PLATELIA CMV IgM TESTŮ

Transkript

1 PLATELIA CMV IgM TESTŮ KVALITATIVNÍ STANOVENÍ IgM PROTILÁTEK PROTI CYTOMEGALOVIRU V LIDSKÉM SÉRU NEBO PLAZMĚ POMOCÍ ENZYMOVÉ IMUNOANALÝZY 1. POUŽITÍ Platelia CMV IgM je imunoanalýza využívající imunologické vychytávání pro kvalitativní stanovení IgM protilátek proti cytomegaloviru v lidském séru nebo plazmě. 2. KLINICKÝ VÝZNAM Lidský cytomegalovirus (CMV) je všudypřítomný virus, který se nachází ve všech geografických oblastech světa a ve všech socioekonomických skupinách. CMV je (rodiny)rodu herpetických virů a je přenášen cestou biologických tekutin během úzkých mezilidských kontaktů (moč, sliny, mateřské mléko, krev, slzy, sperma a vaginální sekrety). Po infekci může CMV zůstávat v těle nakaženého pacienta latentní po několik let a poté se může reaktivovat a způsobit opakující se infekce s možným přenosem na ostatní jedince. K primární infekci může dojít různými cestami přenosu a v různých obdobích života (kongenitální infekce, postnatální infekce). Po uplynutí fáze latence může dojít k sekundární infekci buď cestou reinfekce exogenním virem nebo reaktivací latentního viru. 50 až 85 % populace je infikováno před dosažením dospělosti, ale většina infekcí zůstává asymptomatických a pouze u 2 % pacientů se objeví atypické symptomy, jako například horečka, astenie, bolesti svalů či kloubů. CMV infekce však může být závažná, když postihne těhotné ženy, novorozence nebo imunokompromitované hostitele. V průběhu těhotenství je 1 až 3 % žen infikováno CMV a fetální přenos placentární difúzí je pozorován u 40 až 50 % pacientů. 95 % fetálních infekcí není symptomatických, ale u 5 % dochází k velmi závažným komplikacím: hepatosplenomegálie, microcephalus, hydrocephalus, nedonošenost, psychomotorická retardace a úmrtí plodu. U 10 % asymptomatických infekcí se u novorozenců projeví opožděné komplikace, jako například částečná nebo úplná hluchota nebo slepota. U imunokompromitovaných pacientů (AIDS, příjemců transplantovaných orgánů, pacientů s lymfoproliferativními onemocněními či rakovinou) jsou závažné komplikace spojené s diseminovanou anebo viscerální infekcí: splenomegalie, chorioretinitida, hepatitida, pneumonie, myokarditida, encefalitida. U těchto pacient může být infekce smrtelná. Několik týdnů po CMV infekci vede imunitní odpověď k objevení se specifických IgM protilátek, což je o několik dnů později následováno objevením se specifických IgG protilátek. Sérologická diagnóza CMV infekce je prokázána sérokonverzí nebo významným vzestupem titru IgG. Detekce specifických anti-cmv IgM protilátek je užitečná k potvrzení diagnózy primárních nebo kongenitálních CMV infekcí. 3. PRINCIP Platelia CMV IgM je kvalitativní test určený k detekci IgM protilátek proti cytomegaloviru v lidském séru nebo plazmě enzymovou imunoanalýzou s vychytáváním IgM na pevné fázi. Pevná fáze) je potažena protilátkami proti lidským µ-řetězcům (jamky na mikrodestičce). Směs antigenu CMV a monoklonální protilátky proti antigenu CMV značená peroxidázou se užívá jako konjugát. Test probíhá dle následujících kroků: Krok 1 Vzorky pacientů, kalibrátor a kontroly se naředí 1:21 a poté se napipetují do jamek v mikrodestičce. V průběhu inkubace trvající 1 hodinu při 37 C se IgM protilátky přítomné ve vzorku navážou na anti-µ protilátky, kterými jsou potaženy jamky mikrodestičky. Po inkubaci se promýtím