninu. Účinek parecoxibu byl ovlivněn dobou podání. Při preventivním podání parecoxibu byla zaznamenána signifikantně snížená exprese c-fos proteinu. Podání parecoxibu až po intraplantárním navození zánětlivé reakce již expresi c-fos proteinu v míše nijak neovlivnilo (Urdaneta et al. 2009) Shrnutí diskuse k účinkům zvolených analgetik na míšní COX Při periferní zánětlivé bolesti vyvolané intraplantární injekcí karageninu došlo ke zvýšení exprese i produkce míšní COX-2, nikoliv však míšní COX-1. Ze sedmi testovaných analgetik v ekvipotentních dávkách (analgetických ED 50 ) neovlivnil expresi nebo produkci 91

98 míšní COX-1 nebo COX-2 pouze tramadol a paracetamol. Naproti tomu inhibitory COX vykazovaly v některých ohledech signifikantní účinky. Všechny inhibitory COX (diklofenak, meloxikam, metamizol, celecoxib a FR122407) zabránily zvýšení produkce COX-2 v míše při zánětlivé bolesti po intraplantární aplikaci karageninu. Selektivní inhibitor COX-1 látka FR signifikantně snížil expresi i produkci COX-1 v míše a selektivní inhibitor COX-2 celecoxib zabránil zvýšení exprese a signifikantně snížil produkci COX-2 v míše při zánětlivé bolesti po intraplantární aplikaci karageninu. Zdá se, že selektivní inhibitory COX působí již na úrovni exprese cyklooxygenáz, zatímco neselektivní či preferenční COX-2 látky blokují až následnou produkci bílkovin. Naše zjištění, že inhibitory COX mohou nejen tlumit aktivitu cyklooxygenáz, ale i jejich syntézu považujeme za velmi závažné. Otázkou je, zda je to účinek přímý nebo nepřímo zprostředkovaný např. cytokiny uvolňovanými při zánětu na periferii (jejichž tvorbu mohou inhibitory COX tlumit). Další výzkum této problematiky by mohl být velmi zajímavý a přínosný. 92

99 6 Závěry a zhodnocení cílů práce Jak bylo výše uvedeno, tato dizertace měla dva hlavní cíle: Prvním cílem bylo zjistit, zda a jak se mění exprese a produkce COX-1 a 2 v míše u různých typů bolestí. Bylo známo, že u zánětlivé bolesti dochází v míše ke zvýšení exprese a produkce COX-2, nikoliv však COX-1. Snažili jsme se zjistit, zda je tomu tak i u jiných typů bolestí (zejména zda je exprese a produkce míšní COX-1 tak minimálně ovlivněna i u jiných typů bolestí). Jak vyplývá z tabulky 4 (Tab. 4), zjistili jsme, že u pooperační bolesti dochází ke zvýšení exprese nejen míšní COX-2 (jako u zánětlivé bolesti), ale i ke zvýšení exprese míšní COX-1. Stejný výsledek (Prochazkova et al. 2006) publikovali současně další autoři (Ririe et al. 2006). Naše výsledky u zánětlivé bolesti byly ve shodě s publikovanými údaji (Tab. 4), přitom však ukázaly, že exprese míšní COX-2 je u pooperační bolesti mnohem méně zvýšena než u zánětlivé bolesti (Obr. 12). I u dalších dvou modelů bolesti (při osteoartróze a neuropatické bolesti) jsme zjistili signifikantní zvýšení exprese i produkce COX-1 v míše. Přitom u neuropatické bolesti nedošlo ke zvýšení exprese ani produkce míšní COX-2 (Tab. 4), takže u tohoto typu bolesti byl profil změn COX-1 a COX-2 v míše opačný než u zánětlivé bolesti. U osteoartrózy došlo ke zvýšení exprese a produkce i míšní COX-2 (Tab. 4). Naše výsledky tak ukazují, že při periferní bolesti může být v míše zvýšena exprese a produkce nejen COX-2, ale i COX-1 a že profil změn exprese a produkce COX-1 a COX-2 v míše je u různých typů bolestí různý. Domníváme se, že první hlavní cíl této dizertace byl splněn. 93

100 zánět COX-1 exprese nemění se a,b,c,f nemění se COX-1 produkce COX-2 exprese COX-2 produkce nemění se b,e,g a,b,c,d,f b,e,g operace i h,i nemění se j a Beiche1996, b Beiche 1998, c Hay 1997, d Hay 1998, e Seybold 2003, f Seibert 1994, g Ebersberger 1999 Procházková 2006 h Zhu 2003, i Ririe 2006, j Kroin 2004 Procházková 2006 osteoartróza Procházková 2009 neuropatie nemění se k nemění se nemění se k Broom 2004 Tab. 4 - Exprese a produkce COX-1 a COX-2 na míšní úrovni v různých modelech bolesti ( =zvýšení, = snížení). Červeně = vlastní výsledky uvedené v této dizertaci, černě = publikované výsledky. Druhým hlavním cílem bylo zjistit vliv vybraných analgetik na expresi a produkci míšních COX-1 a COX-2 v modelu zánětlivé bolesti. Z analgetik jsme zvolili neselektivní a selektivní COX inhibitory spolu s opioidním analgetikem tramadolem. Jak je uvedeno v tabulce 5 (Tab. 5), různá analgetika měla odlišný vliv na expresi a produkci cyklooxygenáz na míšní úrovni. COX-1 COX-1 COX-2 COX-2 exprese produkce exprese produkce Zánět bez analgetik nemění se nemění se Tramadol nemění se nemění se Paracetamol nemění se nemění se Diklofenak nemění se nemění se nemění se Meloxikam nemění se nemění se nemění se Metamizol nemění se nemění se nemění se FR nemění se nemění se Celecoxib nemění se nemění se nemění se Tab. 5 Účinek analgetik v ekvianalgetických dávkách (ED 50 ) na změny exprese a produkce míšní COX-1 a COX-2 v modelu zánětlivé bolesti vyvolané intraplantární injekcí karageninu ( =zvýšení, = snížení ve srovnání s kontrolami). 94

101 Ze sedmi testovaných analgetik v ekvipotentních dávkách (analgetických ED 50 ) neovlivnil zánětem změněnou expresi nebo produkci míšní COX-1 nebo 2 pouze tramadol a paracetamol (profil jejich účinků byl stejný jako u zánětu bez analgetik Tab. 5). Naproti tomu inhibitory COX vykazovaly v některých ohledech signifikantní účinky. Všechny inhibitory COX (diklofenak, meloxikam, metamizol, celecoxib a FR122407) zabránily zvýšení produkce COX-2 v míše při zánětlivé bolesti po intraplantární aplikaci karageninu. Selektivní inhibitor COX-1 látka FR signifikantně snížil expresi i produkci COX-1 v míše a selektivní inhibitor COX-2 celecoxib zabránil zvýšení exprese a signifikantně snížil produkci COX-2 v míše při zánětlivé bolesti po intraplantární aplikaci karageninu. Zdá se, že selektivní inhibitory COX působí již na úrovni exprese cyklooxygenáz, zatímco neselektivní či preferenční COX-2 látky blokují až následnou produkci bílkovin. Domníváme se, že i tento druhý hlavní cíl naší dizertace byl splněn. Naše zjištění, že inhibitory COX mohou nejen tlumit aktivitu cyklooxygenáz, ale i jejich syntézu považujeme za velmi závažné. Otázkou je, zda je to účinek přímý nebo nepřímo zprostředkovaný např. cytokiny uvolňovanými při zánětu na periferii (jejichž tvorbu mohou inhibitory COX tlumit). Další výzkum této problematiky by mohl být velmi zajímavý a přínosný. 95

102 7 Souhrn Cílem naší práce bylo zjistit, zda a jak se mění exprese a produkce COX-1 a 2 v míše u různých typů bolestí a zjistit vliv vybraných analgetik na expresi a produkci COX-1 a COX-2 v lumbální části míchy v modelu zánětlivé bolesti. Všechny experimenty, které byly provedeny v rámci disertační práce, byly provedeny na laboratorních potkanech. Bolest byla měřena v plantar testu nebo pomocí von Freyových filament. Exprese jednotlivých cyklooxygenáz byla testována pomocí real-time PCR analýzy, zatímco produkce COX-1 a COX-2 byla sledována pomocí ELISA metody. Zjistili jsme, že při periferní bolesti může být v míše zvýšena exprese a produkce nejen COX-2, ale i COX-1 a že profil změn exprese a produkce COX-1 a 2 v míše je u různých typů bolestí různý. Při zánětlivé bolesti způsobené intraplantární aplikací karageninu se v míše zvyšovala exprese COX-2, neměnila se však exprese COX-1. Naproti tomu u neuropatické bolesti se v míše exprese COX-2 nezvyšovala, ale docházelo k výraznému zvýšení exprese COX-1, a to až po dlouhé latenci 21 dní. K indukci obou cyklooxygenáz docházelo v modelu pooperační bolesti a osteoartrózy. Změny exprese a produkce COX-1 a 2 v míše nebyly statické, ale vyvíjely se v čase. Analgetika podaná v ekvianalgetických dávkách (ED 50 ) měla v modelu zánětlivé bolesti různý vliv na expresi a produkci míšních cyklooxygenáz. Zatímco selektivní COX-1 nebo COX-2 inhibitory (FR nebo celecoxib) působily inhibičně již na úrovni exprese jednotlivých cyklooxygenáz, neselektivní COX inhibitor (diklofenak), preferenční COX-2 inhibitor (meloxikam) a metamizol působily na úrovni blokády produkce COX proteinu. Opioidní analgetikum tramadol a paracetamol neovlivňovaly změny exprese a produkce COX-1 ani 2 v míše v modelu zánětlivé bolesti. 96

103 8 Použitá literatura Aanonsen,LM, Wilcox,GL. Phencyclidine selectively blocks a spinal action of N-methyl-Daspartate in mice. Neurosci. Lett. 1986;67: Aanonsen,LM, Wilcox,GL. Nociceptive action of excitatory amino acids in the mouse: effects of spinally administered opioids, phencyclidine and sigma agonists. J. Pharmacol. Exp. Ther. 1987;243: Abbott,FV, Franklin,KB, Westbrook,RF. The formalin test: scoring properties of the first and second phases of the pain response in rats. Pain 1995;60: Abbracchio,MP, Burnstock,G. Purinoceptors: are there families of P2X and P2Y purinoceptors? Pharmacol. Ther. 1994;64: Al-Majed,AA, Khattab,M, Raza,M, Al-Shabanah,OA, Mostafa,AM. Potentiation of diclofenacinduced anti-inflammatory response by aminoguanidine in carrageenan-induced acute inflammation in rats: the role of nitric oxide. Inflamm. Res. 2003;52: Aley,KO, Reichling,DB, Levine,JD. Vincristine hyperalgesia in the rat: a model of painful vincristine neuropathy in humans. Neuroscience 1996;73: Alhaider,AA, Wilcox,GL. Differential roles of 5-hydroxytryptamine1A and 5- hydroxytryptamine1b receptor subtypes in modulating spinal nociceptive transmission in mice. J. Pharmacol. Exp. Ther. 1993;265: Ali,Z, Meyer,RA, Campbell,JN. Secondary hyperalgesia to mechanical but not heat stimuli following a capsaicin injection in hairy skin. Pain 1996;68: Ambler Z. Neuropatická bolest. In: Rokyta R., Kršiak M., Kozák J. Bolest. Praha. Tigis, 2006, p

104 Armstrong,RA, Wilson,NH. Aspects of the thromboxane receptor system. Gen. Pharmacol. 1995;26: Arvidsson,U, Dado,RJ, Riedl,M, Lee,JH, Law,PY, Loh,HH, Elde,R, Wessendorf,MW. delta- Opioid receptor immunoreactivity: distribution in brainstem and spinal cord, and relationship to biogenic amines and enkephalin. J. Neurosci. 1995a;15: Arvidsson,U, Riedl,M, Chakrabarti,S, Lee,JH, Nakano,AH, Dado,RJ, Loh,HH, Law,PY, Wessendorf,MW, Elde,R. Distribution and targeting of a mu-opioid receptor (MOR1) in brain and spinal cord. J. Neurosci. 1995b;15: Arvidsson,U, Riedl,M, Chakrabarti,S, Vulchanova,L, Lee,JH, Nakano,AH, Lin,X, Loh,HH, Law,PY, Wessendorf,MW. The kappa-opioid receptor is primarily postsynaptic: combined immunohistochemical localization of the receptor and endogenous opioids. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1995c;92: Authier,N, Coudore,F, Eschalier,A, Fialip,J. Pain related behaviour during vincristine-induced neuropathy in rats. Neuroreport 1999;10: Basbaum,AI, Fields,HL. Endogenous pain control mechanisms: review and hypothesis. Ann. Neurol. 1978;4: Beiche,F, Brune,K, Geisslinger,G, Goppelt-Struebe,M. Expression of cyclooxygenase isoforms in the rat spinal cord and their regulation during adjuvant-induced arthritis. Inflamm. Res. 1998;47: Beiche,F, Scheuerer,S, Brune,K, Geisslinger,G, Goppelt-Struebe,M. Up-regulation of cyclooxygenase-2 mrna in the rat spinal cord following peripheral inflammation. FEBS Lett. 1996;390:

