DISERTAČNÍ PRÁCE. Studijní program: P1417 Chemie Studijní obor: 1401V002 Anorganická chemie KOVŮ S HETEROCYKLICKÝMI DERIVÁTY ODVOZENÝMI OD

Transkript

1 UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI Přírodovědecká fakulta Katedra anorganické chemie Regionální centrum pokročilých technologií a materiálů DISERTAČNÍ PRÁCE Studijní program: P1417 Chemie Studijní obor: 1401V002 Anorganická chemie SYNTÉZA A STUDIUM KOMPLEXŮ VYBRANÝCH PŘECHODNÝCH KOVŮ S HETEROCYKLICKÝMI DERIVÁTY ODVOZENÝMI OD PURINOVÉHO SKELETU Synthesis and Study of Selected Transition Metal Complexes with Heterocyclic Compounds Derived from the Purine Skeleton Mgr. Radka Novotná Školitel: Prof. RNDr. Zdeněk Trávníček, Ph.D. Konzultant: Mgr. Igor Popa, CSc. Olomouc 2012

2 Prohlašuji, že jsem disertační práci Syntéza a studium komplexů vybraných přechodných kovů s heterocyklickými deriváty odvozenými od purinového skeletu sepsala samostatně pod odborným vedením prof. RNDr. Zdeňka Trávníčka, Ph.D. a konzultanta RNDr. Igora Popy, CSc. za použití literárních zdrojů uvedených v seznamu literatury. Mgr. Radka Novotná 1

3 OBSAH 1. ÚVOD A CÍLE PRÁCE TEORETICKÁ ČÁST Kinetin, jeho deriváty a koordinační sloučeniny Zinek Měď EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST Použité metody charakterizace Příprava kinetinu a jeho derivátů Příprava Zn(II) komplexů s kinetinem a jeho deriváty (1 12) Příprava Cu(II) komplexů s kinetinem a jeho deriváty (13 21) VÝSLEDKY A DISKUZE Zn(II) komplexy s kinetinem a jeho deriváty Cu(II) komplexy s kinetinem a jeho deriváty SHRNUTÍ SUMMARY PODĚKOVÁNÍ SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK POUŽITÉ LITERÁRNÍ ZDROJE SEZNAM PUBLIKACÍ A KONFERENČNÍCH PŘÍSPĚVKŮ PŘÍLOHY

4 1. ÚVOD A CÍLE PRÁCE Anorganická chemie léčiv v zásadě zkoumá jednak látky, jejichž cílem účinku v organismu jsou kovové ionty, volné nebo vázané na proteiny, nebo studuje přímo biologicky aktivní sloučeniny kovů, u nichž je právě atom kovu klíčovým nositelem specifického mechanismu účinku [1]. Rozšířenost použití anorganických sloučenin kovů v medicíně souvisí se známým faktem, že život a zdraví lidského organismu jsou mimo jiné závislé na přítomnosti bio-esenciálních kovových prvků, které hrají klíčovou roli pro správnou funkčnost přibližně třetiny všech proteinů a enzymů. Mezi takovéto kovy se řadí i zinek a měď, které jsou se železem nejvíce zastoupenými kovy v lidském organismu a v makromolekulách plní zásadní strukturní i katalytické funkce (společně např. v antioxidačním metaloenzymu Cu, Zn-superoxid-dismutáza) [2]. Vzhledem k tomu, že měď i zinek jsou kovy organismu vlastní, k jejich biodostupnosti, biodegradabilitě i klíčovým biochemickým funkcím, jsou vhodnými atomy pro nová potenciální metaloterapeutika v souvislosti s možnou nižší toxicitou pro zdravé buňky. Velký zájem v rámci anorganické chemie léčiv o obor studia komplexních sloučenin různých přechodných kovů a jejich biologické aktivity podnítil bezpochyby kolektiv Barnetta Rosenberga a jejich objev protinádorových účinků cis-diammin-dichloridoplatnatého komplexu cis-[pt(nh 3 ) 2 Cl 2 ] neboli cisplatiny v šedesátých letech minulého století [3]. Cisplatina byla v sedmdesátých letech schválena jako chemoterapeutikum pro léčbu různých typů rakoviny a i dnes zůstává jedním z nejpoužívanějších kancerostatik [4]. Od úspěchu cisplatiny bylo připraveno a na biologickou aktivitu testováno množství dalších typů komplexních sloučenin, zejména platiny. Cílem bylo navýšit aktivitu oproti cisplatině, najít látky účinné i proti nádorům rezistentním vůči léčbě ciplatinou a v neposlední řadě také snížit nežádoucí vedlejší účinky léčby související s toxicitou cisplatiny nejen vůči nádorovým, ale i zdravým buňkám. Doposud však bylo z velkého množství testovaných sloučenin pro léčbu schváleno pouze několik derivátů cisplatiny druhé a třetí generace [2]. Nicméně za těchto několik desítek let intenzivního výzkumu komplexů různých kovů jako potenciálních terapeutik bylo jednoznačně ukázáno, že v závislosti na atomu přítomného kovu a typu ligandu lze aplikovatelnost komplexních sloučenin v medicíně nalézt nejen v protinádorové terapii, ale že tyto sloučeniny mohou vykazovat antiradikálovou, protizánětlivou, antimikrobiální nebo antivirovou (např. anti-hiv) účinnost na in vitro i in vivo systémech. Jednou z cest bioanorganické chemie k nalezení nových biologicky aktivních koordinačních sloučenin je syntéza komplexů, které jako ligand obsahují organickou sloučeninu, která sama o sobě vykazuje nějakou biologickou aktivitu. Mnoha studiemi bylo totiž prokázáno, že koordinací na vhodný kov může dojít ke změně nebo navýšení biologické aktivity vyniklého komplexu v porovnání s výchozími látkami. Jedním z vhodných ligandů pro takovéto komplexy by mohla být i molekula kinetinu (6-furfurylaminopurinu, N6-furfuryladeninu), což je derivát adeninu, který se řadí mezi rostlinné hormony cytokininy, jež se podílejí na různých fyziologických procesech rostlin včetně 3

5 stimulace buněčného dělení, diferenciace buněk, transkripce DNA, regenerace, zpomalení stárnutí a jiných dějů [5,6,7]. Samotný kinetin vykazuje kromě cytokininových účinků v rostlinách i významné funkce v živočišných buňkách, včetně role antioxidační a antisenescenční. Díky svým prokázaným účinkům proti stárnutí je v současnosti už součástí mnoha kosmetických přípravků [13]. V teoretické části předložené disertační práce jsou shrnuty informace z literární rešerše týkající se kinetinu, jeho derivátů a komplexů s různými přechodnými kovy, vlastností zinku a mědi a také jejich komplexů s různými biologicky relevantními organickými látkami odvozenými od purinového skeletu, které vykazují určitý typ biologické aktivity. Tato literární rešerše byla provedena v dostupných knihách a internetových databázích, jako jsou Scifinder Scholar, nebo Cambridge Structural Database. Experimentální část stručně shrnuje metody syntéz kinetinu a jeho derivátů, které byly následně využity jako ligandy pro přípravu dvanácti Zn(II) komplexů (1 12) a devíti Cu(II) komplexů různých strukturních typů, a to polymerních (13 15), dimerních (14 19) a jednojaderných s dalším N- donorovým ligandem (1,10-fenanthrolinem) v koordinační sféře (20,21). Třetí část, tedy Výsledky a diskuze, se soustředí na shrnutí výsledků charakterizace připravených komplexů širokým spektrem analytických technik, včetně chemické analýzy prvků, infračervené, Ramanovy, elektronové a NMR spektroskopie, hmotnostní spektrometrie, měření vodivosti a teplotní závislosti magnetické susceptibility, termické analýzy a také monokrystalové rentgenostrukturní analýzy. V této části je také stručně popsána metodika a diskutovány výsledky různých typů testů biologické aktivity prezentovaných látek. Pro Zn(II) komplexy testování zahrnovalo in vitro fytotoxickou aktivitu na tabákových buňkách, in vitro cytotoxicitu na vybraných lidských nádorových liniích (osteosarkom, adenokarcinom prsu, prostatické nádorové linie, monocyty), protizánětlivé účinky komplexů na základě testování produkce protizánětlivých cytokinů a aktivity enzymů matrixmetaloproteináz a také bylo studováno pronikání komplexů do buněk. U Cu(II) komplexů byla studována jejich in vitro antiradikálová, konkrétně superoxid dismutáza (SOD)-mimetická aktivita. Disertační práce si tedy vytyčila několik následujících cílů: 1. provedení důkladné literární rešerše studované problematiky v dostupných knižních publikacích a internetových databázích; na základě získaných informací pak specifikace výchozích látek pro syntézy komplexních sloučenin (výchozí anorganické soli přítomnost vhodného aniontu, vhodná substituce purinového skeletu pro studování jejího vlivu na vlastnosti připravených komplexů), vytipování možných strukturních typů studovaných koordinačních sloučenin a navržení typů studované biologické aktivity; 2. přípravu různě substituovaných derivátů kinetinu a přípravu nových koordinačních sloučenin vybraných přechodných kovů, konkrétně zinku a mědi s těmito (případně dalšími) N- donorovými ligandy; možný synergický efekt přítomnosti zinku nebo mědi (biogenních 4

6 stopových prvků hrajících klíčové role v biochemických procesech v lidském organismu) jako centrálních atomů studovaných komplexů v kombinaci s N-donorovými ligandy odvozenými od kinetinu (látky samy o sobě vykazující biologickou, např. antioxidační a antisenescenční, aktivitu) by mohl mít za důsledek zvýšení biologické aktivity, např. cytotoxicity, oproti výchozím látkám; navíc díky tomu, že zvolené kovy jsou lidskému tělu vlastní, by mohlo jít o látky potenciálně netoxické pro zdravé buňky; 3. charakterizaci připravených látek vhodnými metodami (chemickou analýzou prvků, infračervenou, Ramanovou, elektronovou, NMR spektroskopií, hmotnostní spektrometrií, termickou analýzou, vodivostním měřením, měřením teplotní závislosti magnetické susceptibility a monokrystalovou rentgenostrukturní analýzou); 4. testování různých typů biologické aktivity připravených komplexních sloučenin (in vitro cytotoxicity na různých buněčných modelech, protizánětlivé aktivity u Zn(II) komplexů; in vitro SOD-mimetické aktivity u Cu(II) komplexů) a snahu o analýzu těchto výsledků ve vztahu ke struktuře připravených látek; pokus o predikci ideálního strukturního modelu komplexu pro další studium. Výsledky shrnuté v předložené disertační práci jsou publikovány v rámci čtyř odborných článků uvedených v Přílohách 1 4, další práce je v recenzním řízení (Příloha 5). Je třeba zdůraznit, že tato práce je shrnutím získaných výsledků, proto detailnější informace o připravených látkách a použitých analytických metodách lze nalézt v jednotlivých přílohách. 5

