Barevnost látek. Optické metody

Transkript

1 ÚSTAV LÉKAŘSKÉ BIOCHEMIE 1. LF UK Optické metody používané v biochemii Martin Vejražka Praha, 2008

2 Optické metody Velká část analytických metod používaných v biochemii využívá interakcí analytu se světlem. Může jít o změnu barvy či její intenzity, luminiscenci, fluorescenci, změnu optické otáčivosti nebo o změnu rozptylu světla při průchodu vzorkem. Barevnost látek Řada látek obsahuje valenční elektron, který může být excitován do vyšší energetické hladiny elektromagnetickým zářením. Taková látka pak absorbuje záření o vlnové délce odpovídající rozdílu energií obou elektronových hladin. Pokud absorbované záření leží ve viditelné části spektra, bude se lidskému oku látka jevit barevná (bude mít barvu doplňkovou k barvě absorbovaného světla). Absorbovaná vlnová délka Barva absorbovaného světla Barva látky fialová žlutozelená modrá žlutá zelenomodrá oranžová modrozelená červená zelená purpurová žlutozelená fialová žlutá modrá oranžová zelenomodrá červená modrozelená Předpovědět barvu látky na základě její chemické struktury bohužel není jednoduché, ani není možné na základě absorpčního spektra jednoznačně usuzovat na složení látky. Z našeho hlediska jsou však významné tři skupiny látek, které jsou často barevné: 1. Látky obsahující systém konjugovaných dvojných vazeb, jejichž molekula není symetrická. Představíme-li si symetrický konjugovaný systém dvojných vazeb, může existovat ve dvou rezonančních stavech, které jsou energeticky rovnocenné: Přítomnost asymetrického substituentu způsobí, že se energie obou stavů budou lišit. Rozdíl energií přitom často odpovídá záření z viditelné části spektra. Typickými zástupci mohou být barviva s polymethinovým řetězcem ( CH=CH CH=CH ) nebo azobarviva ( N=N ). Podobně se chovají i látky s aromatickými či heterocyklickými strukturami vázanými na společný centrální atom (např. trifenylmetanová barviva) 2. Rovněž d a f valenční elektrony mnohdy podmiňují barvu sloučeniny. Bývají přítomny v koordinačně kovalentních vazbách komplexních sloučenin. Tak např. bezvodý síran měďnatý CuSO 4 je bezbarvý, zatímco jeho pentahydrát CuSO 4 5H 2 O i vodný roztok mají modrou barvu: v obou případech totiž měď vstupuje do komplexu s vodou [Cu(H 2 O) 4 ] 2+. Podobně bývají barevné i komplexní sloučeniny dalších přechodných kovů (Fe, Cu, Cr, Mn, Ni, Co), komplexně vázaný kov je i v barevných bílkovinách hemoglobinu a cytochromech. 3. Barevné jsou také ionty, které jako centrální atom obsahují přechodný kov s vysokým oxidačním číslem, např. MnO 4 -, Cr 2 O Analytické metody používané v lékařské chemii a biochemii využívají všech tří skupin barevných sloučenin. Systémy konjugovaných dvojných vazeb často vznikají v reakcích, v nichž analyt kondenzuje s vhodným chromogenem (např. kreatinin s kyselinou pikrovou v Jaffého reakci, diazokopulační reakce při průkazu bilirubinu), nebo vznikají oxidací chromogenu, který obsahuje o jednu dvojnou vazbu méně (oxidace derivátů benzidinu v peroxidázových reakcích). Tvorby barevných komplexů se využívá např. při stanovení bílkovin tzv. biuretovou reakcí (komplexy Cu 2+ s O a N peptidových vazeb) nebo při průkazech řady látek např. pomocí FeCl 3. Změny barvy při redukci Cr 6+ na Cr 3+ se využívá např. při průkazu ethanolu ve vydechovaném vzduchu. 2

3 Fotometrie a spektrofotometrie Stanovení vlastností vzorku, např. koncentrace určité látky, na základě pohlcování světla určité vlnové délky se označuje jako fotometrie. Pokud se neměří jen při jedné vlnové délce, ale hodnotí se určitý úsek spektra, mluvíme o spektrofotometrii. Transmitance Množství světla určité vlnové délky, které prošlo vzorkem, popisuje veličina transmitance (lat. transmitto převádím, propouštím). Ta je definována I T =, I 0 kde I 0 je intenzita světla vstupujícího do vzorku a I je intenzita světla ze vzorku vystupujícího. V praxi by bylo nevhodné měřit přesně obě intenzity: kromě vlastností vzorku jsou ovlivněny i absorpcí a odrazem světla na stěnách kyvety a v optice fotometru, prostředím, v němž probíhá měření atd. Proto se obvykle měří transmitance relativně vzhledem ke slepému vzorku. Nejprve se změří intenzita světla procházejícího slepým vzorkem (blankem, referenčním vzorkem), tj. roztokem obsahujícím všechny složky vyjma stanovované barevné látky. Pak se za stejných podmínek měří intenzita světla procházejícího neznámým vzorkem. Transmitance