105 Bennett,GJ, Xie,YK. A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man. Pain 1988;33: Bernardini,N, Sauer,SK, Haberberger,R, Fischer,MJ, Reeh,PW. Excitatory nicotinic and desensitizing muscarinic (M2) effects on C-nociceptors in isolated rat skin. J. Neurosci. 2001;21: Bianchi,M, Martucci,C, Ferrario,P, Franchi,S, Sacerdote,P. Increased tumor necrosis factoralpha and prostaglandin E2 concentrations in the cerebrospinal fluid of rats with inflammatory hyperalgesia: the effects of analgesic drugs. Anesth. Analg. 2007;104: Bianchi,M, Panerai,AE. The dose-related effects of paracetamol on hyperalgesia and nociception in the rat. Br. J. Pharmacol. 1996;117: Bianchi,M, Rossoni,G, Sacerdote,P, Panerai,AE. Effects of tramadol on experimental inflammation. Fundam. Clin. Pharmacol. 1999;13: Bowery,NG. GABAB receptor pharmacology. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1993;33: Brennan,TJ, Vandermeulen,EP, Gebhart,GF. Characterization of a rat model of incisional pain. Pain 1996;64: Broom,DC, Samad,TA, Kohno,T, Tegeder,I, Geisslinger,G, Woolf,CJ. Cyclooxygenase 2 expression in the spared nerve injury model of neuropathic pain. Neuroscience 2004;124: Calcutt,NA, Jorge,MC, Yaksh,TL, Chaplan,SR. Tactile allodynia and formalin hyperalgesia in streptozotocin-diabetic rats: effects of insulin, aldose reductase inhibition and lidocaine. Pain 1996;68:

106 Carlton,SM, Du,J, Davidson,E, Zhou,S, Coggeshall,RE. Somatostatin receptors on peripheral primary afferent terminals: inhibition of sensitized nociceptors. Pain 2001;90: Carlton,SM, Zhou,S, Coggeshall,RE. Peripheral GABA(A) receptors: evidence for peripheral primary afferent depolarization. Neuroscience 1999;93: Chandrasekharan,NV, Dai,H, Roos,KL, Evanson,NK, Tomsik,J, Elton,TS, Simmons,DL. COX-3, a cyclooxygenase-1 variant inhibited by acetaminophen and other analgesic/antipyretic drugs: cloning, structure, and expression. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 2002;99: Chaplan,SR, Bach,FW, Pogrel,JW, Chung,JM, Yaksh,TL. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. J. Neurosci. Methods 1994;53: Choi,Y, Yoon,YW, Na,HS, Kim,SH, Chung,JM. Behavioral signs of ongoing pain and cold allodynia in a rat model of neuropathic pain. Pain 1994;59: Chuang,HH, Prescott,ED, Kong,H, Shields,S, Jordt,SE, Basbaum,AI, Chao,MV, Julius,D. Bradykinin and nerve growth factor release the capsaicin receptor from PtdIns(4,5)P2- mediated inhibition. Nature 2001;411: Clatworthy,A, Williams,JH, Barasi,S. Intrathecal 5-hydroxytryptamine and electrical stimulation of the nucleus raphe magnus in rats both reduce the antinociceptive potency of intrathecally administered noradrenaline. Brain Res. 1988;455: Coderre,TJ, Gonzales,R, Goldyne,ME, West,J, Levine,JD. Noxious stimulus-induced increase in spinal prostaglandin E2 is noradrenergic terminal-dependent. Neurosci. Lett. 1990;115:

107 Colpaert,FC. Evidence that adjuvant arthritis in the rat is associated with chronic pain. Pain 1987;28: Combe,R, Bramwell,S, Field,MJ. The monosodium iodoacetate model of osteoarthritis: a model of chronic nociceptive pain in rats? Neurosci. Lett. 2004;370: Courteix,C, Bardin,M, Chantelauze,C, Lavarenne,J, Eschalier,A. Study of the sensitivity of the diabetes-induced pain model in rats to a range of analgesics. Pain 1994;57: Courteix,C, Eschalier,A, Lavarenne,J. Streptozocin-induced diabetic rats: behavioural evidence for a model of chronic pain. Pain 1993;53: Coutinho,SV, Meller,ST, Gebhart,GF. Intracolonic zymosan produces visceral hyperalgesia in the rat that is mediated by spinal NMDA and non-nmda receptors. Brain Res. 1996;736: Couture,R, Harrisson,M, Vianna,RM, Cloutier,F. Kinin receptors in pain and inflammation. Eur. J. Pharmacol. 2001;429: Crawley,B, Saito,O, Malkmus,S, Fitzsimmons,B, Hua,XY, Yaksh,TL. Acetaminophen prevents hyperalgesia in central pain cascade. Neurosci. Lett. 2008;442: Cunha,FQ, Ferreira,SH. Peripheral hyperalgesic cytokines. Adv. Exp. Med. Biol. 2003;521: Decosterd,I, Woolf,CJ. Spared nerve injury: an animal model of persistent peripheral neuropathic pain. Pain 2000;87: DeLander,GE, Wahl,JJ. Behavior induced by putative nociceptive neurotransmitters is inhibited by adenosine or adenosine analogs coadministered intrathecally. J. Pharmacol. Exp. Ther. 1988;246:

108 Dennis,EA. The growing phospholipase A2 superfamily of signal transduction enzymes. Trends Biochem. Sci. 1997;22: 1-2. Di,RM. Biological properties of carrageenan. J. Pharm. Pharmacol. 1972;24: Dirig,DM, Isakson,PC, Yaksh,TL. Effect of COX-1 and COX-2 inhibition on induction and maintenance of carrageenan-evoked thermal hyperalgesia in rats. J. Pharmacol. Exp. Ther. 1998;285: Dirig,DM, Konin,GP, Isakson,PC, Yaksh,TL. Effect of spinal cyclooxygenase inhibitors in rat using the formalin test and in vitro prostaglandin E2 release. Eur. J. Pharmacol. 1997;331: Doležal T., Kršiak M. Farmakologie nocicepce. In: Rokyta R., Kršiak M., Kozák J. Bolest. Praha. Tigis, 2006, p Donaldson,LF, Humphrey,PS, Oldfield,S, Giblett,S, Grubb,BD. Expression and regulation of prostaglandin E receptor subtype mrnas in rat sensory ganglia and spinal cord in response to peripheral inflammation. Prostaglandins Other Lipid Mediat. 2001;63: Dray,A. Kinins and their receptors in hyperalgesia. Can. J. Physiol Pharmacol. 1997;75: Dubuisson,D, Dennis,SG. The formalin test: a quantitative study of the analgesic effects of morphine, meperidine, and brain stem stimulation in rats and cats. Pain 1977;4: Dudhgaonkar,SP, Tandan,SK, Bhat,AS, Jadhav,SH, Kumar,D. Synergistic anti-inflammatory interaction between meloxicam and aminoguanidine hydrochloride in carrageenan-induced acute inflammation in rats. Life Sci. 2006;78:

109 Dudhgaonkar,SP, Tandan,SK, Kumar,D, Naik,AK, Raviprakash,V. Ameliorative effect of combined administration of inducible nitric oxide synthase inhibitor with cyclooxygenase-2 inhibitors in neuropathic pain in rats. Eur. J. Pain 2007;11: Duggan,AW, Hendry,IA, Morton,CR, Hutchison,WD, Zhao,ZQ. Cutaneous stimuli releasing immunoreactive substance P in the dorsal horn of the cat. Brain Res. 1988;451: Duggan,AW, Hope,PJ, Jarrott,B, Schaible,HG, Fleetwood-Walker,SM. Release, spread and persistence of immunoreactive neurokinin A in the dorsal horn of the cat following noxious cutaneous stimulation. Studies with antibody microprobes. Neuroscience 1990;35: Dumond,H, Presle,N, Pottie,P, Pacquelet,S, Terlain,B, Netter,P, Gepstein,A, Livne,E, Jouzeau,JY. Site specific changes in gene expression and cartilage metabolism during early experimental osteoarthritis. Osteoarthritis. Cartilage. 2004;12: D Amour F.E.and Smith D.L. A method for determining the loss of pain sensation. JPET 1941;72: Ebersberger,A, Grubb,BD, Willingale,HL, Gardiner,NJ, Nebe,J, Schaible,HG. The intraspinal release of prostaglandin E2 in a model of acute arthritis is accompanied by an up-regulation of cyclo-oxygenase-2 in the spinal cord. Neuroscience 1999;93: el-yassir,n, Fleetwood-Walker,SM, Mitchell,R. Heterogeneous effects of serotonin in the dorsal horn of rat: the involvement of 5-HT1 receptor subtypes. Brain Res. 1988;456: Elliott,MJ, Maini,RN, Feldmann,M, Kalden,JR, Antoni,C, Smolen,JS, Leeb,B, Breedveld,FC, Macfarlane,JD, Bijl,H,. Randomised double-blind comparison of chimeric monoclonal antibody to tumour necrosis factor alpha (ca2) versus placebo in rheumatoid arthritis. Lancet 1994;344:

110 Engelhardt,G, Homma,D, Schlegel,K, Schnitzler,C, Utzmann,R. General pharmacology of meloxicam--part II: Effects on blood pressure, blood flow, heart rate, ECG, respiratory minute volume and interactions with paracetamol, pirenzepine, chlorthalidone, phenprocoumon and tolbutamide. Gen. Pharmacol. 1996;27: Engelhardt,G, Homma,D, Schlegel,K, Utzmann,R, Schnitzler,C. Anti-inflammatory, analgesic, antipyretic and related properties of meloxicam, a new non-steroidal anti-inflammatory agent with favourable gastrointestinal tolerance. Inflamm. Res. 1995;44: Fernihough,J, Gentry,C, Malcangio,M, Fox,A, Rediske,J, Pellas,T, Kidd,B, Bevan,S, Winter,J. Pain related behaviour in two models of osteoarthritis in the rat knee. Pain 2004;112: Ferreira,SH, Lorenzetti,BB. Glutamate spinal retrograde sensitization of primary sensory neurons associated with nociception. Neuropharmacology 1994;33: Ferreira,SH, Lorenzetti,BB. Intrathecal administration of prostaglandin E2 causes sensitization of the primary afferent neuron via the spinal release of glutamate. Inflamm. Res. 1996;45: Ferreira-Gomes,J, Adaes,S, Castro-Lopes,JM. Assessment of movement-evoked pain in osteoarthritis by the knee-bend and CatWalk tests: a clinically relevant study. J. Pain 2008;9: Fleetwood-Walker,SM, Quinn,JP, Wallace,C, Blackburn-Munro,G, Kelly,BG, Fiskerstrand,CE, Nash,AA, Dalziel,RG. Behavioural changes in the rat following infection with varicella-zoster virus. J. Gen. Virol. 1999;80 ( Pt 9): Franca,DS, Ferreira-Alves,DL, Duarte,ID, Ribeiro,MC, Rezende,RM, Bakhle,YS, Francischi,JN. Endogenous opioids mediate the hypoalgesia induced by selective inhibitors of cyclo-oxygenase 2 in rat paws treated with carrageenan. Neuropharmacology 2006;51:

111 Francischi,JN, Chaves,CT, Moura,AC, Lima,AS, Rocha,OA, Ferreira-Alves,DL, Bakhle,YS. Selective inhibitors of cyclo-oxygenase-2 (COX-2) induce hypoalgesia in a rat paw model of inflammation. Br. J. Pharmacol. 2002;137: Franěk M. Animální modely bolesti. In: Rokyta R., Kršiak M., Kozák J. Bolest. Praha. Tigis, 2006, p Freshwater,JD, Svensson,CI, Malmberg,AB, Calcutt,NA. Elevated spinal cyclooxygenase and prostaglandin release during hyperalgesia in diabetic rats. Diabetes 2002;51: Fukuoka,H, Kawatani,M, Hisamitsu,T, Takeshige,C. Cutaneous hyperalgesia induced by peripheral injection of interleukin-1 beta in the rat. Brain Res. 1994;657: Garlicki,J, Dorazil-Dudzik,M, Wordliczek,J, Przewlocka,B. Effect of intraarticular tramadol administration in the rat model of knee joint inflammation. Pharmacol. Rep. 2006;58: Garry,MG, Hargreaves,KM. Enhanced release of immunoreactive CGRP and substance P from spinal dorsal horn slices occurs during carrageenan inflammation. Brain Res. 1992;582: Giamberardino,MA, Valente,R, de,bp, Vecchiet,L. Artificial ureteral calculosis in rats: behavioural characterization of visceral pain episodes and their relationship with referred lumbar muscle hyperalgesia. Pain 1995;61: Guhring,H, Gorig,M, Ates,M, Coste,O, Zeilhofer,HU, Pahl,A, Rehse,K, Brune,K. Suppressed injury-induced rise in spinal prostaglandin E2 production and reduced early thermal hyperalgesia in inos-deficient mice. J. Neurosci. 2000;20:

112 Guingamp,C, Gegout-Pottie,P, Philippe,L, Terlain,B, Netter,P, Gillet,P. Mono-iodoacetateinduced experimental osteoarthritis: a dose-response study of loss of mobility, morphology, and biochemistry. Arthritis Rheum. 1997;40: Guzman,RE, Evans,MG, Bove,S, Morenko,B, Kilgore,K. Mono-iodoacetate-induced histologic changes in subchondral bone and articular cartilage of rat femorotibial joints: an animal model of osteoarthritis. Toxicol. Pathol. 2003;31: Hamilton,SG, McMahon,SB. ATP as a peripheral mediator of pain. J. Auton. Nerv. Syst. 2000;81: Hao,JX, Xu,XJ, Yu,YX, Seiger,A, Wiesenfeld-Hallin,Z. Baclofen reverses the hypersensitivity of dorsal horn wide dynamic range neurons to mechanical stimulation after transient spinal cord ischemia; implications for a tonic GABAergic inhibitory control of myelinated fiber input. J. Neurophysiol. 1992;68: Hargreaves,K, Dubner,R, Brown,F, Flores,C, Joris,J. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia. Pain 1988;32: Hawkey,CJ. COX-2 inhibitors. Lancet 1999;353: Hay,CH, de Belleroche,JS. Dexamethasone prevents the induction of COX-2 mrna and prostaglandins in the lumbar spinal cord following intraplantar FCA in parallel with inhibition of oedema. Neuropharmacology 1998;37: Hay,CH, Trevethick,MA, Wheeldon,A, Bowers,JS, de Belleroche,JS. The potential role of spinal cord cyclooxygenase-2 in the development of Freund's complete adjuvant-induced changes in hyperalgesia and allodynia. Neuroscience 1997;78:

113 Hefferan,MP, O'Rielly,DD, Loomis,CW. Inhibition of spinal prostaglandin synthesis early after L5/L6 nerve ligation prevents the development of prostaglandin-dependent and prostaglandin-independent allodynia in the rat. Anesthesiology 2003;99: Herschman,HR. Prostaglandin synthase 2. Biochim. Biophys. Acta 1996;1299: Hogestatt,ED, Jonsson,BA, Ermund,A, Andersson,DA, Bjork,H, Alexander,JP, Cravatt,BF, Basbaum,AI, Zygmunt,PM. Conversion of acetaminophen to the bioactive N-acylphenolamine AM404 via fatty acid amide hydrolase-dependent arachidonic acid conjugation in the nervous system. J. Biol. Chem. 2005;280: Honda,CN, Rethelyi,M, Petrusz,P. Preferential immunohistochemical localization of vasoactive intestinal polypeptide (VIP) in the sacral spinal cord of the cat: light and electron microscopic observations. J. Neurosci. 1983;3: Hsueh,SF, Lu,CY, Chao,CS, Tan,PH, Huang,YW, Hsieh,SW, Hsiao,HT, Chung,NC, Lin,SH, Huang,PL, Lyu,PC, Yang,LC. Nonsteroidal anti-inflammatory drugs increase expression of inducible COX-2 isoform of cyclooxygenase in spinal cord of rats with adjuvant induced inflammation. Brain Res. Mol. Brain Res. 2004;125: Hua,XY, Calcutt,NA, Malmberg,AB. Neonatal capsaicin treatment abolishes formalin-induced spinal PGE2 release. Neuroreport 1997;8: Hua,XY, Chen,P, Marsala,M, Yaksh,TL. Intrathecal substance P-induced thermal hyperalgesia and spinal release of prostaglandin E2 and amino acids. Neuroscience 1999;89: Hylden,JL, Wilcox,GL. Intrathecal serotonin in mice: analgesia and inhibition of a spinal action of substance P. Life Sci. 1983;33:

114 Iadarola,MJ, Brady,LS, Draisci,G, Dubner,R. Enhancement of dynorphin gene expression in spinal cord following experimental inflammation: stimulus specificity, behavioral parameters and opioid receptor binding. Pain 1988;35: Ibuki,T, Matsumura,K, Yamazaki,Y, Nozaki,T, Tanaka,Y, Kobayashi,S. Cyclooxygenase-2 is induced in the endothelial cells throughout the central nervous system during carrageenaninduced hind paw inflammation; its possible role in hyperalgesia. J. Neurochem. 2003;86: Iniguez,MA, Pablos,JL, Carreira,PE, Cabre,F, Gomez-Reino,JJ. Detection of COX-1 and COX-2 isoforms in synovial fluid cells from inflammatory joint diseases. Br. J. Rheumatol. 1998;37: Inoue,N, Ito,S, Tajima,K, Nogawa,M, Takahashi,Y, Sasagawa,T, Nakamura,A, Kyoi,T. Etodolac attenuates mechanical allodynia in a mouse model of neuropathic pain. J. Pharmacol. Sci. 2009;109: Jain,NK, Ishikawa,TO, Spigelman,I, Herschman,HR. COX-2 expression and function in the hyperalgesic response to paw inflammation in mice. Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids 2008;79: Jeftinija,S. Enkephalins modulate excitatory synaptic transmission in the superficial dorsal horn by acting at mu-opioid receptor sites. Brain Res. 1988;460: Jeftinija,S, Jeftinija,K, Liu,F, Skilling,SR, Smullin,DH, Larson,AA. Excitatory amino acids are released from rat primary afferent neurons in vitro. Neurosci. Lett. 1991;125: Jeftinija,S, Liu,F, Jeftinija,K, Urban,L. Effect of capsaicin and resiniferatoxin on peptidergic neurons in cultured dorsal root ganglion. Regul. Pept. 1992;39:

115 Junod,A, Lambert,AE, Orci,L, Pictet,R, Gonet,AE, Renold,AE. Studies of the diabetogenic action of streptozotocin. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1967;126: Kalbhen,DA. Chemical model of osteoarthritis--a pharmacological evaluation. J. Rheumatol. 1987;14 Spec No: Karlsten,R, Post,C, Hide,I, Daly,JW. The antinociceptive effect of intrathecally administered adenosine analogs in mice correlates with the affinity for the A1-adenosine receptor. Neurosci. Lett. 1991;121: Kawamura,T, Yamauchi,T, Koyama,M, Maruyama,T, Akira,T, Nakamura,N. Expression of prostaglandin EP2 receptor mrna in the rat spinal cord. Life Sci. 1997;61: Kerr,DI, Ong,J. GABAB receptors. Pharmacol. Ther. 1995;67: Kim,SH, Chung,JM. An experimental model for peripheral neuropathy produced by segmental spinal nerve ligation in the rat. Pain 1992;50: Kimura,S, Kontani,H. Demonstration of antiallodynic effects of the cyclooxygenase-2 inhibitor meloxicam on established diabetic neuropathic pain in mice. J. Pharmacol. Sci. 2009;110: Knorth,H, Dorfmuller,P, Lebert,R, Schmidt,WE, Wittenberg,RH, Heukamp,M, Wiese,M, Willburger,RE. Participation of cyclooxygenase-1 in prostaglandin E2 release from synovitis tissue in primary osteoarthritis in vitro. Osteoarthritis. Cartilage. 2004;12: Koda,H, Minagawa,M, Si-Hong,L, Mizumura,K, Kumazawa,T. H1-receptor-mediated excitation and facilitation of the heat response by histamine in canine visceral polymodal receptors studied in vitro. J. Neurophysiol. 1996;76:

116 Koetzner,L, Hua,XY, Lai,J, Porreca,F, Yaksh,T. Nonopioid actions of intrathecal dynorphin evoke spinal excitatory amino acid and prostaglandin E2 release mediated by cyclooxygenase- 1 and -2. J. Neurosci. 2004;24: Kroin,JS, Ling,ZD, Buvanendran,A, Tuman,KJ. Upregulation of spinal cyclooxygenase-2 in rats after surgical incision. Anesthesiology 2004;100: Kuraishi,Y, Hirota,N, Sato,Y, Hino,Y, Satoh,M, Takagi,H. Evidence that substance P and somatostatin transmit separate information related to pain in the spinal dorsal horn. Brain Res. 1985a;325: Kuraishi,Y, Hirota,N, Sato,Y, Kaneko,S, Satoh,M, Takagi,H. Noradrenergic inhibition of the release of substance P from the primary afferents in the rabbit spinal dorsal horn. Brain Res. 1985b;359: LaMotte,RH, Thalhammer,JG, Torebjork,HE, Robinson,CJ. Peripheral neural mechanisms of cutaneous hyperalgesia following mild injury by heat. J. Neurosci. 1982;2: Lang,E, Novak,A, Reeh,PW, Handwerker,HO. Chemosensitivity of fine afferents from rat skin in vitro. J. Neurophysiol. 1990;63: Larsson Forsell,PK, Kennedy,BP, Claesson,HE. The human calcium-independent phospholipase A2 gene multiple enzymes with distinct properties from a single gene. Eur. J. Biochem. 1999;262: Ledent,C, Vaugeois,JM, Schiffmann,SN, Pedrazzini,T, El,YM, Vanderhaeghen,JJ, Costentin,J, Heath,JK, Vassart,G, Parmentier,M. Aggressiveness, hypoalgesia and high blood pressure in mice lacking the adenosine A2a receptor. Nature 1997;388:

117 Lee,YH, Choi,SJ, Kim,A, Kim,CH, Ji,JD, Song,GG. Expression of cyclooxygenase-1 and -2 in rheumatoid arthritis synovium. J. Korean Med. Sci. 2000;15: Levine,JD, Lau,W, Kwiat,G, Goetzl,EJ. Leukotriene B4 produces hyperalgesia that is dependent on polymorphonuclear leukocytes. Science 1984;225: Liu,H, Wang,H, Sheng,M, Jan,LY, Jan,YN, Basbaum,AI. Evidence for presynaptic N-methyl- D-aspartate autoreceptors in the spinal cord dorsal horn. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1994;91: Lopez-Munoz,FJ, Godinez-Chaparro,B, Huerta-Cruz,JC, Guevara-Lopez,U, Dominguez- Ramirez,AM, Cortes-Arroyo,AR. The antinociceptive efficacy of morphine, metamizol, or their combination in an experimental rat model with different levels of inflammatory pain. Pharmacol. Biochem. Behav. 2008;91: Lorenzetti,BB, Ferreira,SH. Mode of analgesic action of dipyrone: direct antagonism of inflammatory hyperalgesia. Eur. J. Pharmacol. 1985;114: Lynn,B. Capsaicin: actions on nociceptive C-fibres and therapeutic potential. Pain 1990;41: Ma,W, Du,W, Eisenach,JC. Role for both spinal cord COX-1 and COX-2 in maintenance of mechanical hypersensitivity following peripheral nerve injury. Brain Res. 2002;937: Machelska,H, Stein,C. Pain control by immune-derived opioids. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol 2000;27: Malcangio,M, Bowery,NG. GABA and its receptors in the spinal cord. Trends Pharmacol. Sci. 1996;17:

118 Mallet,C, Daulhac,L, Bonnefont,J, Ledent,C, Etienne,M, Chapuy,E, Libert,F, Eschalier,A. Endocannabinoid and serotonergic systems are needed for acetaminophen-induced analgesia. Pain 2008;139: Malmberg,AB, Hamberger,A, Hedner,T. Effects of prostaglandin E2 and capsaicin on behavior and cerebrospinal fluid amino acid concentrations of unanesthetized rats: a microdialysis study. J. Neurochem. 1995;65: Malmberg,AB, Yaksh,TL. Capsaicin-evoked prostaglandin E2 release in spinal cord slices: relative effect of cyclooxygenase inhibitors. Eur. J. Pharmacol. 1994;271: Malmberg,AB, Yaksh,TL. Cyclooxygenase inhibition and the spinal release of prostaglandin E2 and amino acids evoked by paw formalin injection: a microdialysis study in unanesthetized rats. J. Neurosci. 1995a;15: Malmberg,AB, Yaksh,TL. The effect of morphine on formalin-evoked behaviour and spinal release of excitatory amino acids and prostaglandin E2 using microdialysis in conscious rats. Br. J. Pharmacol. 1995b;114: Marnett,LJ, Rowlinson,SW, Goodwin,DC, Kalgutkar,AS, Lanzo,CA. Arachidonic acid oxygenation by COX-1 and COX-2. Mechanisms of catalysis and inhibition. J. Biol. Chem. 1999;274: Martin,TJ, Buechler,NL, Eisenach,JC. Intrathecal administration of a cylcooxygenase-1, but not a cyclooxygenase-2 inhibitor, reverses the effects of laparotomy on exploratory activity in rats. Anesth. Analg. 2006;103: Matsumura,K, Watanabe,Y, Onoe,H, Watanabe,Y. Prostacyclin receptor in the brain and central terminals of the primary sensory neurons: an autoradiographic study using a stable prostacyclin analogue [3H]iloprost. Neuroscience 1995;65:

119 Matsunaga,A, Kawamoto,M, Shiraishi,S, Yasuda,T, Kajiyama,S, Kurita,S, Yuge,O. Intrathecally administered COX-2 but not COX-1 or COX-3 inhibitors attenuate streptozotocin-induced mechanical hyperalgesia in rats. Eur. J. Pharmacol. 2007;554: McMahon,SB. NGF as a mediator of inflammatory pain. Philos. Trans. R. Soc. Lond B Biol. Sci. 1996;351: McMahon,SB, Abel,C. A model for the study of visceral pain states: chronic inflammation of the chronic decerebrate rat urinary bladder by irritant chemicals. Pain 1987;28: Mert,T, Gunes,Y, Gunay,I. Local analgesic efficacy of tramadol following intraplantar injection. Eur. J. Pharmacol. 2007;558: Meyer R.A., Ringkamp M., Campbell,JN, Raja,SN. Peripheral mechanisms of cutaneous nociception. In: Wall,PD, Melzack,R. Textbook of Pain. Elsevier, 2005, p Meyer,RA, Campbell,JN. Myelinated nociceptive afferents account for the hyperalgesia that follows a burn to the hand. Science 1981;213: Minami,T, Nishihara,I, Ito,S, Sakamoto,K, Hyodo,M, Hayaishi,O. Nitric oxide mediates allodynia induced by intrathecal administration of prostaglandin E2 or prostaglandin F2 alpha in conscious mice. Pain 1995a;61: Minami,T, Nishihara,I, Uda,R, Ito,S, Hyodo,M, Hayaishi,O. Characterization of EP-receptor subtypes involved in allodynia and hyperalgesia induced by intrathecal administration of prostaglandin E2 to mice. Br. J. Pharmacol. 1994a;112: Minami,T, Nishihara,I, Uda,R, Ito,S, Hyodo,M, Hayaishi,O. Involvement of glutamate receptors in allodynia induced by prostaglandins E2 and F2 alpha injected into conscious mice. Pain 1994b;57:

120 Minami,T, Okuda-Ashitaka,E, Mori,H, Ito,S, Hayaishi,O. Prostaglandin D2 inhibits prostaglandin E2-induced allodynia in conscious mice. J. Pharmacol. Exp. Ther. 1996;278: Minami,T, Onaka,M, Okuda-Ashitaka,E, Mori,H, Ito,S, Hayaishi,O. L-NAME, an inhibitor of nitric oxide synthase, blocks the established allodynia induced by intrathecal administration of prostaglandin E2. Neurosci. Lett. 1995b;201: Minami,T, Uda,R, Horiguchi,S, Ito,S, Hyodo,M, Hayaishi,O. Allodynia evoked by intrathecal administration of prostaglandin F2 alpha to conscious mice. Pain 1992;50: Minami,T, Uda,R, Horiguchi,S, Ito,S, Hyodo,M, Hayaishi,O. Allodynia evoked by intrathecal administration of prostaglandin E2 to conscious mice. Pain 1994c;57: Mizumura,K, Minagawa,M, Koda,H, Kumazawa,T. Influence of histamine on the bradykinin response of canine testicular polymodal receptors in vitro. Inflamm. Res. 1995;44: Moises,HC, Rusin,KI, MacDonald,RL. Mu- and kappa-opioid receptors selectively reduce the same transient components of high-threshold calcium current in rat dorsal root ganglion sensory neurons. J. Neurosci. 1994;14: Morris,CJ. Carrageenan-induced paw edema in the rat and mouse. Methods Mol. Biol. 2003;225: Morton,CR, Hutchison,WD. Release of sensory neuropeptides in the spinal cord: studies with calcitonin gene-related peptide and galanin. Neuroscience 1989;31: Morton,CR, Hutchison,WD, Hendry,IA, Duggan,AW. Somatostatin: evidence for a role in thermal nociception. Brain Res. 1989;488:

121 Muth-Selbach,US, Tegeder,I, Brune,K, Geisslinger,G. Acetaminophen inhibits spinal prostaglandin E2 release after peripheral noxious stimulation. Anesthesiology 1999;91: Narita,M, Shimamura,M, Imai,S, Kubota,C, Yajima,Y, Takagi,T, Shiokawa,M, Inoue,T, Suzuki,M, Suzuki,T. Role of interleukin-1beta and tumor necrosis factor-alpha-dependent expression of cyclooxygenase-2 mrna in thermal hyperalgesia induced by chronic inflammation in mice. Neuroscience 2008;152: Narumiya,S, Sugimoto,Y, Ushikubi,F. Prostanoid receptors: structures, properties, and functions. Physiol Rev. 1999;79: Negishi,M, Sugimoto,Y, Ichikawa,A. Molecular mechanisms of diverse actions of prostanoid receptors. Biochim. Biophys. Acta 1995;1259: Niederberger,E, Schmidtko,A, Rothstein,JD, Geisslinger,G, Tegeder,I. Modulation of spinal nociceptive processing through the glutamate transporter GLT-1. Neuroscience 2003;116: Nishihara,I, Minami,T, Uda,R, Ito,S, Hyodo,M, Hayaishi,O. Effect of NMDA receptor antagonists on prostaglandin E2-induced hyperalgesia in conscious mice. Brain Res. 1995;677: Nishisho,T, Tonai,T, Tamura,Y, Ikata,T. Experimental and clinical studies of eicosanoids in cerebrospinal fluid after spinal cord injury. Neurosurgery 1996;39: Noguchi Y.,IJaOI. Comparative pharmacological profiles of piroxicam, indomethacin, phenylbutazone, diclofenac, ibuprofen and mefenamic acid. Royal Society of Medicine International Congress and Symposium Series No ;

122 O'Rielly,DD, Loomis,CW. Increased expression of cyclooxygenase and nitric oxide isoforms, and exaggerated sensitivity to prostaglandin E2, in the rat lumbar spinal cord 3 days after L5- L6 spinal nerve ligation. Anesthesiology 2006;104: Ochi,T, Goto,T. Differential effect of FR122047, a selective cyclo-oxygenase-1 inhibitor, in rat chronic models of arthritis. Br. J. Pharmacol. 2002;135: Ochi,T, Motoyama,Y, Goto,T. The analgesic effect profile of FR122047, a selective cyclooxygenase-1 inhibitor, in chemical nociceptive models. Eur. J. Pharmacol. 2000;391: Ogino,K, Hatanaka,K, Kawamura,M, Katori,M, Harada,Y. Evaluation of pharmacological profile of meloxicam as an anti-inflammatory agent, with particular reference to its relative selectivity for cyclooxygenase-2 over cyclooxygenase-1. Pharmacology 1997;55: Oida,H, Namba,T, Sugimoto,Y, Ushikubi,F, Ohishi,H, Ichikawa,A, Narumiya,S. In situ hybridization studies of prostacyclin receptor mrna expression in various mouse organs. Br. J. Pharmacol. 1995;116: Oku,R, Satoh,M, Takagi,H. Release of substance P from the spinal dorsal horn is enhanced in polyarthritic rats. Neurosci. Lett. 1987;74: Ong,WY, Horrocks,LA, Farooqui,AA. Immunocytochemical localization of cpla2 in rat and monkey spinal cord. J. Mol. Neurosci. 1999;12: Ortega-Varela,LF, Herrera,JE, Caram-Salas,NL, Rocha-Gonzalez,HI, Granados-Soto,V. Isobolographic analyses of the gabapentin-metamizol combination after local peripheral, intrathecal and oral administration in the rat. Pharmacology 2007;79:

123 Ortega-Varela,LF, Herrera,JE, Medina-Santillan,R, Reyes-Garcia,G, Rocha-Gonzalez,HI, Granados-Soto,V. Synergistic interaction between gabapentin and metamizol in the rat formalin test. Proc. West Pharmacol. Soc. 2004;47: Ossipov,MH, Lai,J, Porreca,F. Mechanisms of experimental neuropathic pain: integration from animal models. In: Wall,PD, Melzack,R. Textbook of Pain Elsevier. 2005, p Ossipov,MH, Lopez,Y, Bian,D, Nichols,ML, Porreca,F. Synergistic antinociceptive interactions of morphine and clonidine in rats with nerve-ligation injury. Anesthesiology 1997;86: Otto,JC, Smith,WL. Prostaglandin endoperoxide synthases-1 and -2. J. Lipid Mediat. Cell Signal. 1995;12: Padi,SS, Kulkarni,SK. Differential effects of naproxen and rofecoxib on the development of hypersensitivity following nerve injury in rats. Pharmacol. Biochem. Behav. 2004;79: Pang,IH, Vasko,MR. Morphine and norepinephrine but not 5-hydroxytryptamine and gammaaminobutyric acid inhibit the potassium-stimulated release of substance P from rat spinal cord slices. Brain Res. 1986;376: Penning,TD, Talley,JJ, Bertenshaw,SR, Carter,JS, Collins,PW, Docter,S, Graneto,MJ, Lee,LF, Malecha,JW, Miyashiro,JM, Rogers,RS, Rogier,DJ, Yu,SS, AndersonGD, Burton,EG, Cogburn,JN, Gregory,SA, Koboldt,CM, Perkins,WE, Seibert,K, Veenhuizen,AW, Zhang,YY, Isakson,PC. Synthesis and biological evaluation of the 1,5-diarylpyrazole class of cyclooxygenase-2 inhibitors: identification of 4-[5-(4-methylphenyl)-3-(trifluoromethyl)-1Hpyrazol-1-yl]benze nesulfonamide (SC-58635, celecoxib). J. Med. Chem. 1997;40:

124 Peter-Szabo,M, Kekesi,G, Nagy,E, Sziver,E, Benedek,G, Horvath,G. Quantitative characterization of a repeated acute joint inflammation model in rats. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol 2007;34: Polomano,RC, Mannes,AJ, Clark,US, Bennett,GJ. A painful peripheral neuropathy in the rat produced by the chemotherapeutic drug, paclitaxel. Pain 2001;94: Pomonis,JD, Boulet,JM, Gottshall,SL, Phillips,S, Sellers,R, Bunton,T, Walker,K. Development and pharmacological characterization of a rat model of osteoarthritis pain. Pain 2005;114: Porro,CA, Cavazzuti,M. Spatial and temporal aspects of spinal cord and brainstem activation in the formalin pain model. Prog. Neurobiol. 1993;41: Prochazkova,M, Dolezal,T, Sliva,J, Krsiak,M. Different patterns of spinal cyclooxygenase-1 and cyclooxygenase-2 mrna expression in inflammatory and postoperative pain. Basic Clin. Pharmacol. Toxicol. 2006;99: Ralevic,V, Burnstock,G. Receptors for purines and pyrimidines. Pharmacol. Rev. 1998;50: Ramos,KM, Jiang,Y, Svensson,CI, Calcutt,NA. Pathogenesis of spinally mediated hyperalgesia in diabetes. Diabetes 2007;56: Ramwell,PW, Shaw,JE, Jessup,R. Spontaneous and evoked release of prostaglandins from frog spinal cord. Am. J. Physiol 1966;211: Randall,LO, Selitto,JJ. A method for measurement of analgesic activity on inflamed tissue. Arch. Int. Pharmacodyn. Ther. 1957;111:

125 Rathee,PK, Distler,C, Obreja,O, Neuhuber,W, Wang,GK, Wang,SY, Nau,C, Kress,M. PKA/AKAP/VR-1 module: A common link of Gs-mediated signaling to thermal hyperalgesia. J. Neurosci. 2002;22: Reeve,AJ, Patel,S, Fox,A, Walker,K, Urban,L. Intrathecally administered endotoxin or cytokines produce allodynia, hyperalgesia and changes in spinal cord neuronal responses to nociceptive stimuli in the rat. Eur. J. Pain 2000;4: Rezende,RM, dos Reis,WG, Duarte,ID, Lima,PP, Bakhle,YS, de Francischi,JN. The analgesic actions of centrally administered celecoxib are mediated by endogenous opioids. Pain 2009;142: Rezende,RM, Franca,DS, Menezes,GB, dos Reis,WG, Bakhle,YS, Francischi,JN. Different mechanisms underlie the analgesic actions of paracetamol and dipyrone in a rat model of inflammatory pain. Br. J. Pharmacol. 2008;153: Ririe,DG, Prout,HD, Barclay,D, Tong,C, Lin,M, Eisenach,JC. Developmental differences in spinal cyclooxygenase 1 expression after surgical incision. Anesthesiology 2006;104: Rokyta R. Transmise bolesti a její centrální transmise. In: Rokyta R., Kršiak M., Kozák J., editors. Bolest. Praha: Tigis, 2006, p Rokyta R., Kršiak M., Kozák J. Farmakologie nocicepce. Bolest. Praha: Tigis, 2006, p Samad,TA, Moore,KA, Sapirstein,A, Billet,S, Allchorne,A, Poole,S, Bonventre,JV, Woolf,CJ. Interleukin-1beta-mediated induction of Cox-2 in the CNS contributes to inflammatory pain hypersensitivity. Nature 2001;410: Sawynok,J, Sweeney,MI. The role of purines in nociception. Neuroscience 1989;32:

126 Schaible,HG, Ebersberger,A, von Banchet,GS. Mechanisms of pain in arthritis. Ann. N. Y. Acad. Sci. 2002;966: Scholer,DW, Ku,EC, Boettcher,I, Schweizer,A. Pharmacology of diclofenac sodium. Am. J. Med. 1986;80: Schuster,VL. Molecular mechanisms of prostaglandin transport. Annu. Rev. Physiol 1998;60: Seibert,K, Zhang,Y, Leahy,K, Hauser,S, Masferrer,J, Perkins,W, Lee,L, Isakson,P. Pharmacological and biochemical demonstration of the role of cyclooxygenase 2 in inflammation and pain. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1994;91: Seltzer,Z, Dubner,R, Shir,Y. A novel behavioral model of neuropathic pain disorders produced in rats by partial sciatic nerve injury. Pain 1990;43: Seybold,VS, Jia,YP, Abrahams,LG. Cyclo-oxygenase-2 contributes to central sensitization in rats with peripheral inflammation. Pain 2003;105: Shafer,DM, Assael,L, White,LB, Rossomando,EF. Tumor necrosis factor-alpha as a biochemical marker of pain and outcome in temporomandibular joints with internal derangements. J. Oral Maxillofac. Surg. 1994;52: Siegle,I, Klein,T, Backman,JT, Saal,JG, Nusing,RM, Fritz,P. Expression of cyclooxygenase 1 and cyclooxygenase 2 in human synovial tissue: differential elevation of cyclooxygenase 2 in inflammatory joint diseases. Arthritis Rheum. 1998;41: Simone,DA, Alreja,M, LaMotte,RH. Psychophysical studies of the itch sensation and itchy skin ("alloknesis") produced by intracutaneous injection of histamine. Somatosens. Mot. Res. 1991;8:

127 Skilling,SR, Smullin,DH, Beitz,AJ, Larson,AA. Extracellular amino acid concentrations in the dorsal spinal cord of freely moving rats following veratridine and nociceptive stimulation. J. Neurochem. 1988;51: Sluka,KA, Westlund,KN. An experimental arthritis in rats: dorsal horn aspartate and glutamate increases. Neurosci. Lett. 1992;145: Smith,CJ, Zhang,Y, Koboldt,CM, Muhammad,J, Zweifel,BS, Shaffer,A, Talley,JJ, Masferrer,JL, Seibert,K, Isakson,PC. Pharmacological analysis of cyclooxygenase-1 in inflammation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1998;95: Smith,HS. Potential analgesic mechanisms of acetaminophen. Pain Physician 2009;12: Smith,WL. The eicosanoids and their biochemical mechanisms of action. Biochem. J. 1989;259: Stahl S.M. Pain and the Treatment of Fibromyalgia and Functional Somatic Syndromes. Stahl's essential psychopharmacology Cambridge University Press, Steen,KH, Reeh,PW. Sustained graded pain and hyperalgesia from harmless experimental tissue acidosis in human skin. Neurosci. Lett. 1993;154: Steen,KH, Steen,AE, Kreysel,HW, Reeh,PW. Inflammatory mediators potentiate pain induced by experimental tissue acidosis. Pain 1996;66: Stein,C, Millan,MJ, Herz,A. Unilateral inflammation of the hindpaw in rats as a model of prolonged noxious stimulation: alterations in behavior and nociceptive thresholds. Pharmacol. Biochem. Behav. 1988;31:

128 Stone,LS, Broberger,C, Vulchanova,L, Wilcox,GL, Hokfelt,T, Riedl,MS, Elde,R. Differential distribution of alpha2a and alpha2c adrenergic receptor immunoreactivity in the rat spinal cord. J. Neurosci. 1998;18: Suleyman,H, Demircan,B, Karagoz,Y, Oztasan,N, Suleyman,B. Anti-inflammatory effects of selective COX-2 inhibitors. Pol. J. Pharmacol. 2004;56: Suyama,H, Kawamoto,M, Gaus,S, Yuge,O. Effect of etodolac, a COX-2 inhibitor, on neuropathic pain in a rat model. Brain Res. 2004;1010: Sylven,C, Edlund,A, Brandt,R, Beermann,B, Jonzon,B. Angina pectoris-like pains provoked by intravenous adenosine. Br. Med. J. (Clin. Res. Ed) 1986;293: Szallasi,A. The vanilloid (capsaicin) receptor: receptor types and species differences. Gen. Pharmacol. 1994;25: Taiwo,YO, Levine,JD. Prostaglandins inhibit endogenous pain control mechanisms by blocking transmission at spinal noradrenergic synapses. J. Neurosci. 1988;8: Takasaki,I, Andoh,T, Shiraki,K, Kuraishi,Y. Allodynia and hyperalgesia induced by herpes simplex virus type-1 infection in mice. Pain 2000;86: Takeda,K, Sawamura,S, Tamai,H, Sekiyama,H, Hanaoka,K. Role for cyclooxygenase 2 in the development and maintenance of neuropathic pain and spinal glial activation. Anesthesiology 2005;103: Tal,M, Bennett,GJ. Extra-territorial pain in rats with a peripheral mononeuropathy: mechanohyperalgesia and mechano-allodynia in the territory of an uninjured nerve. Pain 1994;57:

129 Tatsuo,MA, Carvalho,WM, Silva,CV, Miranda,AE, Ferreira,SH, Francischi,JN. Analgesic and antiinflammatory effects of dipyrone in rat adjuvant arthritis model. Inflammation 1994;18: Tiseo,PJ, Adler,MW, Liu-Chen,LY. Differential release of substance P and somatostatin in the rat spinal cord in response to noxious cold and heat; effect of dynorphin A(1-17). J. Pharmacol. Exp. Ther. 1990;252: Tjolsen,A, Berge,OG, Hunskaar,S, Rosland,JH, Hole,K. The formalin test: an evaluation of the method. Pain 1992;51: Todd A.J., Koerber H.R. Neuroanatomical substrates of spinal nociception. In: Wall,PD, Melzack,R. Textbook of Pain Elsevier. 2005, p Tonai,T, Taketani,Y, Ueda,N, Nishisho,T, Ohmoto,Y, Sakata,Y, Muraguchi,M, Wada,K, Yamamoto,S. Possible involvement of interleukin-1 in cyclooxygenase-2 induction after spinal cord injury in rats. J. Neurochem. 1999;72: Uda,R, Horiguchi,S, Ito,S, Hyodo,M, Hayaishi,O. Nociceptive effects induced by intrathecal administration of prostaglandin D2, E2, or F2 alpha to conscious mice. Brain Res. 1990;510: Urdaneta,A, Siso,A, Urdaneta,B, Cardenas,R, Quintero,L, Avila,R, Suarez-Roca,H. Lack of correlation between the central anti-nociceptive and peripheral anti-inflammatory effects of selective COX-2 inhibitor parecoxib. Brain Res. Bull. 2009;80: Vane,JR. Inhibition of prostaglandin synthesis as a mechanism of action for aspirin-like drugs. Nat. New Biol. 1971;231:

130 Vane,JR, Bakhle,YS, Botting,RM. Cyclooxygenases 1 and 2. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1998;38: Versteeg,HH, van Bergen en Henegouwen PM, van Deventer,SJ, Peppelenbosch,MP. Cyclooxygenase-dependent signalling: molecular events and consequences. FEBS Lett. 1999;445: 1-5. Waldmann,R. Proton-gated cation channels--neuronal acid sensors in the central and peripheral nervous system. Adv. Exp. Med. Biol. 2001;502: Watkins,LR, Maier,SF, Goehler,LE. Immune activation: the role of pro-inflammatory cytokines in inflammation, illness responses and pathological pain states. Pain 1995;63: Welch,SP, Eads,M. Synergistic interactions of endogenous opioids and cannabinoid systems. Brain Res. 1999;848: Werz,MA, Grega,DS, MacDonald,RL. Actions of mu, delta and kappa opioid agonists and antagonists on mouse primary afferent neurons in culture. J. Pharmacol. Exp. Ther. 1987;243: Wesselmann,U, Czakanski,PP, Affaitati,G, Giamberardino,MA. Uterine inflammation as a noxious visceral stimulus: behavioral characterization in the rat. Neurosci. Lett. 1998;246: Willingale,HL, Gardiner,NJ, McLymont,N, Giblett,S, Grubb,BD. Prostanoids synthesized by cyclo-oxygenase isoforms in rat spinal cord and their contribution to the development of neuronal hyperexcitability. Br. J. Pharmacol. 1997;122:

131 Winter,CA, Risely,EA, Nuss,GW. Carrageenin-induced edema in hind paw of the rat as an assay for antiiflammatory drugs. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1962;111: Woolf,CJ, Allchorne,A, Safieh-Garabedian,B, Poole,S. Cytokines, nerve growth factor and inflammatory hyperalgesia: the contribution of tumour necrosis factor alpha. Br. J. Pharmacol. 1997;121: Woolfe G,MAD. The evaluation of the analgesic action of pethidine hydrochloride (demerol). JPET 1944;80: Wright,DH, Nantel,F, Metters,KM, Ford-Hutchinson,AW. A novel biological role for prostaglandin D2 is suggested by distribution studies of the rat DP prostanoid receptor. Eur. J. Pharmacol. 1999;377: Xie,H, Dong,ZQ, Ma,F, Bauer,WR, Wang,X, Wu,GC. Involvement of serotonin 2A receptors in the analgesic effect of tramadol in mono-arthritic rats. Brain Res. 2008;1210: Xu,XJ, Puke,MJ, Wiesenfeld-Hallin,Z. The depressive effect of intrathecal clonidine on the spinal flexor reflex is enhanced after sciatic nerve section in rats. Pain 1992;51: Yaksh,TL. Pharmacology of spinal adrenergic systems which modulate spinal nociceptive processing. Pharmacol. Biochem. Behav. 1985;22: Yaksh,TL, Dirig,DM, Conway,CM, Svensson,C, Luo,ZD, Isakson,PC. The acute antihyperalgesic action of nonsteroidal, anti-inflammatory drugs and release of spinal prostaglandin E2 is mediated by the inhibition of constitutive spinal cyclooxygenase-2 (COX- 2) but not COX-1. J. Neurosci. 2001;21: Yaksh,TL, Michener,SR, Bailey,JE, Harty,GJ, Lucas,DL, Nelson,DK, Roddy,DR, Go,VL. Survey of distribution of substance P, vasoactive intestinal polypeptide, cholecystokinin, 125

132 neurotensin, Met-enkephalin, bombesin and PHI in the spinal cord of cat, dog, sloth and monkey. Peptides 1988;9: Yaksh,TL, Wilson,PR. Spinal serotonin terminal system mediates antinociception. J. Pharmacol. Exp. Ther. 1979;208: Yamamoto,T, Sakashita,Y. The role of the spinal opioid receptor like1 receptor, the NK-1 receptor, and cyclooxygenase-2 in maintaining postoperative pain in the rat. Anesth. Analg. 1999;89: Yang,LC, Marsala,M, Yaksh,TL. Characterization of time course of spinal amino acids, citrulline and PGE2 release after carrageenan/kaolin-induced knee joint inflammation: a chronic microdialysis study. Pain 1996a;67: Yang,LC, Marsala,M, Yaksh,TL. Effect of spinal kainic acid receptor activation on spinal amino acid and prostaglandin E2 release in rat. Neuroscience 1996b;75: Yoshimura,M, North,RA. Substantia gelatinosa neurones hyperpolarized in vitro by enkephalin. Nature 1983;305: Yousufzai,SY, Chen,AL, Abdel-Latif,AA. Species differences in the effects of prostaglandins on inositol trisphosphate accumulation, phosphatidic acid formation, myosin light chain phosphorylation and contraction in iris sphincter of the mammalian eye: interaction with the cyclic AMP system. J. Pharmacol. Exp. Ther. 1988;247: Zhao,Z, Chen,SR, Eisenach,JC, Busija,DW, Pan,HL. Spinal cyclooxygenase-2 is involved in development of allodynia after nerve injury in rats. Neuroscience 2000;97: Zhu,X, Conklin,D, Eisenach,JC. Cyclooxygenase-1 in the spinal cord plays an important role in postoperative pain. Pain 2003;104:

133 Zhu,X, Conklin,DR, Eisenach,JC. Preoperative inhibition of cyclooxygenase-1 in the spinal cord reduces postoperative pain. Anesth. Analg. 2005;100: , table. Zhu,X, Eisenach,JC. Cyclooxygenase-1 in the spinal cord is altered after peripheral nerve injury. Anesthesiology 2003;99: Zhu,X, Vincler,MA, Parker,R, Eisenach,JC. Spinal cord dynorphin expression increases, but does not drive microglial prostaglandin production or mechanical hypersensitivity after incisional surgery in rats. Pain 2006;125:

134 C Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology 2006, 99, Printed in Denmark. All rights reserved Copyright C ISSN Different Patterns of Spinal Cyclooxygenase-1 and Cyclooxygenase-2 mrna Expression in Inflammatory and Postoperative Pain Michaela Prochazkova, Tomas Dolezal, Jiri Sliva and Miloslav Krsiak Department of Pharmacology, 3rd Faculty of Medicine, Charles University, Prague, Czech Republic (Received January 20, 2006; Accepted March 30, 2006) Abstract: Levels of cyclooxygenase-2 (COX-2) mrna, but not those of COX-1, were reported to be raised significantly after peripheral inflammation in the rat spinal cord. The aim of the present study was to ascertain whether this pattern of COX-2 and COX-1 expression applies also to other pain conditions induced by surgical procedure. Experiments were performed on two types of pain models. In a model of postoperative pain, 1 cm longitudinal incision was made through skin, fascia and muscle of the plantar aspect of the right hind paw in anaesthetized rats. In the second model, peripheral inflammation was induced by unilateral, intraplantar injection of carrageenan in the right hind paw. Carrageenan injection or skin incision produced marked and significant reduction of paw withdrawal latencies to noxious radiant heat stimuli after 2 and 6 hr. Under the acute inflammation 2 and 6 hr after carrageenan injection levels of COX-2 mrna were markedly raised (7.8 and 15.5 times; P 0,001, respectively) while spinal levels of COX-1 mrna were not significantly altered (n.s.). In contrast, spinal levels of COX-2 mrna were raised less markedly in a model of postoperative pain (4.9 times at 2 hr; P 0,001 and 2.9 times (n.s.) at 6 hr after surgery) whilst levels of COX-1 mrna in the lumbar spine were increased significantly (2.3 times; P 0,001) 6 hr after surgery. The present findings indicate that expression of COX-2 mrna in the spine is less dominant in postoperative pain than in inflammatory pain and that spinal COX-1 mrna is upregulated in postoperative pain. Cyclooxygenase (COX) is an enzyme that catalyzes the conversion of arachidonic acid to prostaglandins (Smith et al. 1991). Two different COX isoforms have been characterized, COX-1, which is constitutively expressed in almost all tissues and COX-2, which is highly inducible in response to inflammatory stimuli (Feng et al. 1993). Both cyclooxygenases are expressed constitutively in the spinal cord (Beiche et al & 1998; Willingale et al. 1997). Intraplantar injection of complete Freund s adjuvant in the hind paw produced not only mechanical allodynia, but also thermal hyperalgesia, attended by a significant increase of COX-2 mrna levels in a lumbar section of spinal cord. However COX-1 mrna remained almost unchanged by this stimuli (Beiche et al & 1998; Hay et al. 1997). Intrathecal administration of COX-2 inhibitors reduced inflammatory-induced mechanical allodynia and thermal hyperalgesia (Yamamoto & Nozaki-Taguchi 1996; Dirig et al. 1998; Yaksh et al. 2001). Administration of a COX-1 inhibitor (SC-560) did not have this effect. These studies indicate that COX-2 plays an important role in inflammatory pain. On the other hand, intrathecal administration of COX-2 inhibitors (NS398 and JTE522) attenuated only minimally mechanical hyperalgesia induced by a skin incision (Yamamoto & Sakashita 1999). COX-1 inhibitors (ketorolac and SC-560) administered intrathecally dose-dependently increased withdrawal threshold to von Frey filaments in an incisional model of postoperative pain, but the COX-2 in- Author for correspondence: Michaela Prochazkova, Department of Pharmacology, 3rd Faculty of Medicine, Charles University, Prague, , Czech Republic (fax π , michaela.prochazkova/lf3.cuni.cz). hibitor (NS-398) had no effect in this model (Zhu et al. 2003). These studies suggest that spinal COX-1 might play an important role in postoperative pain. The aim of the present study was to assess the participation of spinal COX-1 and COX-2 in the postoperative and inflammatory pain models. To this end, the expression of mrna for COX-1 and COX-2 was ascertained in the rat spinal cord after surgery in the limb (paw incision) and compared with that after peripheral inflammation (induced by intraplantar injection of carrageenan). Materials and Methods Experimental animals. Adult male Wistar albino rats (weight g) obtained from VÚFB Konárovice (Czech Republic) were used in all experiments. The animals were housed under standard laboratory conditions in a temperature-controlled (21 1 æ) room in groups of 5 with a normal 12 hr light/dark cycle. Animals were fed standard rat chow (Pelet, St1; VELAZ, Czech Republic) with water available ad libitum. All experiments were reviewed and approved by the Committee for Protection of Laboratory Animals of the 3rd Faculty of Medicine at Charles University and were concordant with IASP Committee for Research and Ethical Issues requirements (Zimmermann 1983). Carrageenan-induced inflammation. Eight rats received unilateral, intraplantar injection of 1% l-carrageenan 150 ml (Sigma) in the right hind paw. Control animals (nω8) received unilateral, intraplantar injection of the same volume of saline. Paw incision. As described by Brennan et al. (1996), rats (nω8) were anaesthetized with ketamine 5% 2 ml/kg (Narcamon, Spofa) and xylazine 2% 0,5 ml/kg (Rometar, Spofa). Longitudinal incision (1 cm) was made through skin, fascia and muscles of the plantar part of the right hind paw, starting 0,5 cm from the proximal edge of the