odstraní IgG a ostatní sérové proteiny. Krok 2 Konjugát (směs CMV antigenu a monoklonální protilátky anti-cmv značené peroxidázou) se napipetuje do jamek mikrodestičky. Během jednohodinové inkubace při 37 C se konjugát naváže na specifické IgM anti-cmv protilátky, které jsou posléze vychytávány na mikrodestičku. Nenavázaný konjugát je na konci inkubace odstraněn promytím. Krok 3 Přítomnost imunokomplexů (protilátky proti lidským µ-řetězcům - IgM anti-cmv - CMV antigen - monoklonální protilátka anti- CMV značená peroxidázou) se prokazuje přidáním roztoku chromogenu do každé jamky. Krok 4 Po inkubaci při pokojové teplotě (18 30 C) se enzymatická reakce zastaví přidáním 1N roztoku kyseliny sírové. Hodnota optické denzity získaná spektrofotometrem nastaveným na 450/620 nm je úměrná množství IgM protilátek proti CMV přítomných ve vzorku. 1

2 4. SLOŽENÍ SOUPRAVY Dodávaná množství činidel byla vypočtena tak, aby umožnila 96 testů. Všechna činidla jsou určena výhradně pro diagnostické použití in vitro. Označení Složení reagencií Množství R1 Mikrodestička Mikrodestička (hotová k použití): 12 proužků s 8 oddělitelnými jamkami potaženými protilátkami proti lidským µ řetězcům R2 Koncentrovaný promývací roztok (20x) Koncentrovaný promývací roztok (20x): TRIS-NaCl pufr (ph 7,4), 2 % Tween 20 R3 Negativní kontrola Negativní kontrola: Lidské séru negativní na IgM protilátky proti CMV a negativní na HBs antigen, anti-hiv1, anti- HIV2 a anti-hcv. R4 Kalibrátor Kalibrátor: Lidské sérum reaktivní na IgM protilátky proti CMV a negativní na HBs antigen, anti-hiv1, anti- HIV2 a anti-hcv. R5 Pozitivní kontrola Pozitivní kontrola: Lidské sérum reaktivní na IgM protilátky proti CMV a negativní na HBs antigen, anti-hiv1, anti- HIV2 a anti-hcv. R6a Antigen CMV antigen: Lyofilizovaný CMV antigen R6b Konjugát (101x) Konjugát (101x): Myší monoklonální protilátka anti-cmv značená peroxidázou. R7 Ředicí roztok Ředicí roztok pro vzorky a konjugát (hotový k použití): Tris-NaCl pufr, fetální telecí sérum, kozí sérum, myší IgG, fenolová červeň. R9 Chromogen TMB Chromogen (hotový k použití): tetramethylbenzidin (< 0,1%), H 2 O 2 (<1%) R10 Zastavovací roztok Zastavovací roztok (hotový k použití): 1N roztok kyseliny sírové 1 1 x 70 ml 1 x 0,75 ml 1 x 0,75 ml 1 x 0,75 ml 6 x 4,5 ml 1 x 0,4 ml 1 x 80 ml 1 x 28 ml 1 x 28 ml Samolepící fólie 4 Podmínky uchovávání a datum exspirace jsou uvedeny v nápisech na krabici. 5. UPOZORNĚNÍ A BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ Spolehlivost výsledků závisí na správném dodržování následujících pravidel Správné laboratorní praxe: Nepoužívejte činidla po datu exspirace. Během jednoho cyklu nemíchejte ani nepřidávejte činidla z různých šarží. POZNÁMKA: u promývacího roztoku (R2, označení na štítku: 20x zelené barvy), Chromogenu (R9, označení na štítku: TMB tyrkysové barvy) a zastavovacího roztoku (R10, označení na štítku: 1N červené barvy) je možné použít jiné šarže než ty, které jsou obsaženy v soupravě za předpokladu, že jsou tato činidla zcela stejná a stejné šarže jako ta, která se použijí pro daný běh testu. POZNÁMKA: navíc může být promývací roztok (R2, označení na štítku: 20x zelené barvy) smíchán s 2 jinými promývacími roztoky obsaženými v různých soupravách činidel Bio-Rad (R2, označení na štítku: 10x modré barvy nebo 10 x oranžové barvy), jestliže je správně naředěný