Degradační produkty proteinových aduktů v moči jako nový typ biomarkerů v toxikologii

Rozměr: px

Začít zobrazení ze stránky:

Download "Degradační produkty proteinových aduktů v moči jako nový typ biomarkerů v toxikologii"

Miloslav Vaněk
před 5 lety
Počet zobrazení:

1 28.Teisingerův den průmyslové toxikologie, Degradační produkty proteinových aduktů v moči jako nový typ biomarkerů v toxikologii J. Mráz, I. Linhart *, I. Hanzlíková, Š. Dušková, L. Dabrowská, H. Chrástecká, E. Černá, K. Černá Státní zdravotní ústav, Praha * VŠCHT Praha

2 TXIKLGIE nauka o interakcích škodlivých látek s živými organismy, jejich mechanismech, projevech a důsledcích Hodnocení rozsahu expozice chem. látkám Hodnocení biochemického/ biologického účinku chem. látek stanovení v prostředí biomarkery fyziologické vyšetření fyzické vyšetření

3 28.Teisingerův den průmyslové toxikologie, Biomarkery v toxikologii Míra rozsahu interakce chemické látky s organismem: biomarkery expozice biomarkery biochemického/biologického účinku Vnímavost organismu k poškození chemickou látkou: biomarkery vnímavosti (susceptibility) Využití biomarkerů expozice a biochemického/ biologického účinku při ochraně zdraví osob při práci: biologické expoziční testy (BET) (Vyhláška č. 432/2003 novela 107/2013) 3

4 Biomarkery v toxikologii 28. Teisingerův den průmyslové toxikologie, Výchozí látky v biologickém materiálu (moč, krev, vydechovaný vzduch, sliny, vlasy ) Metabolity v biologickém materiálu (moč) Adukty s buněčnou DA DA adukty v moči Adukty s proteiny (globin, albumin) Změněné hladiny endogenních látek Cytogenetické biomarkery (CA, SCE, M, etc.) Genotyp biotransformačních enzymů BM expozice BM biochemického/ biologického účinku BM vnímavosti

5 Biomarkery v toxikologii 28. Teisingerův den průmyslové toxikologie, Výchozí látky v biologickém materiálu (moč, krev, vydechovaný vzduch, sliny, vlasy ) Metabolity v biologickém materiálu (moč) Adukty s buněčnou DA DA adukty v moči Adukty s proteiny (globin, albumin) Změněné hladiny endogenních látek Cytogenetické biomarkery (CA, SCE, M, etc.) Genotyp biotransformačních enzymů BM expozice BM biochemického/ biologického účinku BM vnímavosti

6 Adukty s buněčnou DA: biomarkery efektivní dávky v cílové tkáni invasivní odběr vzorku (krve) pracná a složitá analýza DA adukty v moči: korelace s hladinami aduktů v buněčné DA (?) neinvasivní odběr vzorku (moče) Instrumentálně náročná analýza

7 H 2 H CH 3 Krüger a Salomon, Hoppe-Seyler s Zeitschrift für physiologische Chemie, 1898 isolace 3.4 g 7-MeGua z l lidské moče 7-methylguanin (první identifikovaný DA adukt v moči) H H 2 dr H 8-H-2 -deoxyguanosin (marker oxidativního stresu)

8 Projekt MŠMT ( ) ová strategie biologického monitorování expozice mutagenům a karcinogenům (řešitel I.Linhart, VŠCHT Praha) Cíl Identifikovat v moči DA adukty toxikologicky významných chemických látek jako potenciální biomarkery jejich expozice/účinku styren benzen 3-aminobenzanthron

9 Hlavní vazebná místa pro chemické látky v DA Ade H H H H CH 3 H Thy Gua - P H 7 3 H... H H... H... H H P - Cyt pro elektrofilní látky pro volné radikály

10 Výsledky a závěry styren Myš: po vysokých inhalačních expozicích v moči snadno stanoveny 4 DA adukty Člověk (profesionální expozice): nalezen jediný DA adukt, výtěžek v moči řádově nižší než u myší, nález jen u některých osob, nízká specifita málo vyhovující biomarker benzen Myš: po vysokých inhalačních expozicích v moči stanoven jediný DA adukt, nález jen u některých zvířat Člověk (profesionální expozice): žádný hledaný DA adukt nenalezen

11 Proč adukty s globinem? Vhodná náhrada za adukty s DA Dlouhodobá persistence v organismu po celou dobu života erythrocytů (u člověka ca. 125 dní) Dostupnost v dostatečném množství (140 mg/ml krve) Zavedené analytické postupy Doporučené pro hodnocení expozice na pracovištích (biologické limity, BET) Použitelné pro alkylační činidla (např. epoxidy), arylaminy, isokyanáty,,-dimethylformamid

12 ucleophilic sites in globin CH(CH 3 ) 2 CH 2 SH (CH 2 ) 4 H 2 H 2 C H C H C H C H C H C Val Cys Lys H H CH 2 CH 2 H C H C H C H C His Tyr

13 Toxicokinetics of globin adducts in humans MVH (nmol/g globin) days -methylcarbamoylvaline level in globin following single percutaneous exposure to DMF in human volunteers

14 Globin adducts: structure Val Leu His Phe Pro Lys Gly Cys Ile Gln xenobiotic Ala Arg nucleophilic amino acid Gly Ala Cys Trp Leu Phe Gly Gly Asp Tyr Ala Lys His Gly Glu Ile Pro Met Gln Cys Ala

15 Globin adducts: methods of analysis (1) Edman degradation (for adducts of isocyanates) Modified Edman degradation (for adducts of alkylating agents) Val Val Leu His Phe Pro Lys Gly Cys Ile Gln Ala Arg Gly Ala Cys Trp Leu Phe Gly Gly Asp Tyr Ala Lys His Gly Glu Ile Pro Met Gln Cys Ala

16 Globin adducts: methods of analysis (2) Total hydrolysis (acidic or enzymatic with pronase) Val Le u His Phe Pro Ly s Gly Cys Ile Gln Ala Gly Ala Cy s Tyr Trp Le u Phe Gly Gly Ar g Asp Ala Ly s His Gly Glu Ile Pro Me t Gln Cys Ala Val Le u His His Phe Pro Ly s Gly Cys Cys Ile

17 Adukty s buněčnou DA Produkty odbourávání v moči Adukty s globinem? Produkty odbourávání v moči (téměř žádné informace)

18 Pracovní hypotéza projektu IGA T /2012 Po ukončení životnosti erythrocytu je globin s navázanými adukty odbourán proteolytickou degradací, při níž se uvolní: volné aminokyseliny, které (znovu) vstoupí do fyziologických metabolických cyklů volné aminokyselinové adukty, které se vyloučí močí

19 Modifikované aminokyseliny v moči Modifikace endogenními procesy Klinická medicína 3-methylhistidin: obnova/degradace kosterního svalstva prolyl-4-hydroxyprolin: obnova/degradace kostních proteinů (při osteoporóze) Modifikace cizorodými látkami Průmyslová toxikologie, hygiena: nevyužíváno

20 Výzkumný plán Etapa 1 Studium vylučování aminokyselinových aduktů po jejich podání in vivo 1) Syntéza modelových aminokyselinových aduktů 2) Vývoj analytických postupů 3) Podání potkanům, sběr moči 4) Analýza moči: stanovení podaných látek a/nebo jejich (očekávaných) metabolitů; identifikace neočekávaných produktů

21 Amino acid adducts: model compounds Precursor in vivo Reactive species Amino acid Adduct,-dimethylformamide methylisocyanate Val Lys -methylcarbamoyl-val ε -methylcarbamoyl-lys ethylene oxide ethylene oxide Val -(2-hydroxyethyl)-Val Cys S-(2-hydroxyethyl)-Cys acrylamide acrylamide Val -(2-amidoethyl)-Val Cys S-(2-amidoethyl)-Cys styrene styrene oxide Val -(2-hydroxy-1-phenylethyl)-Val -(2-hydroxy-2-phenylethyl)-Val Cys -(2-hydroxy-1-phenylethyl)-Cys -(2-hydroxy-2-phenylethyl)-Cys

22 Aminokyselinové adukty methylisokyanátu H 3 C CH 3 H 3 C CH 3 H 2 H H H CH 3 H C H 3 Val CH 3 H -methylcarbamoyl-val (MVU) methylisocyanate (MIC) H 2 H H H H 2 H 2 Lys (5)-methylcarbamoyl-Lys (MLU)

23 Aminokyselinové adukty ethylenoxidu ethylenoxid (E) H H 2 Val SH H H 2 Cys H H H 2-hydroxyethyl-Val (HEV) H S H H 2 2-hydroxyethyl-Cys (HEC)

24 Výtěžky aduktů a jejich metabolitů v moči potkanů (0-24 h) po i.p. podání aduktů, 10 mg/kg Podaný adukt Látky stanovené v moči potkanů a jejich výtěžek (%) 1) Výchozí látka Metabolický produkt HEV HEV 29; 33 HEC HEC <1 % HEMA, CMMA MVU MVU 58; 105 n.m. 2) MLU MLU 0,5; 0,5 MLU-Ac 46; 70 1) individuální hodnoty, n=2; 2) n.m. neměřeno

25 Aminokyselinové adukty: další přeměny H H C H 3 H H C H 3 H H MLU H 2 MLU-Ac H CH 3 H H H S H S H S H H 2 H H HEC CH 3 CH 3 HEMA CMMA

26 Analytické postupy: isolace z moče Extrakce do kapaliny nevyhovující Extrakce na pevné fázi (SPE) Alkylace s reaktivními chlor-formiáty + extrakce v jediném kroku Lyofilizace + esterifikace RH.HCl + extrakce Stanovení HPLC/MS, GC/MS Příprava isotopicky značených vnitřních standardů

27 Výzkumný plán - Etapa 2 Studium osudu nativních globinových aduktů po jejich fyziologickém odbourání z organismu 1) Inkubace erythrocytů z potkanů-dárců s aduktotvorným činidlem 2) Promytí erythrocytů: odstranění všech rozpustných (tj. nenavázaných) forem aduktotvorného činidla 3) Přenos (transfúze) erythrocytů do krevního oběhu potkanů-příjemců 4) Stanovení globinových aduktů v přenášených erythrocytech a pak po transfúzi v krvi příjemců 5) Stanovení globinových aduktů v krvi příjemců po celou dobu života erythrocytů 6) Stanovení produktů odbourávání globinových aduktů, tj. aminokyselinových aduktů a případně jejich následných metabolitů v moči potkanů (paralelně s globinovými adukty)

28 Perspektivy Pokud bude prokázáno, že fyziologické odbourávání globinových aduktů skutečně produkuje aminokyselinové adukty a jejich metabolické produkty vylučované močí, pak budou tyto látky představovat novou kategorii biomarkerů expozice, spojující tři hlavní výhody: Specificitu pro výchozí chemickou látku Možnost monitorování dlouhodobých kumulativních expozic einvazivní odběr vzorků Možné využití i u dalších proteinů. Možné aplikace v toxikologii, klinické medicíně a farmakologii.

29 Poděkování IGA MZ ČR Grant T /2012 Spolupracovníkům Posluchačům

Podobné dokumenty

Degradační produkty proteinových aduktů v moči jako perspektivní biomarkery kumulativní expozice reaktivním chemickým látkám

Degradační produkty proteinových aduktů v moči jako perspektivní biomarkery kumulativní expozice reaktivním chemickým látkám J. Mráz, I. Linhart *, I. Hanzlíková, Š. Dušková, L. Dabrowská, H. Chrástecká,