POLYMERNÍ FILMY V MEDICÍNĚ A ELEKTRONICE

Transkript

1 POLYMERNÍ FILMY V MEDICÍNĚ A ELEKTRONICE VÁCLAV ŠVORČÍK Ústav inženýrství pevných látek, Vysoká škola chemicko-technologická, Technická 5, Praha, vaclav.svorcik@vscht.cz V této práci jsou shrnuty některé poznatky o využití polymerních filmů v medicíně a v elektronice. Pozornost byla věnována zejména oblastem, kterými se zabývá naše skupina na VŠCHT. V oblasti polymerů v medicíně je to studium modifikovaných polymerů jako nosičů pro pěstování kožních buněk při léčbě poškození kůže (popáleniny, bércové vředy, ) nebo interakce těchto filmů s buňkami hladkého svalstva pro cévní protézy. V oblasti využití polymerů v elektronice se zabýváme studiem dotace filmů diplóly pro konstrukci čidel (např. teplotních). Jsou studovány struktury kov-polymer-kov, které jsou základem tzv. tunelovacích diod a příprava metalizovaných polymerů, které lze využít při balení a ohřevu potravin. POLYMERY V MEDICÍNĚ Při řízené interakci buněk se substrátem jsou aplikovány dvě základní strategie. První se snaží o vytvoření dokonale inertních materiálů, jež by nedovolovaly adhezi ani růst buněk na jejich povrchu. Tento typ materiálů je žádoucí např. při konstrukci kontaktních čoček nebo některých zařízení, která jsou v kontaktu s krví 1. Druhým přístupem je tvorba substrátů, jež by naopak podporovaly adhezi (uchycení), proliferaci (růst) a diferenciaci (vyzrávání) buněk. Pouze diferenciované buňky jsou schopny správně plnit všechny své životní funkce. V transplantační medicíně je nutné správné fungování transplantátu a jeho integrace s okolními tkáněmi (v případě kostí, parenchymatických orgánů a obvykle také cév) 2. Tento typ umělých transplantátů může být před samotnou transplantací kolonizován pacientovými buňkami (in vitro) a tím může být sníženo riziko odmítavé reakce imunitního systému. Dále jsou diskutovány dva příklady využití polymerních substrátů v medicíně (cévní náhrady, nosiče pro kultivaci kožního krytu). Bylo prokázáno, že snížení trombogenicity a podpoření správného fungování cévních náhrad může být dosaženo pokrytím povrchu umělé cévy vrstvou autologních buněk před implantací do organismu 3. Tato metoda odpovídá základní myšlence tkáňového inženýrství vytvářet funkční náhrady tkání kombinováním biologicky aktivních buněk a vhodných materiálů. Jedná se o poměrně mladou techniku, první pokusy byly zahájeny v 80. letech a první klinická data byla publikována v roce

2 Výsledky dosažené při snižování trombogenicity naznačují, že se jedná o perspektivní metodu 3. Dalším důležitým uplatněním polymerů je jejich využití jako růstových substrátů pro kultivaci buněk. Díky interdisciplinárnímu přístupu v ošetřování rozsáhlých popálenin mohou dnes přežívat pacienti popálení na více než 80% celkového povrchu těla. Nedostatek vhodných odběrových míst pro permanentní krytí je řešen kultivací epidermálních buněk keratinocytů - in vitro. V poslední době se přistupuje ke kultivaci buněk na umělých nosičích, které mohou být spolu s nimi přeneseny na ránu pacienta 4. Tímto způsobem je možno předejít poškození buněk a nosiče zároveň slouží jako dočasný kryt 5. Modifikace povrchu polymerů Uchycení, růst i vyzrávání buněk na umělých substrátech jsou ovlivňovány povrchovými vlastnostmi materiálu. Polymery před interakcí s buňkami je nutné na povrchu modifikovat. Dále je popsána jedna z možností. Iontová implantace je perspektivní metodou pro povrchovou úpravu polymerů využívaných v medicíně, jelikož umožňuje kontrolovaně řídit biokompatibilitu materiálu a tím ovlivňovat chování různých typů buněk 6,7. Ukazuje se, že iontová implantace může zvýšit adhezi a následný růst buněk na polymerních substrátech. Další výzkum směřuje k tomu, aby iontovou implantací bylo dosaženo specifických vlastností (selektivní adheze určitého typu buněk, adheze buněk ve vymezených úsecích materiálu, antibakteriální povrchy a podobně). Vysoce energetické ionty, které jsou separovány v magnetickém a urychleny v elektrickém poli, jsou při implantaci rozptylovány na cílových atomech. Disipující energie způsobuje změny ve struktuře polymeru. Expozice polymerů vysoce energetickými ionty způsobuje degradaci polymerních řetězců. Štěpení vazeb vede k tvorbě volných radikálů a následným chemickým reakcím. Již při relativně nízkých dávkách dochází k síťování řetězců, vzniku dvojných vazeb, oxidaci 8 a uvolňování plynných produktů. V závislosti na dávce ozáření jsou pozorovány různé stupně karbonizace popř. grafitizace polymeru 9. Iontová implantace může být prováděna při pokojové teplotě a modifikována je pouze povrchová vrstva materiálu ( tloušťka nm). Pro biologické účely jsou nejčastěji implantovány ionty inertních plynů (Ne +, Ar +, Kr +, Xe +,), u kterých se předpokládá, že jejich přítomnost ve vrstvě nebude buňky nijak ovlivňovat. Dále jsou implantovány ionty biogenních prvků (O +, N +,) nebo v některých případech dokonce ionty známé svým působením proti růstu buněk (Ag - pro vytváření antiadhezních povrchů 10 ). 2

3 Vliv substrátu na chování buněk Přestože některé savčí buňky jsou schopny růst v suspendovaných kulturách, naprostá většina z nich je závislá na dobrém ukotvení. Tyto buňky se musí nejprve uchytit na povrchu vhodného substrátu, aby mohly začít plnit své fyziologické funkce. Správné fungování buněk kultivovaných na umělých podkladech významně závisí na fyzikálně-chemických vlastnostech povrchu studovaných materiálů. Neupravované polymery jsou obvykle příliš hydrofobní nebo negativně nabité a proto nemohou být dostatečně kolonizovány buňkami. Některé studie přisuzují lepší buněčnou adhezi po iontové implantaci zvýšené polaritě povrchu a přítomnosti oxidovaných struktur 11. Další autoři uvádějí jako možné vysvětlení vyšší biokompatibility zvýšení obsahu uhlíku v modifikované vrstvě 12. K vlastnostem často dávaným do souvislosti s biokompatibilitou materiálu patří také povrchová morfologie, adhezní a elektrické vlastnosti substrátu a přítomnost některých funkčních skupin. Dobrá adheze buňky k růstovému substrátu je základním předpokladem jejího normálního vývoje. Kromě přímého navázání buněk k růstovému substrátu (předpokládá se vliv elektrostatických sil) 12 je adheze zprostředkována také molekulami extracelulární matrice (vitronektin, fibronektin, kolagen, laminin, fibrinogen,...) preadsorbovanými k podložnímu materiálu 13. Pevnost adheze buněk je zkoumána mechanicky (působením smykových sil) či enzymaticky (např. trypsinem) 14. Díky změnám volného objemu a chemické aktivitě ozařovaného polymeru je u modifikované vrstvy ovlivněna penetrace a zabudování různých látek, jež mohou dále ovlivňovat vlastnosti polymeru. Difuzí vhodných dopantů lze zvýšit elektrickou vodivost či biokompatibilitu. Výsledky zjištěné při dopování polymeru uhlíkem ovšem podporují ideu, že pro adhezi buněk není důležitá pouze nulová hloubka, ale určitá tloušťka povrchové vrstvy. Vlivem modifikace dochází ke změnám povrchové morfologie polymeru. Je známo, že morfologie povrchu hraje při interakcích buňka-substrát významnou roli. Na uhlíkových kompozitech, jejichž povrch byl uměle zdrsněn, se buňky hladkého svalstva (SMC) natáčely ve směru podélných rýh 15. Drsnost zvyšuje hodnotu kontaktního úhlu a materiál se stává více hydrofobní. Je známo, že výsledky týkající se vlivu drsnosti na chování buněk se liší pro různé substráty i použité buňky. Vysvětlením může být skutečnost, že nezáleží pouze na velikosti a vzdálenosti povrchových nerovností (topografii), ale také na jejich tvaru (morfologii). Další příčinou rozporuplných pozorování může být skutečnost, že některé buňky jsou považovány za rugofilní - tedy drsnomilné (např. makrofágy), jiné naopak za rugofobní (např. fibroblasty) 16. Elektrické interakce jsou důležitým faktorem při pohybu a adhezi buněk. Negativně nabitá místa na buněčné membráně jsou využívána v rozpoznávacím procesu a při následné 3

4 interakci buňky se substrátem. Dřívější studie prokázaly vliv elektrického náboje povrchu substrátu na fúzi makrofágů 17. Adheze byla nejvyšší na kationtovém povrchu ve srovnání s neutrálním a aniontovým. Nabité skupiny substrátu navíc ovlivňují sorpci adhezních proteinů důležitých pro dobré uchycení a správný vývoj buněk 18. Uhlíkaté materiály jsou známy svou vysokou biokompatibilitou, jež byla ověřena v podmínkách in vitro stejně jako in vivo 19,20. Jsou proto studovány možnosti zvýšení biokompatibility polymerů zvyšováním obsahu uhlíku v jejich povrchové vrstvě. Je využíváno např. depozice uhlíkových vrstev na povrchu polymerů, dopování polymerů sazemi nebo iontové implantace. Ve všech uvedených případech bylo prokázáno zlepšení adheze a růstu buněk. POLYMERNÍ FILMY V ELEKTRONICE Pro elektroniku jsou zajímavé zejména metalizované polymerní filmy. Metalizace polymerních filmů je v literatuře poměrně často studovanou problematikou. Důvodem je široké využití struktur kov-polymer-kov (MIM). Toto základní uspořádání umožňuje měřit elektrické a dielektrické vlastnosti polymerů 21,22. Např. v elektronice je oboustranně metalizovaný polymerní film základem diod se záporným diferenciálním odporem 21, v optoelektronice se tyto struktury uplatňují při konstrukci světlo emitujících diod (LED) na bázi polymerů 23. Metalizované polymerní folie (susceptory) tvoří základní prvek aktivních obalů potravin pro mikrovlnný ohřev 24 ). Vrstva kovu na polymer se nanáší několika základními způsoby, např. napařováním, naprašováním nebo elektrochemicky. Pro výše uvedené příklady se polymery metalizují vrstvou od ultratenkých tlouštěk do několika set nm. Základní vliv na struktury deponované vrstvy mají nukleační procesy. Pro napařování a naprašování vrstev publikoval Walton 25 mikroskopickou nukleační teorii, která popisuje vznik zárodků vrstvy obsahující malý počet atomů. Při nanášení kovu na polymer existují 2 základní problémy: adheze kovu k substrátu a u tenkých kovových vrstev (do ca 20nm) měření jejich tloušťky, s čímž souvisí sledování její spojitosti. Adhezi kovové vrstvy lze zvýšit modifikací polymeru, např. chemicky, plazmou, ozřováním plazmou nebo ionty, koronou nebo ozonem. Pro některé aplikace metalizovaných filmů je nezbytné, aby vrstva kovu byla spojitá (elektrická měření, konstrukce diod). Naopak pro některé aplikace je nezbytné připravit nespojité kovové vrstvy (difuze kovů pro přípravu vodivých filamentů 26,27, obaly pro mikrovlnný ohřev 24. U metalizovaných filmů se předpokládá penetrace kovu do polymerního filmu. Penetrace kovů z pevné fáze do polymeru je velmi nízká. Např. pro difuzi zlata a stříbra do 4

5 polykarbonatu při teplotách C byly naměřeny difuzní koeficienty 5x10-14 až 1x10-16 cm 2 s -1. Při elektrickém formování submikronové struktury kov-polymer-kov je předokládána tvorba kovových filamentů, které vznikají difuzí kovů do polymerů. Kovy jsou pravděpodobně díky vysoké intenzitě elektrického pole při difuzi v kapalném stavu 26. Penetrace prvků a sloučenin do pristine i modifikovaných polymerů je limitována jejich volným objemem. Po penetraci kovu do polymerního filmu po přiložení vnějšího elektrického pole se vytvoří díky elektroformování vodivé filamenty. Jejich množství závisí na tloušťce polymeru. Voltampérová charakteristika vykazuje od určité hodnoty přiloženého napětí oblast tzv. záporného diferenciálního odporu, tj. oblast, kde neplatí Ohmův zákon. U anorganických izolačních struktur je tento jev základem tunelovacích diod. Dále lze pomocí struktur kov-polymer-kov studovat dielektrické vlastnosti polymerů. Většina polymerů se chová jako polarizovatelné dielektrikum. Změnou vlastností polymeru (struktury, složení, molekulové hmotnosti atd.) je možno dosáhnou výrazných změn dielektrických vlastností od izolantů až po feroelektrika nebo organické polovodiče. Důležitým strukturním parametrem z hlediska dielektrických vlastností je polarita vazeb v hlavním řetězci nebo bočních skupinách. Přítomnost dipólových momentů v polymeru zvyšuje celkovou polarizovatelnost o orientační člen, který je teplotně závisly. Teplotní závislost dielektrických vlastností byla studována např. na polárním kaučuku, fluorovaných polymerech, polytetrafluorethylenu nebo kompozitu feroelektrické keramiky a fluorovaného polymeru nebo na polymerech dotovaných sloučeninami obsahujícími dipóly 22. Bylo prokázáno, že u těchto dotovaných polymerních filmů dochází s rostoucí koncentrací dipolů k nárůstu permitivity. Permitivita kompozitu roste s teplotou. Vlivem vnějšího napětí lze orientovat dipóly v polymerní matrici. ZÁVĚR Z výše uvedeného vyplývá, že polymerní filmy nacházejí poměrně široké uplatnění i v interdisciplinárních oborech jako je tkáňové a elektronické inženýrství. Je zřejmé, že na řešení těchto problematik se musejí podílet kromě chemiků i fyzici, buněční morfologové, kliničtí chirurgové a elektronici. Autor děkuje za finanční podporu GA ČR (projekt 203/99/1626 a 102/01/1324) a GA AVČR (A ). 5

6 LITERATURA 1. Kawamoto N., Mori H., Terano M., Zui N.: J. Biomater. Sci. Polymer Edn. 8, 859 (1997). 2. Doik K., Matsuda T.: J. Biomed. Mater. Res. 37, 573 (1997). 3. Thornton M.A., Howard L.C., Patternson E.A.: Med. Eng. Phys. 19, 588 (1997). 4. Dvořánková B., Smetana K., Königová R., Singerová H., Vacík J, Jelínková M., Kapounková Z., Zahradník M.: Biomaterials 19, 141 (1998). 5. Zacchi V., Soranzo C., Cortivo R., Radice M., Brun P., Abatangelo G.: J. Biomed. Mater. Res. 40,187 (1998). 6. Bačáková L., Švorčík V., Rybka V., Miček I., Hnazowicz V., Lisá V., Kocourek F.: Biomaterials 17,1121 (1996). 7. Švorčík V., Rybka V., Hnatowicz J., Smetana K.: J. Mater. Sci., Mater. Med. 8, 435 (1997). 8. Švorčík V., Prošková K., Rybka V., Hnatowicz V.: Polym. Degr. Stab. 60, 431 (1998). 9. Švorčík V., Arenholz E., Rybka V., Hnatowicz V.: Nucl. Instr. Meth. B 122, 663 (1997). 10. Tsuji H., Satoh H., Ikeda S., Ikemura S., Gotoh Y., Ishikawa J.: Nucl. Instr. Meth. B 148, 1136 (1999). 11. Gao J.M., Niklason L., Langer R.: J. Biomed. Mater. Res. 42, 417 (1998). 12. Švorčík V., Rybka V., Hnatowicz V., Bačáková L., Lisá V., Kocourek F.: J. Mater. Chem. 5, 27 (1995). 13. Garcia A.J., Vega M.D. Boettiger D.: Mol. Biol. Cell. 10, 785 (1999). 14. Bačáková L., Mareš V., Lisá V., Švorčík V.: Biomaterials 21, 1173 (2000). 15. Kim S.R.: J. Appl. Polym Sci. 77, 1913 (2000). 16. Brunette D.M., Chehroudi B.: J. Biomechan. Eng.- Transact ASME 121, 49 (1999). 17. Smetana K., Vytášek R., Štol M.: Intern. J. Hematol. 56, 219 (1992). 18. Garrett Q.: Biomaterials 19, 2175 (1998). 19. Švorčík V., Rybka V., Hnatowicz V., Bačáková L.: J. Mater. Sci. Lett. 14, 1723 (1995). 20. Lampin M., Warocquier-Clérout R., Legris C., Degrange M., Sigot-Luizard M.F.: J.Biomed. Mater.Res. 36, 99 (1997). 21. Efimenko K., Rybka V., Švorčík V., Hnatovicz V.: Appl.Phys. A 68, 479 (1999). 6

7 22. Švorčík V., Králová J., Rybka V., Hnatowicz V.: J.Polym.Sci, Polym.Phys.39, 831 (2001). 23. Gustavson G., Cao Y., Heeger A.J.: Nature 357, 477 (1992). 24. Houšková J., Hoke J., Dobiáš J.: Czech J.Food Sci. 16, 143 (1998). 25. Walton D.: Phil. Mag. 7, 1671 (1962). 26. Efimenko K., Rybka V., Švorčík V., Hnatowicz V.: Appl.Phys A 67, 503 (1998). 27. Švorčík V., Efimenko K., Rybka V., Hnatowicz V.: Appl.Phys. A 68, 357 (1999). 7

8 Geneticky modifikované organismy M. Ondřej Ústav molekulární biologie rostlin AVČR* 1. Vymezení pojmů Pro začátek bude užitečné uvést několik definic, aby se vytříbily základní pojmy, které se v dalším textu budou používat. Termíny jsou obecně známé, ale různí autoři je používají v různém smyslu. Zde uvedené definice si nedělají nárok na univerzální platnost. Genetika je věda o dědičnosti a její proměnlivosti. Molekulární genetika je ta část genetiky která studuje dědičnost na molekulární úrovni, konkrétně na úrovni nukleových kyselin a proteinů. Genové inženýrství nebo genové manipulace jsou tou částí molekulární genetiky, která využívá specifických enzymů, jež umožňují provádět přesné, reprodukovatelné zásahy do DNA. Je to především rekonstrukce poměrně krátkých úseků DNA a analýza jejích primárních sekvencí (sledů) bází. Pro DNA, jež byla sestavena metodami genového inženýrství z různých úseků, pocházejících z odlišných organismů, se vžil termín rekombinovaná DNA (rdna). Šlechtění je technologie, která využívá genetiky a dalších vědních oborů ke tvorbě nových odrůd a jejich udržování. Biotechnologie představují aplikaci metod genového inženýrství a dalších moderních laboratorních metod (tkáňové a buněčné kultury) v biologické produkci. Bioetika pojednává o uplatnění etických principů v biologii a jejím praktickém využití. Těsně s ní souvisí otázky zákonných norem, legislativy biotechnologií a geneticky modifikovaných organismů. Tyto obory se překrývají v ne příliš velkém, ale velmi důležitém prostoru, který bude předmětem této přednášky. Přednáška bude pojednávat nejvíce o rostlinách, protože geneticky modifikované odrůdy rostlin jsou často ne zcela informovaně diskutovány. V prvé řadě je nutno si ujasnit, co jsou a co nejsou tak zvané genové manipulace, zda a v čem se liší od předchozích přístupů, jež našly praktickou aplikaci ve šlechtění. 2. Souběžný vývoj genetiky a šlechtitelských metod 2.1. Období klasické genetiky Hlavním praktickým výsledkem, kterým genové inženýrství přispělo ke šlechtění, je přenášení genů nezávisle na taxonomické vzdálenosti a tvorba geneticky modifikovaných organismů, které obsahují jeden nebo několik genů, vnesených do genomu metodami genového inženýrství a biotechnologií. Chceme-li se dovědět, co je na nich nového a co je pokračujícím uplatněním rozšiřujících se genetických metod, je třeba si uvědomit paralelní vztah vývoje genetiky a vývoje šlechtění. Ještě jsme neslavili sté výročí vzniku genetiky. Mendel své objevy o štěpení znaků v potomstvu hybridů sice publikoval již v r. 1864, ale upadly v zapomenutí a teprve na počátku tohoto století byly znovuobjeveny. Termín genetika vznikl v r na schůzi Královské zahradnické společnosti v Londýně, kdy prof. William Bateson navrhl, aby se takto nazývala nově vznikající věda o dědičnosti. Celé 20. století je dobou intenzivního rozvoje genetiky a šlechtění. Již pravěký člověk sil obilí a k setí uchovával zrno nejlepších rostlin. Tento princip umělého výběru se uchoval jako jediná metoda šlechtění prakticky až do 19. století. Teprve v průběhu století bylo definitivně prokázáno, že pyl rostlin působí jako samčí princip a to vedlo k postupnému zavádění záměrného křížení do šlechtění rostlin. První semenářské a šlechtitelské podniky vznikaly až na přelomu 19. a 20. století a teprve uplynulé století je stoletím rozvoje šlechtění. Hlavní přínosy genetiky pro šlechtění se projevily v těchto nových přístupech: 8

9 1. Hybridologická analýza, předpověď a vysvětlení štěpení kvalitativních znaků, využívání znalosti zákonitostí dědičnosti kvantitativních znaků 2. Indukce polyploidie - znásobení počtu chromosomů (od r. 1930). 3. Vzdálená hybridizace, tedy hybridizace mezi různými biologickými druhy nebo dokonce rody. Vzdálenější hybridizace se klasickými metodami nepodařila (asi od r. 1930). 4. Indukce mutací ionizujícím zářením a chemickými mutageny (přibližně od roku1930). 5. Genetické uplatnění tkáňových kultur (přibližně od roku 1960). 6. Nové možnosti dané genovým inženýrstvím (přibližně od roku 1970). Ad 1) Hybridologická analýza: S možností výpočtu předpokládaných frekvencí určitých kombinací genů v potomstvu hybridů bylo možno plánovat potřebný rozsah šlechtitelského materiálu a tím zefektivnit proces šlechtění. Ad 2) Zdvojování počtu chromosomů (vznik polyploidních buněk a jedinců). Základem je blokáda tvorby vřeténka v anafázi buněčného dělení prostřednictvím některých látek, z nichž nejvýznamnější je kolchicin. Důsledkem je vznik buněk a z nich celých rostlin s dvojnásobným počtem chromosomů. To má své důsledky pro možnosti vzdálené hybridizace. Ad 3) Vzdálené - mezidruhové křížení: Zde se perspektivy průběžně rozšiřují po dalších asi 40 let. Vzdálená hybridizace je hybridizace mezi různými rostlinnými druhy, případně rody. Druhy se v zásadě v přírodě nekříží. Může to být ale dáno jen geografickou izolací nebo různou dobou kvetení. V některých případech jsou blokády oplození po sprášení, v jiných blokády vzniku hybridních semen, jindy hybridní semena vznikají, ale jsou neklíčivá. V řadě případů je nekřižitelnost důsledkem odlišného počtu chromosomů.přitom ke křížení někdy dochází, ale hybridi nejsou plodní. V meiozi totiž nedochází k normálnímu párování a normálnímu rozdělení chromosomů. Takovýmto situacím může odpomoci právě zdvojení počtu chromosomů hybridů (tzv. amfidiplodizace, tedy zdvojení chromosomových sádek obou rodičů), které vede k obnově jejich homologie při meiosi a ke vzniku hybridů. Tak vznikaly i nové kulturní rostliny, jako rod Triticale - kříženec pšenice a žita, která se dnes pěstuje na velkých plochách i v ČR, rod Tritordeum, - kříženec pšenice a ječmene, josta - amfidiploidní kříženec rybízu a angreštu. Mezidruhové křížení se využívá i u dalších kulturních plodin, které nejsou deklarovány jako mezidruhoví hybridi. Například odolnost k houbovým a bakteriálním chorobám je možno dodávat odrůdám bramboru křížením s příbuznými planými druhy (Solanum andigena, S. phureja, S. demisum a d.) a pak se provádí několikanásobné zpětné křížení s bramborem a ve všech generacích se sleduje na znak odolnosti k chorobám. Ad 4) Indukce mutací: Mutace jako přirozené změny dědičné hmoty vznikají spontánně s nízkou frekvencí. I když většina z nich je vývojově nepříznivých, malá část vývojově příznivých mutací je hybnou silou vývoje. Protože však spontánní vznik je velmi vzácný, v klasických dobách šlechtění se mutace jen zřídka stávaly základem pro vznik nových odrůd. V r však byla objevena možnost indukce mutací ionizujícím zářením a v roce 1942 ještě účinnějšími chemickými mutageny. Posledních 50 let se indukované mutace využívají ve šlechtění rostlin. Jedná se buď o tzv. bodové mutace, které mění jediný, gen, nebo o chromosomové aberace, přeskupení úseků chromosomů za vzniku často mikroskopicky pozorovatelné změny struktury chromosomů (například translokace). Typické naše odrůdy, které vznikly mutačním šlechtěním, je odrůda ječmene Diamant a z něho odvozené odrůdy tzv. diamantové řady. Je třeba konstatovat, že změny, k nimž dochází mutacemi, nejsou vždy zcela přesně definované. Kromě mutace, která byla detekována a je využívána mutace pravděpodobně způsobil i řadu dalších změn DNA, které nejsou zřejmé. Ve šlechtění se často kombinují metody vzdálené hybridizace a indukce chromosomových přestaveb, zvláště translokací. Mnoho současných vysoce výkonných odrůd pšenice tak obsahuje ve svém dědičném základu úseky chromosomů žita, které jim dodávají odolnost k některým chorobám. 9

10 Ad 5) Využití tkáňových kultur ve šlechtění. Na tkáňových kulturách rostlin se začalo intenzivně pracovat asi před třiceti lety a od té doby se staly jedním ze základních nástrojů šlechtění.části rostlin i celé rostliny lze pěstovat sterilně na agarových kulturách. Části rostlin mohou také růst jako nediferencovaná pletiva, tzv, kalusy nebo jako buněčné populace v tekutých mediích, v suspenzních buněčných kulturách. Z tkáňových kultur lze zpětně získat celé rostliny, přesadit je do půdy a dále množit. Tkáňové kultury rostlin lze využít k celé řadě různých genetických zásahů. Lze jimi také navozovat mutace a tento způsob indukce mutací se využívá dokonce častěji, než působení záření a chemických mutagenů. Pomocí prašníkových kultur je možno takto získávat rostliny se základním gametickým počtem chromosomů 1n. Působením kolchicinu je možno takovéto rostliny diploidizovat (přesněji dihaploidizovat) a získávat tak zcela čisté linie. Pro šlechtitele je to zvláště výhodné v prvé generaci hybridů, protože tímto způsobem lze "obejít" štěpící generace a urychlit tak proces šlechtění nových odrůd až o několik let. Značně velké možnosti poskytuje využití rostlinných protoplastů, tedy buněk, zbavených buněčné stěny, se kterými je rovněž pracovat metodami tkáňových kultur. Důležitou metodou je somatická hybridizace rostlinných protoplastů různých druhů nebo i vzdálenějších taxonomických jednotek. V dalších fázích je možno dosáhnout regenerace buněčných stěn, dělení buněk a konečně vznik celých somaticky hybridních rostlin. Ty jsou geneticky odlišné od klasických hybridů (pokud je vůbec generativní hybridizací lze získat) především v tom, že počet chromosomů je součtem počtu chromosomů obou rodičů (což odpovídá amfidiploidii). Navíc, zatímco při generativní hybridizaci genetická výbava chloroplastů a mitochondrií při běžné generativní hybridizaci je shodná s genetickou výbavou mateřského jedince, při somatické hybridizaci může chloroplastová genetická výbava pocházet z jednoho či druhého druhu a mitochondriální může být navíc rekombinovaná. Klasickým příkladem hybrida, vzniklým somatickou hybridizací, je hybrid mezi bramborem a rajčetem. Praktického uplatnění však nedoznal, protože celá rostlina je jedovatá, vytváří jen malé plody a nevytváří hlízy. Vše o čem se psalo v této kapitole, jsou genetické změny, které nejsou genetickými modifikacemi. Termín genetické modifikace je populárním tisku zavedený, ne však nejlepší termín pro vnášení klonovaných genů do genomu. Tyto geny nemusejí nutně pocházet z nepříbuzných organismů. Zatímco přístupy klasické genetiky ve šlechtění umožňují využívat uvedených neusměrněných změn, jejichž podstatu známe jen obecně, genové inženýrství umožňuje vnášet jediný gen nebo malou skupinu genů, které známe zcela přesně (na úroveň primární sekvence basí v DNA). 2. Období genového inženýrství Poslední příklad současně ukazuje omezení významu hybridizačních metod a metod somatické hybridizace pro šlechtění rostlin. To současně zvýrazňuje význam transgenose - vnesení jednoho, přesně definovaného genu (nebo malé skupiny přesně definovaných genů) do dědičného základu - genomu metodami genového inženýrství. Tyto zásahy se často nazývají také genetické modifikace. Obdobná je i situace ve šlechtění hospodářských zvířat i v biochemickém využití mikroorganismů. Na genetických modifikacích je nové to, že přidáváme jediný gen nebo malou skupinu přesně (až na úroveň sekvence basí DNA) známých. Jsou tedy přímějšími a lépe definovanými změnami, než hybridizace nebo mutace, kdy povahu změn v potomstvu zcela přesně neznáme. Současně jsou jen dalším rozšířením spektra genetických metod používaných ve šlechtění rostlin. Přenášení genů, klonovaných metodami genového inženýrství je logickým pokračováním dosavadního vývoje uplatňování nových přístupů genetiky ve šlechtění rostlin. Je třeba si uvědomit, že metody klasické genetiky, aplikované na šlechtění, všeobecně indukují neusměrněné změny, ze kterých šlechtitelé vybírají změny, které směřují k cíli šlechtění. Mohou být založeny na výběru vhodných jedinců v potomstvu hybridů. Rostlinný 10

11 genom má zhruba genů (modelová rostlina huseníček, jejíž genom již byl sekvencován) až přes genů (u pšenice se předpokládá asi genů). Při křížení se smísí genomy obou rodičů a výsledné genomy ve štěpících generacích představují náhodný výběr z nesmírného množství všech existujících genových kombinací. Při mutačních zásazích dochází k náhodným změnám genů podobně, jako při využívání tkáňových kultur rostlin. Již mnoho desítek let neplatí, že by odrůdy kulturních rostliny byly přírodní a přirozené. Jsou produktem uvedených genetických metod, využívaných ve šlechtění rostlin. Právě tyto metody se zasloužily o jejich vysokou kvalitu a výnos. Přirozeným pokračováním vývoje jsou metody genových manipulací, které jsou založeny na principech, jež se rozvíjejí posledních 30 let. Jsou to metody, jejichž základem je využití specifických enzymů, které přesně definovaným způsobem upravují DNA. Hlavní z nich jsou restrikční endonukleasy - enzymy, které působí zlomy v přesně definovaných krátkých úsecích dvojvláknové DNA, často o délce 6 párů bází. To je spojeno s dalšími enzymy, které umožňují spojovat úseky DNA a které mají ještě mnoho jiných specifických funkcí. Geny jsou obvykle vřazován do bakteriálních plasmidů. Plasmid je kružnicová bakteriální DNA, která existuje a množí se nezávisle na chromosomální DNA, je mnohem menší a nese některé geny, které pro bakterii nejsou zcela nepostradatelné. Plasmidy, používané v genovém inženýrství byly upraveny tak, aby dobře sloužily jako nosiče pro množení a úpravy jakéhokoli klonovaného genu - vyjmutého z genomu a namnoženého v plasmidu v bakteriálních buňkách. Základní úpravy genu se dělají na plasmidech v bakteriích Escherichia coli a upravené plasmidy se pak přenášejí do bakterií A. tumefaciens, odkud jsou na nich obsažené geny vnášeny do rostlinných buněk. Enzymatické metody ve spojení s fyzikálními metodami (bakteriální transformace, sekvenování, konstrukce genomových knihoven, umělá syntéza polynukleootidů a jiné) umožňují širokou škálu nových přístupů. Jednou z nejdůležitějších je právě transgenose. Geny, které jsou transgenosí vnášeny, mohou pocházet z organismů zcela nepříbuzných (bakteriálních, virových, živočišných, rostlinných). Často to bývají chimérické geny (které jsou složeny z úseků, pocházejících z různých genomů) a mohou to být i syntetické geny, syntetizované na základě odpovídajících genů z přírody. Vnášení genů do rostlinného genomu je možné od r. 1978, kdy bylo prokázáno, že půdní bakterie Agrobacterium tumefaciens je schopna vnášet malou část své DNA do rostlinného genomu. Tohoto přirozeného přírodního principu bylo využito ke vnášení předem plánovaných a upravených genů do rostlinného genomu. Později byly vyvinuty i metody tak zvané přímé transformace, při nichž použití bakterií A. tumefaciens není třeba. Do rostlin byly v posledních pětadvaceti letech takto vneseny tisíce genů, většinou za účelem využití ve vědeckém výzkumu, někdy u s cílem praktického využití v nových odrůdách. V populárním tisku se nepoužívá pojem transgenní organismy, ale geneticky modifikované organismy (GMO). Při využití bakterií A. tumefaciens je třeba, aby geny, které chceme přenést do rostlin, byly nejprve metodami genového inženýrství a s využitím bakterií E. coli integrovány do vhodného vektorového plasmidu a v něm vneseny (transformací nebo bakteriální konjugací) do upraveného kmene bakterií Agrobacterium tumefaciens. Bakterií se pak inokulují rostliny. Je třeba, aby rostliny byly prosté jiných mikroorganismů, tedy aby byly kultivovány sterilně ve tkáňových kulturách. Při inokulaci bakteriemi A. tumefaciens přejde přesně vymezená část plasmidu, označovaná jako T-DNA (transferred DNA) z bakterií do některých rostlinných buněk a vestaví se do některého rostlinného chromosomu. K tomu dojde jen v malé frakci buněk. Je proto třeba vyselektovat ty rostlinné buňky, u kterých k vestavění došlo a proto DNA, vnášená do rostlin, musí obsahovat 2 typy genů: 1. Selektovatelné geny. Na základě jejich projevu je možno selektovat na vhodném výživném mediu ty rostlinné buňky, u kterých došlo k vestavění cizorodé DNA (transgenosi). 2. Vlastní funkční geny, které chceme do rostlin vnést a v rostlinách studovat a využívat. 11

12 Selektovatelné geny jsou často geny pro odolnost k některému antibiotiku (kanamycin, hygromycin). Mohou to být i geny pro toleranci k herbicidům (glyfosát) nebo jiné geny. Jestliže jsou rostlinná pletiva, na která bylo působeno bakteriemi A. tumefaciens kultivována na agarovém mediu s přidáním selekční látky, potom jsou schopné růst a dělit se jen ty buňky, které jsou transgenní. Ty pak dají vznik celým transgenním rostlinám, jež je možno přenést do půdy. V agarovém mediu musí být současně i další antibiotikum, vhodné pro eliminaci bakterií A. tumefaciens. Při přímé transformaci, bez využití bakterií A. tumefaciens, je postup velmi podobný. Transformace se nejčastěji provádí tak zvanou mikrobalistickou metodou pomocí mikroprojektilů. To znamená, že mikroskopické zlaté nebo wolframové kuličky o průměru mm, které nesou na svém povrchu plasmidovou DNA s transgenem, se pomocí speciálního zařízení vstřelují do rostlinných buněk. Některé z nich proniknou do buněčných jader a tam se plasmidová DNA uvolní a pravděpodobně se zabuduje do některého chromosomu. I ty kuličky, které proniknou pouze do cytoplasmy, uvolní svou DNA a ta má určitou, i když malou pravděpodobnost dostat se do buněčného jádra. Je třeba uvést, že většina zasažených buněk je průnikem kuličky natolik poškozena, že není schopna dalšího dělení. Účinnost metody je tedy poměrně malá. Další často používané metody přímé transformace jsou mikroinjekce přímo do buněčných jader (velmi účinné) nebo jen do pletiv (málo účinné), případně působení roztokem DNA na rostlinné protoplasty, při němž je stimulován průnik cizorodé DNA do cytoplasmy a z ní do buněčných jader. Speciálními metodickými postupy je možno u některých rostlinných druhů selektovat buňky, u nichž došlo k začlenění transgenu při přímé transgenosi do chloroplastové DNA. Výhodou je intenzivnější projev transgenu a to, že není přenášen pylem. 3. Genetické modifikace kulturních rostlin V současné době byly již metody transgenose vypracovány pro většinu kulturních rostlin. Množství typů transgenních rostlin, které jsou již využívány jako odrůdy, je přesto zatím velmi omezené. Tržně jsou uvolněny odrůdy těchto kulturních rostlin (seřazeno přibližně podle velikosti využívané zemědělské plochy): kukuřice, soja, řepka, bavlník, brambor, cukrovka, rajče, tabák, tykev, papaja, čekanka, karafiát. Celková plocha transgenních rostlin ve světě v r byla přes km 2. Počet malých pokusných políček, na kterých byly prováděny pokusy před tržním uvolněním odrůd, jde do sta tisíc Tolerance k herbicidům Jedná se o toleranci k poměrně novým typům herbicidů, jež jsou nejedovaté pro živočichy a člověka, po aplikaci mají krátkou životnost a v půdě jsou poměrně rychle biodegradovatelné prostřednictvím půdních mikroorganismů. Příčinou toxicity herbicidů pro rostliny obvykle je, že herbicid inokuluje některý konkrétní enzym, který je pro rostlinu nepostradatelný. Jedná se současně o enzym, který je specifický pro rostliny (a bakterie) a který se u živočichů nevyskytuje, nebo má jinou formu a funkci. Transgenní odrůdy tolerantní k herbicidům obsahují ve svém dědičném základu zpravidla transgeny pro toleranci k některému z těchto dvou hlavních typů herbicidů: Glyfosát: vyrábí firma Monsanto pod obchodním názvem Roundup. Tento herbicid blokuje v chloroplastech enzym, který se podílí na biosyntetické dráze aromatických aminokyselin. Porušení této biosyntézy u všech netransgenních rostlin vede již po několika dnech k úhynu rostlin. Enzym, který je kódován transgenem, je odolný k působení glyfosátu a liší se jen nepatrně od enzymu kódovaného rostlinným genem (v jedné variantě transgenní kukuřice se enzym kódovaný transgenem liší od odpovídajícího rostlinného jen dvěma aminokyselinami). Fosfinothricin (gluphosinate ammonium): vyrábí firma Aventis pod obchodním názvem Liberty. Přípravek blokuje rostlinný enzym pro přeměnu amoniaku na aminokyselinu glutamin. Hromadění amoniaku v netransgenní rostlině po působení fosfinothricinu je 12

13 příčinou rychlého uhynutí po aplikaci fosfinothricinu, ale rostliny s odpovídajícím transgenem přežívají Odolnost k hmyzím škůdcům Jsou druhou nejvíce využívanou skupinou genetických modifikací v transgenních odrůdách. Obsahují gen pro bílkovinu δ-endotoxin (enterotoxin) bakterie Bacillus thuringiensis. Tato bílkovina v bakteriích vzniká pouze při jejich sporulaci. Je známo téněř 200 kmenů této bakterie, které mají geny pro různé odlišné formy enterotoxinu. Tato bílkovina je jedovatá pro určité řády hmyzu dokonce preferenčně pro určité druhy. Spektrum hmyzu zahrnuje motýly, brouky a dvojkřídlý hmyz a liší se podle výchozího bakteriálního kmene. Toxin, produkovaný určitým bakteriálním kmenem je jedovatý jen pro jednu z těchto skupin hmyzu a zcela nejedovatý pro ostatní živočichy. Transgenní rostliny (kukuřice, bavlník, brambory) pak jsou odolné ke svým hlavním hmyzím škůdcům. Tím se ušetří mnoho insekticidů, které by se jinak musely aplikovat na pole s netransgenními odrůdami. Odpůrci transgenních rostlin namítají, že enterotoxin se kořenovou soustavou transgenních rostlin dostává i do půdy. Většina je ho sice brzy rozložena, ale část se adsorbuje na jílovitých částečkách půd a v této formě je poměrně stabilní. Bylo však prokázáno, že na půdní mikrofaunu to nemá vliv. Jiná námitka se týká toho, že se u hmyzích škůdců geneticky vyvíjí odolnost k δ-endotoxinu. Vzniká tím, že se v populacích hmyzu selektují spontánní mutace hmyzu se zvýšenou odolností k δ-endotoxinu. Je pravda, že v tomto ohledu se transgenní rostliny s transgenem pro δ-endotoxin v zásadě neliší od chemických pesticidů, na které rovněž u hmyzu vzniká odolnost. Genetici však vyvinuli opatření, jejichž cílem je rozvoj populací hmyzu, odolných k transgenním rostlinám s genem pro δ-endotoxin, maximálně oddálit s tím, že se předpokládá, že do té doby budou nové transgenní odrůdy, jejichž resistence k hmyzu je založena na jiných principech Další typy geneticky modifikovaných odrůd rostlin Existují (ale není jich mnoho) transgenní odrůdy, odolné k určitým rostlinným virům. Takováto transgenní rostlina ve svém dědičném základu obsahuje transgen pro obalový protein viru. Projev tohoto genu, který nemá nic společného se symptomy virového onemocnění, chrání rostlinu před napadením obdobným typem viru. Existuje i velké množství dalších typů transgenů, rostlinných i živočišných. Některé jsou schopné dodávat rostlinám obecnou odolnost k virům, ale v transgenních rostlinách se nepoužívají. Jiné odrůdy geneticky modifikovaných rostlin mají ve svém dědičném základu vnesený gen pro pylovou sterilitu a gen pro obnovu fertility pylu. Tato dvojice, zpravidla v kombinaci s tolerancí k herbicidům, umožňují snadno získávat hybridní (F 1 ) odrůdy. Prostřednictvím transgenose je možno také zablokovat aktivitu určitého genu nebo skupiny podobných genů. Jestliže se gen zabuduje obráceně do úseku, který obsahuje k němu příslušející regulační úseky, potom jeho přepisem vzniká RNA v obráceném smyslu, tedy protismyslová (angl. antisense) RNA. Ta tvoří se správnou mrna genu dvojvláknovou RNA, která nemůže být překládána do struktury bílkovin. Toho bylo využito již u prvé geneticky modifikované odrůdy, rajčete FlavrSavr, které bylo tržně uvolněno již v r Toto rajče má blokován gen pro galakturonidasu - enzym, který narušuje pektin v buněčných stěnách. Rajče zraje pomaleji, je méně napadáno skládkovými chorobami a ke spotřebiteli se dostane v dobrém, nepoškozeném stavu. Na podobném principu - blokádě syntézy ethylenu prostřednictvím antisense RNA, která blokuje syntézu jednoho enzymu, potřebného ke tvorbě tohoto rostlinného plynného hormonu, byly vyvinuty transgenní odrůdy karafiátu, jejichž květy vydrží delší dobu čerstvé ve váze. Existují dále transgenní odrůdy řepky, které mají odlišné složení olejů semen a jsou vhodné pro speciální použití, například v kosmetickém průmyslu, nebo k výrobě mazadel ve strojírenství. 13

14 3.4. Transgenní rostliny pro budoucnost Velké množství dalších typů transgenních rostlin je připraveno k uznání jako odrůdy. Jsou to především typy luskovin a obilovin s vhodnějším obsahem aminokysein v zásobních bílkovinách semen. Bílkoviny semen totiž mají nedostatek některých aminokyselin. Z tohoto důvodu nemohou rostlinné bílkoviny být plnohodnotnou náhražkou masa jako zdroje bílkovin v lidské výživě. Některé typy transgenních rostlin však mají poměr aminokyselin daleko příznivější a takové by mohly výrazně přispět ke zlepšení lidské výživy, zvláště v zemích třetího světa. Ještě důležitější jsou transgenní rostliny, které mají zvláštní hodnotu jako léčiva. Existují již typy transgenních rostlin, které syntetizují antigen, například úsek bílkoviny nějakého pathogena (např. viru hepatitidy typu C) a jsou schopny imunizovat člověka proti nákaze tímto virem. Dále jsou typy geneticky modifikovaných rostlin, které jsou schopny syntetizovat protilátky. Může jít o protilátky proti rostlinným patogenům a rostliny pak nejsou napadány, nebo o protilátky vhodné k využití v medicině, které ze z rostlin účinně izolovat. Konečně existují v této skupině další geneticky modifikované rostliny, které produkují vzácné bílkoviny, využitelné v medicině. Jednou z takovýchto bílkovin je například. hirudin - protein pijavky koňské, který zabraňuje srážení krve. Má významné použití při operacích, zabraňuje emboliím. Je možné ho produkovat v semenech transgenní řepky. Široké použití má tzv. zlatá rýže. Ta v obilkách produkuje β-karoten, provitamin vitaminu A. Jeho nedostatek je častou příčinou vývojových, zvláštně očních poruch u dětí třetího světa. Zlatá rýže má také zvýšený obsah železa. Byla vyvinuta teprve zcela nedávno a zatím není k dispozici jako tržní odrůda. Vědci, kteří tuto transgenní rýži vyvinuli, však ji dali bezplatně k využití pro vývoj odrůd v zemích třetího světa. Bylo by možno uvést celou řadu příkladů nových typů geneticky modifikovaných rostlin, které mají nová průmyslová využití: transgenní rostliny, které produkují nové typy dřeva, jiné, které produkují biodergradovatelné polymery, vhodné pro využití v obalové technice místo umělých hmot a další Transgenní rostliny ve vědě Jestliže počet transgenů, které se uplatnily v nových odrůdách, můžeme počítat na desítky a těch, které jsou perspektivní pro šlechtění na stovky, počet transgenů v různých typech transgenních rostlin pro vědecký výzkum jde dnes již do tisíců. Transgenní rostliny se využívají především pro studium genové regulace a pro funkční genomiku - přisuzování funkcí jednotlivým známým genům. 4. Předpokládaná rizika geneticky modifikovaných rostlin Transgenním rostlinám se přisuzují mnohé potenciální negativní vlastnosti. Předpokládají se negativní vlivy na přírodní prostředí, přírodní společenstva a zdraví člověka i zvířat. I když žádné bezprostřední negativní vlivy nebyly prokázány, antibiotechnologčtí aktivisté varují před dlouhodobými vlivy, které se mohou podle jejich názoru projevit až po desítkách let. Jsou to názory těžko vyvrátitelné bez vědeckých argumenů, protože těm zpravidla nechtějí naslouchat. Teoretická možnost nepříznivých účinků transgenních rostlin musí zajímat vědce dříve, než rostliny uvedou do prostředí. Rozhodujícím je tedy okamžik kdy se přechází z uzavřeného způsobu kultivace transgenních rostlin z laboratoře, kultivační místnosti nebo uzavřeného skleníku do volné přírody - nejprve na pokusný záhon nebo políčko. Toto stadium se nazývá uvolnění do prostředí a představuje také legislativní krok. Vždy je třeba požádat o povolení oprávněný státní orgán, pověřený realizací zákona o GMO. Ten si vyžádá tzv hodnocení rizika, t.,j. přehled možných nepříznivých vlivů a dosavadních zkušeností, podložených vědeckými výsledky. Uvolňování GMO do prostředí se děje případ od případu a krok za krokem. 14

15 Závažnou námitkou je možnost vzniku toxických nebo alergenních produktů v důsledku transgenoze. Transgeny jsou vždy sekvenovány. Je známo nejen pořadí basí DNA, ale i odpovídající pořadí aminokyselin v bílkovině, z toho je možno modelovat strukturu bílkoviny a je známa i její funkce. Na základě analogie se strukturou genů a odpovídajících bílkovin v molekulárně genetických Internetových databasích je možno předpovídat další vlastnosti a experimentáleně je ověřovat. Samozřejmě, pokud se transgenní rostlina má stát odrůdou, musí být zcela vyloučeny možnosti toxických produktů genu. Co se týče alergenity, malá frakce bílkovin má alergenní vlastnosti. Pro transgenosi platí základní pravidlo: výchozí organismus, z něhož je transgen isolován, nesmí mít alergenní vlastnosti. Pokud by je měl, je třeba provést důkazy, že je nemá bílkovina, kódovaná přeneseným genem. Transgenní rostliny, které mají být využity jako odrůdy, musí být testovány z tohoto hlediska. V souvislosti s transgenními odrůdami tolerantními k herbicidům se někdy hovoří o nebezpečí, že transgen se přenese pylem do dědičného základu nepříbuzných planých druhů, ty se stanou k herbicidu odolné a budou se množit jako obtížný plevel. Toto nebezpečí není nijak velké. Z transgenních rostlin, které přicházejí v úvahu ve střední Evropě, se uvažuje o této potenciální možnosti hlavně u řepky. Ani tam však oplození příbuzných planých rostlin a další rozšíření transgenu není příliš pravděpodobné. Mezidruhoví hybridi zde vznikají vzácně a jsou částečně nebo úplně neplodní. Pokud by takovéto plané rostliny vznikly a rozšířily se, byly by nebezpečím především pro firmu, která transgenní rostliny a k nim odpovídající herbicid produkuje - herbicid by se stal k ošetřování transgenních rostlin daného druhu nepoužitelný. Přesto se možnost přenosu transgenu pro toleranci k hmyzu do planých druhů, tak do kulturních netransgenních rostlin téhož druhu pečlivě sleduje v četných výzkumných projektech. Někdy se hovoří o tzv. horizontálním přenosu genů. To znamená, že se předpokládá, že geny se mohou přenášet v přírodě mezi nepříbuznými druhy podobně, jako při pokusu s transgenosí. Nebylo to experimentálně potvrzeno, s výjimkou přenosu plasmidů a jimi nesených genů mezi různými druhy bakterií. Všechna z toho vyplývající údajná nebezpečí (přenosu selektovatelného genu pro odolnost k antibiotiku z transgenní rostliny do bakterie, přenosu genů z transgenní, ale ne netransgenní rostliny do trávicího traktu člověka) jsou vykonstruovaná a nikdy nebyla prokázána. 5. Geneticky modifikované mikroorganismy Základním krokem genových manipulací je namnožení klonované sekvence DNA, jež je součástí bakteriální mimochromosomální DNA - plasmidu, který se množí v bakteriích Escherichia coli. V dalších krocích se může opět štěpit restrikčními endonukleasami, upravovat, sekvencovat nebo přenášet do dalších prokaryontních či eukaryoontních hostitelů. Genetické modifikace rostlin a živočichů tak nutně zahrnují i genetické modifikace bakterií. Konstrukce plasmidu však může být i taková, že umožňuje projev vloženého genu přímo v bakteriální buňce E. coli. Jinou bakterií, která je využívána již i pro biotechnologickou produkci proteinů na základě rdna, je Bacillus subtilis. Při produkci bílkovin, které jsou eukaryotního původu, v bakteriálních buňkách však bílkovinám často chybí nezbytné posttranslační modifikace (acetylace, glykosylace). Proto se k produkci proteinů často využívá kvasinek Saccharomyces cerevisiae nebo jiných eukaryontních buněk, které lze pěstovat ve fermentorech. Řadu dalších bílkovin je však nutno získávat z rostlinných nebo živočišných buněk právě proto, aby měly příslušné modifikace. První úkoly, které stály před biotechnology a byly řešeny již před cca 20 lety, byla produkce vzácných bílkovin, potřebných v medicině. V klasickém období rozvoje mikrobiálních biotechnologií se pozornost soustředila na tři okruhy genetických modifikací: 1. Produkce lidského růstového hormonu. Tento hormon u člověka napravuje některé specifické dědičné vývojové defekty. Před érou biotechnologií byl velmi omezeně dostupný, bylo možno jej získávat pouze z mrtvých lidí. Biotechnologicky, pomocí geneticky 15

16 modifikovaných mikroorganismů, je možné tuto bílkovinu produkovat v dostatečně velkém množství. 2. Produkce insulinu. Pro nemocné cukrovkou se insulin klasickým způsobem získávají z živočišných zdrojů. U některých nemocných však časem k tomuto insulinu vzniká alergie. Pro takové osoby je nyní dostupný lidský insulin, produkovaný biotechnologicky pomocí mikroorganismů. 3. Produkce interferonu. To je protivirový protein, vyráběný buňkami savců. Jeho terapeutické účinky nebyly bez biotechnologické produkce přesně známy, protože ho nebylo možno získat větší množství. Působí i proti některým nádorovým chorobám, základní obrat v medicině však nepředstavuje. V současné době se spektrum vzácných proteinů, které lze produkovat pomocí mikroorganismů s rdna, stále zvětšuje. V mnoha případech jsou alternativní možnosti produkce pomocí mikroorganismů, rostlin nebo živočichů a je třeba zvažovat, který způsob je u daného proteinu nejvýhodnější. 6. Geneticky modifikovaní živočichové Možnost vnášet jednotlivé geny do živočišných buněk se stala reálnou přibližně ve stejné době, jako u rostlin,m tedy asi před třiceti lety. Je možno získávat geneticky modifikovaný hmyz, ryby, obojživelníky, ptáky a savce. Často se využívá mikroinjekcí do jader vajíček, případně mikroprojektilů. Kromě sekvencí DNA na plasmidů se používají také speciálně upravené virové vektory. Základním typem virů pro ně jsou retroviry. To jsou živočišné a lidské viry, které mají schopnost se zabudovávat do chromosomů a reprodukují se prostřednictvím transkripce, vzniká tedy RNA. Ta je pak převáděna do formy DNA v buňkách zvláštním enzymem reversní transkriptasou, která je kódována přímo virovým genomem. U savců existuje tradiční modelový objekt transgenose - myš. Provádí se ale také u ovcí, koz, a prasat, skotu a podařila se i u primátů. Hlavní praktické cíle transgenose jsou: intenzita růstu, odolnost proti chorobám, změny kvality živočišných produktů, produkce transgenních zvířat pro xenotransplantace a produkce léčiv pro medicinu. Co se týče zvýšení intenzity růstu, mnoho pokus bylo provedeno s genem pro růstový hormon z různých zdrojů.myši skutečně rostly daleko rychleji, ale u hospodářských zvířat se k intenzivnímu růstu připojily různé nepříznivé vedlejší vlivy jako poruchy kloubů a defekty končetin. Rybí varianta genu silně zvyšuje růst u lososovitých ryb. Transgenní lososi s tímto genem mají až 43x větší váhový přírůstek. Takovéto ryby by mohly mít selekční výhodu proti původním typům a postupně je vytěsnit. To by však mohlo vést k rozsáhlejšímu porušení přirozené biologické rovnováhy ve vodních ekosystémech. Proto se zatím pěstují jen jejich triploidní (s počtem chromosomů 3n) sterilní varianty, které nejsou schopné rozmnožování, a to jen v uzavřených nádržích. Do genomu živočichů bylo experimentálně vneseno několik genů, které zvyšují odolnost vůči chorobám. Je to například gen pro plášťový protein viru ptačí ptačí leukosy vyvolává odolnost vůči tomuto ptačímu viru. Je možno provádět imunizaci živočichů přímo vnesením genů pro lehký a těžký řetězec imunoglobulinů monoklonálních protiiátek. Byl přenesen myší gen Mx, který navozuje odolnost proti chřipkovým virům. Rovněž gen pro protimrznoucí protein (antifreeze protein) z dědičného základu některých arktických ryb byl vpraven do genomu lososa. Blokuje růst krystalů ledu v krvi a tím zvyšuje odolnost ryb vůči mrazu. Co se týče změn kvality živočišných produktů prostřednictvím transgenose, jsou zatím obecně v experimentálním stadiu. Celá řada směrů výzkumu se týká úpravy kravského mléka. Mnoho lidí nemůže pít mléko, protože nemohou štěpit cukr laktosu - chybí jim k tomu příslušný enzym. Existuje několik způsobů, jak genetickými modifikacemi obsah laktosy v mléce snížit, i když ho nelze zcela odstranit. Jsou rovněž snahy odstranit z mléka složku, která u některých lidí způsobuje alergii. Další výzkumný směr se týká humanizace mléka - snahy 16

17 získávat kravské mléko s bílkovinami mateřského mléka, vhodnými pro výživu kojenců. Jiné směry výzkumu, u dalších hospodářských zvířat, usilují o zvýšení kvality masa, kvality vlny a dalších parametrů. Směr využití transgenose živočichů, který se opouští, je produkce transgenních zvířat pro xenotransplantace. Možnost transplantace živočišných (prasečích) orgánů by mohla zachránit život mnoha lidem. Při transplantaci živočišné tkáně ale dochází k velmi rychlému odvržení transplantátu - jeho nekrose. Tomu lze předejít vnesením některých lidských genů do zvířecího genomu. Existují však nebezpečné prasečí viry, přenosné na člověka a proto byl tento směr výzkumu pozastaven. Poslední směr se týká produkce léčiv pro medicinu prostřednictvím transgenních živočichů. Léčivem pro hemofiliky může být např. lidská bílkovina - faktor srážlivosti krve IX, který lze produkovat v mléce transgenních zvířat. Stádo několika desítek krav by bylo schopno pokrýt celosvětovou potřebu této bílkoviny. 7. Genetické modifikace tělních buněk člověka V některých případech dědičných onemocnění (cystická fibrosa) a některých nádorových onemocnění (zvláště krvetvorných buněk) existují různé, zatím individuálně a experimentálně využívané možnosti, jak vnesením transgenu napravit dědičný defekt nebo pomoci zastavit nádorový růst. Jako nádorová onemocnění mají mnoho typů, tak je i mnoho možností léčení některých typů zhoubného bujení transgenosí. Již je na světě více než stovka lidí, kterým transgenose zachránila život. Existují dva způsoby vnášení cizorodé DNA: - In vivo. DNA se vnáší přímo do těla. Může to být DNA adenovirů s určitým vřazeným genem. Adenoviry v buňkách projevují svou dědičnou informaci, ale nezabudovávají se do chromosomů. Postupně množství adenovirů klesá. Pak klesá i projev s nimi vneseného genu a proceduru je třeba opakovat. Upravené retroviry naopak svou genetickou informaci do malé části tělních buněk zabudovávají a projevuje se trvale. - In vitro. Při tomto způsobu jsou tělní buňky (obvykle krvetvorné buňky) z těla vyjmuty, kultivovány in vitro na umělém mediu a je do nich zabudován malý úsek další genetické informace. Buňky s touto změnou jsou pak ve tkáňové kultuře vyselektovány a namnoženy a pak jsou vpraveny znovu do těla. Transgenoze zárodečné linie člověka se neprovádí. Nebyla by etická, i po biologické stránce by byla pochybná. 8. Postoj veřejnosti Genetické modifikace a jejich praktické využité představují široké spektrum otázek mikrobiologických biotechnologií, nových směrů ve šlechtění rostlin, nových směrů plemenářství i nových směrů mediciny. Poslední dvě odvětví jsou v experimentálním stadiu. Geneticky modifikované mikroorganismy se využívají v průmyslových biotechnologiích bez velké pozornosti veřejnosti. Značná pozornost veřejnosti v negativním smyslu je věnována transgenním rostlinám. Poloviny americké produkce kukuřice i podstatná část soji představuje plodiny transgenní. Absenci jakýchkoli negativních vlivů prokázala nejen věda a výzkum, ale i praxe, to, že se již po více než 5 let ve velkém konzumují a potraviny z nich připravené běžně jedí miliardy lidí bez jakýchkoli nepříznivých následků.. Přesto veřejnost požaduje značení transgenních potravin. V současné době se provádí všude dokonce značení transgenních rostlinných produktů od pěstování na poli až ke spotřebiteli. Legislativa v Evropě, která upravuje pěstování a využívání transgenních plodin, je určována spíše snahou politiků naklonit si voliče, tedy politickými, méně však biologickými aspekty. Lze očekávat, že jde o přechodný stav a opatření registrace a kontroly transgenních plodin a z nich vyrobených potravin se bude časem zmirňovat. Svou negativní úlohu v něm sehrály tzv. ekologické organizace typu 17

18 Greenpeace, které mají v programu bojovat proti transgenním odrůdám rostlin. Jejich boj je obdobou boje proti parním strojům, železnici a automobilismu v minulosti. 9. Legislativa týkající se geneticky modifikovaných organismů Již v průběhu prvých pokusů na genovém inženýrství mikroorganismů si biologové uvědomili potenciání nebezpečí, které genové inženýrství může obsahovat a v roce 1974 uveřejnili v odborných časopisech Nature a Science výzvu k dočasnému zastavení pokusů s rekombinovanou DNA do doby svolání konference, na které se vědečtí pracovníci dohodnou, zda v pokusech dále pokračovat a za jakých podmínek. Tato konference se sešla v r v americkém městě Asilomaru. Bylo dohodnuto pokračování s tím, že bakterie Escherichia coli, v nichž se rekombinovaná DNA převážně pěstuje, budou upraveny tak, aby nemohly přežít mimo specifické laboratorní podmínky. Rovněž laboratoře s rekombinovanou DNA od této konference mají svou ochranu danou vybavením, která je odstupňována do čtyř stupňů podle potenciální nebezpečnosti rekombinované DNA. První regulace GMO tedy zavedli biologové Legislativa USA, Kanady a Evropského společenství Zásadní rozdíl v přístupu ke GMO je mezi legislativou v USA a Kanady na jedné straně a mezi evropskými zeměmi na straně druhé. V USA a Kanadě se za potenciální zdroj rizika nepovažuje metoda, jakou bylo určitého typu organismu dosaženo, ale jeho vlastnosti. Neexistuje tedy speciální zákonná úprava pro práci s GMO, ale například transgenní odrůdy rostlin, resistentní k herbicidům, nebo škůdcům, musí vyhovovat některým předpisům o pesticidech. GMO se posuzují pode běžně platných zákonů, například Federálního zákona o insekticidech, fungicidech a rhodenticidech, zákona o rostlinných škůdcích a dalších. V Evropském společenství se GMO posuzují zcela odděleně. Principem posuzování je již to, že obsahují rekombinovanou DNA. Před deseti lety byly vydány dvě směrnice 90/219/EEC (která se vztahuje pouze na geneticky modifikované mikroorganismy) a 90/220/EEC, která reguluje uvádění geneticky modifikovaných organismů do prostředí a na trh. Tyto směrnice, které byly novelizovány, v zásadě ukládají členským státům přijmout odpovídající opatření k ochraně lidského zdraví a prostředí před možnými nežádoucími účinky GMO a ustanovit příslušný orgán státní správy, který bude zajišťovat registraci práce s GMO a dozor nad ní. Každý stát evropského společenství má vlastní legislativu, týkající se GMO, která musí ovšem být v souladu s touto základní směrnicí Legislativa v České republice U nás existuje od Zákon č. 153/2000 o nakládání s geneticky modifikovanými organismy a produkty a o změně některých dalších zákonů. V zásadě implementuje uvedené dvě evropské směrnice a předvídá další vývoj legislativy v ES. Garantem zákona je Ministerstvo životního prostředí, ve spolupráci s Ministerstvem zemědělství a Ministerstvem zdravotnictví. Podle tohoto zákona každá právnická osoba, která hodlá nakládat s GMO, musí podat žádost o zapsání do seznamu uživatelů. Současně geneticky modifikovaný organismus, se kterým bude nakládat, musí být zařazen do seznamu geneticky modifikovaných organismů. Existují tři typy nakládání s GMO: - Uzavřené nakládání (v laboratoři, kultivační místnosti, fermentoru, uzavřeném skleníku nebo zvěřinci) - Uvádění do prostředí (např. pokusné pěstování transgenních rostlin v přírodě), kdy již není možno zcela zabránit nekontrolovanému šíření, ale jeho objem je omezen. - Uvádění do oběhu, kdy transgenní organismus je volně dostupný (je v prodeji) a jeho další šíření není legislativně omezeno. Jednotlivé fáze musí následovat za sebou v tomto pořadí, žádnou nelze přeskočit. Pokud však transgenní rostlina byla vyvinuta v zahraničí a tam provedena prvá nebo prvé dvě fáze, po nichž následovalo hodnocení, mohou výsledky tohoto hodnocení být u nás akceptovány a již 18

19 proběhlé fáze se nemusí opakovat. V každém případě, i po uvolnění do oběhu, je nutno provádět monitoring geneticky modifikovaného organismu. Existují také čtyři kategorie rizika nakládání s GMO. Podle zákona:. První kategorie rizika představuje činnost bez rizika nebo s minimálním rizikem škodlivého působení na zdraví člověka a zvířat, životní prostředí nebo biologickou rozmanitost. - Druhá kategorie rizika představuje činnost s rizikem takového škodlivého působení na zdraví člověka a zvířat, životní prostředí nebo biologickou rozmanitost, které může být snadno odstraněno obecně známými opatřeními. - Třetí kategorie představuje činnost s rizikem takového škodlivého působení na zdraví člověka a zvířat, životní prostředí nebo biologickou rozmanitost, které může být odstraněno jen zvláště náročnými zásahy. - Čtvrtá kategorie představuje činnost s rizikem takového škodlivého působení na zdra ví člověka a zvířat, životní prostředí nebo biologickou rozmanitost, které zanechává trvalé následky a nemůže být zcela odstraněno ani zvláště náročnými zásahy. V praxi se setkáváme především s první a druhou kategorií rizika nakládání s GMO. Žádosti o zapsání do seznamu uživatelů a geneticky modifikovaných organismů podle zákona posuzuje Česká komise pro nakládání s geneticky modifikovanými organismy. Skládá se z odborníků v molekulární genetice a genovém inženýrství, odborníků na mikroorganismy, šlechtitelů rostlin i odborníků na živočišnou genetiku, hygieniků, právníků, a odborníků na otázky životního prostředí i zástupců občanských sdružení. Posuzuje žádosti o zapsání o seznamu uživatelů a geneticky modifikovaných organismů a doporučuje Ministerstvu životního prostředí jejich povolení, případně doporučuje změny, které je třeba v žádostech udělat. Současně provádí kontrolu pracovišť, kde se pracuje s GMO a dostává od nich pravidelná hlášení o postupu práce. Sleduje vědecký a legislativní pokrok v otázkách GMO ve světě a uvádí ho do souladu s odbornou a legislativní úrovní v ČR. Komise má tedy dobře zmapovánu situaci práce s GMO v ČR Budoucnost nakládání s geneticky modifikovanými organismy Parlament a Rada EU připravují nové nařízení o geneticky modifikovaných organismech a potravinách nebo krmivech nich vyrobených. Značení se bude týkat sledovanosti a značení geneticky modifikovaných organismů a potravinářských výrobků, vyrobených z GMO nebo příměsí výrobků, obsahujících GMO. Předpokládá, že Komise EU zavede systém jednoduchého numerického kódu pro GMO. Tento kód bude doprovázet organismus od jeho produkce až ke spotřebiteli, nebo ke zpracování, které z něj učiní neživý produkt. Ten bude opatřen již jen nápisem Vyrobeno z GMO. Nařízení se týká i výrobků z GMO, které neobsahují zjistitelné stopy nukleových kyselin a bílkovin (např. olejů). Není vyžadováno u produktů, vyrobených s pomocí GMO, např. u živočišných produktů zvířat, krmených geneticky modifikovanými rostlinami. Podle Zákona č. 306/2000 Sb. o potravinách a tabákových výrobcích u nás od příštího roku bude nutno značit potraviny, které obsahují příměs GMO. Existuje několik laboratoří, které provádějí detekci příměsi GMO v surovinách a potravinách. Metoda je založena na analýze přítomnosti specifických sekvencí DNA (tzv. metoda PCR). Aby měla smysl, musí být schopna zachytit úsek části genu, tedy úsek, který tvoří méně než 1/ obsahu DNA v jádře. Tento úsek musí umět zachytit v množství příměsi menším než 1%, čímž se požadavek na citlivost metody opět o dva řády zvyšuje. Cena analýzy representativního vzorku potravin nebo surovin se pohybuje v rozmezí tisíců až desítek tisíců korun. Podle zákona č. 153/2000 Sb. však pokuty za neoprávněné nakládání s GMO dosahují výše statisíců až milionů korun. Tato opatření jsou vynucena veřejností, silně negativně ovlivněnou antibiotechnologickými organizacemi. Dočasně je ve světě sice možná koexistence maximálního využívání předností GMO v USA a Kanadě a obav a vyhýbání se jim v Evropě, není to ale trvalý stav. 19

20 Závěry: U většiny kulturních plodin neexistují přirozené odrůdy, získané výběrem. Všechny současné odrůdy kulturních plodin byly získány kombinací různých přístupů moderní genetiky. Genetické modifikace - včleňování jednotlivých genů nebo malých skupin genů do dědičného základu, jsou nejnovějším členem řady těchto přístupů. Zavádění geneticky modifikovaných rostlin do přírodního prostředí se provádí v postupných krocích, které se vyhodnocují. Využívají se také geneticky modifikované kultury mikroorganismů a spíše v experimentálním stadiu, než ve stadiu běžného využití, jsou geneticky modifikovaní živočichové. V ČR se geneticky modifikované odrůdy tržně nepěstují, ale pěstují se na malých plochách postupně. Podle zákona č. 153/2000 veškeré kultivace geneticky modifikovaných organismů povoluje, registruje a sleduje Ministerstvo životního prostředí spolu s Českou komisí pro nakládání s geneticky modifikovanými organismy, Ministerstvem zemědělství a Ministerstvem zdravotnictví. Žádné nepříznivé vlivy geneticky modifikovaných rostlin zatím u nás ani kdekoli jinde nebyly zjištěny. Geneticky modifikované odrůdy rostlin se tržně pěstují od r a v roce 2000 se pěstovaly na celkové ploše přes km 2. Potraviny a produkty z nich vyrobené se v USA a Kanadě používají bez omezení a žádné zdravotní ani jiné problémy nevznikly. Přesto v EU jsou a v ČR od příštího roku budou výrobky, obsahující geneticky modifikované organismy, při prodeji značeny. Literatura Římanová, D., Doubková, Z.: Zákon o nakládání s geneticky modifikovanými organismy a produkty a o změně některých dalších zákonů včetně prováděcích předpisů s komentářem. Nakl. Polygon, Šifner, F. a kol.: Vybrané kapitoly z biotechnologií pro studující učitelství biologie a ekologické výchovy. (Skriptum). Karolinum, Praha *Adresa autora: Doc. RNDr. Miloš Ondřej, DrSc. Ústav molekulární biologie rostlin AVČR České Budějovice Branišovská ondrej@umbr.cas.cz tel. 038/ fax 038/