Analýza biologicky aktivních látek VOJTĚCH ADAM

Transkript

1 Analýza biologicky aktivních látek VOJTĚCH ADAM

2 Obsah I. Nízkomolekulární biologicky aktivní thioly II. Metalothionein III.Nukleové kyseliny

4 I. Nízkomolekulární biologicky aktivní thioly Těžké kovy Těžké kovy jsou chemické prvky, mezi které patří zejména přechodné kovy, některé polokovy, lanthanoidy a aktinoidy. Existuje mnoho různých definic, některé vyčleňují těžké kovy podle hustoty, jiné podle protonového čísla nebo atomové hmotnosti či podle toxicity. Definice z pohledu efektu na organismus Toxické (olovo, kadmium, rtuť atd.) Esenciální (zinek, měď, železo atd.)

5 I. Nízkomolekulární biologicky aktivní thioly Těžké kovy Těžké kovy a jejich sloučeniny jsou jednou z nejvíce toxických látek znečišťujících životní prostředí včetně zemědělských produktů. Vyskytují se přirozeně a nemohou být degradovány. Vyšší koncentrace jak esenciálních, tak toxických těžkých kovů vedou k otravám. Těžké kovy jsou dále nebezpečné z pohledu jejich schopnosti se bioakumulovat.

6 I. Nízkomolekulární biologicky aktivní thioly Těžké kovy minulost a přítomnost Kadmium Rtuť Olovo Stříbro

7 I. Nízkomolekulární biologicky aktivní thioly Těžké kovy přítomnost a budoucnost? Platina Paladium Rhodium

8 I. Nízkomolekulární biologicky aktivní thioly Rostliny Rostliny jsou schopny produkovat nízkomolekulární thioly, jako je glutathion a fytochelatiny jako obranné látky proti působení těžkých kovů.

9 I. Nízkomolekulární biologicky aktivní thioly Glutathion Glutathion (GSH) je tripeptid složený z aminokyselin kyseliny glutamové, cysteinu a glycinu O O S H O H O N H N H O H N H 2 O Účastní se detoxifikace exogenních a endogenních sloučenin, jako jsou reaktivní kyslíkové radikály, ionty těžkých kovů, perzistentní organické polutanty. Je schopen redukovat disulfidické vazby proteinů, kdy udržuje tyto látky v redukovaném funkčním stavu. Slouží jako zdroj cysteinu. Hraje důležitou roli v redukci ribonukleotidů na deoxyribonukleotidy.

10 I. Nízkomolekulární biologicky aktivní thioly Fytochelatiny Významný rostlinný peptid, který má základní strukturu (g-glu-cys) n -Gly. Dipeptidická repetice glutamové kyseliny a cysteinu (g-glu-cys) se může opakovat 2 až 11krát. O H CH 2 SH H HN CH 2 C C NH COOH C CH 2 NH C CH 2 HOOC H O n (g-glutamylcysteinyl) n glycin Molekula glutathionu (γ-glu-cys-gly) je substrátem pro syntézu fytochelatinů. Hlavní funkce této skupiny peptidů je detoxikace těžkých kovů, která probíhá vazbou na thiolové skupiny peptidu schopnost interakce.

11 I. Nízkomolekulární biologicky aktivní thioly Fytochelatin syntáza 2GS - Cd GSH Cd 2+ VAKUOLA GSH PC - Cd 2GS - Cd GSH FYTOCHELATIN SYNTÁZA PC - Cd (γ-glu-cys) n -gly FYTOCHELATINY γ-glu-cys-gly + γ-glu-cys-gly γ-glu-cys-γ-glu-cys-gly + gly (γ-glu-cys) n=2 gly γ-glu-cys-gly *AKTIVACE* Cd 2+ Cd 2+ FYTOCHELATIN SYNTÁZA γ-glu-cys- γ-glu-cys-γ-glu-cys-gly + gly (γ-glu-cys) n=3 -gly γ-glu-cys-gly n = 4 Převzato z O. Zitka, et al. (2011) Int. J. Electro. Sci., 192, n = 5