a za předpokladu, že je během daného cyklu testu použita pouze jedna směs. Před použitím vyčkejte 30 minut, aby činidla dosáhla pokojové teploty (18 30 C). Činidla pečlivě rozpusťte, nebo nařeďte tak, abyste zamezili jakékoli kontaminaci. Neprovádějte test v přítomnosti reaktivních výparů (výpary kyseliny, zásady či aldehydu) nebo prachu, které by mohly změnit enzymovou aktivitu konjugátu. Používejte sklo důkladně umyté a opláchnuté deionizovanou vodou nebo nejlépe materiál pro jednorázové použití. Promytí mikrodestičky je kritickým krokem pracovního postupu: dodržujte doporučený počet promývacích cyklů a ujistěte se, že všechny jamky byly zcela naplněny a poté zcela vyprázdněny. Nesprávné promytí může způsobit nepřesné výsledky. Nedovolte, aby mikrodestička mezi koncem procesu promývání a pipetování činidla vyschla. Nikdy nepoužívejte stejnou nádobku pro pipetování konjugátu a chromogenu. Enzymatická reakce je velmi citlivá na kov nebo ionty kovu. Proto nedovolte, aby jakýkoli kovový prvek přišel do kontaktu s různými roztoky, které obsahují konjugát nebo chromogen. Roztok chromogenu (R9) musí být bezbarvý. Vznik modré barvy znamená, že se nesmí činidlo použít a musí být vyměněno. Pro každý vzorek použijte novou pipetovací špičku. Zkontrolujte přesnost a správnou funkci pipet a ostatního vybavení. 2

3 BEZPEČNOSTNÍ PŘEDPISY A OCHRANA ZDRAVÍ Materiál lidského původu použitý při přípravě činidel byl testován a shledán nereaktivním na povrchový antigen viru hepatitidy B (HBsAg), protilátky proti viru hepatitidy C (anti-hcv) a viru lidské imunodeficience (anti-hiv1 a anti-hiv2). Protože žádná metoda nemůže zcela zaručit nepřítomnost infekčních agens, musí být s činidly lidského původu a vzorky pacientů zacházeno tak, jako by byly potenciálně schopné přenést infekční onemocnění: Jakýkoli materiál, včetně promývacích roztoků, který je v přímém kontaktu se vzorky a činidly obsahujícími materiál lidského původu, musí být považován za schopný přenášet infekční onemocnění. Při manipulaci se vzorky a činidly noste rukavice na jednorázové použití. Nepipetujte ústy. Zabraňte rozlití vzorků nebo roztoků obsahujících vzorky. Rozlité vzorky musí být omyty chlornanem sodným naředěným na 10 %. V případě rozlití kyseliny musí být tato nejprve neutralizována hydrouhličitanem sodným a poté omyta chlornanem sodným naředěným na 10 % a vysušena adsorpčním papírem. Materiál použitý k čištění musí být likvidován do nádoby na kontaminovaný odpad. Pacientské vzorky, činidla obsahující materiál lidského původu a také kontaminovaný materiál a produkty musí být likvidovány až po dekontaminaci: - buď ponořením do chlornanu sodného o konečné koncentraci chlornanu sodného 5 % po dobu 30 minut, - nebo autoklávováním při teplotě 121 C po dobu minimálně 2 hodin. POZOR: roztoky, které obsahující chlornan sodný nesmí být vkládány do autoklávu. Zabraňte jakémukoli kontaktu činidel, včetně těch, které nejsou považovány za nebezpečné, s kůží nebo sliznicemi. S chemickým a biologickým odpadem musí být manipulováno a musí být likvidován v souladu s pravidly správné laboratorní praxe. Všechna činidla soupravy jsou určena výhradně pro diagnostické použití in vitro. Upozornění: Některá činidla obsahují ProClin 300 < 1,5 %. R43: Může vyvolat senzibilizaci při styku s kůži. S28-37: Při styku s kůží okamžitě omyjte velkým množstvím vody s mýdlem. Používejte vhodné ochranné rukavice. 