Vysokoúčinná kapalinová chromatografie. Petr Kozlík Katedra analytické chemie

HTML
DOWNLOAD

Rozměr: px

Začít zobrazení ze stránky:

Download "Vysokoúčinná kapalinová chromatografie. Petr Kozlík Katedra analytické chemie"

Miroslav Beneš
před 6 lety
Počet zobrazení:

1 Vysokoúčinná kapalinová chromatografie Petr Kozlík Katedra analytické chemie 1

2 Vysokoúčinná kapalinová chromatografie Teorie HPLC Praktické aspekty, vývoj metody Validace chromatografické metody Aplikace HPLC 2

3 Sylabus přednášky: Základní chromatografické charakteristiky: distribuční konstanta retenční čas retenční objem průtok mobilní fáze kapacitní faktor separační faktor rozlišení symetrie píku Teorie chromatografického patra: účinnost separačního procesu Van Deemterova rovnice ovlivnění rozlišení 3

4 Distribuční konstanta HPLC je založena na separaci analytů na základě jejich distribuce mezi stacionární a mobilní fázi. Během separace dochází k mnoha typům interakcí. Uplatňují se interakce analytů s mobilní fází, interakce mobilní fáze se stacionární fází a sorpce analytů na stacionární fázi. Distribuční konstanta K D je poměr rovnovážné koncentrace analytu ve stacionární fázi a mobilní fázi KD A s Am As Am je rovnovážná koncentrace analytu ve stacionární fázi je rovnovážná koncentrace analytu v mobilní fázi 4

5 Retenční charakteristiky t R i tm t, ' R, i tm t R, i V R i VM V, ' R, i Retenční čas t R je doba, která uplyne od nástřiku vzorku do dosažení maxima eluční křivky Mrtvý čas t M je retenční čas analytu, který není v koloně zadržován. Redukovaný retenční čas t R je čas, který stráví analyt ve stacionární fázi. Retenční objem V R je objem mobilní fáze, který musí projít kolonou, aby se příslušný analyt dostal od počatku ke konci separační kolony. Mrtvý objem V M je objem mobilní fáze, který musí projít kolonou, aby se nezadržovaný analyt dostal od počátku ke konci kolony. 5

6 Retenční charakteristiky Lineární rychlost mobilní fáze u [cm/min] u L tm Objemová průtoková rychlost mobilní fáze F m [ml/min] Kapacitní faktor k t M Fm ni V t tr i t n M, i s k KD, I * Výhoda nezávislý na délce kolony a průtoku mobilní fáze m M M V V s m k = 0 analyt nestráví ve SF žádný čas a proto není zadržován k = 1 analyt stráví stejný čas v MF a v SF a proto eluuje ve 2x mrtvého času kolony k = 4 analyt stráví 4x času ve SF oproti MF a proto eluuje v 5x mrtvého času kolony 6

7 Retenční charakteristiky Separační faktor - selektivita k 2 k 1 K K D, 2 D,1 α = 1 α = 1,2 α = 1,6 7

8 Retenční charakteristiky Rozlišení píků R 1,2 ( tr,2 1 *( w 2 t B,2 R,1 ) w B,1 ) tr,1 tr,2 Dva píky jsou rozděleny na základní linii, pokud R>1.5 8

9 Symetrie píku Faktor asymetrie píku Tailing faktor píku Nesymetrické ( fronting nebo tailing ) píkí mohou způsobit nepřesnou kvantifikaci zhoršení rozlišení zakrytí minoritních píků nereprodukovatelnost retenčních časů Snažíme se o co možná nejsymetričtější píky! 9

10 Teorie chromatografického patra Účinnost chromatografického procesu nám říká, jak hodně (málo) je zóna eluující látky rozšiřována při průchodu HPLC systémem a kolonou. Gaussova křivka tr střední hodnota δ směrodatná odchylka 10

11 Teorie chromatografického patra Počet teoretických pater N t w 2 R, i R, i 16* 5.545* b Výškový ekvivalent teoretického patra H N L Typický počet teoretických pater za optimálních separačních podmínek t w

12 Van Deemterova teorie H H p H d H m Hp Hd Hm vířivá (turbulentní) difúze v mobilní fázi molekulární (axiální) difúze v mobilní fázi odpor proti převodu hmoty v mobilní fázi a stacionární fázi 12

Hp vířivá (turbulentní) difúze v mobilní fázi Díky nehomogenitě stacionární fáze proudí mobilní fáze různými kanálky stacionární fáze a tím urazí různou dráhu (analyty se proto navzájem opožďují nebo

13 Hp vířivá (turbulentní) difúze v mobilní fázi Díky nehomogenitě stacionární fáze proudí mobilní fáze různými kanálky stacionární fáze a tím urazí různou dráhu (analyty se proto navzájem opožďují nebo předbíhají) H p 2* * d p A geometrický faktor velikost částic Jak minimalizovat vířivou difuzi: používat dobře naplněné kolony používat malé částice používat kolony s malou distribucí velikosti částic 13