12 I. Nízkomolekulární biologicky aktivní thioly Jak komplexně hodnotit reakci rostliny na přítomnost těžkého kovu?

13 I. Nízkomolekulární biologicky aktivní thioly Distribuce kovů Laserem indukovaná ablační spektrometrie Převzato z V. Diopan, et al. (2010) Electroanalysis, 22,

14 I. Nízkomolekulární biologicky aktivní thioly Distribuce kovů Laserem indukovaná ablační spektrometrie List salátu 0.5 mm Pb(II) Pět dnů List kukuřice 0.5 mm Pb(II) Pět dnů List slunečnice 0.5 mm Pb(II) Pět dnů Větev borovice 5 mm Cu(II) 16 hodin

15 Obsah thiolů (µm) Výška píku (µa) Cystine GSSG PC2 PC3 PC5 I. Nízkomolekulární biologicky aktivní thioly Obsah thiolů Vysoce účinná kapalinová chromatografie s elektrochemickou detekcí Listy salátu vystavené účinku 0.5 mm Pb-EDTA 80 Cys H-Cys GSH PC Retenční čas (min) Thioly Převzato z V. Diopan, et al. (2010) Electroanalysis, 22,

16 Obsah I. Nízkomolekulární biologicky aktivní thioly II.Metalothionein III.Nukleové kyseliny

17 Počet aminokyselin II. Metalothionein Metalothionein protein Intracelulární, nízkomolekulární, na cystein velmi bohatý protein (6 10 kda). Metalothionein se skládá ze dvou vazebných domén α a β. N-terminální část peptidu β-doména; tři vazebná místa pro dvojmocné ionty. C-terminální část peptidu -doména; čtyři vazebná místa pro dvojmocné ionty kovů. Nejčastější repetice: cystein(c) serin(s) cystein(c). 20 β - doména α - doména C S K G A T N E M P D Q I Aminokyseliny (C cystein, S serin, K lysin, G glycin, A alanin, T threonin, N asparagin, E kyselina glutamová, M methionin, P prolin, D kyselina asparagová, Q glutamin, I isoleucin) Převzato z J. Petrlova, et al. (2006) Electrochim. Acta, 51,

18 II. Metalothionein Detoxikace těžkých kovů (f) ledvina vyloučení těžké kovy (Zn, Cd, Pb, Cu?) (a) MT (e) fosforylace?? MTF-1 MTI MTF-1 MRE (b) MTI MTF-1 (c) jádro MT mrna (d) (a) (b) (c) (d) (e) Vstup iontů kovu do buňky. Ionty interagují s inhibitorem syntézy metalothioneinu (MTI). Spuštění transkripčního faktoru (MTF-1) spojeného s metaloresponsivním elementem (MRE). Syntéza mrna pro translaci MT. MT se váží ion těžkých kovů, komplex MT-iont těžkého kovu je transportován do ledviny nebo k regulačním proteinům závislým na těžkém kovu (f). cytoplasma Převzato z Eckschlager, et al. (2009). Curr. Protein Pept. Sci., 10,

19 II. Metalothionein Metalothionein jako zhášeč reaktivních forem kyslíku Těžké kovy (Zn, Cd, Pb, Cu? (a) Reaktivní formy kyslíku (ROS) H 2 O 2 MT MT GSSG S S S S (b) (c) GSH OH MT S S MTF-1 MRE Reaktivní formy kyslíku (d) Poškození DNA jádro Poškození buňky MT MT S S S S cytoplasma (a) Přítomnost těžkých kovů v buňce může produkovat reaktivní formy kyslíku (ROS). (b) Pro odbourání ROS může být použit glutathion a MT. (c) (d) Přítomnost volných iontů těžkých kovů vede k aktivaci MTF-1 syntéza MT. MT může vázat ionty kovů a odbourávat ROS. Převzato z Eckschlager, et al. (2009). Curr. Protein Pept. Sci., 10,