6. VZORKY 1. Doporučenými typy vzorků jsou sérum nebo plazma (EDTA, heparin nebo citrát). 2. Pro manipulaci, zpracování a uchovávání krevních vzorků dodržujte následující doporučení: Při odběru krevních vzorků dodržujte rutinní bezpečnostní opatření pro venepunkci. U séra ponechte vzorky, aby se před odstředěním zcela srazily. Zkumavky udržujte vždy zazátkované. Po odstředění oddělte sérum nebo plazmu od sraženiny nebo červených krvinek do těsně zazátkované skladovací zkumavky. Bude-li test proveden během 7 dnů, mohou být vzorky uchovávány při teplotě 2-8 C. Nebude-li test dokončen během 7 dnů nebo pro přepravu, zmrazte vzorky na teplotu -20 C nebo nižší. Nepoužívejte vzorky, které byly rozmraženy více než třikrát. Dříve zmrazené vzorky musí být po rozmrazení před testováním důkladně promíchány (třepačka Vortex). 3. U vzorků obsahujících 90 g/l albuminu nebo 100 mg/l nekonjugovaného bilirubinu, lipemických vzorků obsahujících ekvivalent 36 g/l triglyceridu a hemolyzovaných vzorků obsahujících až 10 g/l hemoglobinu, nejsou výsledky ovlivněny. 4. Vzorky nezahřívejte. 7. PROVEDENÍ TESTU 7.1 Potřebný materiál, který není součástí dodávky Třepačka Vortex. Spektrofotometr pro mikrodestičky vybavený filtry 450 nm a 620 nm (*). Inkubátor pro mikrodestičky s termostatem nastavitelným na 371 C (*). Automatická, poloautomatická nebo ruční promývačka mikrodestiček (*). Sterilní destilovaná nebo deionizovaná voda. Rukavice na jednorázové použití. Brýle nebo ochranné brýle. Savý papír. Automatické nebo poloautomatické, nastavitelné nebo fixní pipety nebo multipipety k měření a pipetování 10 µl až 1000 µl a 1 ml, 2 ml a 10 ml. Odměrné válce o objemu 25 ml, 50 ml, 100 ml a 1000 ml. Chlornan sodný a hydrouhličitan sodný. Nádoba na biologicky nebezpečný odpad. Zkumavky na jednorázové použití. (*) Pokud požadujete detailní informace o doporučeném vybavení, kontaktujte naše technické oddělení. 7.2 Příprava činidel R1: před otevřením sáčku ponechte 30 minut při pokojové teplotě (18 30 C). Vyjměte rámeček, nepoužité stripy okamžitě vraťte do sáčku a zkontrolujte přítomnost pohlcovače vlhkosti. Pečlivě znovu uzavřete sáček a uchovávejte při teplotě 2 8 C. R2: nařeďte promývací roztok R2 destilovanou vodou v poměru 1:20: např. k získání promývacího roztoku hotového k použití smíchejte 50 ml R2 a 950 ml destilované vody. Pro jednu destičku s 12 stripy při ručním promývání připravte 350 ml naředěného promývacího roztoku. 3

4 R3, R4, R5: nařeďte ředícím roztokem (R7) v poměru 1:21 (například: 300 µl R µl kalibrátoru nebo kontroly). R6a: CMV antigen je lyofilizovaný. Pro běh cyklu se 2 stripy rozpusťte lyofilizovaný antigen v jedné lahvičce přidáním 4,5 ml ředicího roztoku (R7). Důkladně promíchejte. Po naředění musí být roztok antigenu (R6a+R7) naprosto čirý. R6 (R6a+R6b) Pracovní roztok konjugátu: do každé lahvičky s rozpuštěným CMV antigenem (R6a+R7) přidejte 45 µl konjugátu (R6b). Důkladně promíchejte. Pracovní roztok konjugátu musí být použít ihned po přípravě. 