14 Hd molekulární (axiální) difúze v mobilní fázi Molekuly analytu difundují z místa s vyšší koncentrací do místa s nižší koncentrací. difúzní koeficient H d 2* * D u m B u lineární rychlost mobilní fáze korekční faktor charakterizující tvar kanálků v náplni kolony Jak minimalizovat vířivou difuzi: používat vyšší průtoky mobilní fáze používat krátké spojovací kapiláry s vhodným vnitřním průměrem Příspěvek molekulární difúze v LC je při běžných průtocích mobilní fáze zanedbatelný 14

Hm odpor proti převodu hmoty v mobilní fázi a stacionární fázi * d H Dm průměr částic náplně kolony 2 p * d Dp 2 p * u C * u intračásticový difúzní koeficient difúzní koeficient analytu v mobilní

15 Hm odpor proti převodu hmoty v mobilní fázi a stacionární fázi * d H Dm průměr částic náplně kolony 2 p * d Dp 2 p * u C * u intračásticový difúzní koeficient difúzní koeficient analytu v mobilní fázi koeficient závislý na distribuci velikosti částic a distribuci pórů Jak minimalizovat odpor proti převodu hmoty: používat nižší průtoky mobilní fáze používat menší rozměry částic používat vyšší teplotu na koloně 15

16 Van Deemterova rovnice H (µm) minimální H lineární průtoková rychlost (cm) optimální průtoková rychlost 16

17 Mimokolonové příspěvky k rozšiřování zón zavisí na objemu a geometrii detekční cely 2 celkem 2 kolona 2 injektor 2 spoje 2 det ektor objem vzorku má být co nejmenší spojovací kapiláry mají být co nejkratší s malým vnitřním průměrem 17

18 18

19 19

20 Jak ovlivnit rozlišení? Skutečná rovnice rozlišení R 1,2 ( tr,2 1 *( w 2 t B,2 R,1 ) w B,1 ) R 1,2 N 4 1 k * * 1 k účinnost selektivita retence kinetický aspekt termodynamický aspekt kapacitní aspekt rozlišení je přímo úměrné druhé odmocnině z počtu teoretických pater kolony rozlišení je přímo úměrné selektivitě a blíží se k nule pokud se selektivita blíží k jedné rozlišení je přímo úměrné retenci a blíží se k nule pokud se retence blíží k nule 20

21 Jak ovlivnit rozlišení? R 1,2 N 4 1 k * * 1 k největší efekt změny k pro k < 2 pro k > 10 nemá smysl dále zvyšovat k 21

22 Jak ovlivnit rozlišení? R 1,2 N 4 1 k * * 1 k selektivita je nejúčinější nástroj jak ovlivnit rozlišení Parametr Použití organická složka mobilní fáze ph mobilní fáze síla mobilní fáze + aditiva mobilní fáze stacionární fáze teplota změna organické složky (acetonitril X metanol X tetrahydrofuran) změna stupně ionizace analytů (změna hydrofobicity) změna poměru organické a vodné složky mobilní fáze největší vliv na selektivitu nejmenší vliv na selektivitu, často používán v chirálních separacích 22

23 Jak ovlivnit rozlišení? R 1,2 N 4 1 k * * 1 k 23

24 Jak ovlivnit rozlišení? R 1,2 N 4 1 k * * 1 k Faktory ovlivňující účinnost průtok mobilní fáze délka kolony velikost částic 24

25 Jak ovlivnit rozlišení? R 1,2 N 4 1 k * * 1 k 25

26 Gradientová eluce V průběhu gradientové eluce dochází ke změně složení mobilní fáze. k e 1 2,3* b g strmost gradientu b g mrtvý čas kolony t S 0* tg doba trvání gradientu eluční síla organického modifikátoru změna složení mobilní fáze během gradientu Píková kapacita P 1 1 n t n * 1 g w b 26

27 Gradientová eluce gradientový průběh je charakterizován gradientovými křivkami 27

28 Gradientová eluce píky 8 a 9 jsou velmi široké a eluují ve vysokých retenčních časech vyřešen problém s píky 8 a 9. Došlo ke zhoršení rozlišení píku 1 a 2, které koeluují Problémy isokratické eluce řeší gradientová eluce, kdy všechny píky jsou rozděleny na základní linii s krátkou dobou celkové analýzy 28

29 Gradientová eluce Příklad celkové doby gradientu na selektivity některých píku 29

30 Použité zdroje a zároveň doporučená literatura Monografie: Snyder R. L., Kirkland J. J.: Practical HPLC method development Snyder R. L., Kirkland J. J.: Introduction to modern chromatography Nováková L., Douša M.: Moderní HPLC separace v teorii a praxi (první a druhý díl) Snyder R. L., Dolan J. W.: High performance gradient elution Meyer V. R.: Practical high performance liquid chromatography Dong M. W.: Modern HPLC for practicing scientists Kromidas S.: More practical problem solving in HPLC Internetové zdroje: Časopisy: Journal of Chromatography A, B Journal of Separation Science Analytical Chemistry Chromatographia Journal of Liquid Chromatography LCGC 30

Podobné dokumenty

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie. Petr Kozlík Katedra analytické chemie

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie Petr Kozlík Katedra analytické chemie e-mail: kozlik@natur.cuni.cz 1 Sylabus přednášky: Praxe v HPLC Mobilní fáze Chromatografická kolona Spoje v HPLC Vývoj chromatografické