7 2. TEORETICKÁ ČÁST 2.1. Kinetin, jeho deriváty a koordinační sloučeniny Kinetin (6-furfurylaminopurin, N6-furfuryladenin, HL 1, Obr. 1) byl izolován již v roce 1955 z autoklávované DNA spermatu mořského sledě jako první cytokinin. Cytokininy představují skupinu rostlinných růstových hormonů, které stimulují buněčné dělení, ovlivňují diferenciaci buněk, transkripci DNA, podílí se na regeneračních procesech, a tak na zpomalení stárnutí, a jiných fyziologických procesech rostlin [5,6,7]. Z těchto důvodů byl kinetin, stejně jako ostatní cytokininy, využíván v oblasti rostlinného výzkumu, v různých biotechnologiích a rostlinné výrobě zejména v souvislosti se stimulací rostlinného růstu, zpomalením stárnutí listů a ovlivněním reakcí rostlin na stresové stimuly okolního prostředí [6,7]. Z důvodu extrémních podmínek v autoklávu při izolaci kinetinu se dlouho předpokládalo, že se kinetin nevyskytuje v přírodě a je produktem rozkladu DNA za vysokého tlaku. Až na konci minulého století byla přítomnost kinetinu prokázána v rostlinných extraktech, lidské moči a buněčné DNA [9,10,11]. Pozdější výzkum na úrovni buněčné biologie pak prokázal u kinetinu, kromě cytokininových, i další Obr. 1. Molekulová struktura kinetinu [8]. významné vlastnosti. Bylo zjištěno, že kinetin působí jako antioxidant zabráněním vzniku reaktivních forem kyslíku nebo přímo zachytáváním volných radikálů [12,13]. Mechanismus tohoto působení byl zatím pouze navržen, a to tak, že radikály mohou přímo reagovat s vodíkem na α-uhlíku u amino skupiny kinetinu [13]. Bylo prokázáno, že kinetin může chránit před oxidativním poškozením DNA i proteinů [14,15], poškozením krevních destiček in vitro a tvorbou krevních sraženin in vivo [16]. Vlivem svých účinků proti stárnutí našel kinetin uplatnění jako účinná látka v různých kosmetických přípravcích. Bylo zjištěno, že zpomaluje stárnutí nejen u rostlin, ale i u octomilek Zaprionus paravittiger [17] a zejména pak lidských fibroblastů [18,19]. Cytotoxicita kinetinu byla testována na širokém spektru lidských nádorových linií, přičemž výsledky ukázaly, že kinetin v tomto typu testů není aktivní [20]. Doposud bylo připraveno množství různě substituovaných derivátů kinetinu, zejména pak na purinovém skeletu [21]. Například, u připraveného 6-(furfurylamino)-9-(tetrahydropyran-2-yl)purinu byla zjištěna výraznější aktivita proti stárnutí lidských fibroblastů než u samotného kinetinu, proto i tato látka již našla využití v léčebné kosmetice [22,23]. Vyřešených molekulových a krystalových struktur analogů kinetinu bylo do Cambridgské strukturní databáze (CSD) [24], kromě látek prezentovaných v této práci, vloženo sedm, a to samotný kinetin [8], kinetin ribozid seskvihydrát [25], 6-(furfurylamino)-9-(tetrahydropyran-2-yl)purin [26], 2-chlor-N6-(5-methylfurfuryl)adenosin [27], dihydrogenfosforečnan [28], chlorid [29] a pikrát kinetinu [30]. 6

8 Obr. 2. Molekulová struktura derivátů kinetinu 6-(furfurylamino)-9-(tetrahydropyran-2-yl)purinu [vlevo, 26] a 2-chlor-N6-(5-methylfurfuryl)adenosinu [vpravo, 27]. Interakce přírodních bioaktivních látek nebo jejich derivátů s přechodnými kovy jsou již dlouhodobě zkoumány, protože vzniklé systémy mohou být dobrým modelem pro pochopení role stopových prvků v biochemických procesech a studování vlivu vzniku komplexu na výslednou biologickou aktivitu takového systému. Příkladem mohou být studie prokazující zvýšené antioxidační vlastnosti kinetinu v přítomnosti mědi [13] nebo zvýšené inhibiční účinky významné složky zeleného čaje epigallokatechin-3-gallátu na růst prostatických nádorových buněk PC-3 v přítomnosti volného Zn 2+, přičemž při testování Zn(II) komplexu s tímto katechinem se ukázalo, že ten je neaktivní [31]. Výrazné navýšení biologické aktivity oproti výchozím organickým sloučeninám bylo naopak prokázáno u vzniklých komplexů s deriváty kinetinu strukturně podobnému cytokininu N6- benzyladeninu, kdy například Cu(II) komplexy byly stejně aktivní nebo i aktivnější v antiradikálových testech než nativní hovězí enzym superoxid dismutáza [32] nebo Pt(II) oxaláto komplexy vykazovaly vyšší cytotoxicitu na mnohých nádorových buňkách než v současnosti využívané cytostatikum cisplatina [33]. Na základě výše uvedeného je zajímavé, že prací zabývajících se komplexní chemií kinetinu, molekuly s mnoha zajímavými biologickými účinky, bylo dosud publikováno relativně malé množství. Navíc biologická aktivita byla studována pouze ve dvou pracích, a to in vitro SOD-mimetická aktivita pro měďnatý komplex [Cu(L 1 ) 2 ], kdy bylo prokázáno, že komplexací se aktivita oproti volnému kinetinu zvýšila, ale komplex měl řádově 100 nižší rychlostní konstantu reakce se superoxidem než samotný enzym superoxid dismutáza [34]. Studie polymerních metalocenových komplexů kovů 4. skupiny složení [(η 5 -C 5 H 5 ) 2 M(HL 1 )] n, kde M = Ti, Zr, Hf, se soustředila na ovlivnění klíčení semen [35]. Syntetické práce se zabývaly především měďnatými komplexy, přičemž bylo navrženo složení komplexů [Cu(HL 1 )Cl 2 ], [Cu(HL 1 )Br 2 ] se čtvercově planární geometrií [36] a komplexů se základním poměrem kovu a ligandů Cu(HL 1 ) 2 (ClO 4 ) 2 nh 2 O (n = 1; 2) a Cu(L 1 ) 2 4H 2 O, pro něž byla navržena dimerní struktura 7

9 s můstkováním pomocí čtyř organických molekul [37]. Dále byl připraven a charakterizován komplex [Rh 2 (HL 1 )(Ac) 4 ] n H 2 O s acetáto můstky [38]. V letošním roce pak byla publikována práce popisující přípravu a NMR a DFT studii tautomerů a míst protonizace Pt(IV) komplexu [PtCl 5 (H 2 L 1 )] [39]. Molekulové a krystalové struktury (Obr. 3) byly, podle CSD [24], vyřešeny pro 3 měďnaté komplexy [Cu(L 1 ) 2 (EtNH 2 ) 2 (H 2 O) 2 ], [Cu(L 1 ) 2 (EtNH 2 ) 3 ] [40] a [Cu(H 2 L 1 ) 2 Cl 4 ] HCl [41] a jeden kademnatý 1D polymer [Cd 2 (H 2 L 1 ) 2 (μ-cl 4 )Cl 2 ] n [42]. Obr. 3. Molekulové struktury komplexů kinetinu, zleva: [Cu(L 1 ) 2 (EtNH 2 ) 2 (H 2 O) 2 ], [Cu(L 1 ) 2 (EtNH 2 ) 3 ] [40], [Cu(H 2 L 1 ) 2 Cl 4 ] HCl [41], [Cd 2 (H 2 L 1 ) 2 (μ-cl 4 )Cl 2 ] n [42]. Vodíkové atomy byly pro přehlednost vynechány Zinek Zinek (Zn) patří společně s kadmiem (Cd) a rtutí (Hg) do 12. skupiny periodické tabulky prvků. Elektronovou konfiguraci zinku lze zapsat jako [Ar] 3d 10 4s 2. Z důvodu vysoké stability zaplněných d orbitalů vykazují prvky 12. skupiny málo charakteristik přechodných kovů a typickým oxidačním stavem je +II [43]. Sloučeniny zinku jsou většinou bezbarvé a diamagnetické. Zinek také tvoří relativně stabilní koordinační vazby s elektronegativními donorovými atomy, jako jsou například dusík, kyslík, síra nebo halogeny. U iontů M 2+ s jejich elektronovou konfigurací d 10 nenajdeme žádné typické stereochemie související se stabilizační energií ligandového pole. Proto vykazují několik možných koordinačních čísel a geometrií s typickými koordinačními čísly 4, 5 a 6 [44,45,46]. Zinek je jedním z nejhojnějších esenciálních stopových prvků v lidském těle. V těle dospělého člověka je asi 2 3 g zinku (pro srovnání 4 6 g železa, ~ mg mědi). Téměř všechen zinek nalezneme uvnitř buněk; 30 40% je v jádře, 50% v cytoplazmě a organelách a zbytek v buněčné membráně [47]. Bylo prokázáno, že zinek hraje klíčovou roli pro strukturu a funkci velkého množství makromolekul a pro více než 300 enzymatických reakcí [2,45,46]. Má jak katalytické, tak strukturní funkce v enzymech, jeho přítomnost je kritická pro správnou funkčnost mnoha metaloenzymů, včetně 8