7.3 Uchovávání a exspirace otevřených a/nebo naředěných činidel Souprava musí být uchovávána při teplotě 2 8 C. Je-li před otevřením souprava uchovávána při teplotě 2 8 C, může být každá složka použita do data exspirace uvedeného na vnějším obalu soupravy. R1: po otevření zůstávají stripy stabilní do 8 týdnů, jestliže jsou uchovávány při teplotě 2 8 C ve stejném, pečlivě uzavřeném sáčku (zkontrolujte přítomnost pohlcovače vlhkosti R2: po naředění může být promývací roztok uchováván po dobou 2 týdnů při teplotě 2 30 C. Po otevření je koncentrovaný promývací roztok uchovávaný pří teplotě 2 30 C stabilní do data exspirace uvedeného na štítku, pokud nedošlo ke kontaminaci. R3, R4, R5, R6b, R7: pokud byla tato činidla po otevření a bez jakékoli kontaminace uchovávána při teplotě 2 8 C, jsou stabilní po dobu 8 týdnů. R6 (R6a+R6b): pracovní roztok konjugátu je nutno použít ihned po přípravě. R9: po otevření a bez jakékoli kontaminace je reagencie uchovávaná při teplotě 2 8 C je stabilní po dobu 8 týdnů R10: po otevření a bez jakékoli kontaminace je reagencie uchovávaná při teplotě 2 8 C stabilní do data exspirace uvedeného na štítku. 7.4 Pracovní postup Dodržujte přísně pracovní postup testu a zásady správné laboratorní praxe. Před použitím nechte činidla dosáhnou pokojové teploty (18 30 C). Použití oddělitelných jamek vyžaduje při manipulaci zvláštní pozornost. K ověření výsledků testu použijte při každém cyklu všechny kalibrátory a kontroly. 1. Pečlivě připravte plán rozmístění a identifikace kalibrátorů, kontrol a pacientských vzorků. 2. Připravte naředěný promývací roztok (R2) [viz odstavec 7.2]. 3. Vyjměte rámeček a stripy (R1) z ochranného sáčku [viz odstavec 7.2]. 4. V jednotlivě označených zkumavkách nařeďte kalibrátor a kontroly (R3, R4, R5) a pacientské vzorky (S1, S2 ) ředicím roztokem (R7), na ředění 1:21: 300 µl ředicího roztoku (R7) a 15 µl vzorku. Promíchejte naředěné vzorky. 5. Do každé jamky napipetujte 200 µl naředěných kalibrátorů, kontrol a pacientských vzorků přesně podle níže uvedeného pořadí: A R3 S5 S13 B R4 S6 C R4 S7 D R5 S8 E S1 S9 F S2 S10 G S3 S11 H S4 S12 6. Mikrodestičku přelepte samolepící fólií pro destičky a poté na destičku silně zatlačte, abyste zajistili těsné uzavření. Mikrodestičku ihned inkubujte v termostatem řízené vodní lázni nebo v suchém inkubátoru 1 hodinu ± 5 minut při 37 C ± 1 C. 7. Připravte pracovní roztok konjugátu R6 (R6a+R6b) [viz odstavec 7.2]. 8. Na konci první inkubační obdoby odstraňte z destičky přilnavou fólii. Odsajte obsah všech jamek do nádoby na biologicky nebezpečný odpad (obsahující chlornan sodný). Mikrodestičku 4-krát promyjte 350 µl promývacího roztoku (R2). Mikrodestičku otočte a jemně poklepte na adsorpční papír, abyste odstranili zbývající tekutinu. 9. Do všech jamek okamžitě napipetujte 200 µl pracovního roztoku konjugátu (R6). Před použitím musí být roztok jemně protřepán. 10. Mikrodestičku přelepte přilnavou fólií a poté na destičku silně zatlačte, abyste zajistili těsné uzavření. Mikrodestičku ihned inkubujte v termostatem řízené vodní lázni nebo v suchém inkubátoru 1 hodinu ± 5 minut při 37 C ± 1 C. 11. Na konci druhé inkubační doby odstraňte přilnavou fólii z destičky. Odsajte obsah všech jamek do nádoby na biologicky nebezpečný odpad (obsahující chlornan sodný). Mikrodestičku 4-krát promyjte 350 µl promývacího roztoku (R2). Mikrodestičku otočte a jemně poklepte na adsorpční papír, abyste odstranili zbývající tekutinu. 12. Rychle do každé jamky mimo dosah přímého světla napipetujte 200 µl roztoku chromogenu (R9). Reakci nechte probíhat ve tmě při pokojové teplotě (18-30 C) 30 5 minut. V průběhu této inkubace nepoužívejte přilnavou fólii. 13. Enzymatickou reakci ukončete přidáním 100 µl zastavovacího roztoku (R10) do každé jamky.. Zachovejte stejný sled pipetování a časové intervaly jako při pipetování substrátového roztoku. 14. Opatrně otřete dno destičky. Změřte optickou denzitu na spektrofotometru pro mikrodestičky při 450/620 nm do 30 minut po zastavení reakce. Před měřením musí být stripy vždy uchovávány ve tmě. 15. Před nahlášením výsledků zkontrolujte soulad mezi měřením a distribučním plánem destičky a vzorků 4