135 174 MICHAELA PROCHAZKOVA ET AL. heel and extending toward the toes. All the tendons remained intact. After haemostasis, the skin was tacked together with 1 stitch. Following surgery, the animals were housed singly in clear plastic cages with solid floors covered with soft bedding. Paw withdrawal testing. The response to a noxious thermal stimulus was determined using thermal plantar device (Plantar test 7371, Ugo Basile, Italy) according to the procedure described by Hargreaves et al. (1988). Rats were placed into transparent plastic chambers (22 cm in width 17 cm in length 14 cm in height) for 15 min. prior to the start of the each experiment. This lets the animals accommodate to their new environment before testing. The animals in boxes had no restraint. Movable infrared radiant heat source was placed directly under the plantar surface of the hind paw and the time taken for hind paw withdrawal was monitored. A cut-off time of 20 sec. was used in all experiments. Three tests were carried out at 10 min. intervals and then the mean value taken as the nociceptive treshold. Following three baseline measurements at 10 min. intervals, rats received intraplantar injection of carrageenan (150 ml 1%l-carrageenan), saline solution (150 ml) or the incision of the right hind paw was made. Two and six hours after intraplantar injection of carrageenan or 2, 6, 12 and 24 hr after the surgery, paw withdrawal latencies were measured again in these animals. Tissue preparation. Two and six hr after carrageenan injection or paw incision, animals were killed in halothane anaesthesia and lumbar section of the spinal cord was ejected, given in RNAlater solution and frozen immediatly for gene expression studies. RNA isolation. Samples from the lumbar section of spinal cord of individual animals were placed in RNAlater stabilization solution (Qiagen) to prevent unwanted changes in the gene expression pattern due to RNA degradation. Small sections of the tissue weighing approximately 100 mg were homogenized and total RNA was extracted by 1 ml Trizol reagent (Invitrogen) according to the manufacturer s instruction. The samples were homogenized in Trizol and stored for 5 min. at room temperature. After this step 0,2 ml of chloroform was added and the preparation was shaken vigorously by hand for 15 sec. and then incubated for a few minutes at room temperature. The samples were then centrifuged at 15,000 g for 15 min. at 4 æ. The aqueous phase was collected. Isopropanol (0.5 ml, Sigma) was next added, the preparation was stored for 5 min. at room temperature and centrifuged at 12,000 g for 10 min. at 4 æ. The supernatant was removed and the RNA pellet was washed with 75% ethanol, centrifuged at 8,000 g at4æ for 5 min. Then air-dried (10 15 min.) and solubilized in RNAse free water. RNA integrity was determined by gel electrophoresis in 2% agarose gel stained with ethidium bromide. The purity of the RNA was assessed by the ratio of absorbance at 260 nm and 280 nm. The total RNA concentration was estimated by spectrophotometric measurements at 260 nm assuming 40 mg of RNA per milliliter equals on absorbance unit. RNA was stored in aliquots at ª70 æ until used for reverse transcription. Reverse transcription. RNA samples were reverse transcribed using RT buffer, 25 mm MgCl 2, 10 mm dntps (2.5 mm of each), 50 mm random hexamers, RNase inhibitor (20 U/ml) and reverse transcriptase (50 U/ml), all from Applied Biosystems. The mix was aliquoted into individual tubes (30 ml) and RNA was added. Samples were incubated for 10 min. at 25 æ, 30 min. at 48 æ and then for 5 min. at 95 æ. Polymerase chain reaction. Reverse transcribed cdna was amplified with PCR buffer with MgCl 2 (Sigma), HotStartTaq polymerase (Qiagen), specific forward and reverse primer for cyclooxygenase-1 and cyclooxygenase-2 (East-port), dntps and water (Sigma). The amplification conditions were 95 æ for 15 min. for one cycle, 95 æ for 30 sec., 62 æ for 1 min., 72 æ for 1 min. for 35 cycles and finally 72 æ for 10 min. Amplified DNA fragments were resolved by electrophoresis through a 2% agarose gel and detected by ethidium bromide staining. Fig. 1. Paw withdrawal latency to a noxious radiant heat stimulus before and after unilateral, intraplantar injection of carrageenan in the right hind paw. Carrageenan-induced inflammation reduced paw withdrawal latencies in the right paw of carrageenan-treated rats (nω8). Control (saline-treated) rats (nω8) exhibited no differences in paw withdrawal latencies. Withdrawal latencies of left (uninjected) paws of carrageenan-treated rats did not differ from those of control (saline-treated) rats. Asterisks indicate significant (P 0.001) difference from baseline (timeω0). Pluses indicate significant difference between carrageenan-treated and control animals at the indicated time-points ( πππ P 0.001). All results are displayed as mean values S.E.M. Real-time PCR. A reaction mix for real-time PCR was made with TaqMan Universal PCR master mix, water and assays on demand gene expression products for cyclooxygenase-1, cyclooxygenase-2 and 18S RNA (all Applied Biosystems). After mixing all these components, 19 ml of reaction mix was aliquoted to the wells on a realtime PCR plate. Each sample was made in duplicate. A volume of 5 ml of cdna was added to each well. Wells were sealed with optical caps. A no template control contained instead cdna water. PCR reaction was run on an ABI PRISM 7000 (ABI PRISM 7000 SDS analytical cycler, Applied Biosystems) using standard conditions. Expression of COX-1 and COX-2 was normalized to RNA loading for each sample using the 18S RNA as an internal standard. The quantity of mrna was given as 2 ªDDct. DDct was calculated as follows: DDctΩDct (gene of interest)ªdct(18s RNA). Drugs. l-carrageenan was purchased from Sigma-Aldrich and the other compounds ketamine (Narcamon) and xylazine (Rometar) were supplied by Spofa. Statistical analysis. All results are expressed as mean values S.E.M. Statistical analysis was carried out using two-way repeated measures ANOVA with a post-hoc Student-Newman-Keuls test in case of repetitive testing of paw withdrawal. P 0.05 was accepted as significant. The evaluation of real-time PCR data was done by one-way ANOVA with a post-hoc Tukey s test using 2 ªDDct values of each samples. A value of P 0.05 was considered significant. Results Effect of carrageenan on paw withdrawal latency to heat stimuli. Carrageenan-induced inflammation was used as a model of inflammatory pain. This treatment consistently produced a localizated inflammation of inoculated paw characterized by an increase in paw volume, redness and swelling.

136 CYCLOOXYGENASE-1 AND -2 mrna EXPRESSION 175 Fig. 2. Paw withdrawal latency to a noxious radiant heat stimulus before and after operation (skin incision) of the right hind paw. The surgery reduced paw withdrawal latencies in the operated paw. Control (unoperated) rats (nω8) exhibited no differences in paw withdrawal latencies. Withdrawal latencies of left paws of operated rats (nω8) did not differ from those of unoperated rats. Asterisks indicate significant (**P 0.01; P 0.001) difference from baseline (timeω0). Pluses indicate significant difference between operated and control animals at the indicated time-points ( πππ P 0.001). All data are displayed as mean values S.E.M. Paw withdrawal latency to heat stimuli was tested before and following intraplantar injection of carrageenan. The injection of carrageenan into the rat hind paw induced marked hyperalgesia in the ipsilateral paw. Two and six hr after unilateral intraplantar injection of carrageenan, the paw withdrawal latency for the ipsilateral side was significantly decreased (P versus baseline and P versus control) (fig. 1.). Effect of surgery on paw withdrawal latency to heat stimuli. Paw withdrawal latency to heat stimuli was tested in eight rats before and after incision of the right hind paw. Incision of rat hind paw induced marked hyperalgesia in the ipsilateral paw at all observed times. Paw withdrawal latency to heat stimuli recorded 2, 6, 12 and 24 hr after surgery showed a significant decrease for the ipsilateral side compared to baseline before surgery and compared to control animals. Two and six hr after surgery, the paw withdrawal latency was significantly decreased versus baseline and versus control animals (P 0.001). Twelve hours after surgery, the paw withdrawal latency was significantly decreased versus baseline (P 0.001) and 1 day after incision of the right hind paw, the paw withdrawal latency was still decreased versus baseline (PΩ0.012) (fig. 2). Expression of COX-1 and COX-2 mrna in the spinal cord after induction of inflammation and after paw incision. Expression of COX-1 and COX-2 mrna in the spinal cord was detected by polymerase chain reaction after peripherally induced inflammation, after incison of the right hind paw and in control animals (fig. 3). In terms of the results after RT-PCR we could presume increased expression of Fig. 3. Expression of COX-1 mrna and COX-2 mrna in the lumbar spinal cord. The results indicate the expression of both genes 6 hr after peripheral inflammation, after incison of the right hind paw and in control animals. Ten ml of RT-PCR specific product was loaded per line. Two samples from each group are shown. COX-2 in inflammation and after surgery. Increased expression was also shown in COX-1 after incision of the paw. These results were later confirmed in a real-time PCR analysis. Levels of COX-1 and COX-2 mrna in the spinal cord after induction of inflammation and after paw incision. Data obtained in real-time PCR analysis of mrna for COX-1 and COX-2 in a model of peripherally induced inflammation and after incision of the hind paw are displayed in fig. 4. All measurements were normalized to levels of expression in control animals. The values for control animals were assumed as 1. Spinal COX-1 mrna levels. Two hr after induction of inflammation and after incision of the right hind paw spinal levels of COX-1 mrna were not significantly different from control animals. Six hr after incision of the right hind paw, real-time PCR revealed significantly increased levels of COX-1 mrna with respect to control animals (2.3 times, P 0.001) but no significant changes after induction of inflammation (fig. 4). Spinal COX-2 mrna levels. Two hr after induction of inflammation spinal levels of COX-2 mrna were signicantly increased in comparison to control animals (7.8 times, P 0.001) and they were less but significantly increased after incission of the right hind paw (4.9 times, P 0.001). Six hr after induction of inflammation, spinal levels of COX-2 mrna were markedly and significantly increased in comparison to control animals (15.5 times, P 0.001). In contrast, spinal COX-2 mrna levels were increased only 2.9 times (n.s.) 6 hr after surgery (fig. 4). Discussion The present results indicate that inflammatory and postoperative pain have different patterns of expression of mrna for COX-1 and COX-2 in the spinal cord. Expression of COX-2 mrna was markedly increased during in-