10 oxidoreduktáz, hydroláz, ligáz a lyáz, u enzymu superoxid dismutáza hraje koaktivační roli společně s mědí. U transkripčních faktorů s motivem zinkových prstů, které obsahují sekvence bohaté na histidin a cystein s repeticemi His 2 Cys 2, zajišťuje uspořádání proteinových sub-domén pro interakci s DNA nebo jinými proteiny [48]. Bylo zjištěno, že DNA i RNA polymerázy jsou Zn-metaloenzymy, což znamená, že je zinek zásadní pro syntézu DNA a buněčné dělení [49]. Ionty Zn 2+ se neúčastní redoxních reakcí, takže jsou stabilní v biologickém médiu. V organismu se vyskytují zejména ve formě komplexů s proteiny a nukleovými kyselinami a podílejí se tak na intermediárním metabolismu, regulaci exprese genetické informace, opravě DNA a apoptóze, syntéze a funkci peptidických hormonů, struktuře chromatinu a biomembrán. Další významnou vlastností intracelulárního zinku je jeho schopnost vystupovat jako antioxidant. Role zinku v ochraně proti poškození volnými radikály je spojena s několika faktory: udržuje dostatečnou koncentraci proteinů metalothioneinů, které zachytávají volné radikály, je součástí aktivního centra enzymu superoxid dismutáza, zabraňuje interakci určitých chemických skupin s redox-aktivními kovy, jako je železo nebo měď, při které by došlo ke vzniku volných radikálů [2,47]. Správné množství a funkce intracelulárního zinku, díky všem zásadním rolím, které hraje v biochemických procesech, pak také souvisí s imunitou organismu, funkcí mozku a ochranou proti mnoha nemocem obecně, včetně rakoviny. Z hlediska imunitního systému je zinek zásadní pro vývoj a aktivaci T-lymfocytů (druhu bílých krvinek pomáhajících v boji s infekcí) [2,47]. V mozku, kde jsou obecně vysoké koncentrace zinku, hraje tento kov významnou roli při stresových reakcích a v udržování celkové mozkové kapacity. Změny v homeostáze zinku byly pozorovány při rozvoji mnoha nemocí mozku včetně mrtvice, Parkinsonovy i Alzheimerovy choroby, stejně jako při změnách na mozku souvisejících s rostoucím věkem. V souvislosti s antioxidačními vlastnostmi zinku bylo zahájeno studium role zinku při rozvoji rakoviny. Bylo ukázáno, že nedostatek zinku má souvislost s vyšším rizikem rozvoje rakoviny [50,51]. Přestože vliv zinku byl ukázán na mnohých typech tumorů, nejvíce studií se zabývá vlivem zinku a různých typů Zn(II) komplexů na rakovinové buňky prostaty. Souvisí to se zjištěným faktem, že zásadní biochemickou charakteristikou rakoviny prostaty je výrazný pokles množství zinku v maligních buňkách, přičemž tento pokles byl prokázán v různých typech a fázích rakoviny prostaty i u různých věkových skupin pacientů [50]. Zdravé prostatické buňky totiž obsahují výrazně vyšší množství zinku (3 7 ) než ostatní orgány [52]. Ovšem dosud nebylo objasněno, jestli zhoubné bujení je způsobeno narušením akumulace zinku v buňkách, nebo naopak. Nicméně se ukázalo, že suplementace zinku inhibuje růst prostatických rakovinových buněk zastavením buněčného cyklu a indukcí buněčné apoptózy jak in vitro, tak in vivo [53]. Z toho důvodu se Zn(II) komplexy staly i dalším aktuálním tématem bioanorganické chemie. Biodostupnost a nízká toxicita ve spojení s koordinační variabilitou zinku by z jeho komplexů mohly udělat výhodnou novou generaci metaloterapeutik s potlačenými vedlejšími účinky oproti v současnosti používaným kancerostatikům na bázi platiny (cisplatina, oxaliplatina, karboplatina). Již bylo také publikováno několik prací o Zn(II) komplexech s různými typy organických ligandů vykazujících 9

11 výraznou in vitro cytotoxicitu na různých nádorových buňkách (nejen prostatických) [54,55,56,57,58]. Zn(II) komplexů s různými typy N-donorových ligandů bylo již popsáno velké množství. Například databáze SciFinder Scholar obsahuje 603 struktur látek (červenec 2012) obsahujících jak zinek, tak purinový skelet. Různé typy biologické aktivity byly studovány u Zn(II) komplexů s koordinovaným biologicky relevantním derivátem purinu. Například pro komplex [Zn(Atpy) 2 (PF 6 ) 2 ] (Atpy = 4 -p-n9 -adeninylmethylfenyl-2,2 :6,2 -terpyridin) bylo zjištěno, že navozuje výrazné strukturní změny DNA a je schopen štěpit DNA. Tento komplex se ukázal i in vitro cytotoxickým proti vybraným lidským nádorovým liniím karcinomu děložního čípku (HeLa), karcinomu jater (HepG2), prsnímu adenokarcinomu (MCF-7) a karcinomu prostaty (PC-3) [59]. Slibné výsledky při in vitro a in vivo cytotoxickém screeningu na lidských nádorových buňkách Daltonova lymfomu byly zjištěny pro komplex [Zn 2 (5FCyt)(Gua)(OH) 4 (H 2 O)] 2H 2 O (5FCyt = 5-fluorocytosin, Gua = guanin) [60]. Komplexy typu [Zn(XCH 2 COO) 2 (Kof) 2 ] 2H 2 O (Kof = Kofein; 1,3,7-trimethyl-1H-purin-2,6- (3H,7H)-dion; X = H, CI, Br, I) byly podrobeny testování antifungální a antibakteriální aktivity na Staphylococcus aureus, Escherichia coli a Candida albicans s nejzajímavějšími výsledky pro jododerivát na Staphylococcus aureus (MIC, minimální inhibiční koncentrace potřebná k zastavení mikrobiálního růstu, 78 g/cm 3 ) [61]. Slibné výsledky byly nalezeny i při testování vlivu Zn(II) komplexů s acyclovirem {nejčastěji používané antivirotikum k léčbě infekcí způsobených viry Herpes simplex a Herpes varicella-zoster; Acv, 2-amino-9-[(2-hydroxyethoxy)methyl]-1H-purin-6(9H)-on} {např. [Zn(Acv) 2 Cl 2 (H 2 O)]} na replikaci virů Herpes simplex 1 a 2 (HSV-1, HSV-2) [62], přičemž komplexy byly aktivní i na acyclovir-rezistentní viry. Navýšení biologické aktivity oproti nekoordinovanému purinovému derivátu bylo pozorováno i u Zn(II) komplexů připravených dříve v naší laboratoři. Použitými organickými sloučeninami byly deriváty N6-benzyladeninu, který patří stejně jako kinetin mezi růstové hormony cytokininy. Konkrétně byly pro syntézy použity Olomoucin [Olo, 2-(2-hydroxyethylamino)-N6-benzyl-9- methyladenin], i-propyl-olomoucin [iprolo, 2-(2-hydroxyethylamino)-N6-benzyl-9-isopropyladenin] a Bohemin [Boh, 2-(3-hydroxypropylamino)-N6-benzyl-9-isopropyladenin]. Tyto 2,6,9- trisubstituované deriváty purinu byly identifikovány jako inhibitory cyklin-dependentních kináz (CDK), enzymů zásadních pro správný průběh buněčného cyklu. Inhibice těchto enzymů vede ke kontrolované buněčné smrti, což lze samozřejmě využít při řízené apoptóze buněk nádorových [63,64]. Připravené komplexy o složení [Zn(Olo)Cl 2 ] n, [Zn(iprOlo)Cl 2 ] n, [Zn(BohH + )Cl 3 ] H 2 O a [Zn(iprOloH + )Cl 3 ] H 2 O (Obr. 4) vykazovaly, ve většině případů, vyšší cytotoxickou aktivitu na lidských nádorových liniích melanomu (G-361), osteosarkomu (HOS), prsního adenokarcinomu (MCF-7) a myelogenní leukémie (K-562) a výraznější inhibici CDK2/cyklin E kinázy než samotné organické CDK inhibitory [65]. 10

12 Obr. 4. Část 1D polymerní struktury [Zn(Olo)Cl 2 ] n (nahoře) a molekulová struktura [Zn(BohH + )Cl 3 ] H 2 O, molekula vody byla pro přehlednost vynechána [65] Měď Měď (Cu) je se stříbrem (Ag) a zlatem (Au) řazena do 11. skupiny (1.B) periodické tabulky prvků. Elektronovou konfiguraci mědi lze zapsat jako [Ar] 3d 10 4s 1. Vytváří množství sloučenin, ve kterých má převážně oxidační čísla I a II, přičemž zbarvení je často modré, modrozelené až zelené. Méně běžnými oxidačními stavy mědi jsou III, IV, V a stavy záporné, které jsou stabilizovány zejména v komplexech. V koordinačních sloučeninách, kterých je popsáno velké množství s různými typy ligandů, se měď vyskytuje v různém prostorovém uspořádání v závislosti na oxidačním a koordinačnímu čísle, přičemž nejběžnější jsou koordinační čísla 4 a 6 [43,44,45]. Měď je stejně jako zinek esenciálním stopovým prvkem, který je nepostradatelný pro mnohé živé organismy. Přestože není v lidském těle zastoupena tak hojně jako zinek ( mg u dospělého člověka), má nezastupitelnou úlohu pro správné fungování orgánů a metabolických procesů, a proto je důležitý denní přísun mědi (asi 3 5 mg) [43]. Měď je součástí mnoha proteinů a metaloenzymů, je tak důležitá pro správný růst, vývoj a fungování kostí, pojivových tkání, mozku, srdce a jiných orgánů, účastní se i tvorby červených krvinek, absorpce a transportu železa, metabolismu cholesterolu a glukosy a mnoha jiných bio-procesů. V metaloenzymech se měď jako redox-aktivní kov účastní redoxních dějů přecházením mezi oxidačními stavy I a II. V případě makromolekul (proteinů) je zásadní pro jejich správné strukturní uspořádání [66,67]. Konkrétními příklady Cu-enzymů mohou být cytochrom-c-oxidáza (účastní se dýchacího řetězce), aminooxidáza (oxidace aminů, např. histidinu), ferroxidáza I (oxidace Fe 2+ ), lysyloxidáza (síťování pojivových tkání kolagenu a elastinu), tyrosináza 11

13 (tvorba melaninu), dopamin- -hydroxyláza (tvorba neurotransmiterů) a superoxid dismutáza (ochrana proti reaktivním formám kyslíku, rozklad superoxidového radikálu) [68]. Mezi Cu-vázající proteiny patří například metalothioneiny (nízkomolekulární proteiny s vysokým obsahem cysteinu, díky jehož SH skupinám na sebe mohou vázat kovy a účastnit se tak homeostázy kovů), krevní srážecí faktor V a hlavními transportními proteiny mědi jsou albumin, transkuprein nebo ceruloplasmin. Z hlediska ochrany buněk, a tak i celého lidského organismu proti oxidativnímu stresu, který je společnou charakteristikou více než stovky chorob, včetně cukrovky [70], rakoviny [71] a neurodegenerativních [72,73] či zánětlivých procesů [71], hraje klíčovou roli jeden ze zmíněných metaloenzymů, a to Cu, Zn-superoxid dismutáza (Cu, Zn-SOD, Obr. 5) [74]. Tento enzym katalyzuje přeměnu cytotoxického superoxidového aniontu na peroxid vodíku a kyslík. Plní tak důležitou roli ochrany organismu vůči volným radikálům, protože ze superoxidového radikálu mohou dále vznikat mnohem reaktivnější látky, např. hydroxylový radikál, singletový kyslík a hydrogenperoxidový radikál. Zvýšený výskyt superoxidových radikálů byl pozorován například v rakovinových buňkách, a bylo zjištěno, že nádorové buňky mají sníženou specifickou aktivitu enzymů superoxid dismutáz (Mn- SOD; Cu, Zn-SOD). Studie ukázaly, že podávání nativního enzymu Cu, Zn-SOD myším s různými typy tumorů způsobilo výrazné prodloužení života testovaných zvířat [75]. Ve struktuře aktivního místa tohoto enzymu jsou dvě kovová centra. Na centrální atom Cu(II) jsou koordinovány čtyři molekuly histidinu přes iminové atomy dusíku z imidazolového cyklu, přičemž jeden imidazolový kruh tvoří můstek, který se druhým atomem dusíku váže na Zn(II). Ten je ještě koordinován dalšími dvěma iminovými dusíky dvou imidazolů a kyslíkem karboxylové skupiny kyseliny asparagové, což vytváří deformovaný tetraedr. Přítomnost redox-aktivního Cu-centra je pro mechanismus dismutace zásadní, protože bylo zjištěno, že pokud byl zinek nahrazen další mědí, taková strukturní modifikace SOD vykazovala stejnou aktivitu jako nativní enzym [76]. Obr. 5. Struktura lidského enzymu Cu, Zn-SOD, naznačeno je umístění atomů kovů: Cu (modrozelená) a Zn (šedá) [převzato z 69]. Komplexní sloučeniny mědi jsou častým předmětem výzkumu vzhledem k velké variabilitě koordinačních vlastností mědi jako centrálního atomu, různému strukturnímu uspořádáni těchto komplexů a samozřejmě vzhledem k biochemickým vlastnostem mědi jako esenciálního biogenního prvku. Ve spojitosti s rolemi, které hraje měď v organismu, je tak i ideálním centrálním kovem komplexů potenciálně využitelných jako budoucích netoxických metaloterapeutik. 12

14 V databázi Scifinder Scholar (srpen 2012) je uloženo 1259 typů sloučenin, které ve své struktuře obsahují jak měď, tak purinový skelet, což je více než dvojnásobné množství v porovnání s analogickým vyhledáváním sloučenin zinku. I v případě mědi se rešerše soustředila na komplexní sloučeniny vykazující určitý typ biologické aktivity obsahující biologicky relevantní purinový ligand. Byl připraven například komplex s adeninem [Cu 2 (Ade) 4 Cl 2 ]Cl 2 2EtOH, pro který bylo prokázáno, že kromě cytotoxické aktivity (nejlepší hodnota IC 50 = 45 M na linii HepG2) se váže na DNA [77]. Stejně jako v případě Zn(II) komplexů bylo léčivo acyclovir použito jako ligand i při přípravě Cu(II) komplexů. Komplexy [Cu(Acv) 2 CI 2 (H 2 O) 2 ], [Cu(Acv) 2 (H 2 O) 3 ](NO 3 ) 2 H 2 O, [Cu(Acv) 2 (H 2 O) 2 ](NO 3 ) 2 vykazovaly výraznější antivirovou aktivitu než samotný acyclovir (i než výše uvedené Zn(II) komplexy) [78]. U komplexů [Cu(Acv)Cl 2 ] 1,5H 2 O a [Cu 2 (Acv) 3 (H 2 O) 2 Cl] 5H 2 O byla studována antimikrobiální aktivita opět se slibnějšími výsledky než pro samotný ACV [79]. Další antivirotikum valacyklovir {Vcv, 2-[(2-amino-6-oxo-6,9-dihydro-3H-purin-9-yl)methoxy]ethyl-2-amino-3- methylbutanoát} vystupuje jako ligand v komplexech [Cu 2 (Vcv 1- ) 2 (Vcv 2- )(H 2 O) 4 ] a [Cu(Vcv)Cl 2 ], které vykazují vyšší antimikrobiální aktivitu než Vcv i než standardní antibiotika (např. Streptomycin) [80]. Výrazná antimikrobiální aktivita na Staphylococcus aureus byla pozorována i pro komplex [Cu(Klof) 2 (Kof) 2 ], kde Klof = klofibrát, ethyl 2-(4-chlorfenoxy)-2-methylpropanoát, lék snižující hladinu tuků v krvi) [81]. Také další léčivo bylo využito jako ligand pro syntézu Cu(II), a to ibuprofen (kyselina 2-(4-isobutylfenyl)propionová, Ibu). S tímto léčivem byl připraven komplex obsahující i purinový skelet se složením [Cu 2 (Ibu) 4 (Kof) 2 ]; u tohoto komplexu byla prokázána katecholázamimetická aktivita. Katecholáza je Cu-enzym katalyzující aerobní oxidaci katecholu (benzen-1,2-diol) na o-chinon [82]. Byl také charakterizován komplex s dvěma typy N-donorových ligandů, a to 1,10- fenanthrolinem (Phen) a N-(9H-purin-6-yl)benzensulfonamidem (H 2 Pbs) složení [Cu(N9- Pbs)(Phen) 2 ] 3,6H 2 O. Podobně jako mnohé výrazně cytotoxické Cu(II)-Phen komplexy s různými dalšími N-donorovými ligandy [83,84,85,86] vykazuje zmíněný komplex schopnost štěpit DNA a indukovat apoptózu, stejně jako cytotoxicitu na nádorových buňkách Caco-2 (adenokarcinom tračníku) a Jurkat T lymfocytech (leukémie) s hodnotami IC 50 6,47 a 3,51 M. Purinový skelet obsahuje i kinetinu strukturně blízký cytokinin N6-benzyladenin (6- benzylaminopurin, Bap), který také vystupuje jako ligand v Cu(II) komplexech vykazujících různé typy biologické aktivity. S deriváty tohoto cytokininu (RBap) bylo použitím různých reakčních podmínek připraveno několik strukturních typů jednojaderných i dvoujaderných Cu(II) komplexů. Jednojaderné komplexy byly charakterizovány o složení [Cu(3ClBapH + ) 2 Cl]Cl 2H 2 O [87], a komplexy s dalším N-donorovým ligandem (Phen) v koordinační sféře, konkrétně [Cu(H 2 O) 2 (2FBap - ) 2 (Phen)] 2MeOH, [Cu(H 2 O) 2 (3FBap - ) 2 (Phen)] 2MeOH, [Cu(H 2 O) 2 (4FBap - ) 2 (Phen)] 2MeOH, [Cu(H 2 O) 2 (2ClBap - )2(Phen)] 2MeOH a [Cu(H 2 O) 2 (3ClBap - ) 2 (Phen)] 2MeOH (Obr. 6) [88]. 13

15 Obr. 6. Molekulové struktury jednojaderných Cu(II) komplexů s deriváty N6-benzyladeninu: [Cu(3ClBapH + ) 2 Cl]Cl 2H 2 O (vlevo) [87] a [Cu(H 2 O) 2 (2ClBap - )2(Phen)] 2MeOH, molekuly rozpouštědla byly pro přehlednost vynechány [88]. První zmíněný komplex [Cu(3ClBapH + ) 2 Cl]Cl 2H 2 O byl testován na cytotoxickou aktivitu na vybraných lidských nádorových liniích, kdy se ukázalo, že koordinací neaktivních výchozích látek do komplexní sloučeniny došlo ke vzniku látky vykazující jistou cytotoxicitu, nejlepší hodnota IC 50 (17 M) byla pozorována na linii B16-F0 (maligní melanom). Komplexy druhého typu byly testovány na SOD-mimetickou aktivitu, ale ukázaly se jako neaktivní. Dimerních komplexů s RBap bylo připraveno několik různých strukturních motivů zahrnujících rozdílné typy můstkování Cu(II) center. Byly charakterizovány dvě série komplexů zahrnujících 4 organické můstky, tedy N3,N9- koordinované molekuly RBap, a to konkrétně [Cu 2 ( -RBap) 4 Cl 2 ]Cl 2 [32] a [Cu 2 ( - RBap) 4 (ClO 4 ) 2 ](ClO 4 ) 2 (Obr. 7) [89]. Komplexy byly testovány na in vitro SOD-mimetickou aktivitu, přičemž obě skupiny látek se ukázaly být v tomto typu testů aktivní. Výrazně lepší aktivitu ale vykazovaly chlorido-komplexy s nejlepší hodnotou IC 50 rovnou Obr. 7. Molekulová struktura dimeru: [Cu 2 ( - 4ClBap) 4 (ClO 4 ) 2 ](ClO 4 ) 2 H 2 O 2EtOH, chloristanové an ionty a molekuly EtOH byly pro přehlednost vynechány [89]. 14

16 0,69 M, což se řádově shoduje s aktivitou nativního hovězího enzymu Cu, Zn-SOD (0,48 M). Tato skupina komplexů pak byla s pozitivními výsledky testivána i na in vivo antidiabetickou aktivitu. Ostatní motivy popsaných dvojjaderných komplexů zahrnovaly chlorido můstky. Konkrétně byly Obr. 8. Navržené různé strukturní typy Cu(II) dimerů s deriváty N6-benzyladeninu. publikovány sloučeniny s různými RBap obecného složení (na obr. 8 shora) [Cu 2 (μ-rbap) 2 (μ- Cl) 2 (RBap) 2 Cl 2 ] [90], [Cu 2 (μ-rbap) 2 (μ-cl) 2 Cl 2 ] [32,90], [Cu 2 (μ-rbap - ) 2 (μ-cl) 2 (H 2 O) 2 ] [87], obsahující dva typy můstků dva chlorido a dva N3,N9-koordinované organické ligandy. V komplexech typu [Cu 2 (μ- Cl) 2 (RBap) 2 Cl 2 ] [87] jsou Cu(II) centra můstkovaná pouze chlorido ligandy a další dva Cl - anionty jsou společně se dvěma RBap ligandy umístěny terminálně. U uvedených Cu(II) komplexů byla testována cytotoxická aktivita na různých lidských nádorových liniích. Z tohoto testování opět vyplynulo, že koordinací původně neaktivních organických sloučenin na měď došlo ke vzniku cytotoxických komplexů. Nejlepší výsledek byl nalezen pro komplex [Cu 2 (μ-2clbap) 2 (μ- Cl) 2 (2ClBap) 2 Cl 2 ] 2H 2 O, jehož hodnota IC 50 na linii B16-F0 dosáhla 8,2 M. U skupiny komplexů typu [Cu 2 (μ-rbap) 2 (μ-cl) 2 Cl 2 ], kde R = methoxy skupina, bylo dosaženo zatím nejlepších výsledků in vitro SODmimetické aktivity pro Cu(II) komplexy s adeninovým derivátem obecně. Komplex [Cu 2 ( -2MeOBap) 2 ( - Cl) 2 Cl 2 ] dosáhl lepší hodnoty IC 50 (0,25 M) než samotný enzym Cu, Zn-SOD (0,48 M). Komplexy tohoto strukturního motivu navíc také vykazovaly in vivo antidiabetickou aktivitu. 15