5 8. INTERPRETACE VÝSLEDKŮ 8.1 Výpočet hodnoty cut-off (CO). Hodnota cut-off (CO) odpovídá průměrné hodnotě optických denzit (OD) cut-off duplikátů kontroly (R4): CO = průměr OD R4 8.2 Výpočet poměru vzorku Výsledek vzorku je vyjádřen poměrem pomocí následujícího vzorce: Poměr vzorku = OD vzorku/co 8.3 Kontrola kvality Začleňte kalibrátor a kontroly pro každou mikrodestičku a pro každý cyklus a analyzujte získané výsledky. Pro validaci analýzy musí být splněna následující kritéria: Hodnoty optické denzity: CO > 0,200 0,80 x CO < OD R4 duplikátu 1 < 1,20 x CO 0,80 x CO < OD R4 duplikátu 2 < 1,20 x CO (Jednotlivé OD každého duplikátu kontroly cut-off (R4) se nesmí lišit o více než 20 % hodnoty CO). Poměry optických denzit: Poměr R3 (OD R3 / CO) < 0,50 Poměr R5 (OD R5 / CO) > 1,60 Nejsou-li splněna kritéria kontroly kvality, musí být běh testu opakován. 8.4 Interpretace výsledků Poměr vzorku Výsledek Interpretace Poměr < 0,90 Negativní Vzorek je považován za nereaktivní na přítomnost IgM protilátek proti CMV. 0,90 poměr < 1,10 Nejednoznačný Vzorek je považován za nejednoznačný na přítomnost IgM protilátek proti CMV. Výsledek musí být potvrzen jiným testem provedeným na druhém vzorku odebraném nejméně 3 týdny po prvním vyšetření. Poměr 1,10 Pozitivní Vzorek je považován za pozitivní na přítomnost IgM protilátek proti CMV. Je-li podezření na akutní infekci, mohou být k potvrzení diagnózy užitečné jiné sérologické testy, jako například stanovení avidity IgG protilátek. 8.5 Návod k řešení problémů Nevalidované nebo neopakovatelné reakce jsou často způsobeny: Nedostatečným promytím mikrodestičky. Kontaminací negativních vzorků sérem nebo plazmou s vysokým titrem protilátek. Kontaminací substrátového roztoku chemickými oxidačními činiteli (chlornan sodný, kovové ionty). Kontaminací zastavovacího roztoku. 9. ÚČINNOST Účinnost testu Platelia CMV IgM byla hodnocena na 2 pracovištích při použití celkem 824 vzorků od těhotných žen a dárců krve. 9.1 Prevalence Prevalence anti-cmv IgM protilátek při použití testu Platelia CMV IgM byla stanovena na panelu 300 vzorků od těhotných žen z Paříže (Francie). 5 vzorků bylo pozitivních na anti-cmv IgM protilátky. Prevalence měřená testem Platelia CMV IgM je stanovena na 1,7 % (5/300). 9.2 Specificita Relativní specificita byla odhadnuta pomocí panelu 740 vzorků ze 2 míst situovaných ve Francii a rozdělených následovně: 252 sér od dárců krve 488 sér od těhotných žen 5