je pak definována vztahem vz T vz =, Ib I kde I vz je intenzita světla procházejícího vzorkem a I b je intenzita světla procházejícího blankem. Měří-li se transmitance tímto způsobem, není třeba se zabývat nespecifickými ztrátami intenzity světla. Intenzita světla, které prochází slepým vzorkem, se považuje za 100 % (tj. transmitance blanku je 100 %) a transmitance vzorků absorbujících světlo dané vlnové délky je vždy menší než 100 %. Transmitance roztoku, který obsahuje barevnou látku, záleží na 1. vlastnostech absorbující látky 2. vlnové délce procházejícího světla 3. množství absorbující látky, tj. na její koncentraci v roztoku a na tloušťce kyvety. August Beer ( ) poprvé formuloval závislost transmitance na těchto veličinách matematicky. Za předpokladu, že se použije monochromatické světlo, platí T l. c = 10 ε., kde T je transmitance, ε je molární dekadický absorpční koeficient (konstanta specifická pro danou látku při určité vlnové délce), l je optická dráha (tloušťka kyvety) a c je molární koncentrace absorbující látky v roztoku. Algebraickými úpravami můžeme transmitanci vyjádřit také log T = ε l c nebo log T = ε l c. Absorbance a Lambertův-Beerův zákon Výraz log T se označuje jako absorbance A (v literatuře se lze setkat i se starším označením extinkce E). Z výše uvedeného vyplývají pro absorbanci vztahy I I0 A = log T = log = log I0 I A = ε l c Poslední vztah se označuje jako Lambertův-Beerův zákon (Johann Heinrich Lambert, ). Praktickou výhodou jeho užití je, že absorbance je přímo úměrná koncentraci absorbující látky. Z výše uvedených rovnic je zřejmé, že nulovou absorbanci bude mít vzorek, který nepohltí žádné světlo, absorbance 1 znamená, že vzorkem prošla právě jedna desetina světla, při absorbanci 2 právě jedna setina vstupujícího světla 3

4 atd. Záporná absorbance by znamenala, že vzorkem prochází více světla než blankem, zpravidla v důsledku hrubé chyby nebo nesprávného uspořádání pokusu. Absorbance je bezrozměrná veličina. Fotometry a spektrofotometry Pro měření absorbance se používají fotometry, zařízení schopná pracovat při více vlnových délkách a změřit absorpční spektrum vzorku se označují jako spektrofotometry. Principiálně se fotometr skládá ze čtyř částí: 1. zdroj světla 2. monochromátor 3. oddíl, ve kterém je umístěn vzorek 4. detektor Jako zdroj světla slouží vhodná žárovka nebo výbojka. Žárovky a halogenové žárovky poskytují záření o spojitém spektru ve viditelné a infračervené oblasti, nelze je však použít pro měření v UV oblasti. Jako zdroje ultrafialového záření se používají nejčastěji vodíkové nebo deuteriové výbojky. Zdrojem UV i viditelného světla může být také např. xenonová výbojka, široký rozsah vlnových délek je však vyvážen některými nevýhodami: její světlo je složením spojitého a čárového spektra, takže jsou velké rozdíly mezi intenzitami při různých vlnových délkách, výbojka je velmi drahá a intenzita jejího světla není příliš stabilní. Polychromatické světlo následně prochází monochromátorem. Nejjednodušší a nejlevnější možností je zařazení vhodného interferenčního filtru do optické dráhy. Komerčně dostupné jsou dnes filtry prakticky pro libovolnou vlnovou délku ultrafialové a viditelné oblasti. Rozlišuje se několik druhů interferenčních filtrů, jejichž vhodnou kombinací se sestaví filtr požadovaných vlastností. Low-pass filtry propouštějí světlo vlnových délek kratších, než je určitá mez (cut-off). High-pass filtry naopak propouštějí jen světlo, které má větší vlnovou délku, než je hraniční vlnová délka filtru. Pásmové filtry propouštějí určitý rozsah vlnových délek. Protože hranice nebývají zcela ostré, uvádí se jako dolní a horní mez zpravidla taková vlnová délka, pro kterou má filtr padesátiprocentní transmitanci ve srovnání s vlnovou délkou, kterou propouští nejlépe. Někdy se také uvádí střední vlnová délka, kterou filtr propouští, a šířka pásma (nebo polopásma). transm itance šířka pásma šířka polopásma dolní mez horní mez vlnová délka Obr. 1: Vztah mezi šířkou pásma, šířkou polopásma, dolní a horní mezí pro interferenční filtr Obvykle dnes jako monochromátor slouží optická mřížka, jejímž nakláněním lze plynule měnit vlnovou délku (např. tzv. Czerného-Turnerův monochromátor). Rozsah vlnových délek, které z monochromátoru vycházejí, určuje štěrbina, buď pevně nastavená, nebo rovněž nastavitelná. Čím je štěrbina širší, tím větší je intenzita vycházejícího světla, ovšem za cenu menší specifičnosti měření. Naopak užší štěrbina zajistí přesnější dodržení požadované vlnové délky, ovšem za cenu menší intenzity světla a zhoršení odstupu signálu od šumu. 4