17 3. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 3.1. Použité metody charakterizace Chemická analýza prvků (C, H, N): analyzátory Flash EA-1112 (ThermoFinnigan) a Flash 2000 (ThermoScientific), procentuální obsah Cu byl stanoven chelatometricky [91]. Stanovení teploty tání (u připravených organických látek): bodotávek Melting Point B-540 (Büchi). Vodivostní měření: konduktometr Cond330i/SET (WTW), 10 3 M DMF roztoky komplexních sloučenin při 25 ± 0,5 C. Elektronová absorpční (10 3 M DMF roztoky komplexů) a difúzně-reflexní (nujolová suspenze) spektroskopie: spektrometr Lambda40 (Perkin-Elmer). Infračervená spektroskopie ( cm -1 ): spektrometr Nexus 670 FTIR (ThermoNicolet) za užití techniky KBr tablet nebo ATR (Smart Orbit Diamant) techniky pro střední oblast a nujolové techniky pro infračervenou oblast vzdálenou. Ramanova spektroskopie (Zn(II) komplexy a ligandy): ramanovský nástavec NXR FT-Raman (ThermoNicolet) v oblasti cm 1. Měření magnetické susceptibility (Cu komplexy): magnetometr SQUID XL-7 (Quantum Design) v teplotním rozsahu K, použité magnetické pole 1 T. Hmotnostní spektrometrie vybraných Cu(II) komplexů: LCQ Fleet hmotnostní spektrometr s iontovou pastí technikou ionizace ESI+ (Thermo Scientific). Simultánní TG/DTA termická analýza: 6200 Exstar (Seiko Instruments Inc.); měření prováděno do 850 C při teplotním gradientu 2,5 C min -1 NMR spektroskopie (organické sloučeniny a Zn(II) komplexy): NMR spektrometry Avance 300 (Bruker) a Varian 400 (Varian), použité experimenty 1 H, 13 C, 1 H 1 H gs-cosy, 1 H 13 C gs- HMQC, 1 H 13 C gs-hmbc a 1 H 15 N gs-hmbc. Monokrystalová rentgenostrukturní analýza: monokrystalový difraktometr Xcalibur2 (Oxford Diffraction) s CCD detektorem Sapphire2; měření provedeno při 100, 110 nebo 120 K. Podrobnější popis užitých metod je uveden v přílohách Příprava kinetinu a jeho derivátů Kinetin (HL 1 ) a jeho deriváty N6-(5-methylfurfuryl)adenin (HL 2 ), 2-chlor-N6-furfuryladenin (HL 3 ), 2-chlor-N6-(5-methylfurfuryl)adenin (HL 4 ), 2-chlor-N6-furfuryl-9-isopropyladenin (HL 5 ) a 2- chlor-n6-(5-methylfurfuryl)-9-isopropyladenin (HL 6 ) byly připraveny podle částečně modifikovaných dříve publikovaných metod (HL 1 HL 4 [92] a HL 5,6 [93]). Postup je názorně ukázán ve Schématu 1. Čistota připravených organických sloučenin byla kontrolována tenkovrstevnou chromatografií a měřením teploty tání. Tyto látky byly také charakterizovány pomocí CHN analýzy, infračervené a NMR spektroskopie. 16

18 Schéma 1. Příprava kinetinu a jeho derivátů použitých jako ligandů pro přípravu Zn(II) a Cu(II) komplexů. V případě 2-chlor-N6-furfuryladeninu (HL 3 ) a 2-chlor-N6-furfuryl-9-isopropyladeninu (HL 5 ) se podařilo pomalým odpařováním matečných louhů připravit monokrystaly vhodné pro rentgenostrukturní analýzu (Obr. 9). Obr. 9. Molekulové struktury organických sloučenin 2-chlor-N6-furfuryladeninu (vlevo, HL 3 ) a 2-chlor-N6- furfuryl-9-isopropyladeninu (vpravo, HL 5 ). 17

19 3.3. Příprava Zn(II) komplexů s kinetinem a jeho deriváty (1 12) Byly připraveny Zn(II) komplexy kinetinu a jeho derivátů dvou strukturních typů. Je nutno zdůraznit, že optimalizace syntéz (reakční doba, typ rozpouštědla, reakční teplota, ph) probíhala pro každý ligand samostatně vzhledem k různé míře substituce základní molekuly kinetinu, která způsobovala rozdílné vlastnosti použitých organických sloučenin. Tab. 1. Shrnutí připravených Zn(II) komplexů Strukturní typ [Zn(HL n ) 2 Cl 2 ] Strukturní typ [Zn(H 2 L n )Cl 3 ] [Zn(HL 1 ) 2 Cl 2 ] CH 3 OH (1) [Zn(H 2 L 1 )Cl 3 ] HL 1 (7) [Zn(HL 2 ) 2 Cl 2 ] 2H 2 O (2) [Zn(H 2 L 2 )Cl 3 ] 1/2HL 2 (8) [Zn(HL 3 ) 2 Cl 2 ] (3) [Zn(H 2 L 3 )Cl 3 ] 3/2HL 3 (9) [Zn(HL 4 ) 2 Cl 2 ] (4) [Zn(H 2 L 4 )Cl 3 ] 2HL 4 (10) [Zn(HL 5 ) 2 Cl 2 ] (5) [Zn(H 2 L 5 )Cl 3 ] HL 5 (11) [Zn(HL 6 ) 2 Cl 2 ] (6) [Zn(H 2 L 6 )Cl 3 ] HL 6 (12) Syntéza komplexních sloučenin [Zn(HL 1 ) 2 Cl 2 ] CH 3 OH (1), [Zn(HL 2 ) 2 Cl 2 ] 2H 2 O (2) a [Zn(HL 5 ) 2 Cl 2 ] (5) Pro přípravu komplexních sloučenin 1, 2 a 5 byla použita modifikace dříve publikovaného syntetického postupu pro přípravu Zn(II) komplexů adeninu [94]. ZnCl 2 1,5H 2 O (1,4 mmol) byl rozpuštěn ve směsi 15 cm 3 triethylorthoformiátu a 35 cm 3 methanolu. Výsledný roztok byl 2 hod refluxován při 60 C. Poté bylo přidáno 2,5 mmol příslušného ligandu a tato reakční směs byla dále zahřívána pod zpětným chladičem. V případě komplexu 1 reakce probíhala 2 dny, přičemž se postupně vylučoval bílý prášek. Monokrystaly vhodné pro rentgenostrukturní analýzu se podařilo získat po odfiltrování vzniklého prášku postupným odpařováním matečného louhu. V případě komplexu 2 reakce pokračovala po dobu 5 dní a izolovaný béžový prášek musel být dále rekrystalizován z methanolu pro dosažení požadované čistoty. Při přípravě komplexu 5 nedošlo po 5 dnech k vyloučení práškového produktu, nicméně reakční směs změnila barvu původně bezbarvý roztok se změnil na žlutý. Proto byla reakce ukončena a k vyloučení práškového produktu došlo až po týdenním stání při laboratorní teplotě. Všechny získané práškové produkty byly odfiltrovány, promyty studeným methanolem a diethyletherem a vysušeny v sušárně při 40 C. Výsledky charakterizace těchto látek lze nalézt v Příloze Syntéza komplexních sloučenin [Zn(HL 3 ) 2 Cl 2 ] (3) a [Zn(HL 4 ) 2 Cl 2 ] (4) Z důvodu velmi nízké rozpustnosti ligandů HL 3 a HL 4 v nižších alkoholech jako methanol, ethanol a isopropanol, byl použit n-butanol jako solvent v syntézách komplexů 3 a 4. Příslušný ligand (2 mmol, HL 3 nebo HL 4 ) byl tedy za zahřívání na 90 C pod zpětných chladičem rozpuštěn v n- butanolu. Po jeho rozpuštění byl poté přikapán nasycený horký roztok ZnCl 2 1,5H 2 O (1 mmol) v n- butanolu. Výsledná reakční směs byla pak refluxována při 75 C po dobu 2 dní. Čirý reakční roztok pak stál při laboratorní teplotě, až se z něj po několika dnech vyloučil jemný bílý prášek, který byl 18