20 Množství: hmotnostní spektrometrie s průletovým analyzátorem a ionizací s laserovou desorpcí v přítomnosti matrice (MALDI-TOF-MS), hmotnostní spektrometrie s ionizací elektrosprejem (ESI-MS) Atom síry Ion kovu β-doména α-doména cyklická, diferenční pulzní a square wave voltametrie, chronopotenciometrická rozpouštěcí analýza 25 II. síra Metalothionein Metody používané pro studium metalothioneinu CELý protein kov Struktura: nukleární magnetická rezonance, elektronová paramagnetická rezonance (EPR), Ramanova spektroskopie, cirkulární dichroismus (CD), magnetický cirkulární dichroismus, Mossbauerova spektroskopie a rentgenové techniky Specifická sekvence Saturační techniky (Hg(II), Ag(I) a Cd(II)), hmotnostní spektrometrie s indukčně vázaným plasmatem (ICP-MS), hmotnostní spektrometirie s průletovým analyzátorem (ICP-TOF-MS) enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), Western blotting Převzato z Adam, V., et al. (2010) TRAC-Trends Anal. Chem., 29,

21 II. Metalothionein Brdičkova reakce Metallothionein + [Co(NH 3 ) 6 ]Cl 3+ Potential Potenciál Co(II) Metallothionein R(SH) 2 [Co(NH 3 ) 6 ]Cl 2+ [Co(H 2 O) 6 ] 2+ RS2Co + 2H + + 2H + Co + R(S - ) 2 + 2H + + e - + 2e - + 2e - + 2e - Co1 RS 2 Co Cat 1 Cat V -1.2 V V -1.5 V RS 2 Co Co1 250 na Cat1 Cat Potenciál (V)

22 II. Metalothionein Brdičkova reakce Příprava vzorku homogenizace kapalným dusíkem tissues odběr vzorku zmražení denaturace centrifugace ANALÝZA zředění odebrání supernatantu Ze získaných vzorků krevních sér nebo homogenizátů tkání bylo odebráno 100 μl a umístěno na 15 min. při 99 C do termobloku (Eppendorf 5430, USA) pro denaturaci termolabilních proteinů. Směs byla ochlazena na 4 C a metalothionein jako termostabilní protein byl následně oddělen centrifugací při 4 o C, g po dobu 30 min. (Eppendorf 5402, USA). Převzato z J. Petrlova, et al. (2006) Electrochim. Acta, 51,

23 II. Metalothionein Tepelná denaturace a přenosová technika 15 min. kapka vzorku HMDE parafilm mikroskopické sklo 2 C chlazení pomocí vody CE Adsorpce při 10 C analýza Ag/AgCl/ 3M KCl omývání Převzato z Adam, V., et al. (2008) Sensors, 8,

24 Množství MT (%) Množství MT (%) Množství MT (%) 1 µg cddp/ml media 0 µg cddp/ml media II. Metalothionein Tepelná denaturace a přenosová technika A UKF-NB4 sensitivní k cisplatině B a Mateřská linie b Rezistentni linie c 100 na sken MT 300 ng n.d. MT 300 ng MT v buněčném extraku MT 300 ng n.d. C D E UKF-NB4 rezistentní k cisplatině Buněčná linie Koncentrace cisplatiny (µm) Koncentrace karboplatina (µm) Převzato z Fabrik, I., et al. (2008) Electroanalysis, 20,

25 II. Metalothionein Izolace na bázi paramagnetických částic Nukleové kyseliny Proteiny a buňky Hybridizace komplementární sekvence Biotinylované nukloevé kyseliny Biotinylovaný protein Buňka DNA Chemická modifikace povrchu Streptavidin Chemická modifikace povrchu protein G protein A Specifická protilátka Protein Antigen Proteiny vázající nukleové kyseliny Oligo(dT) 25 Protilátka Specifická protilátka mrna Buňka Převzato z E. Palecek a M. Fojta (2007) Talanta, 74,

26 II. Metalothionein Pokročilé materiály v izolaci metalothioneinu A. Navázání protilátek B. Přidání vzorku C. Izolace cílové molekuly D. Separace pomocí magnetu E. Promývání F. Ohřev G. Získání cílové molekuly H. Adsorpce na povrch molekuly I. Promytí J. Měření Referenční elektroda Pracovní elektroda Pomocná elektroda Potenciostat/ Galvanostat Převzato z M. Masarik et al. (2011) Electrophoresis, 32,

27 Normalizovaný signál (%) Normalizovaný signál (%) Normalizovaný signál (%) Normalizovaný signál (%) II. Metalothionein Optimalizace postupu izolace Myší IgG Králičí IgG Vzorek Čas (min) 22Rv1 Teplota ( C) ph Převzato z M. Masarik et al. (2011) Electrophoresis, 32,

28 Metalothionein/viabilita (%) Metalothionein/viabilita (%) II. Metalothionein Analýza prostatické buněčné linie 22Rv1 MT mrna MT mrna Koncentrace Cd(II) (µm) Lyzát: tepelný Lyzát: RIPA Koncentrace Cu(II) (µm) Lyzát: tepelný Lyzát: RIPA Koncentrace Cd(II) (µm) Koncentrace Cu(II) (µm) Převzato z M. Masarik et al. (2011) Electrophoresis, 32,

30 TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT III. Nukleové kyseliny Izolace nukleových kyselin Magnetické částice Vzorek nukleové kyseliny omytí hybridizace omytí Elektrochemická detekce CE CPE nebo HMDE Ag/AgCl magnet AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA Adsorptivní přenosová technika AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA Eluce izolované nukleové kyseliny AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA magnet AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 85 C Separace nukleových kyselin magnet ohřev Převzato z D. Huska et al. (2009) Talanta, 79,

31 POTENCIOSTAT GALVANOSTAT Poloautomatická III. Nukleové kyseliny Izolace nukleových kyselin Automatická Promývání 3x A D B C 85 C Promývání 3x A Elektrochemická detekce potenciostat Elektrochemická detekce Signal Převzato z D. Huska et al. (2009) Talanta, 79,

32 Výška píku (%) Výška píku (%) Výška píku Výška píku (%) Výška píku (%) Square wave voltametrie Cyklická voltametrie III. Nukleové kyseliny Optimalizace elektrochemické detekce nukleových kyselin A B C (na) Potenciál (V) Frekvence (Hz) D E F Doba akumulace (s) y = x R 2 = Teplota ( C) ph Koncentrace poly(a) (µg/ml) Převzato z D. Huska et al. (2009) Talanta, 79,

33 Koncentrace mrna (µg/g mozkové tkáně) Odezva signálu (%) III. Nukleové kyseliny Izolace mrna z reálného vzorku Tkáně Pletiva 800 Kontrolní rostliny mm Cd(II) Aplikovaná koncentrace kadmia (µm) 105 kořen stonek mm Cd(II) 35 0 Patient 1 Patient 5 Patient 4 Patient 3 Patient 2 Vzorky mozkové tkáně Patient Aplikovaná koncentrace kadmia (µm) Doba kultivace (hod) Převzato z D. Huska et al. (2009) Talanta, 79, D. Huska et al. (2009) Chem. Listy, 103, s167-s171.

34 SHRNUTí

35 Pedagogický rozvoj oborů vyučovaných na Agronomické fakultě Využití moderní a robustní analytické, biochemické a biologické instrumentace v základní výuce Anorganické a Analytické chemie a Biochemie. Unikátní přístroje ve specializovaných chemických a biochemických předmětech (Bioanalytické chemie, Biotechnologie životního prostředí, Biosenzory, Biochemické pokročilé praktikum). Bakalářské a diplomové práce.

36 Pedagogický rozvoj oboru Zemědělská chemie na Agronomické fakultě Výchova mladých vědeckých pracovníků Rozvoj izolačních a separačních postupů založených na pokročilých materiálech. Lab-on-chip technologie, aplikace in situ. Praktická aplikace, studium procesů v organismech všech úrovní.

37 Pedagogický a vědecký rozvoj oboru Zemědělská chemie na Agronomické fakultě In vivo technologie Chemotherapy... fundoscopic examination... dealing with medievalism here! Leonard Bones McCoy Star Trek IV Voyage Home

38 Vyměnit f Pedagogický a vědecký rozvoj oboru Zemědělská chemie na Agronomické fakultě In vivo zobrazovací technologie Kvantová tečka quantum dot, ohraničená oblast polovodiče o průměru kolem 30 nm a výšce 8 nm, schopná v důsledku nižší energie ve srovnání s energií vodivostního pásu okolního polovodiče vázat elektrony. Důležitou vlastností je také optická schopnost teček se zabarvovat. C Intenzita signálu ~ 200 pozadí Excitace (730 nm), Emise (830 nm) kontrola 10 µm 100 µm