5 zdroj světla štěrbina detektor optická mřížka kyveta Obr. 2: Zjednodušené schéma uspořádání fotometru. Monochromatické světlo prochází vzorkem. V biochemii se téměř výlučně pracuje s roztoky, které se plní do standardních kyvet s optickou dráhou 1 cm (vzácněji kratší tzv. ultramikrokyvety pro velmi malé objemy měřených roztoků). Kyvety mohou být vyrobeny z různých materiálů a mohou mít různé provedení. Kyvety z optického skla (zpravidla označované OG = optical glass, G = glass apod.) se hodí pro měření ve viditelné části spektra. Pro měření v UV oblasti je třeba použít kyvet z křemenného skla (Q = quartz, UV). Dostupné jsou i kyvety ze speciálních optických skel (OS = Optisches Glas), které lze obvykle použít pro širší část spektra než kyvety z obvyklého optického skla, jsou však levnější, než kyvety křemenné. Měření v kyvetách z různých typů skla je velmi přesné, při správné technice lze stanovit absorbanci vzorku s přesností až na čtyři či pět desetinných míst. Kyvety jsou však relativně drahé z optického skla stojí řádově stovky až tisíce korun, cena běžné kyvety z křemenného skla se pohybuje kolem čtyř až pěti tisíc korun. Přitom je životnost kyvet omezená, navíc jejich údržba je poměrně pracná. Z těchto důvodů se pro běžná měření používají jednorázové plastové kyvety, jejichž cena bývá několik korun, na druhou stranu s nimi lze spolehlivě měřit s přesností jen na dvě až tři desetinná místa (což je však pro většinu aplikací plně vyhovující). Většinou se vyrábějí z polystyrenu (PS) pro viditelnou část spektra, nebo z polymetylmetakrylátu (PMMA) i pro část UV oblasti. Pro větší přesnost měření bývá na kyvetách uveden tzv. faktor kyvety vlastně skutečná optická délka kyvety v cm. V ideálním případě je faktor kyvety roven jedné, může se však lišit v důsledku výrobních nepřesností. Standardní spektrofotometrické kyvety (tzv. makrokyvety) mají dnes vnitřní rozměry až 4 cm a plní se na objem 3 ml (nebo méně podle uspořádání fotometru a výšky paprsku nade dnem kyvety). Vzhledem k tomu, že se pracuje se stále menšími vzorky, používají se čím dál častěji semimikrokyvety, které mají prostor pro vzorek zúžený a stačí je tak plnit jen asi 0,8 ml vzorku (opět záleží na provedení přístroje). Dostupné jsou i mikro- a ultramikrokyvety, které, někdy již za cenu zkrácení optické délky, mohou pracovat i s podstatně menšími objemy (řádově až mikrolitry). Protože by při použití semimikro-, mikro- a ultramikrokyvet v některých spektrofotometrech podstatná část světla procházela sklem kolem vzorku, což by výrazně zvyšovalo pozadí a zhoršovalo přesnost měření, bývají tyto kyvety tzv. maskované sklo kolem oblasti se vzorkem je začerněno. Pro speciální aplikace se používají další typy kyvet, např. průtokové kyvety, které lze připojit např. k chromatografickým přístrojům, temperované kyvety, spektrofotometrické kapiláry apod. Kyveta se v přístroji umisťují do kyvetátoru, který zajišťuje jejich přesnou polohu, může být temperován a někdy obsahuje i magnetickou míchačku, pomocí níž lze po vložení míchadélka do kyvety promíchávat její obsah během měření. Často bývá možné do kyvetátoru založit najednou několik kyvet, které se pak automaticky vsunují do optické dráhy. Světlo vycházející ze vzorku konečně dopadá na detektor, zpravidla fotodiodu nebo jiný fotoelektrický prvek. Intenzita se vyhodnotí pomocí systému převodníků, srovná se s intenzitou světla procházejícího blankem a tím se získá absorbance. Přesnost měření ovlivňuje integrační čas doba, po kterou se absorbance měří. Čím je delší, tím přesnější bude výsledek měření, pokud ovšem není absorbující látka fotocitlivá (tj. pokud nedojde při delším osvitu k vyblednutí vzorku). Nevýhodou dlouhého integračního času je samozřejmě také prodlužování doby měření, což je podstatné zejména při zpracování velkého množství vzorků, při měření při velkém počtu vlnových délek (tj. při měření spekter), nebo při zpracování vzorků, které se v čase mění (kinetická měření). Kromě tzv. jednopaprskových fotometrů, v nichž se nejprve měří slepý vzorek a pak se do stejné optické dráhy vkládá měřený vzorek, se používají i tzv. dvoupaprskovými fotometry, které jsou vybaveny dvěma detektory a umožňují měřit blank i vzorek současně ve dvou optických drahách. Jiná uspořádání spektrofotometru Měření spektra na spektrofotometru s optickou mřížkou znamená, že přístroj změří absorbanci při jedné vlnové délce, pak posune mřížku, měří při další vlnové délce a to se neustále opakuje, dokud se neproměří celá 5