20 odfiltrován, promyt n-butanolem a diethyletherem a usušen v sušárně při 40 C. Výsledky charakterizace těchto látek lze nalézt v Příloze Syntéza komplexních sloučenin [Zn(H 2 L 1 )Cl 3 ] HL 1 (7), [Zn(H 2 L 2 )Cl 3 ] 1/2HL 2 (8), [Zn(H 2 L 3 )Cl 3 ] 3/2HL 3 (9), [Zn(H 2 L 4 )Cl 3 ] 2HL 4 (10) a [Zn(H 2 L 5 )Cl 3 ] HL 5 (11) Příslušná organická látka (1 mmol) byla pod zpětným chladičem rozpuštěna v alkoholickém médiu (methanol pro 7, 8 a 11; n-butanol pro 9 a 10) a výsledný nasycený roztok byl okyselen několika kapkami 0,1 M HCl (aby ph bylo přibližně 4 5). Poté byl po kapkách přidán nasycený roztok obsahující ekvimolární množství ZnCl 2 1,5H 2 O v příslušném alkoholu. Reakce pokračovala 2 dny pod zpětným chladičem (při 60 C pro 7, 8 a 11; při 80 C pro 9, 10). V případě komplexů 7 a 8 se pevný produkt po dvou dnech vyloučil již za zahřívání. Ostatní produkty se v práškové formě vyloučily až po přibližně týdenním stání při laboratorní teplotě. Všechny pevné podíly byly odfiltrovány, promyty studeným alkoholem použitým jako reakční médium a usušeny v exsikátoru ve vakuu. Pouze v případě komplexu 7 se podařilo získat monokrystaly vhodné pro rentgenostrukturní analýzu, a to postupným odpařováním matečného roztoku při laboratorní teplotě. Výsledky charakterizace těchto látek lze nalézt v Příloze Syntéza komplexních sloučenin [Zn(HL 5 ) 2 Cl 2 ] (6) a [Zn(H 2 L 6 )Cl 3 ] HL 6 (12) Za účelem testování biologické aktivity byla sada Zn(II) komplexů doplněna o zatím nepublikované látky, tedy komplexy [Zn(HL 5 ) 2 Cl 2 ] (6) a [Zn(H 2 L 6 )Cl 3 ] HL 6 (12), které mají v koordinační sféře trisubstituovaný derivát kinetinu, konkrétně 2-chlor-N6-(5-methylfurfuryl)-9- isopropyladenin (HL 6 ). Látky byly do sady Zn(II) komplexů doplněny později z důvodu déle probíhající optimalizace reakčních podmínek, které přineslo použití ligandu HL 6 při syntézách. Delší dobu se totiž nedařilo izolovat látky v požadované čistotě. [Zn(HL 5 ) 2 Cl 2 ] (6): Modelem pro syntézu byla příprava komplexu 1, ale ideální čistota produktu byla dosažena při jiných objemech rozpouštědel, jiné reakční teplotě a čase. ZnCl 2 1,5H 2 O (1,4 mmol) byl rozpuštěn ve směsi 8 cm 3 triethylorthoformiátu a 18 cm 3 methanolu. Výsledný roztok byl 2 hod refluxován při 60 C. Poté bylo přidáno 2,5 mmol ligandu HL 6 a tato reakční směs byla zahřívána pod zpětným chladičem při nižší teplotě, a to 45 C. Reakce musela běžet minimálně 60 hod. Pokud totiž bylo refluxování zastaveno po kratší době a po zchladnutí roztoku došlo k vyloučení bílého produktu, následné analýzy prokázaly přítomnost pravděpodobně polymerní sloučeniny, jejíž prvková analýza odpovídala složení [ZnCl 2 L] n a podle chemických posunů v NMR spektrech došlo pravděpodobně ke koordinaci organického ligandu přes atomy N1 a N7. Pokud však reakce probíhala 60 hod, došlo pomalým odpařováním reakčního roztoku k vyloučení bílého prášku komplexu 6, který byl promyt diethyletherem a vysušen pod infralampou a následně v exsikátoru ve vakuu. [Zn(HL 6 ) 2 Cl 2 ] (6): Výtěžnost: 53%, vypočteno pro ZnC 28 H 32 N 10 O 2 Cl 4 (Mr = 747.8): C 45,0; H 4,3; N 18,7. Nalezeno: C 44,7; H 4,7; N 18,8%. Λ M (10-3 DMF roztok, S cm 2 mol 1 ): 17,5. FTIR (Nujol, 19

21 cm 1 ): 290s (Zn N), 305s (Zn Cl). FTIR (KBr, cm 1 ): 1164w (C Cl), 1538w (C=C), 1583s, 1618s (C=N), 2922m (C H) met, 3109m, 3128m (C H) ar, 3260s (N H). Raman (cm 1 ): 295m (Zn N), 309m (Zn Cl), 1165m (C Cl), 1508s (C=C), 1580m, 1610m (C=N), 2935s (C met H), 3118m, 3135m (C H) ar, 3269w (N H). 1 H NMR (DMF-d 7, TMS, ppm): 8,97 (t, 1H, N6H), 8,36 (s, 1H, C8H), 7,48 (m, 1H, C13H), 6,46 (t, 1H, C12H), 6,49 (d, 1H, C11H), 4,85 (d, 2H, C9H), 4,69 (sep, 1H, C14H), 2,28 (s, 3H, C17H), 1,55 (d, 6H, C15H, C16H). 13 C NMR (DMF-d 7, TMS, ppm): 155,98 (C6), 154,02 (C2), 152,90 (C10), 152,11 (C13), 149,63 (C4), 141,88 (C8), 117,05 (C5), 112,92 (C11), 109,02 (C12), 48,84 (C14), 36,50 (C9), 21,14 (C15, C16), 12,28 (C17). [Zn(H 2 L 6 )Cl 3 ] HL 6 (12): Organická sloučenina HL 6 (1 mmol) byla rozpuštěna v 10 cm 3 methanolu a výsledný roztok byl okyselen 0,5 cm 3 0,1 M HCl. Poté byl v ultrazvukové lázni přidán nasycený roztok ZnCl 2 1,5H 2 O (1 mmol) v 10 cm 3 methanolu. Reakce pokračovala 50 hod pod zpětným chladičem při 55 C. Bílý produkt se v práškové formě vyloučil po zchladnutí reakčního roztoku na laboratorní teplotu. Prášek byl odfiltrován, promyt diethyletherem a usušen v exsikátoru ve vakuu. [Zn(H 2 L 6 )Cl 3 ] HL 6 (12): Výtěžnost: 58%; vypočteno pro ZnC 28 H 33 N 10 O 2 Cl 5 (Mr = 784.3): C 42,9; H 4,2; N 17,9. Nalezeno: C 42,7; H 4,0; N 18,3%. Λ M (10-3 DMF roztok, S cm 2 mol 1 ): 18,5. FTIR (Nujol, cm 1 ): 289s (Zn N), 328 (Zn Cl). FTIR (KBr, cm 1 ): 1166w (C Cl), 1539w (C=C), 1581s, 1615s (C=N), 2876m, 2920m (C H) met, 3113m, 3128m (C H) ar, 3259s (N H). Raman (cm 1 ): 295m (Zn N), 310m (Zn Cl), 1167m (C Cl), 1510s (C=C), 1575m, 1617w (C=N), 2878m, 2922s (C met H), 3103m, 3129w (C H) ar, 3261w (N H). 1 H NMR (DMF-d 7, TMS, ppm): 8,97 (t, 1H, N6H), 8,36 (s, 1H, C8H), 7,45 (m, 1H, C13H), 6,36 (t, 1H, C12H), 6,41 (d, 1H, C11H), 4,89 (d, 2H, C9H), 4,79 (sep, 1H, C14H), 2,29 (s, 3H, C17H), 1,45 (d, 6H, C15H, C16H). 13 C NMR (DMF-d 7, TMS, ppm): 155,54 (C6), 154,52 (C2), 152,49 (C10), 152,22 (C13), 149,53 (C4), 141,87 (C8), 117,07 (C5), 112,53 (C11), 109,52 (C12), 48,75 (C14), 36,61 (C9), 21,18 (C15, C16), 12,21 (C17) Příprava Cu(II) komplexů s kinetinem a jeho deriváty (13 21) Byly připraveny různé strukturní typy Cu(II) komplexů v závislosti na reakčních podmínkách, výchozích sloučeninách, včetně míry substituce na základní molekule kinetinu. Tab. 2. Shrnutí připravených Cu(II) komplexů Polymerní Cu(II) komplexy Dimerní Cu(II) komplexy Jednojaderné Cu(II) komplexy [Cu 2 (μ-l 1 ) 2 (μ-ac) 2 ] n (13) [Cu 2 (μ-ac) 4 (HL 5 ) 2 ] (16) [Cu(H 2 O) 2 (L 3 ) 2 (Phen)] (20) [Cu 2 (μ-l 2 ) 2 (μ-ac) 2 ] n (14) [Cu 2 (μ-ac) 4 (HL 6 ) 2 ] (17) [Cu(H 2 O) 2 (L 4 ) 2 (Phen)] 2H 2 O (21) [Cu 2 (μ-l 3 ) 2 (μ-ac) 2 ] n (15) [Cu 2 (μ-hl 1 ) 4 Cl 2 ]Cl 2 (18) [Cu 2 (μ-hl 2 ) 2 (μ-cl) 2 (HL 2 ) 2 Cl 2 ] 4H 2 O (19) Syntéza polymerních Cu(II) komplexů s acetáto-můstky [Cu 2 (μ 3 -L 1 ) 2 (μ 2 -Ac) 2 ] n (13), [Cu 2 (μ 3 - L 2 ) 2 (μ 2 -Ac) 2 ] n (14), [Cu 2 (μ 3 -L 3 ) 2 (μ 2 -Ac) 2 ] n (15) Příslušná organická sloučenina (HL 1 HL 3, 1 mmol) byla rozpuštěna pod zpětným chladičem v alkoholickém prostředí (methanol pro HL 1, HL 2 ; n-butanol pro HL 3 ) s přídavkem 1 cm 3 vodného 20

22 roztoku amoniaku (25%). Do tohoto roztoku byl po kapkách přidán molární ekvivalent Cu(Ac) 2 H 2 O rozpuštěný v minimálním množství horké destilované vody. V případě syntézy komplexů 13 a 14 došlo k rychlé změně barvy z tmavě fialové na zelenou. V případě komplexu 15 byla po přidání octanu měďnatého reakční směs světle modrá a postupná barevná změna na zelenou byla pozorována v průběhu 24 hod. Reakční směsi byly 2 dny míchány pod zpětným chladičem. V průběhu reakční doby přibývalo vyloučeného zeleného práškového produktu, který byl po uplynutí reakční doby odfiltrován, promyt studeným reakčním alkoholem a diethyletherem a vysušen pod infralampou a poté v exsikátoru. Výsledky charakterizace těchto látek lze nalézt v Příloze Syntéza dimerních Cu(II) komplexů s různými typy můstkování [Cu 2 (μ 2 -Ac) 4 (HL 5 ) 2 ] (16), [Cu 2 (μ 2 -Ac) 4 (HL 6 ) 2 ] (17), [Cu 2 (μ 2 -HL 1 ) 4 Cl 2 ]Cl 2 (18) a [Cu 2 (μ-hl 2 ) 2 (μ-cl) 2 (HL 2 ) 2 Cl 2 ] 4H 2 O (19) Při přípravě komplexů 16 a 17, podobně jako v případě syntézy Cu(II) komplexů popsaných výše (3.4.1), byla organická látka (HL 5 nebo HL 6, 1 mmol) rozpuštěna za použití ultrazvukové lázně v methanolu s přídavkem 1 cm 3 vodného roztoku amoniaku. Poté byl přidán horký nasycený roztok Cu(Ac) 2 H 2 O ve vodě. Molární poměry derivátu kinetinu a mědi použité v přípravě 16 a 17 se vzájemně lišily, protože v případě 16 byl tento poměr roven 1:2 a při syntéze 17 to bylo 1:4. Reakční směsi byly míchány pod zpětným chladičem při 60 C, přičemž se barva postupně měnila z tmavě modré na zeleno-modrou. Po dvou dnech refluxování byly roztoky ponechány volně stát při laboratorní teplotě. Po několika dnech došlo v případě komplexu 16 k vyloučení zeleno-modrých krystalů, které se ukázaly jako vhodné pro monokrystalovou rentgenovou strukturní analýzu. Z druhého reakčního roztoku (17) byl izolován práškový produkt, který byl rekrystalizován z methanolu, což nakonec také vedlo k úspěšné přípravě monokrystalů. Při syntéze komplexu 18 byl kinetin (HL 1 ) pod zpětným chladičem rozpuštěn v 50 cm 3 methanolu a poté byl přidán horký nasycený roztok CuCl 2 2H 2 O ve vodě. Výsledná reakční směs okamžitě vytvořila tmavě zelenou suspenzi. Tato suspenze byla ihned zfiltrována a izolovaný tmavě zelený práškový produkt byl promyt studeným methanolem a diethyletherem a vysušen pod infralampou a poté v exsikátoru ve vakuu. Modifikace dříve publikovaného postupu pro přípravu komplexů adeninu s chloridy 3d kovů autorů Mikulski et al. [95] byla použita při syntéze komplexu 19. CuCl 2 2H 2 O (1,4 mmol) byl rozpuštěn ve směsi methanolu (35 cm 3 ) a triethylorthoformiátu (15 cm 3 ) a výsledný roztok byl 1 hod míchán při 50 C. Následně byl ve formě prášku přidán N6-(5-methylfurfuryl)adenin (HL 2, 2,5 mmol) a tato reakční směs byla pod zpětným chladičem míchána 6 dní. Ihned po smíchání reaktantů se vytvořila zelená suspenze, která v průběhu reakční doby tmavla na tmavě zelenou a pevného produktu postupně přibývalo. Tmavě zelený práškový produkt byl následně odfiltrován, promyt studeným methanolem a diethyletherem a vysušen pod infralampou a poté v exsikátoru ve vakuu. Výsledky charakterizace těchto látek lze nalézt v Přílohách 3 a 4. 21