137 176 MICHAELA PROCHAZKOVA ET AL. Fig. 4. Relative expression of COX-1 and COX-2 mrna in lumbar section of spinal cord 2 and 6 hr after peripheral inflammation (induced by intraplantar injection of carrageenan) or after surgery in the limb (paw incision) as determined by real-time PCR. The data represent observations from eight animals displayed as means S.E.M. Asterisks indicate significant difference between operated and control animals (P 0.001). flammation while that of COX-1 mrna did not differ from the control levels in inflammatory pain. COX-2 mrna was much less induced in the model of postoperative pain than in that of inflammatory pain, however. The increase of spinal COX-2 mrna after paw incision was more than five times lower than that after carageenan injection. On the other hand, expression of COX-1 mrna was to a certain extent increased in postoperative pain. The expression of COX-1 mrna rised gradually after paw incision and after 6 hr there was no difference between relative amount of COX-1 and COX-2 mrna. The increased expression of spinal COX-2 mrna found in the present study in carrageenan-induced thermal hyperalgesia is in agreement with up-regulation of COX-2 mrna in the rat spinal cord following peripheral inflammation induced by injection of complete Freund s-type adjuvant in the rat hind paw (Beiche et al & 1998; Hay et al. 1997). The lower expression of spinal COX-2 mrna found in the model of postoperative pain does not seem to be due to the anaesthesia (ketamine with xylazine) used in the present study. Ketamine/xylazine combination did not influence the COX-2 expression, although this combination inhibited some proinflammatory genes in the serum and stomach (Helmer et al. 2003). Selective COX-2 inhibitors (NS398 and JTE522) administered intrathecally failed to attenuate hyperalgesia induced by skin incision in rats (Yamamoto & Sakashita 1999; Zhu et al. 2003), which suggests for low activation of spinal COX-2 in postoperative pain. In these two studies an inhalation anaesthesia (with halothane) was used. The increased expression of spinal COX-1 mrna found in the present study during thermal hyperalgesia induced by skin incision corroborates other findings suggesting an increased role of spinal COX-1 in postoperative pain. Following intrathecal administration, inhibitors of COX-1 (ketorolac and SC-560) dose-dependently reduced pain (increased paw withdrawal threshold) in this model (Zhu et al. 2003). The levels of COX-1 protein were not measured directly in the present study. However, it seems likely that the increased expression of spinal COX-1 mrna found in the

138 CYCLOOXYGENASE-1 AND -2 mrna EXPRESSION 177 present model of postoperative pain was associated with an increased level of COX-1 protein, because an increased COX-1 immunoreactivity was found in the rat spinal cord in an incisional model of postoperative pain (Zhu et al. 2003). The present finding of lower induction of COX-2 mrna in postincisional pain and the reported lack of analgesic effect of intrathecally administered COX-2 selective inhibitors in this model of postoperative pain (Yamamoto & Sakashita 1999; Zhu et al. 2003) suggests that spinal COX-2 might play less important role in this type of pain. In contrast, spinal COX-1 might be important in postoperative pain as well as in other types of pain, such as in neuropathic pain (Zhu & Eisenach 2003). Rofecoxib (selective COX-2 inhibitor) treatment failed to modify the development of allodynia and hyperalgesia in the spared nerve injury model showing that the hypersensitivity in neuropathic pain was not COX-2 dependent (Broom et al. 2004). The role of spinal COX-1 and COX-2 izoenzymes in pain processing is not fully understood. Spinal COX-1 and COX- 2 might play complementary roles in pain. Both COX-1 and COX-2 were necessary for the initiation of thermal hyperalgesia in the model of carageenan-induced inflammation (Dirig et al. 1998). Expression of COX-1 in the spinal cord is not static, but changes some time after injury (Zhu & Eisenach 2003). It appears that expression of mrna for COX-1 and COX-2 differs in inflammatory and postoperative pain not only in quantity, but also in a time-course. Levels of COX-2 mrna increased from the second to the sixth hour in inflammatory pain but they decreased in postoperative pain during this period. On the other hand, spinal levels of COX-1 mrna tended to increase in postoperative pain from the second to the sixth hour. The present findings indicate that not only COX-2, but also COX-1 might be up-regulated under certain circumstances. The up-regulation of COX-1 was also recently shown in inflammed peripheral joint. Western blot and immunocytochemical analyses of COX-1 and COX-2 in the synovial cells isolated from patients with rheumatoid arthritis showed an induction in both COX-1 and COX-2 expression by IL-1 (Onodera et al. 2004). In conclusion, the present findings suggest, that expression of COX-2 mrna is less dominant in postoperative pain than in inflammatory pain and that spinal COX-1 mrna is up-regulated in a postoperative pain model. Acknowledgements This work was supported by research grants VZ: MSM and GAUK 74/2005/C/3.LF. References Beiche, F., K. Brune, G. Geisslinger & M. Goppelt-Struebe: Expression of cyclooxygenase isoforms in the rat spinal cord and their regulation during adjuvant-induced arthritis. Inflamm. Res. 1998, 47, Beiche, F., S. Scheuerer, K. Brune, G. Geisslinger & M. Goppelt- Struebe: Up-regulation of cyclooxygenase-2 mrna in the rat spinal cord following peripheral inflammation. FEBS Lett. 1996, 390, Brennan, T. J., E. P. Vandermeulen & G. F. Gebhart: Characterization of a rat model of incisional pain. Pain 1996, 64, Broom, D. C., T. A. Samad, T. Kohno, I. Tegeder, G. Geisslinger & C. J. Woolf: Cyclooxygenase 2 expression in the spared nerve injury model of neuropathic pain. Neuroscience 2004, 124, Dirig, D. M., P. C. Isakson & T. L. Yaksh: Effect of COX-1 and COX-2 inhibition on induction and maintenance of carrageenanevoked thermal hyperalgesia in rats. J. Pharmacol. Exp. Therap. 1998, 285, Feng, L., W. Sun, Y. Xia, W. W. Tang, P. Chanmugam, E. Soyoola, C. B. Wilson & D. Hwang: Cloning two isoforms of rat cyclooxygenase: differential regulation of their expression. Arch. Biochem. Biophys. 1993, 307, Hargreaves, K., R. Dubner, F. Brown, C. Flores & J. Joris: A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia. Pain 1988, 32, Hay, C. H., M. A. Trevethick, A. Wheeldon, J. S. Bowers & J. S. de Belleroche: The potential role of spinal cord cyclooxygenase-2 in the development of Freund s complete adjuvant-induced changes in hyperalgesia and allodynia. Neuroscience 1997, 78, Helmer, K. S., Y. Cui, L. Chang, A. Dewan & D. W. Mercer: Effects of ketamine/xylazine on expression of tumor necrosis factor-b, inducible nitric oxide synthase, and cyclo-oxygenase-2 in rat gastric mucosa during endotoxemia. Shock 2003, 20, Onodera, M., Y. Horiuchi, K. Nakahama, T. Muneta, Y. Mano & I. Morita: Induction of cyclooxygenase-1 in cultured synovial cells isolated from rheumatoid arthritis patients. Inflamm. Res. 2004, 53, Smith, W. L., L. J. Marnett & D. L. DeWitt: Prostaglandin and thromboxane biosynthesis. Pharmacol. Therap. 1991, 49, Willingale, H. L., N. J. Gardiner, N. McLymont, S. Giblett & B. D. Grubb: Prostanoids synthesized by cyclo-oxygenase isoforms in rat spinal cord and their contribution to the development of neuronal hyperexcitability. Brit. J. Pharmacol. 1997, 122, Yaksh, T. L., D. M. Dirig, C. M. Conway, C. Svensson, Z. D. Luo & P. C. Isakson: The acute antihyperalgesic action of nonsteroidal, anti-inflammatory drugs and release of spinal prostaglandin E2 is mediated by the inhibition of constitutive spinal cyclooxygenase-2 (COX-2) but not COX-1. J. Neurosci. 2001, 21, Yamamoto, T. & N. Nozaki-Taguchi: Analysis of the effects of cyclooxygenase (COX)-1 and COX-2 in spinal nociceptive transmission using indomethacin, a non-selective COX inhibitor, and NS-398, a COX-2 selective inhibitor. Brain Res. 1996, 739, Yamamoto, T. & Y. Sakashita: The role of the spinal opioid receptor like1 receptor, the NK-1 receptor, and cyclooxygenase-2 in maintaining postoperative pain in the rat. Anesth. Analg. 1999, 89, Zhu, X., D. Conklin & J. C. Eisenach: Cyclooxygenase-1 in the spinal cord plays an important role in postoperative pain. Pain 2003, 104, Zhu, X. & J. C. Eisenach: Cyclooxygenase-1 in the spinal cord is altered after peripheral nerve injury. Anesthesiology 2003, 99, Zimmermann, M.: Ethical guidelines for investigations of experimental pain in conscious animals. Pain 1983, 16,

139 Physiol. Res. 58: , 2009 Increased Gene Expression and Production of Spinal Cyclooxygenase 1 and 2 during Experimental Osteoarthritis Pain M. PROCHÁZKOVÁ 1, P. ZANVIT 2, T. DOLEŽAL 1, L. PROKEŠOVÁ 2, M. KRŠIAK 1 1 Department of Pharmacology, Third Faculty of Medicine, Prague, 2 Institute of Immunology and Microbiology, First Faculty of Medicine, Charles University, Prague, Czech Republic Received October 29, 2007 Accepted April 2, 2008 On-line July 18, 2008 Summary Knowledge on the involvement of spinal COX-1 and COX-2 in pain due to osteoarthritis could be useful for better understanding of its pathogenesis and therapy. In this study we have investigated a long-term pattern of expression and production of spinal COX-1 and COX-2 in the model of osteoarthritis induced in rats by injection of monoiodoacetate (MIA) into the knee joint. MIA injection produced thermal hyperalgesia (assessed by the plantar test) and tactile allodynia (measured with von Frey hairs). The pain measures reached maximum on the 5th day, then remained relatively stable. The expression of spinal COX-2 mrna reached maximum on day 5 (5.2 times; P<0.001) and remained increased until day 31 (4.9 times; P<0.001). Expression of spinal COX-1 mrna increased gradually reaching maximum on the day 31 (4.5 times; P<0.001) when the relative expression of both genes was almost equal. The production of both proteins was almost similar at the beginning of the experiment. The highest production of COX-2 protein was observed on day 5 after the induction of osteoarthritis (increased 3.9 times). The levels of COX-1 protein increased gradually with maximum on day 31 (3.4 times). The present findings indicate that not only expression of COX-2 mrna but also that of COX-1 mrna is significantly increased in the spine during osteoarthritis pain. Thus, in contrast to inflammatory pain, the upregulation of spinal COX-1 may be important in osteoarthritis pain. Key words Osteoarthritis Cyclooxygenase (COX) Pain Spinal cord Corresponding author M. Procházková, Department of Pharmacology, 3rd Faculty of Medicine, Charles University, Ruská 87, Prague 10, Czech Republic. michaela.prochazkova@lf3.cuni.cz, Fax: Introduction Cyclooxygenases are the enzymes that catalyze the conversion of arachidonic acid to prostaglandins which play an important role in inflammation and pain. There are two identified cyclooxygenase (COX) isoenzymes: COX-1 and COX-2. COX-1 is the housekeeping form, expressed by a wide variety of cells. COX-2 is highly inducible in response to inflammatory and noxious stimuli. Both cyclooxygenases are constitutively expressed in the spinal cord (Kaufmann et al. 1997). The involvement of spinal COX-1 and COX-2 in various pain states is not fully understood. COX-2 gene expression and production in the spinal cord was significantly increased in rats with peripheral inflammation induced by intraplantar injection of Freund s complete adjutant (Beiche et al. 1996, Hay et al. 1997, Beiche et al. 1998). No increase of COX-1 gene expression and production in the spinal cord was found in this model which was associated with swelling, hyperalgesia and allodynia (Beiche et al. 1996, Hay et al. 1997, Beiche et al. 1998). In agreement with these findings, spinal COX-2 mrna were markedly increased and spinal levels of COX-1 mrna were not significantly altered in peripheral inflammation induced by intraplantar injection of carrageenan (Procházková et al. 2006). Rats with streptozotocin-induced diabetes exhibited significantly increased levels of spinal COX-2 protein and activity along with hyperalgesia (Ramos et al. 2007). Intrathecal administration of COX-2 inhibitors has an anti-hyperalgesic effect on streptozotocin-induced PHYSIOLOGICAL RESEARCH ISSN (print) ISSN (online) 2009 Institute of Physiology v.v.i., Academy of Sciences of the Czech Republic, Prague, Czech Republic Fax , physres@biomed.cas.cz,

140 420 Procházková et al. Vol. 58 mechanical hyperalgesia (Matsunaga et al. 2007). A sharp upregulation of spinal COX-2 was reported in the mouse model of amyotrophic lateral sclerosis (McGeer and McGeer 2002). On the other hand, the expression of COX-2 mrna in the spine was less dominant in postoperative pain model than in inflammatory pain, while expression of spinal COX-1 mrna was significantly increased in postoperative pain (Procházková et al. 2006). The important role of COX-1 in the model of postoperative pain was also shown by Zhu et al. (2003). Spinal COX-1 also appears to play a role in the model of neuropathic pain. Spinal COX-1 expression was increased after partial peripheral nerve transsection (Zhu and Eisenach 2003). The inhibition of COX-1 prevented the development of allodynia and hyperalgesia after peripheral nerve ligation (Hefferan et al. 2003). One of the widespread painful disorders is osteoarthritis (OA), which is a degenerative joint disease. The joints are characterized by progressive degeneration of articular cartilage leading to inflammation and pain. In an attempt to peruse the pathophysiology of osteoarthritis, experimental models that mimic human disease have been developed (Pritzker 1994). One of the most frequently used and one of the best characterized models of osteoarthritis is that of monoiodoacetate (MIA) induced OA. This model was first described twenty years ago by Kalbhen (1987). Monoiodoacetate inhibits the activity of glyceraldehyde- 3-phosphate dehydrogenase in chondrocytes and producing degeneration of the cartilage. Knowledge on the involvement of spinal COX-1 and COX-2 in pain due to OA could be useful both for better understanding of its pathogenesis and for its therapy. In this study, therefore, we have investigated a long-term pattern of expression and production of spinal COX-1 and COX-2 in the model of monoiodoacetateinduced osteoarthritis. In particular, we have attempted to correlate changes in spinal cord production of COX-1 and COX-2 and expression of mrna for COX-1 and COX-2 with the development of thermal hyperalgesia and tactile allodynia. Methods Animals Male Wistar albino rats (weight g) obtained from VÚFB Konárovice (Czech Republic) were used in all experiments. The animals were housed under standard laboratory conditions (in a temperaturecontrolled (21±1 ºC) room with a normal 12-h light/dark cycle). Animals were fed a standard pelleted rat chow (ST-1; Velaz, Czech Republic) with water ad libitum throughout the whole experiment. Rats were acclimated to their surroundings over one week to eliminate the effect of stress before the experiment. All experiments were approved by the Committee for Protection of Laboratory Animals of the 3rd Faculty of Medicine at Charles University and were concordant with IASP Committee for Research and Ethical Issues requirements (Zimmermann 1983). Induction of osteoarthritis For induction of osteoarthritis, rats were anesthetized with halothane (Narcotan, Zentiva). Eight rats per group received single injection of monoiodoacetate (2 mg) (Sigma Aldrich) into the right knee joint in a total volume of 25 µl. Control animals (n=8) were injected 25 µl of vehicle into the right knee joint under the same conditions. Paw withdrawal testing The response to noxious thermal stimulus was determined using thermal plantar device (Ugo Basile, Italy) according to the procedure described by Hargreaves et al. (1988) before and in defined times during 31 days after the injection of monoiodoacetate. Rats were placed to opaque plastic chambers (22 cm in width x 17 cm in length x 14 cm in height) for 10 min prior to the start of the each experiment. This lets the animals accommodate to their new environment before testing. Movable infrared radiant heat source was placed directly under the plantar surface of the hind paw and the time taken for hind paw withdrawal was monitored. A cut-off time of 20 s was used in all experiments. Three tests were carried out at 10 min intervals and then the mean value was taken as the nociceptive threshold. Following three baseline measurements, rats received intraarticular injection of monoiodoacetate or saline. In the defined times after injection of monoiodoacetate or saline, paw withdrawal latencies were recorded. von Frey hairs Tactile allodynia was measured with von Frey hairs (Ugo Basile, Italy). Animals were placed into wire mesh bottom cages and allowed to acclimatize prior the start of the experiment. Tactile allodynia was tested by

141 2009 Expression and Production of COX-1,2 during Osteoarthritis 421 touching the plantar surface of the animal's hind paw with von Frey hairs in ascending order of force until a paw withdrawal response was elicited. Each von Frey hair was applied to the paw for 5 s or until a response occurred. Once a withdrawal response was established, the paw was retested. The lowest amount of force required to elicit a response was recorded as withdrawal threshold in grams. Following three baseline measurements, rats received intraarticular injection of monoiodoacetate or saline. Paw withdrawal thresholds were measured in defined times after the injection of monoiodoacetate or saline. Tissue preparation In four different times after monoiodoacetate or saline injection, animals (eight per group) were euthanized in halothane anesthesia. Lumbar section of the spinal cord was removed and given in RNAlater solution (Qiagen). RNA isolation Disruption and homogenization of small parts of the lumbar section of spinal cord weighing approximately 100 mg stabilized with the RNAlater (Qiagen) was performed using Ultra-Turrax (Ika). Total RNA was isolated with the RNeasy lipid tissue isolation kit (Qiagen) according to the manufacturer s instruction. RNA integrity was determined by gel electrophoresis in 2 % agarose gel stained with ethidium bromide. The purity of the RNA was assessed by the ratio of absorbance at 260 nm and 280 nm. RNA was stored in aliquots at 70 C until used for reverse transcription. Reverse transcription RNA samples were reverse transcribed using RT buffer, 25 mm MgCl 2, 10 mm dntps (2.5 mm of each), 50 µm random hexamers, RNase inhibitor (20 U/µl) and reverse transcriptase (50 U/µl), all from Applied Biosystems. The mix was aliquoted into individual tubes and RNA was added. Samples were incubated for 10 min at 25 ºC, 30 min at 48 ºC and then for 5 min at 95 ºC. Real-time PCR A reaction mix for real-time PCR was made with TaqMan Universal PCR master mix, water and Assays on Demand gene expression products (all Applied Biosystems). Reaction mix was aliquoted to the wells on a real-time PCR plate. Each sample was made in duplicate. A volume of 5 µl of cdna was added to each well. A notemplate control contained water instead of cdna. PCR reaction was run on ABI PRISM 7300 (ABI PRISM 7300 SDS analytical cycler, Applied Biosystems) using standard conditions. Expression of COX-1 and COX-2 was normalized to RNA loading for each sample using the β2-microglobulin as an internal standard. The quantity of mrna was given as 2 -ΔΔct. ΔΔct was calculated as follows: ΔΔct = Δct (gene of interest) Δct (endogenous control). ELISA For detection of antigens, sandwich enzymelinked immunosorbent assay (ELISA) was used. Microtiter NUNC plates (Schoeller) were coated with monoclonal antibody specific for cyclooxygenase 1 (Alpha Diagnostic) and for cyclooxygenase 2 (Kamiya Biomedical Company) diluted in coating buffer and incubated overnight. After 24 h the plates were washed two times with washing buffer PBS (phosphate buffered saline) and two times with PBST (PBS containing 0.05 % Tween 20, Sigma-Aldrich). Each well was then filled with PBST and incubated for one hour at room temperature to prevent non-specific adsorption of protein to the well surfaces. During this time, samples from spinal cord of monoiodoacetate-injected or control animals were homogenized in 5 % FBS (fetal bovine serum, Sigma- Aldrich) and then added to the wells. Two hours after this incubation at room temperature, the plates were washed two times with PBS and two times with PBST (PBS containing 0.05 % Tween 20, Sigma-Aldrich). The secondary biotinylated antibodies (Acris Antibodies) were added to the wells and incubated for next two hours. The plates were then washed, followed by incubation of 1:1000 dilution of streptavidin (Beckman Coulter) for 20 min. After washing the coated well, TMB (tetramethylbenzidine, Sigma-Aldrich) and citric buffer with peroxide were added. For development of the color reaction the plates were incubated in the dark and the reaction was stopped by the addition of H 2 SO 4 to each well. The color intensity was determined at 450 nm on Multiscan RC reader. Results are expressed as stimulation index (OD of monoiodoacetate treated vs. OD of control animals). Drugs Monoiodoacetate was purchased from Sigma- Aldrich and halothane (Narcotan) was obtained from Zentiva.

142 422 Procházková et al. Vol. 58 Statistical analysis All results are expressed as mean values ± S.E.M. Statistical analysis was carried out using twoway repeated measures ANOVA with a post-hoc Student- Newman-Keuls test in the case of repetitive testing of paw withdrawal. P<0.05 was accepted as significant. The evaluation of real-time PCR data was done by one-way ANOVA with a post-hoc Turkey s test using 2 -ΔΔct values of each samples. P<0.05 value was considered significant. Data from ELISA method are presented as stimulation index and were analyzed using unpaired t-test. The results were considered significant if P value was less than Results Effect of monoiodoacetate on paw withdrawal latency Paw withdrawal latencies were measured before and in defined times after application of monoiodoacetate or saline. Intraarticular injection of monoiodoacetate into the right knee joint produced marked and significant reduction of paw withdrawal latencies to noxious radiant heat stimuli. Decreased paw withdrawal latencies were evident from the first day following injection of monoiodoacetate, with the maximum on day 5 after induction of osteoarthritis (statistically significant at all observed times compared to baseline and to control animals; P<0.001). The paw withdrawal latencies remained decreased until day 31 (Fig. 1). Effect of monoiodoacetate on tactile allodynia Tactile allodynia was measured with von Frey hairs before and following intraarticular injection of monoiodoacetate or saline. The injection of monoiodoacetate into the right knee joint induced marked allodynia. The onset of allodynia was evident from the first day following injection of monoiodoacetate. Figure 2 shows that tactile allodynia in the monoiodoacetate-injected knee joints reaches the maximum on day 5 and was observed throughout the experiment (statistically significant at all observed times compared to baseline and to control animals, P<0.001). Expression of COX-1 and COX-2 mrna in the spinal cord after induction of osteoarthritis Expression of COX isoenzymes was measured at four different times. First day after monoiodoacetate injection, spinal levels of COX-1 mrna and COX-2 Fig. 1. Paw withdrawal latencies to a noxious radiant heat stimulus before and after the induction of osteoarthritis. Osteoarthritis reduced paw withdrawal latencies in the right (monoiodoacetate-injected) hind paws. Control animals exhibited no differences in paw withdrawal latencies. Withdrawal latencies of the left (uninfected) paws of osteoarthritis rats did not differ from those of control. The data represent observations from 8 animals per group displayed as means ± S.E.M. (P<0.001 at all observed times compared to baseline and to control animals). Fig. 2. Paw withdrawal thresholds to von Frey hairs before and after the induction of osteoarthritis. Paw withdrawal thresholds to von Frey hairs were significantly decreased from the first day after monoiodoacetate injection into the right knee joint. Control and uninfected (left) paws were not altered during the whole testing period. Results are expressed as median force in grams ± S.E.M. required to induce paw withdrawal in 8 animals per group (P<0.001 at all observed times compared to baseline and to control animals). mrna were moderately increased (2.3 and 2.6 times, respectively; P<0.05). The expression of spinal COX-2 mrna was much higher on day 5 (5.2 times; P<0.001) and remained increased at this level until the day 31 (4.9 times; P<0.001). On the other hand, expression of spinal COX-1 mrna increased gradually during the whole testing period reaching maximum on the day 31 (4.5 times; P<0.001) when the relative expression of both genes was almost equal. All results are expressed in comparison with control animals (Fig. 3).

143 2009 Expression and Production of COX-1,2 during Osteoarthritis 423 Discussion Fig.3. Relative expression of cyclooxygenase 1 and cyclooxygenase 2 in lumbar section of spinal cord 1, 5, 14 and 31 days after the induction of osteoarthritis (induced by injection of monoiodoacetate) as determined by real-time PCR. Each column represents observations from 8 animals displayed as means ± S.E.M. Asterisks indicate significant difference between monoiodoacetate injected and control animals at respective timepoints (* P<0.05; ** P<0.01 and P<0.001). Fig. 4. Production of cyclooxygenase 1 and cyclooxygenase 2 proteins in lumbar section of spinal cord 1, 5, 14 and 31 days after induction of osteoarthritis (induced by injection of monoiodoacetate) as determined by ELISA method. Results (mean values ± S.E.M.) are expressed as stimulation index (OD of monoiodoacetate treated vs. OD of control animals). Asterisks indicate significant difference between production of COX proteins in monoiodoacetate-injected and control animals at four different times ( P<0.001). Production of COX-1 and COX-2 proteins after induction of osteoarthritis The production of spinal COX proteins was comparable to the expression results. The production of COX-1 and COX-2 proteins was almost similar at the beginning of the experiment (1.9 and 2.0 times, respectively; P<0.001). The highest production of COX-2 protein was observed on day 5 after the induction of osteoarthritis (increased 3.9 times; P<0.001). The levels of COX-1 protein increased gradually from the 5th day after induction of osteoarthritis (1.7 times; P<0.001) with maximum on day 31 (3.4 times; P<0.001). Results are expressed as stimulation index (OD of monoiodoacetatetreated vs. OD of control animals) (Fig. 4). Monoiodoacetate injection produced pain as measured by von Frey thresholds and paw withdrawal latencies in the plantar test. The pain measures reached maximum on the 5th day, then remained relatively stable. Expression and production of spinal COX-2 was rapidly increased in parallel to pain measures reaching maximum on the 5th day and then remained relatively stable. On the other hand, the expression and production of spinal COX-1 mrna increased at a slower pace but 31 days after the induction of osteoarthritis there was almost no difference between relative amount of COX-1 and COX-2 mrna. The present results indicate that osteoarthritis pain has different patterns of expression of spinal mrna for COX-1 and COX-2 compared with chronic inflammatory or postoperative pain. Expression and production of spinal COX-2 were significantly increased 22 days after the induction of arthritis by CFA (Complete Freund's Adjuvant) while spinal COX-1 mrna and protein levels remained unchanged at this time (Beiche et al. 1996, Beiche et al. 1998). In contrast, COX-1 might play a more important role in postoperative pain. Expression of spinal COX-1 mrna raised gradually after rat paw incision and 6 hours after the surgery there was no difference between relative amount of COX-1 and COX-2 mrna in the spinal cord (Procházková et al. 2006). The increased expression and production of spinal COX-1 in some types of pain may have therapeutic implications. The lack of analgesic effect of intrathecally administered selective inhibitor of COX-2 (NS-398) in the model of postoperative pain induced by skin incision suggest that spinal COX-2 might play a less important role in this type of pain (Yamamoto and Sakashita 1999). Intrathecal administration of COX-1 inhibitors, but not of COX-2 inhibitor, dose-dependently reduced pain in the model of postoperative pain (Zhu et al. 2003). Perioperative intrathecal administration of COX-1 inhibitors (COX-1 preferring inhibitor ketorolac and COX-1 selective inhibitor SC-560), but not of selective COX-2 inhibitor (NS-398), reduced paw incision induced hypersensitivity in the model of postoperative pain in rats (Zhu et al. 2005). Intrathecal administration of selective COX-1 inhibitor (SC-560), but not selective inhibitor of COX-2 (NS-398), restores normal exploratory activity (rearing behavior) after laparotomy (Martin et al. 2006). The increased expression of spinal COX-1 mrna found in the present study corroborates other