6 požadovaná oblast. To s sebou přináší poměrně dlouhou dobu měření, což může být na závadu z několika důvodů: vzorek se může v čase měnit (zejména při kinetických měřeních) vzorek může být fotocitlivý, v průběhu měření dochází k jeho vyblednutí pokud se zpracovává více vzorků, které nejsou dostatečně stabilní, může být technicky obtížné zajistit stejné podmínky pro první a poslední vzorky měření trvá dlouho, výkonnost metody je nízká Uvedené nedostatky odstraňuje jiné uspořádání spektrofotometru, měření pomocí diodového pole (diode-array). Při něm prochází vzorkem bílé světlo, které je až poté rozloženo na jednotlivé vlnové délky (zpravidla pomocí pevně postavené optické mřížky) a dopadá na destičku s velkým množstvím detektorů fotodiod (odtud název diodové pole). Diodové pole je přitom umístěno tak, že na každou fotodiodu dopadá určitý (poměrně úzký např. 2 nm) rozsah vlnových délek. Zařízení neobsahuje žádné pohyblivé prvky, což zvyšuje reproducibilitu měření, a navíc se změří celé spektrum najednou. Doba měření se tak může zkrátit z několika minut na zlomky sekundy. Toto uspořádání navíc umožňuje konstruovat přístroje přibližně o řád přesnější, než klasické fotometry, navíc nevyžadující prakticky žádnou údržbu, kalibraci atd. Zásadní nevýhodou bývá mnohonásobně vyšší pořizovací cena, avšak se zlevňováním miniaturních elektronických prvků se náklady na výrobu diodového pole rychle snižují. zdroj světla diodové pole kyveta optická mřížka Obr. 3: Uspořádání fotometru s diodovým polem V rutinním použití má klasické uspořádání fotometrie i další nevýhody: vyžaduje velké množství vzorku má malou výkonnost, zpracování jednotlivých vzorků je pracné kyvety jsou drahé a náročné na údržbu spektrofotometry jsou nákladné Tyto nevýhody z velké části odstraňuje měření v mikrotitračních destičkách pomocí fotometru se svislým paprskem (čtečka destiček, plate reader). Vzorky se plní do polystyrénových destiček s 96 jamkami, existují ale i jiné formáty (od 4 do 384 jamek). Pro práci s mikrotitračními deskami jsou k dispozici speciální pomůcky (vícekanálové pipety, opakovací pipety atd.), které výrazně urychlují přípravu vzorků. Na rozdíl od klasických fotometrů, v nichž se absorbance měří vodorovným paprskem a optická dráha je daná tloušťkou kyvety, probíhá v tomto případě měření pomocí svislého paprsku a délka optické dráhy záleží na výšce hladiny v jamce. Pokud ke vzorku přidáme určité množství bezbarvého roztoku, sníží se sice koncentrace absorbující látky, zároveň se ale úměrně zvýší hladina roztoku v jamce (prodlouží se optická dráha) a výsledná absorbance bude stejná. Naopak, pokud se ze vzorku odpaří část bezbarvého rozpouštědla, optická dráha se sice zkrátí, zato však stoupne koncentrace absorbující látky a absorbance se opět nezmění. Lze říci, že na rozdíl od klasické fotometrie, kde absorbance odpovídá koncentraci absorbující látky v roztoku, závisí absorbance při měření svislým paprskem na látkovém množství absorbující látky ve vzorku. Pro fotometrii svislým paprskem je třeba mnohem menší objem vzorku jamky se zpravidla plní jen 100 až 300 µl roztoku. Mikrotitrační destičky jsou jednorázové a jsou vzhledem k počtu zároveň měřených vzorků podstatně levnější než plastové kyvety. Změření všech 96 jamek trvá obvykle jen několik vteřin. Rovněž destičkové fotometry bývají poměrně levné, jako monochromátor většinou používají 6

7 sadu interferenčních filtrů. Zvláště často se fotometrie svislým paprskem využívá v imunochemii, zejména v metodice ELISA (odtud rozšířené označení přístroje ELISA-reader). Pro větší přehlednost se při fotometrii svislým paprskem kromě pojmu absorbance používá ještě termínu optická denzita (OD). Platí přitom vztah OD = A / l. Optická denzita tedy závisí jen na vlastnostech vzorku, nikoli však na délce optické dráhy, po níž světlo vzorkem prochází. Jistě by bylo chybou se na tomto místě alespoň nezmínit o reflexní fotometrii, technice používané v rutinní klinické biochemii hlavně v rámci tzv. suché chemie. Jde o celou řadu metod, v nichž se biologický materiál nezpracovává obvyklým způsobem ve zkumavkách