23 Syntéza jednojaderných Cu(II) komplexů se dvěma typy N-donorových ligandů [Cu(H 2 O) 2 (L 3 ) 2 (Phen)] (20) and [Cu(H 2 O) 2 (L 4 ) 2 (Phen)] 2H 2 O (21) Syntetický postup popsaný u komplexů byl použit jako první fáze při přípravě komplexů 20 a 21. Po smíchání butanolických roztoků HL 3 nebo HL 4 (1 mmol, s přídavkem roztoku amoniaku) s Cu(Ac) 2 H 2 O (1 mmol) ve vodě bylo okamžitě přidáno ekvimolární množství 1,10-fenanthrolinu (Phen). Barva se ihned změnila ze světle modré na zeleno-modrou. Reakční směs byla refluxována při 80 C. Po 24 hod se pomalu začal vylučovat pevný produkt. Reakce byla ukončena po 2 dnech. Vytvořený zeleno-modrý prášek byl odfiltrován, promyt studeným butanolem a diethyletherem a vysušen pod infralampou a poté v exsikátoru ve vakuu. Výsledky charakterizace těchto látek lze nalézt v Příloze 3. 22

24 4. VÝSLEDKY A DISKUZE 4.1. Zn(II) komplexy s kinetinem a jeho deriváty Obecné vlastnosti a charakterizace Zn(II) komplexů Bylo připraveno a charakterizováno dvanáct Zn(II) komplexních sloučenin s kinetinem a jeho deriváty HL 1 6 bílé až béžové barvy dvou strukturních typů obecného složení [Zn(HL n ) 2 Cl 2 ] xsolv (1 6) a [Zn(H 2 L n )Cl 3 ] nhl n (7 12). Výtěžnost reakcí se pohybovala od 32 do 68%. Z hlediska rozpustnosti bylo zjištěno, že komplexy 1 12 jsou velmi dobře rozpustné v DMSO a DMF, částečně rozpustné v methanolu, ethanolu a butanolu za laboratorní teploty. U komplexu 1, jako reprezentativního zástupce, byla provedena NMR studie stability v DMF-d 7 /H 2 O (v:v/1:2). Výsledky této studie ukázaly, že již v přítomnosti malého množství vody dochází k hydrolýze komplexu, kdy jsou Cl - aniony substituovány hydroxido ligandy za vytvoření komplexní částice [Zn(HL 1 ) 2 (OH) 2 ]. Hodnoty molární vodivosti 9,8 19,2 S cm 2 mol 1 měřené v DMF (10-3 mol dm -3 ) potvrdily, že komplexy se chovají jako neelektrolyty [96]. Z hlediska obecných vlastností komplexů 7 12 je třeba zdůraznit, že přímo z reakčních směsí komplexy krystalizovaly s různým počtem příslušných organických molekul HL 1 6 mimo koordinační sféru zinku. Jednoduchá rekrystalizace a pomalé odpařovaní rozpouštědla (DMF, alkohol) nevedla ke krystalizaci samotných komplexních částic bez těchto krystalově vázaných organických molekul. Ale při přípravě vzorků pro měření NMR spekter bylo po přidání DMF-d 7 použito centrifugace a takto došlo k oddělení méně rozpustných organických molekul jako bílých prášků. Toto bylo potvrzeno tak, že v NMR spektrech takto připravených roztoků nebyly přítomny signály nekoordinovaných organických molekul. Z hlediska syntetických postupů bylo pro přípravu komplexů 1 12 použito reakce ZnCl 2 1,5H 2 O s příslušnou organickou molekulou (použité poměry reaktantů byly 1:1,8 u komplexů 1, 2, 5 a 6; 1:2 u 3 a 4; 1:1 u 7 12) v alkoholickém prostředí (methanol, n-butanol) v závislosti na rozpustnosti organických ligandů. V případě syntéz 1, 2, 5 a 6 probíhajících v methanolu byl nutný přídavek dehydratačního činidla triethylorthoformiátu, aby bylo dosaženo požadovaného složení a čistoty komplexních sloučenin, jak bylo již dříve popsáno v pracích autorů Mikulski et al. o komplexech 3d kovů s adeninem [97,98]. Syntézy látek 7 12 probíhaly v kyselém prostředí. Bylo zjištěno, že množství přidané 0,1M HCl je velmi zásadní pro požadovaný průběh reakce. Pokud bylo toto množství nedostatečné, nedošlo k protonizaci organických molekul a vznikly tak komplexy o složení jako v případě 1 6. Naopak, když bylo ph reakční směsi příliš nízké, proběhla kyselá hydrolýza organických molekul, která vedla k oddělení furfurylové skupiny od adeninového skeletu (což bylo prokázáno NMR spektroskopií). Při syntézách komplexů 7 12 proto muselo být ph reakčních směsí v rozmezí 4 5. Simultánní TG/DTA termická analýza prokázala, že komplexy 1 a 2 jsou solvatované; endoefekty na DTA křivkách odpovídaly ztrátě jedné molekuly methanolu (komplex 1) a dvou molekul vody (2). Kromě tohoto prvního kroku desolvatace probíhal teplotní rozklad analogicky u všech komplexů 1 12, a to bez tvorby stabilních meziproduktů až do C. Konečným produktem 23

25 termického rozkladu byl ZnO, což bylo zjištěno nejen výpočtem (odchylka výpočtu od měření <1%), ale i pomocí práškové rentgenové difrakce (PDF-4 Database; ICDD No [99]). Infračervená spektra organických molekul, použitých jako ligandů, i komplexů 1 12 byla měřena v intervalu cm 1. Vzhledem k pozorování charakteristických pásů organických ligandů ve spektrech komplexů byla potvrzena přítomnost HL 1 6 ve struktuře komplexů [100]. Pásy střední až silné intenzity mezi 3268 a 3347 cm 1 lze přiřadit ν(n H), zatímco slabé až středně intenzivní pásy mezi 3010 a 3136 cm 1 odpovídají vibracím ν(c H) aromatic. Velmi intenzivní pásy vibrací ν(c=n) v oblasti cm 1 jsou posunuty o 5 38 cm 1 ve srovnání s pásy stejných vibrací ve spektrech nekoordinovaných organických molekul, což nepřímo potvrzuje koordinaci těchto molekul přes heterocyklický dusík ve studovaných komplexech. Slabé až střední pásy vibrací ν(c Cl) byly pozorovány ve spektrech komplexů 3 6 a 9 12, které mají jako ligandy molekuly HL 3 HL 6, v oblasti cm 1. Většinu pásů pozorovaných mezi 660 a 900 cm 1 lze přiřadit skeletálním vibracím purinové části organických molekul. Nové pásy v oblasti vzdáleného infračerveného záření, které nebyly pozorovány ve spektrech volných molekul HL 1 6, byly podle literatury přiřazeny vibracím ν(zn Cl) ( cm 1 ) a ν(zn N) ( cm 1 ) [101]. Tab. 3. Vybrané infračervené a Ramanovy vibrace ve spektrech komplexů 1 12 (IR/Raman v cm -1 ). ν(zn N) ν(zn Cl) ν(c Cl) ν(c=c) ν(c=n) 1 296m/282m 318s/316m w,1535w/1505s 1617s/1603m 2 287s/275m 304m/310m w,1561m/1513m,1560s 1616s,1654s/1610m,1666w 3 293s/279m 315m/318m 1179w/1158m 1505w,1539w/1504s,1539w 1600s,1624s/1606m,1634w 4 289s/284m 302m/305m 1178w/1170m 1540w,1565m/1538s,1560w 1600s,1627s/1603m,1637w 5 293s/298m 306s/310m 1165w/1167m 1505w,1537w/1506s 1581s,1620s/1578m,1607m 6 290s/295m 305s/309m 1164w/1165m 1538w/1508s 1583s, 1618s/1580m, 1610m 7 297s/295m 316s/315m w,1534w/1503s 1632s/1631w 8 290s/296m 304m/315m w,1557m/1519m,1568s 1618s,1643s/1622m,1666w 9 290s/279m 330m/334m 1177w/1176m 1504w,1539w/1504s 1600s,1624s/1605m,1631w s/289m 330m/310m 1177w/1186w 1560w/1561s 1600s,1627s/1603m s/- 330m/- 1165w/- 1503w,1534w/- 1581m,1619s, s/295m 328s/310m 1166w/1167m 1539w/1510s 1581m,1615s/1575m, 1617w U komplexů 1 10 a 12 byla měřena i Ramanova spektra v oblasti cm 1, která poskytla analogické a doplňující informace k infračervené spektroskopii (Tab. 3). Spektrum komplexu 11 nemohlo být změřeno, protože vzorek působením laseru shořel NMR spektroskopie komplexů 1 12 NMR spektroskopická studie Zn(II) komplexů byla provedena pomocí 1 H a 13 C NMR experimentů. Detekované signály byly přiřazeny s pomocí dvojdimenzionálních NMR experimentů 1 H- 1 H gs-cosy, 1 H- 13 C gs-hmqc a 1 H- 13 C gs-hmbc. Chemické posuny ( ) ve spektrech komplexů 24

26 1 12 byly porovnány se spektry volných organických molekul. Interpretace změn chemických posunů rezonancí, které jsou popsány jako koordinační posuny, δ = δ komplex δ ligand, poskytla velmi citlivý nástroj k určení místa protonizace (v případě 7 12) a způsobu koordinace ligandů v komplexech 1 12 (Tab. 4). Tab. 4. Vybrané koordinační posuny ( δ = δ komplex δ ligand ) určené z 1 H a 13 C NMR spekter Zn(II) komplexů Komplex 1 H NMR 13 C NMR N6H C8H C2H C2 C4 C5 C6 C8 1 0,51 0,36 0,15 0,09 2,15 2,77 1,32 4,92 2 1,02 0,36 0,14 2,26 2,43 3,96 1,76 3,23 3 0,10 0,21-0,24 0,86 2,80 1,39 1,86 4 0,10 0,10-0,21 1,97 1,91 0,90 1,18 5 0,03 0,10-0,10 0,06 0,90 0,52 0,56 6 0,06 0,12-0,14 0,10 1,02 0,68 0,79 7 1,02 0,30 0,26 0,56 0,23 1,89 0,73 2,08 8 0,87 0,32 0,25 0,55 0,62 1,54 0,66 4,43 9 0,06 0,23 2,56 0,57 2,94 1,27 1, ,07 0,23 2,47 1,07 3,13 1,21 1, ,03 0,09 0,31 0,10 0,82 0,47 0, ,06 0,12 0,54 0,18 1,22 0,58 0,79 Nejvýznamnější změny v 1 H NMR spektrech Zn(II) komplexů oproti spektru příslušné volné molekuly HL 1 6 byly pozorovány pro signál přiřazený protonu C8H, který se nachází v bezprostřední blízkosti koordinačního místa organického ligandu atomu N7. Tento signál byl posunut o 0,09 0,36 ppm. V případě komplexů 7 a 8 byly zjištěny výrazné posuny signálu C2H (o 0,26 a 0,25 ppm), tedy protonu v blízkosti místa protonizace organického ligandu. Výrazné koordinační posuny signálu N6H ve spektrech komplexů 1, 2 a 7, 8 ve srovnání s ostatními komplexy mohou mít spojitost s přítomností atomu chloru v pozici C2 organických ligandů v ostatních komplexech 3 5 a 9 12, který přispívá k jinému rozložení elektronové hustoty v rámci struktury organických molekul. Navíc zapojení skupiny N6H do sítě vodíkových vazeb, což samozřejmě také ovlivňuje hodnoty δ, bylo zjištěno v pevné fázi pomocí rentgenostrukturní analýzy provedené u monokrystalů komplexů 1 a 7 (sekce 4.1.2). Největší koordinační posuny v 13 C NMR spektrech byly určeny pro signály atomů C5 ( δ = 0,82 3,96 ppm, k vyššímu poli) a C8 ( δ = 0,54 4,92 ppm, k nižšímu poli), což opět naznačuje, že koordinačním místem molekul HL 1 6 je atom N7. Dále pak u komplexů 7 12 byly pozorovány vyšší posuny u signálů odpovídajících atomům C2 (0,31 2,56 ppm) a C4 (0,23 ppm u 7; 0,62 ppm u 8; 0,57 ppm u 9; 1,07 ppm u 10; 0,10 ppm u 11, 0,18 ppm u 12), které sousedí s místem protonizace, atomem N3. 25

27 Obr. 10. Výřez 1 H- 13 C gs-hmqc NMR spektra komplexu 9 s přiřazením pozorovaných krospíků Molekulové a krystalové struktury komplexů [Zn(HL 1 ) 2 Cl 2 ] CH 3 OH (1) a [Zn(H 2 L 1 )Cl 3 ] HL 1 (7) Pomocí monokrystalové rentgenové strukturní analýzy byly vyřešeny molekulové a krystalové struktury komplexů 1 a 7, tedy zástupců obou strukturních typů připravených Zn(II) komplexů. Molekulová struktura komplexu 1 obsahuje komplexní částici [Zn(HL 1 ) 2 Cl 2 ] a jednu molekulu methanolu mimo koordinační sféru, zatímco molekulová struktura komplexu 7 zahrnuje komplex [Zn(H 2 L 1 )Cl 3 ] a jednu molekulu HL 1 mimo koordinační sféru (Obr. 11). Geometrii v okolí centrálního atomu zinku v obou sloučeninách je možné popsat jako deformovaný tetraedr. Na Zn(II) centrum jsou v 1 koordinované dvě molekuly kinetinu přes atom N7 a dva chlorido ligandy v chromoforu ZnN 2 Cl 2. Naopak v komplexu 7 je chromofor ZnNCl 3 tvořen jednou N7-koordinovanou protonizovanou molekulou kinetinu a třemi chloridovými anionty. Z hlediska tautomerních forem koordinované a krystalové molekuly kinetinu v sloučenině 7 je koordinovaný kinetin přítomný jako N3-H protonizovaný N9-H tautomer. Naproti tomu je v krystalové molekule kinetinu jeden atom vodíku neuspořádaný s obsazovacími faktory 0,81(3) (pro N7 H tautomer) a 0,19(3) (pro N3 H tautomer). V CSD byly nalezeny jen 3 struktury jednojaderných Zn(II) komplexů obsahujících základní motiv ZnN 2 Cl 2 a současně purinovou jednotku. Vyřešených molekulových struktur podobných druhému strukturnímu typu (komplexu 7) bylo do databáze vloženo více, proto byly vyhledávací parametry zúženy a bylo nalezeno 12 molekulových struktur, které obsahují motiv ZnNCl 3 a současně N7-koordinovaný ligand odvozený od adeninu. Průměrné vazebné délky Zn Cl a Zn N v těchto látkách jsou rovny 2,228 a 2,035 Å pro první strukturní typ a 2,246 a 2,064 Å pro druhý. Tyto hodnoty jsou dobře srovnatelné s vazebnými délkami nalezenými v komplexech 1 a 7 (Tab. 5). 26

28 Obr. 11. Molekulové struktury komplexů [Zn(HL 1 ) 2 Cl 2 ] CH 3 OH (1, molekula methanolu není pro přehlednost zobrazena, vlevo) a [Zn(H 2 L 1 )Cl 3 ] HL 1 (7, vpravo). Tab. 5. Vybrané vazebné délky a úhly v komplexech 1 a 7 (Å, ); data pro obě koordinované organické molekuly v 1 jsou udány v pořadí: HL 1 /HL 1A ; u komplexu 7 jsou data udána v pořadí: koordinovaná HL 1 /HL 1 krystalově vázaná molekula Zn N7 2,024(2) 2,0424(16) N3 C2 1,332(3)/1,333(3) 1,336(3)/ 1,336(3) Zn N7A 2,031(2) - N3 C4 1,347(3)/1,350(3) 1,363(2)/1,357(3) Zn Cl1 2,2220(7) 2,2323(6) N7 C8 1,327(3)/1,324(3) 1,328(2)/1,337(3) Zn Cl2 2,2437(7) 2,2339(5) N7 C5 1,391(3)/1,394(3) 1,390(2)/1,382(2) Zn Cl3-2,3027(5) N9 C8 1,336(3)/1,344(3) 1,346(3)/1,334(2) N1 C2 1,335(3)/1,336(3) 1,315(3)/1,334(3) N9 C4 1,371(3)/1,365(3) 1,351(3)/1,374(2) N7 Zn N7A 101,47(8) - N7A Zn Cl2 107,41(6) - N7 Zn Cl1 114,14(6) 109,69(5) Cl1 Zn Cl2 109,92(3) 116,93(2) N7 Zn Cl2 110,23(6) 110,56(5) N7 Zn Cl3-100,47(5) N7A Zn Cl1 113,23(6) - Cl1 Zn Cl3-109,29(2) Testování různých typů biologické aktivity Zn(II) komplexů U připravených Zn(II) komplexů byl proveden screening testování širokého spektra typů biologických aktivit. Protože kinetin patří mezi rostlinné růstové hormony, jeden typ testování zahrnoval zkoumání fytotoxicity komplexů na buňkách Nicotiana tabacum BY-2 a dále vliv komplexů na proces mitózy u zmíněných buněk. Buňky byly vystaveny DMSO roztokům komplexů v různých časových intervalech (0, 24, 48, 72, 96 a 120 hod) i různých koncentracích ( M). Viabilita buněk byla měřena pomocí přídavku fluorescein diacetátu a propidium jodidu, což je interkalující barvivo, které se váže 27

29 na DNA, takže pozitivní zabarvení je pozorováno pouze u umírajících nebo mrtvých buněk (s poškozenou buněčnou membránou). Procento živých a mrtvých buněk bylo spočítáno za použití fluorescenčního mikroskopu (Olympus AX 70) s širokospektrální UV excitací, přičemž bylo z každé série vyhodnoceno 10 náhodných polí v mikroskopu (min buněk). Viabilita (%) byla vyjádřena podle rovnice: viabilita (%) = (počet živých buněk / počet všech buněk)*100. Při pozorování změn na buněčných jádrech bylo jako fluorescenční barvivo použito bisbenzimidu Hoechst Vyhodnocení bylo provedeno obdobně pomocí fluorescenčního mikroskopu. Počet buněk se znaky apoptózy (fragmentace DNA) a mitotický index (poměr počtu buněk v mitóze k celkovému počtu buněk) byly vyjádřeny v procentech k celkovému počtu buněk. Obr. 12. Srovnání mitotického indexu buněk BY-2 při působení Zn(II) komplexů a samotných organických látek HL1 5 při koncentraci 25 M. Obr. 13. Snímek z fluorescenčního mikroskopu: buněčná suspenze BY-2, barvivo Hoechst 33258, komplex 1 (50 M, 72 hodin po aplikaci). Šipka ukazuje přítomnost fragmentace DNA (projev apoptózy). Pro porovnání byly testovány i ligandy HL1 5, u kterých byly pro buňky tabáku nejtoxičtější monosubstituované deriváty kinetinu (HL2 a HL3). Nejvyšší viabilita byla naopak pozorována při testování nesubstituovaného kinetinu (HL1) a disubstituovaných derivátů (HL4 a HL5). Zn(II) komplexy se ve všech případech ukázaly jako toxičtější než samotné ligandy. Jeví se však jako 28