6 Výsledky byl porovnány s těmi, které byly získány pomocí dvou komerčních testů EIA, které byly považovány za referenční. Testovaná populace / pracoviště Počet sér Negativní Nejednoznačné Pozitivní Specificita Místo 1 Těhotné ženy Dárci krve Místo 2 Těhotné ženy Celkem *Pro výpočet specificity byly nejednoznačné výsledky hodnoceny jako pozitivní. [IS 95 %] = 95 % interval spolehlivosti. 99,0 % [96,5 99,9] (203/205) 98,8 % [96,6 99,7] (249/252) 99,7 % [98,1 100,0] (282/283) 99,2 % [98,2 99,7] (734/740) 9.3 Citlivost Relativní citlivost byla stanovena pomocí panelu 113 vzorků ze 2 míst situovaných ve Francii a rozdělených následovně: 35 vzorků od 16 jednotlivých pacientů vykazujících kinetiku CMV primoinfekce ( místo 2). 49 vzorků ze 3 komerčních sérokonverzních panelů (místo 1). 29 jednotlivých vzorků pozitivních na anti-cmv IgM protilátky ( místo 1). Výsledky byly porovnány s těmi, které byly získány pomocí dvou komerčních testů EIA, které byly považovány za referenční. Mezi 35 vzorky z CMV primoinfekcí byly pomocí těchto různých metod detekovány IgM protilátky u 29 vzorků. U všech z těchto 29 vzorků byly protilátky anti-cmv IgG s nízkou aviditou. 2 vzorky byly pozitivní na anti-cmv IgM protilátky v referenčním testu ale ne v testu Platelia CMV IgM. Tyto 2 vzorky měly anti-cmv IgG protilátky s prostřední aviditou a odpovídaly vzorkům odebraným krátce po začátku infekce. Výsledky získané na 3 sérokonverzních panelech byly následující: U jednoho panelu detekoval test Platelia CMV IgM protilátky anti-cmv IgM 10 dnů před referenčním testem. U jednoho panelu byla detekce protilátek anti-cmv IgM simultánní (nejistá u referenčního testu a pozitivní u testu Platelia CMV IgM). U jednoho panelu detekoval test Platelia CMV IgM protilátky anti-cmv IgM 3 dny po referenčním testu (nejisté u referenčního testu a negativní u testu Platelia CMV IgM). Nakonec 28 z 29 jednotlivých vzorků bylo potvrzeno jako pozitivních v testu Platelia CMV IgM a zbývající vzorek byl shledán nejistým. 9.4 Zkřížená reaktivita Panel 156 vzorků zahrnující 115 vzorků pozitivních na toxoplasmosu, zarděnky, EBV, HSV, VZV, příušnice, spalničky a HIV a 41 vzorků pozitivních na revmatoidní faktor, autoprotilátky, heterofilní protilátky a od pacientů s myelomem bylo testováno pomocí testu Platelia CMV IgM a komerčním testem EIA na screening protilátek anti-cmv IgM. Mezi těmito vzorky byly v testu Platelia CMV IgM pouze 2 pozitivní: 1 sérum pozitivní na IgG protilátky proti zarděnkám a negativní v referenčním testu, 1 sérum s revmatoidním faktorem ve shodě s referenčním testem. 9.5 Správnost Opakovatelnost: V průběhu stejného běhu testu byly30 x testovány jeden negativní a tři pozitivní vzorky pro hodnocení opakovatelnosti. Pro každý vzorek byl stanoven poměr (OD vzorku /CO). Průměrný poměr, směrodatná odchylka (SO) a variační koeficient (% VK) pro každý ze čtyř vzorků jsou uvedeny v níže uvedené tabulce: Přesnost během cyklu (opakovatelnost) N=32 Negativní vzorek Slabě pozitivní vzorek Pozitivní vzorek Silně pozitivní vzorek Poměr (OD vzorku/co) Průměr 0,11 1,13 1,90 3,75 SO 0,01 0,07 0,09 0,09 % VK 11,4 % 6,2 % 4,8 % 2,3 % Reprodukovatelnost: Pro hodnocení reprodukovatelnosti byly testovány čtyři vzorky (jeden negativní a tři pozitivní) v duplikátu ve dvou bězích za den během 20-ti denního období. Pro každý vzorek byl stanoven poměr (OD vzorku / CO). Průměrný poměr, směrodatná odchylka (SO) a variační koeficient (%VK) pro každý ze čtyř vzorků jsou uvedeny v níže uvedené tabulce: 6