či jiných nádobkách, ale nanese se na film napuštěný jednotlivými složkami reakční směsi. Výsledkem je změna barvy políčka, kterou lze kvantifikovat pomocí reflexního fotometru měří se úbytek světla určité vlnové délky odraženého od políčka. Jako zdroj světla se používají buď LED diody emitující vhodnou vlnovou délku, nebo žárovkové zdroje s interferenčními filtry. Pro zvýšení citlivosti se odražené světlo soustřeďuje na detektor vydutým zrcadlem (tzv. Ulbrichtovou koulí). Klasickým příkladem suché chemie a reflexní fotometrie je vyšetření moči pomocí diagnostických proužků, vzhledem k jednoduchosti a rychlosti při přesnosti srovnatelné s klasickými metodami se však množství aplikací rychle rozšiřuje. Pokročilé spektrofotometrické techniky Často se stává, že v části spektra, kde má absorpční maximum stanovovaná látka, zároveň absorbuje i další složka reakční směsi. V tom případě nelze snadno stanovit koncentraci měřené látky, protože absorbance při zvolené vlnové délce je součtem absorbancí obou látek. Pokud je koncentrace druhé, překážející složky známá, nebo pokud lze experiment uspořádat tak, aby byla konstantní ve všech vzorcích, lze tuto situaci vyřešit pomocí vhodných slepých vzorků. V některých případech je však nutné postupovat metodami tzv. multikomponentní analýzy spektra. Obvykle se neměří při jedné vlnové délce, ale proměřuje se určitá spojitá část spektra, nebo se přinejmenším měří při několika vlnových délkách. Jsou-li známé extinkční koeficienty jednotlivých látek absorbujících v dané oblasti při různých vlnových délkách (nebo ještě lépe, jsou-li známá absorpční spektra jednotlivých složek směsi), lze koncentraci analytu vypočítat řešením soustavy rovnic. V nejjednodušším případě je třeba stanovit koncentraci jedné látky, přičemž její absorpční spektrum (na Obr. 4 tečkovaně) překrývá spektrum jiné ve vzorku přítomné látky (čárkovaně). Měřením vzorku získáme spektrum, které je součtem obou absorpčních spekter (plnou čarou). I když víme, že stanovovaná látka má absorpční maximum při vlnové délce λ 1, nemůžeme stanovit její koncentraci přímo, neboť při této vlnové délce nelze zanedbat absorbanci druhé látky. Známe-li však tvar absorpčního spektra druhé látky, můžeme najít vlnovou délku, při které absorbuje stejně, jako při vlnové délce λ 1 (označme ji λ 2), tj. extinkční koeficient je pro λ 1 a λ 2 stejný. Potom absorbance samotné stanovované látky bude A = A(λ 1) A(λ 2). absorbance λ λ 1 2 vlnová délka Obr. 4: Příklad multikomponentní analýzy. Jiná zajímavá situace nastává, pokud látka, která má určité spektrum, se v průběhu nějaké reakce mění na jinou látku, která má jiné spektrum, ale obě spektra se částečně překrývají. Příkladem mohou být spektra NAD + a NADH (stanovení těchto koenzymů se využívá při měření aktivity řady enzymů pomocí tzv. Warburgova optického testu). V tomto případě jsou absorpční maxima dostatečně daleko od sebe, takže stanovení jednotlivých forem koenzymu je jednoduché. Užitečná však může být skutečnost, že všechna spektra pro různé poměry NAD + /NADPH (při konstantní celkové koncentraci) se kříží. To je způsobeno tím, že při vlnové délce 281 nm má NAD + i NADH stejný extinkční koeficient. Průsečík spekter se nazývá isosbestický bod (z řeckého isos = stejný a sbennými = zháším) a měřením absorbance v tomto bodě snadno zjistíme celkovou koncentraci NAD + a NADH, aniž bychom potřebovali znát aktuální poměr koncentrací obou složek. 7

8 NAD NADH Absorbance isosbestický bod Vlnová délka (nm) Obr. 5: Isosbestický bod Řadu dalších dat lze získat vhodným matematickým zpracováním naměřených spekter. Při měření složitějších soustav může pomoci derivační spektrofotometrie, která umožní po vyhodnocení prvních a druhých derivací spekter podle vlnové délky např. najít přesné polohy absorpčních maxim apod. Rovněž pro zpracování kinetických měření je nezbytné matematické zpracování získaných dat. Přesnost fotometrických metod Většina fotometrů může měřit absorbanci v rozmezí 0 až 3 nebo 4. To však neznamená, že by měření v celém tomto rozsahu bylo rozumné. Za předpokladu, že náhodná chyba detektoru bude mít stále stejné vlastnosti, bude mít průměrná relativní chyba měření absorbance v závislosti na skutečné absorbanci vzorku průběh zakreslený na Obr. 6 (dále vpravo prudce poroste). Z grafu je zřejmé, že nejlepších výsledků dosáhneme, bude-li se absorbance vzorku pohybovat v rozmezí 0,2 až 0,8, za rozumné lze považovat měření v rozsahu 0,2 až 1,2. Je-li absorbance vyšší, je vhodné vzorek ředit. Konkrétní hodnoty samozřejmě závisejí na vlastnostech použitého fotometru, ovšem průběh průměrné relativní chyby jako funkce absorbance bude stále stejný (liší se jen roztažení křivky). Průměrná relativní chyba měření 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 Absorbance Obr. 6: Závislost průměrné relativní chyby fotometrického měření na absorbanci vzorku. 8

9 Přesnost měření je velmi ovlivněna i přípravou vzorku a kyvety. Vzhledem k tomu, že spektrofotometrie je dnes zdaleka nejrozšířenější analytickou metodou v biochemii, uvádíme na tomto místě aspoň nejdůležitější zásady přesné práce při fotometrickém měření: je třeba měřit ve vhodné kyvetě, zvolená vlnová délka musí ležet v pásmu, pro které je kyveta určena měří-li se ve více kyvetách, měly by mít všechny stejný faktor. Plastové kyvety by měly být všechny ze stejné šarže. kyvety pro vzorky i blanky musejí být čisté. To lze ověřit tak, že naplněné destilovanou vodou dají všechny stejnou absorbanci. s kyvetami je třeba pracovat tak, aby nedošlo ke znečištění optických ploch (např. dotykem prstů). Totéž platí i pro mikrotitrační destičky. kyveta musí být zvenčí suchá, uvnitř nesmějí zůstat bublinky vzduchu, měřený roztok musí být homogenní. Kapka stékající po kyvetě, bublinky nebo plovoucí sraženina v měřeném roztoku se projeví obvykle tím, že se naměřená absorbance neustále mění. kyveta musí být vzorkem dostatečně naplněná. měří-li se více vzorků postupně v jedné kyvetě, je třeba pracovat tak, aby chyba způsobená zbytky předchozího roztoku byla co nejmenší. Obvykle se kyveta mezi vzorky vyplachuje destilovanou vodou a pak se co nejlépe vysuší. Přesnějších výsledků dosáhneme, pokud se kyveta po vymytí ještě propláchne malým množstvím vzorku, který se vylije a pak teprve se kyveta naplní potřebným množstvím vzorku pro měření. Pokud se pracuje s několika podobnými roztoky, může být přesnější kyvety mezi nimi neproplachovat destilovanou vodou, jen je co nejlépe vylít a vysušit. při měření v kyvetách je podstatná koncentrace barevné látky v roztoku, při přípravě vzorku je proto nejdůležitější dodržet poměr jednotlivých složek. Je vhodné uspořádat pokus tak, aby se všechny složky pipetovaly pokud možno stejnou pipetou, nejlépe pevně nastavenou. Měří-li se v mikrotitračních destičkách, je naopak rozhodující látkové množství barevné látky ve vzorku. Proto je třeba pokus uspořádat tak, aby byl do jamky co nejpřesněji odměřen analyt. Velkou chybu může také způsobit různý tvar hladiny v jednotlivých jamkách, všechny vzorky by proto měly mít stejnou afinitu ke stěnám destičky, případně je vhodné desku před měřením krátce promíchat, aby se zajistilo smočení stěn i nad hladinou roztoku. Nefelometrie a turbidimetrie Kromě absorpce může při průchodu světla vzorkem docházet také k jeho rozptylování, pokud jde o disperzní nebo koloidní soustavu. Toho se vyžívá v technikách nefelometrie (řecky nefelé = mrak), kdy se měří intenzita světla rozptýleného pod určitým úhlem, a turbidimetrie (latinsky turba = nepořádek, tlačenice, dav), měří-li se intenzita světla procházejícího vzorkem v původním směru. Obě metody jsou vzájemně zrcadlové, budeme se proto dále zabývat jen turbidimetrií: lze ji uskutečnit pomocí obvyklého fotometrického vybavení a úbytek světla rozptylem při průchodu vzorkem se dá snadno popsat pomocí absorbance a dalších veličin obvyklých ve fotometrii. nefelometrie vzorek turbidimetrie Obr. 7: Nefelometrie a turbidimetrie Množství rozptýleného světla závisí na 1. koncentraci částic. V širokém rozsahu koncentrací jde přitom o závislost lineární, takže lze pracovat zcela analogicky fotometrickým metodám s využitím Lambertova-Beerova zákona. Veličina odpovídající absorbanci se jmenuje turbidita. 2. velikosti částic. Množství rozptýleného světla je přibližně nepřímo úměrné molekulové hmotnosti částice. 9

10 3. vlnové délce světla. Čím kratší je vlnová délka, tím větší podíl světla bude rozptýlen (Tyndallův jev), intenzita rozptýleného světla roste přibližně se čtvrtou mocninou převrácené hodnoty vlnové délky. V praxi se jako nejvýhodnější používají vlnové délky od 340 do 450 nm, krátkovlnnější světlo bývá pohlceno bílkovinami, které jsou v biologických vzorcích zpravidla přítomny. Při turbidimetrických metodách bývá nejobtížnější vytvořit dostatečně stabilní suspenzi, která by byla stálá po celou dobu měření. Proto se do reakčních směsí přidávají ochranné koloidy, nejčastěji polyetylenglykol. Turbidimetrie a nefelometrie se požívají nejčastěji v imunochemických metodách k vyhodnocování imunoprecipitačních reakcí, kde zákal tvoří komplexy antigen-protilátka. Plamenová emisní fotometrie Stanovení některých prvků, např. sodíku, draslíku či lithia, lze provést měřením intenzity světla určité vlnové délky emitovaného po excitaci vzorku plamenem. Roztok analytu se rozpráší na jemnou mlhu (tzv. atomizace), která se přivádí do bezbarvého plamene (propanového nebo acetylenového). Pro zajištění spolehlivých výsledků je nutné použít vnitřní standard (obvykle soli lithia nebo draslíku). Vzhledem k náročnosti měření, obtížné automatizaci a problematické interpretaci některých výsledků není dnes v klinické biochemii plamenová fotometrie rozšířena. Atomová absorpční fotometrie Jde o další optickou metodu vhodnou ke stanovení kovových prvků. Využívá se absorpce světla viditelné nebo UV oblasti volnými atomy prvku. I v tomto případě je vzorek nejprve atomizován, tentokrát při vysoké teplotě, a posléze jím prochází světlo určité vlnové délky. Jako detektor se většinou používá fotonásobič. Metoda není příliš rozšířena kvůli přístrojové náročnosti, je však těžko zastupitelná např. při stanovení stopových prvků jako je měď či zinek. Luminiscenční metody Mezi technicky náročnější, avšak velmi citlivé optické metody patří postupy, které využívají světla emitovaného stanovovanou látkou. Přísně vzato by sem patřila i výše uvedená plamenová emisní fotometrie, při níž je elektron excitován do vyššího energetického stavu plamenem a při návratu na nižší energetickou hladinu emituje světlo. Většinou se však elektron excituje zářením (fotoluminiscence, využívá se při fluorimetrii, a fosforescence), nebo látka s excitovaným elektronem vzniká v chemické reakci (chemiluminiscence, využívá se v luminimetrii). Fluorimetrie a spektrofluorimetrie Fluorimetrie využívá jevu fotoluminiscence. Fluoreskující látka je excitována monochromatickým světlem, čímž se některý z valenčních elektronů vybudí do vyšší energetické hladiny. Při návratu zpět do původního energetického stavu promaří část energie jako teplo, část vyzáří ve formě fotonu. Energie emitovaného záření je proto vždy nižší než energie záření excitačního, tj. emitované světlo má větší vlnovou délku. Emitované světlo se snímá zpravidla ve směru kolmém na excitační paprsek a po průchodu emisním monochromátorem se jeho intenzita měří fotonásobičem. Většina fluorimetrů používá jako excitační i emisní monochromátory interferenční filtry. Dražší přístroje jsou vybaveny optickými mřížkami, takže lze plynule nastavovat excitační i emisní vlnovou délku. V tom případě se hovoří o spektrofluorimetrii. Ve srovnání s fotometrickými metodami má spektrofluorimetrie vyšší specifičnost (kromě absorpčního, tj. excitačního spektra se bere v úvahu i emisní spektrum látky) i citlivost (díky fotonásobiči lze měřit velmi malé intenzity světla a jelikož se měří ve směru kolmém na excitaci a při jiné vlnové délce, než kterou se excituje, je emitované světlo minimálně znečištěno excitačním zářením). Metoda však naneštěstí skrývá řadu technických úskalí: fluorescenční činidla jsou často velmi citlivá na minimální změny ph, iontové síly či polarity, na přítomnost oxidačních činidel či tzv. zhášečů (látek, které umožní sestup excitovaného elektronu do základní energetické hladiny, aniž by vyzářil foton často to jsou např. stopová množství některých přechodných kovů), navíc je nutné poměrně nákladné a složité zařízení. 10

11 Analytické možnosti spektrofluorimetrie lze dále rozšířit zařazením polarizačních filtrů do excitační i emisní části zařízení tzv. polarizační fluorimetrie. Tato technika využívá skutečnosti, že excitovaný elektron se vrací do základního stavu s určitým zpožděním. Pokud by toto zpoždění bylo zcela zanedbatelné a fluoreskující látka by byla excitována polarizovaným světlem, zůstalo by emitované světlo ve stejné polarizační rovině. Jestliže však čas mezi excitací a vyzářením fotonu nelze zanedbat, ztrácí emitované světlo částečně svůj polarizovaný charakter, neboť excitované molekuly fluoreskující látky v roztoku rotují. Malé molekuly přitom mohou rotovat rychleji než velké, takže pomocí polarizační fluorimetrie lze usuzovat na velikost fluoreskující molekuly. Toho se využívá např. v imunochemii, kde lze tímto způsobem rozlišit mezi malou volnou fluorescenčně značenou protilátkou a velkým komplexem této protilátky s antigenem. Zejména ve výzkumu se používá celá řada dalších variant spektrofluorimetrie: zajímavá data lze např. získat, pokud je vzorek osvětlován velmi krátkými záblesky světla a měří se časový průběh fluorescence, spektrofluorimetr lze připojit k fluorescenčnímu mikroskopu, chromatografu, podobně jako v případě fotometrie lze měřit ve speciálních mikrotitračních destičkách apod. Luminimetrie Při chemiluminiscenci jsou elektrony excitovány chemickou reakcí. Musí jít o děj výrazně exoergní, téměř výlučně jde o oxidace. Přitom se však uvolněná energie nesmí uvolnit jako teplo. Některé látky dokáží část energie vyzářit ve formě fotonu přímo, což se projeví krátkým světelným zábleskem, v ostatních případech je nutné přidat do soustavy další látku, na kterou se energie přenese a která pak (zpravidla řadu sekund až minut) emituje světlo. Může jít o syntetické luminofory nebo o přírodní enzym luciferázu světlušek pak se mluví o bioluminiscenci. Konečně je možné použít oxidace vhodné látky elektricky na anodě, což se označuje jako elektrochemiluminiscence. Luminimetrické metody bývají rovněž poměrně citlivé. Luminimetry jsou principiálně podobné emisní části fluorimetru. Jako monochromátor používají často filtry, coby detektor bývá obvykle zapojen fotonásobič. Polarimetrie Některé látky jsou opticky aktivní, tj. stáčejí rovinu polarizovaného světla, které jimi prochází. Z chemického hlediska se tyto látky vyznačují přítomností tzv. chirálního centra u biochemicky významných molekul jde o atom uhlíku, na který jsou připojené čtyři různé substituenty (tj. látka je nesymetrická). Objasnit, proč nesymetrické látky stáčejí rovinu polarizovaného světla, je bez hlubšího fyzikálního výkladu obtížné. Spokojme se tedy s konstatováním, že rovinně polarizované světlo vzniká složením dvou cirkulárně polarizovaných záření, která se liší jen směrem otáčení. Silová pole nesymetrických látek jsou také nesymetrická a proto budou s každým z těchto cirkulárně polarizovaných záření interagovat rozdílně každá složka se bude šířit jinou rychlostí. Jinými slovy, opticky aktivní prostředí má jiný index lomu pro levotočivě a pravotočivě polarizované světlo. Jejich opětovným složením po průchodu látkou dostaneme znovu rovinně polarizované světlo, rovina polarizace však bude pootočená. Dá se ukázat, že úhel, o který se stočí, lze jednoduše vyjádřit vztahem l n α = 180, λ kde α je úhel ve stupních, l je tloušťka vrstvy opticky aktivního prostředí, n je rozdíl indexů lomu pro levotočivě a pravotočivě cirkulárně polarizované světlo a λ je vlnová délka procházejícího světla. Optickou otáčivost látek můžeme měřit pomocí polarimetru. Monochromatické světlo (např. ze sodíkové výbojky) prochází polarizačním filtrem (polarizátor). Polarizované světlo prochází kyvetou naplněnou měřeným vzorkem. Optická aktivita látky se pak vyhodnocuje pomocí druhého polarizačního filtru (analyzátoru), který je upevněn v otočné objímce. Podle polohy analyzátoru a roviny polarizovaného světla prošlého vzorkem se mění intenzita světla v okuláru přístroje. Po nalezení otočení analyzátoru, při němž je intenzita prošlého světla největší, se na stupnici odečte vzájemná pozice obou polarizačních filtrů. Pro usnadnění práce u některých přístrojů dopadá světlo, které prošlo celou soustavou, jen na část zorného pole. Zbytek zorného pole je osvětlen zářením, které neprošlo polarizátorem (ale prošlo vzorkem a analyzátorem). Při správném nastavení analyzátoru pak obě části zorného pole svítí stejně. 11

12 zdroj světla kyveta polarizátor analyzátor Obr. 8: Polarimetrie. Pro srovnání optické aktivity různých látek je vhodné vztáhnout úhel stočení roviny polarizovaného světla na jednotkovou koncentraci. Podle způsobu, jakým koncentraci vyjádříme, se definuje specifická a molární otáčivost. Specifickou otáčivost [α] dostaneme vydělením úhlu stočení roviny polarizovaného světla α délkou kyvety l a hmotnostní koncentrací w [ α ] = α, l w molární otáčivost [Φ] pak získáme obdobně pro látkovou koncentraci c [ Φ] α =. l c Obě konstanty jsou pro danou látku závislé na teplotě a vlnové délce použitého světla. Mají rozměr kg -1 m 2, resp. mol -1 m 2 ; v literatuře zpravidla bývají tabelovány se 100 menšími jednotkami. 12