7 Přesnost mezi cykly (reprodukovatelnost) N=80 Negativní vzorek Slabě pozitivní vzorek Pozitivní vzorek Silně pozitivní vzorek Poměr (OD vzorku/co) Průměr 0,18 1,06 1,76 3,28 SO 0,041 0,11 0,18 0,30 % VK 22,5 % 9,9 % 10,3 % 9,1 % 10. OMEZENÍ TESTU Diagnóza CMV infekce může být stanovena pouze na základě kombinace klinických a biologických údajů. Výsledek jednoho testu pro stanovení protilátek anti-cmv IgM nepředstavuje dostatečný průkaz diagnózy akutní infekce cytomegalovirem. Diagnóza akutní infekce může být provedena pouze s úplnými pacientovými informacemi včetně klinických a biologických údajů (významný nárůst protilátek anti-cmv IgG u 2 sér pacienta odebraných v intervalu 3 týdnů a testovaných ve stejném běhu, přítomnost signifikantní hladiny anti-cmv IgM, průkaz nízké avidity IgG). Přítomnost protilátek anti-cmv IgM nepředstavuje dostatečný důkaz k potvrzení akutní infekce, protože protilátky IgM mohou přetrvávat několik měsíců nebo dokonce několik let po infekci. Když jsou detekovány protilátky IgM, mělo by být provedeno kvantitativní stanovení protilátek anti-cmv IgG a také sledování dynamiky hladin protilátek anti-cmv na nejméně druhém vzorku séra o tři týdny později. Je-li vzorek testován příliš brzy během akutní primoinfekce, protilátky anti-cmv IgM nemusí být ještě přítomny. Existuje-li podezření, měl by být asi za 3 týdny odebrán druhý vzorek, u kterého by bylo opět provedeno testování na IgM protilátky. 11. KONTROLA KVALITY PROVÁDĚNÁ VÝROBCEM Všechny vyráběné reagencie jsou připravovány podle našeho systému kvality jakosti, počínaje převzetím surovin až po finální komercionalizaci výrobku. Každá šarže je podrobena kontrole kvality a je propouštěna na trh pouze tehdy, pokud odpovídá stanoveným kritériím. Dokumentace týkající se výroby a kontroly každé jednotlivé šarže je uchovávána u společnosti Bio-Rad. 12. LITERATURA 1. Alford C.A., Stagno S., Pass R.F., Britt W.J Congenital and perinatal cytomegalovirus infection. Rev. Infect. Dis. 12: S745-S Demmler G.J Summary of a workshop on surveillance for congenital cytomegalovirus disease. Rev. Infect. Dis. 13: Fowler K.B., Stagno S., Pass R.F., Britt W.J., Boll T.J., Alford C.A The outcome of congenital and cytomegalovirus in relation to maternal antibody status. N. Engl. J. Med. 326: Gaytant M.A., Rours I.G., Steegers E.A., Galama J.M., Semmekrot B.A Congenital cytomegalovirus infection after recurrent infection: case reports and review of the literature. Europ. J. Pediatr. 162: Grangeot-Keros L., Mayaux M.J., Lebon P., and al Value of cytomegalovirus (CMV) IgG avidity index for the diagnosis of primary CMV infection in pregnant women. J. Infect. Dis. 175: Lazzarotto T., Guerra B., Spezzacatena P., Varani S., Gabrielli L., Pradelli P., Rumpianesi F., Banzi C., Bovicelli L., Landini M.P Prenatal diagnosis of congenital cytomegalovirus infection. J. Clin. Microbiol. 36: Macé M., Sissoef L., Rudent A., Grangeot-Keros L A serological testing algorithm for the diagnosis of primary CMV infection in pregnant women. Prenat. Diagn. 28: Munro S.C., Hall B., Whybin L.R., Leader L., Robertson P., Maine G.T., Rawlinson W.D Diagnosis of and screening for cytomegalovirus infection in pregnant women. J. Clin. Microbiol. 43: Revello M.L., Gerna G Diagnosis and management of human cytomegalovirus infection in the mother, fetus and newborn infant. Clin. Microbiol. Rev. 15: Stagno S., Pass R.F., Dworsky M.E., and al Congenital cytomegalovirus infection: the relative importance of primary and recurrent maternal infections. N. Engl. J. Med. 306: Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) Fax : +33 (0) /2009 code: