Absolventská práce. Střední zdravotnická škola a Vyšší odborná škola zdravotnická. Plzeň, Karlovarská 99. Histologie ledvin

Transkript

1 Střední zdravotnická škola a Vyšší odborná škola zdravotnická Plzeň, Karlovarská 99 Obor: Diplomovaný zdravotní laborant Absolventská práce Histologie ledvin Zpracovala: Vedoucí práce: Marta Peroutková RNDr. Alena Němečková, CSc , Plzeň

2 Čestné prohlášení: Prohlašuji, že jsem tuto absolventskou práci vypracovala samostatně a všechny použité prameny jsem uvedla v seznamu.. V Plzni

3 Poděkování: Velmi děkuji RNDr. Aleně Němečkové, CSc. za cenné rady a připomínky při zpracování absolventské práce a také Ústavu histologie a embryologie při lékařské fakultě v Plzni za možnost vypracování praktické části.. V Plzni

4 ANOTACE ABSOLVENTSKÉ PRÁCE 1. Název práce: Histologie ledvin 2. Příjmení a jméno: Marta Peroutková 3. Škola: Střední zdravotnická škola a Vyšší odborná škola zdravotnická Plzeň 4. Studijní obor: Diplomovaný zdravotní laborant 5. Vedoucí práce: RNDr. Alena Němečková, CSc. 6. Počet stran: Počet příloh: Rok obhajoby: Klíčová slova: glomerulus, chronická mezangioproliferativní glomerulopatie - IgA glomerulopatie 10. Resumé: Práce se zaměřuje v první polovině na anatomii, funkci, histologii a histofyziologii ledviny. Druhá část nabízí informace především z histologické techniky a z histopatologie glomerulu. Cílem bylo porovnat glomerulus zdravý (ten je popsán v první části práce) a glomerulus poškozený IgA glomerulopatií.

5 OBSAH ÚVOD ANATOMIE A FUNKCE LEDVIN HISTOLOGIE A HISTOFYZIOLOFIE LEDVIN Renální tělísko Proximální kanálek Henleova klička Distální tubulus Sběrací a odvodné kanálky Ledvinové intersticium ZPRACOVÁNÍ TKÁNĚ PRO HISTOLOGICKÉ VYŠETŘENÍ Odběr Fixace Zalití tkáně do parafínu Krájení tkáňových bloků Lepení řezů na podložní sklo Barvení řezů Základní barvení řezů Hematoxylinem-Eozinem postup Barvení Toluidinovou modří - postup Barvení zeleným Trichromem - postup GLOMERULONEFRITIDA Stanovení diagnózy Klasifikace primárních glomerulopatií Klasifikace sekundárních glomerulopatíí IgA glomerulopatie (mezangiálně proliferativní GN) RENÁLNÍ BIOPSIE Manipulace s bioptickým vzorkem ZÁVĚR PŘÍLOHY POUŽITÉ ZDROJE

6 ÚVOD Tato absolventská práce je zaměřena především na histologii ledvin. V první části se kromě samotné histologie a histofyziologie zabývá i anatomií a funkcí ledvin. Druhá část se potom zaměřuje na zpracování histologické tkáně a konkrétním poškozením glomerulu- IgA glomerulopatií. První polovina práce obsahuje pouze informace obecné, druhá polovina obsahuje informace nejen obecné ale i mé konkrétní postupy zpracování histologické tkáně, které jsem měla možnost vypracovat na Ústavu histologie při LF v Plzni. Informace jsem čerpala především z medicínské literatury a celou práci doprovází asi 30 obrázků a schémat pro lepší pochopení textu. 1

7 1. ANATOMIE A FUNKCE LEDVIN Ledvina, ren a také nefros má charakteristický fazolovitý tvar. Jde o párový exkreční orgán (párovou žlázu) uložený po obou stranách páteře ve výši 11. hrudního a 3. bederního obratle, v tzv. retroperitonealním prostoru. Pravá ledvina se dotýká jater, levá sleziny a slinivky a levá je výše než-li pravá(obr. č.1.poloha ledvin). 1 2 obr. 1. poloha ledvin 1 bránice 2 ureter Dlouhá je ledvina cm, široká 5-6 cm, silná 4 cm a hmotnost se zpravidla pohybuje kolem 120 až 17Og. Tento orgán je obalený tukem, který jej chrání a na povrchu bychom též našli vazivové pouzdro (capsula fibrosa). Do vnitřního okraje ledviny (tzv. hilu = konkávního mediálního okraje ledviny vyplněného vazivem) vstupují a vystupují cévy (krevní a lymfatické), vstupují nervy a vystupuje močovod- ureter. Rozšířený proximální konec močovodu = pánvička ledviny, neboli pelvis je ještě dělen ve dva až tři větší kalichy a z těchto větších kalichů se pak dále oddělují kalichy malé (viz. obr. 2. řez ledvinou, obr. 3. kalichy a pánvička, v příloze). Ledviny jsou připojeny mohutnými renálními tepnami (arteriae renales) na břišní aortu a renálními žilami na dolní dutou žílu. Renální tepny krev do ledviny 2

8 přivádí a po vstupu do ní (do hilu) se postupně větví na dvě hlavní artérie (tvořící ramus anterior et ramus posterior, resp. přední a zadní větev hlavní artérie). Ty se rozvětvují v řadu artérií probíhajících ve dřeni paprsčitě a směrem do kůry (obr. 4. v příloze) jako tzv. arteriae terminales (interlobares). Na rozhraní kůry a dřeně se a. terminales dále větví v obloukovité arteriae arcuatae. Z nich ještě vybíhají arteriae corticales radiatae (interlobulares) a z těchto tepének v kůře (po vstupu do glomerulu) potom odstupuje tzv. vasa afferentia, neboli céva přívodná, která se zde též dělí většinou na 2 5 primárních větví rozpadající se na kapiláry (pleteň asi kapilár). Tím je tvořeno klubíčko kapilár = glomerulus (takže vasa afferentia de facto tvoří klubíčko). Tyto kapiláry se pak znovu sbíhají a to ve vas efferens, tedy odvodnou tepénku glomerula. Ta samozřejmě z klubíčka krev (a v ní vstřebané ionty a nízkomolekulární látky) odvádí a pak se rozpadá (ne u juxtamedulárních nefronů, viz str. 6.) v různé vzdálenosti od glomerulu do kapilárních sítí kolem ledvinových kanálků. Tuto síť můžeme také nazvat kapilární pletení, resp. peritubulárními kapilárami (neboli sekundární kapilární řečiště opřádající blízké tubuly mající velký význam pro tubulární resorpci a sekreci). Moderními technikami bylo zjištěno, že peritubulární kapiláry vycházející z určitého vas efferens neopřádají tubuly patřící k danému glomerulu, nýbrž hlavně nefrony cizí. Venuly z peritubulárních kapilár se sbíhají do interlobulárních vénkončerenálními žilami a dolní dutou žílou, viz níže (obr. 5. Schéma větvení cév v ledvině a obr. 6. Schéma stavby krevního zásobení ledviny, v příloze). Zajímavé je, že krev protéká v ledvině kapilárami dvakrát (v glomerulu a potom v peritubulární pleteni, aniž by mezi tím prošla srdcem, proto název sekundární kapilární řečiště pro peritubulární pleteň) a další zajímavostí je, že glomerulární kapiláry jsou jediné kapiláry v těle, z nichž odtéká krev arteriolou (efferens). Tohle větvení tepen se týkalo kůry, větve pro dřeň jsou zmíněny v kapitole distální tubulus juxtaglomerulární aparát. Uvedla jsem také jen větvení artérií a to od nejmohutnější po nejslabší. Co se žilního odtoku týká, vény se nazývají obdobně a začnu od nejslabší po nejmohutnější. Žíly z kůry začínají jako venae stellatae prosvítající na povrchu ledviny a jdou společně s odtokovými žilkami peritubulární kapilární pleteně do venae interlobulares venae arcuatae venae interlobares vena renalis. 3

9 Co se průtoku krve dření a kůry týče - průtok dření je mnohem menší, neboť je nutno si uvědomit, že dřeňový průtok je vždy postkortikální. I přes to, že dřen činí asi ¼ hmotnosti ledviny, průtok krve v ní je asi jen 8% z průtoku celkového. Velký korový průtok je nezbytný pro GF a zpětnou resorpci solutů a vody (hlavně v proximálním tubulu), malý průtok dření hraje zase důležitou roli při koncentrování moči. Ledviny také patří mezi orgány s dokonale vyvinutou autoregulací cirkulace. I přes široké rozmezí tlaku v a. renalis je průtok konstantní. Význam je zřejmý - chránit ledviny před spontánními výkyvy krevního tlaku a zaručení tak stability funkce ledvin. Přibližně 20-25% minutového srdečního objemu je určeno pro obě lidské ledviny, jejichž hmotnost je 0,35-0,5% celkové tělesné hmotnosti. Hodnota průtoku činí 4ml až 6ml na 1g hmotnosti ledviny jde o nejvyšší hodnotu v těle vůbec - představuje to 1l za minutu a z toho je asi tisícina přetvořena na moč. Vysoký průtok je nutný pro vlastní tvorbu moče. Kolem 10% z bazální kyslíkové spotřeby těla spotřebují právě ledviny. obr. 7. Oddíly nefronu 4

10 Pokud bychom pozorovali podélný řez ledvinou, jasně bychom dokázali rozlišit dřeň (medullu), která je naoko tmavší a žíhaná a světlejší zrnitou kůru (cortex). Žíhaný vzhled dřeně je dán přítomností velkého počtu souběžně jdoucích kanálků a cév a zrnitý vzhled kůry je zase podmíněn přítomností velkého počtu ledvinných tělísek a stočených kanálků. Medulla je u člověka upravena do několika (asi 10 18) pyramidových útvarů = dřeňové pyramidy. Na vrcholky pyramid se upínají kalichy přecházející v pánvičky (viz obr. 2. a 3. v příloze). Zaobleným vrcholkům pyramid říkáme papily (papillae renales). Cortex tvoří úzký pásek 5 7mm, je těsně pod vazivovým pouzdrem ledviny a vybíhá mezi pyramidy dřeně, resp. od bází dřeňových pyramid vybíhají do kůry dřeňové paprsky, což jsou paralelní svazky tubulů. (V kůře a ve dřeni jsou odlišné osmotické poměry: prostředí v kůře je izotonické, kdežto ve dřeňové intersticium je hypertonické- více v kapitole o Henleově kličce). Základní stavební a funkční jednotka ledviny je nefron ledvina má asi 1 milion (i více) těchto mikroskopických jednotek. Úplnou funkční jednotku ledviny tvoří potom nefron spolu se sběracím kanálkem, do něhož i ústí. Stavba a funkce nefronů jsou následující. Co se stavby týče - rozlišujeme tzv. renální tělísko (Malpigiho tělísko, též corpusculum renis), které je tvořeno glomerulem, tedy klubíčkem kapilár a ještě Bowmanovým pouzdrem (Bowmanovým váčkem, též capsula glomeruli ) resp. zdvojeným epitelovým obalem. U tohoto pouzdra dále rozlišujeme vnitřní a vnější vrstvu. Vnitřní část, resp. viscerální list Bowmanova váčku, obaluje kapiláry cévního klubka a vnější, neboli parietální list, ohraničuje celé rennální tělísko. V místech, kde do tělíska vstupuje přívodná tepénka a vystupuje odvodná, přechází list vnitřní v list zevní. Důležité je také zmínit, že mezi oběma těmito vrstvami se nachází močový prostor, který obsahuje tekutinu, jež je filtrována přes stěnu kapilár a také přes viscerální list Bowmanova pouzdra a dále, že mezi vrstvami je tenká štěrbinka, ze které začíná systém kanálků. Renální tělísko má cévní pól, což je místo, kde do něj vstupují a vystupují, již zmíněné, arteriola afferens (širší) a arteriola efferens (užší) a dále pól močový, což je místo, kde začíná proximální stočený kanálek. Nefron se dále skládá, z již také zmíněných kanálků, resp. systému ledvinových kanálků. Patří sem: proximální stočený kanálek (kanálek prvního řádu), tenké a tlusté (sestupné a vzestupné) raménko Henleovy kličky, distální 5

11 stočený kanálek (kanálek druhého řádu) a sběrací kanálky. Proximální kanálek je delší než distální, proto jej vidíme na řezech u renálního tělíska častěji (obr. 7., oddíly nefronu) Co se funkce nefronů, potažmo ledvin týká: kapilárami glomerulů protéká krev, která se zde filtruje. A to tak, že se přefiltrují látky z krevní plazmy, které mají menší molekulovou hmotnost, dále voda a ve vodě rozpustné látky, neboť právě tyto látky jsou schopné se dostat přes stěnu kapiláry a vnitřní stěnu Bowmanova váčku do štěrbiny a odtud do kanálku prvního řádu. 2.CITACE : Nízkomolekulární látky se dostávají do moči glomerulární filtrací, větší molekuly jsou zadrženy a v moči je nacházíme jen při poruchách glomerulu. Tímto vzniká, tzv. glomerulární filtrát (neboli primární moč). Denně vzniká ve velkém množství, asi 180 litrů této tekutiny, přičemž 99% přefiltrované tekutiny se v glomerulu vstřebá zpětně, takže denní množství definitivní moče je o poznání menší, asi 1 1,5 litru - což je méně než 1% původního filtrátu. Filtrační a koncentrační schopnost ledviny je tedy obrovská. obr. 8. FT= filtrační tlak v glomerulu,t K = intrakapilární tlak, T onk = onkotický tlak plazmatických bílkovin, T Bp = hydrostatický tlak v Bowmanově pouzdře Primární moč obsahuje látky rozpuštěné ve stejné koncentraci, v jaké jsou v krvi je izoosmotická s krevní plazmou (tab. 1. v příloze ukazuje obvyklé 6

12 koncentrace některých látek v plazmě a v moči). Složení glomerulárního filtrátu je velmi blízké ultrafilrátu krevní plazmy (plazma bez většiny bílkovin). Hnací silou pro proces filtrace je samozřejmě tlak arteriální krve. Za normálních okolností je změněno asi 20 30% plazmy, která proteče glomeruly, v glomer. filtrát. Filtrace v glomerulech je tedy závislá na filtračním tlaku, (obr. 8.) který činí asi 11kPa v kapilárách a asi 2kPa ve štěrbině, přičemž skutečný efektivní filtrační tlak by měl být rozdílem uvedených tlaků, tedy 9kPa, ovšem bereme-li v potaz i další působící tlaky (např. osmotický onkotický tlak plazmatických bílkovin a hydrostatický - tlak ultrafiltrátu v Bowmanově pouzdře oba působí proti tlaku v glomerulárních kapilárách), dostaneme se k číslu o něco nižšímu, nikoli 9kPa, ale asi pouze 6kPa. obr. 9. Možnosti chování látek v tubulech, PAH = kyselina paraaminohippurová používaná k měření průtoku plazmy ledvinami, volně se filtruje v glomerulech a navíc je vylučována z krve do tubulů sekrecí, neresorbuje se, ve vena renalis už není obsažena Z plazmy se odflitrovává ultrafiltrát (tekutina bez většiny bílkovin) tzn. v ní koncentrace plazmatických bílkovin (takže onkotický tlak v kapilárách též stoupá), tzn., že filtrační tlak není všude stejný, s přibývajícím onkotickým tlakem totiž postupně klesá při průtoku kapilárou. (Nutno zmínit, že GF není ovlivňována jen filtračním tlakem ale i permeabilitou filtru a plochou, na níž se 7

13 filtrace odehrává) Aby byl filtrační tlak v glomerulech udržen, funguje tzv. renální autoregulace. Hlavním mechanismem autoregulace je myogenní efekt. Jedná se o přímou reakci hladké svaloviny, při níž nastane vasokonstrikce a stoupne tedy cévní odpor. Spuštění druhého mechanismu závisí na tekutině, která protéká distálním tubulem. Pokud se zvýší GF, přiteče do oblasti macula densa (viz str.12. ) i více tekutiny, tzn. i více solutů v ní. Macula densa je schopna reagovat konkrétně na změněné chloridy a posléze odstartovat sled reakcí, které vedou ke snížení GF, resp. konstrikci vas afferens a tím omezení průtoku v glomerulu. Pokud je tomu naopak a GF je snížená, tedy i průtok tekutiny s chloridy (NaCl) je snížený, macula densa začne spolupracovat s juxtaglomerulárními buňkami (str. 13.) a ve finále dojde ke konstrikci vas efferens. Další látky schopné ovlivnit průtok krve ledvinami jsou: angiotenzin II ( vasokonstrikce vas efferens), endotelin ( konstrikce obou arteriol), atriální natriuretický peptid a bradykinin ( GF dilatací vas afferens), vazoditatačně působí i acetylcholin, histamin, oxid dusnatý, prostaglandiny a glomerulární filtraci podporují i glukokortikoidy. Tromboxan a leukotrieny mají účinky vazokonstrikční. Zmíním -li jednotlivé děje, bez kterých by se z primární moče nevytvořila moč definitivní, byla by to glomerulární ultafiltrace, tubulární resorpce (aktivní, pasivní) a tubulární sekrece. Principy transportních dějů (mechanismy membránových přenosů), které jsou podkladem těchto procesů jsou napsány níže (difúze, resorpce = zprostředkovaný transport a osmóza). Nyní ale uvedu pár obecných informacích o jednotlivých dějích, které probíhají v glomerulu i mimo něj: 1) glomerulární filtrace: Dalo by se říci, že GF je úměrná počtu nefronů. Tento děj nejlépe vystihuje vzorec: GF P ± T = U. V, resp. GF P = U. Kde GF je množství glomerulárního filtrátu, P je koncentrace látky x v plazmě i v glomerulárním filtrátu, T je buď množství látky x secernované ( +T) nebo resorbované ( -T) v tubulech, U je koncentrace látky x v definitivní moči a V je objem definitivní moči. První vzorec nám popisuje vylučování jakékoli nízkomolekulární látky x, která se v tubulech buď resorbuje nebo secernuje. 8

14 Ve druhém vzorci volíme potom látku, která se bez omezení filtruje, avšak nepodléhá tubulární resorpci a tubulární sekreci (tzn. má T = 0), což je inulin nebo kreatinin a což jsou de facto látky, které se profitrují glomerulem a všechno toto množství se dostane i do definitivní moči (vyloučené množství se musí rovnat profiltrovanému). V praxi se odhaduje (stanovuje) glomerulární filtrace podle clearens endogenního kreatininu. Clearens znamená očistit se od dané látky. Měření clearens látek, jejichž chování v ledvinách známe, umožňuje posoudit činnost ledvin, resp. tři jejich základní funkce: průtok plazmy ledvinami, velikost GF a celkovou kapacitu tubulů secernovat či resorbovat. obr.10. Funkce Na +, K + ATPázy 2) Tubulární resorpce TR: Je to část z množství profiltrovaného v glomerulech, která se vstřebá (resorbuje; absorbuje; zpětně vychytá z lumen do cév) v tubulech a platí vztah: GF = TR + FE, přičemž FE je frakční exkrece podíl z množství profiltrovaného v glomerulech, který je vyloučen do definitivní moči a platí, že FE + TR = 1. Stačí tedy sledovat buď jen exkreci či resorpci a zpravidla to bývá FE. Pokud je hodnota FE > 1, znamená to, že se určitá látka víc secernuje než resorbuje, pokud FE = 0, tak je daná látka kompletně resorbována a neměla by být v moči a konečně pokud je FE = 1, odpovídá vyloučené množství profiltrovanému (inulin). O resorpci látek v ledvinách můžeme souhrnně říci, že se za normálních podmínek vstřebá: 99% vody, všechna glukóza, aminokyseliny, kreatin, téměř všechny ionty HCO - 3, 98%- 99% Na +, 95% Ca 2+ a Cl -, asi 90% K +, asi 40% močoviny a 80% kyseliny močové. 9

15 3) Tubulární sekrece: Jde o vyloučení některých iontů a látek do tubulární tekutiny (resp. definitivní moče) buňkami nefronu (kyselina močová apod.). Některé látky se resorbují i secernují podle aktuálních potřeb organismu (K +, H + ). Co se vyšetření tubulárních funkcí týče nejjednodušší je stanovení tubulární resorpce vody (známe- li GF a diurézu, můžeme vypočítat podíl glomerulárního filtrátu, který byl v tubulech resorbován). Pakliže bychom chtěli přesnější vyšetření tubulárních funkcí, použili bychom stanovení exkrečních frakcí (sodíku, draslíku). (obr. 9.). Poté tedy, co se přefiltrovaná plazma dostane ze štěrbiny Bowmanova váčku do proximálního kanálku a dál, je ještě upravována na definitivní moč (tabulka 1: koncentrace některých látek v moči a plazmě). A jaké tedy známe mechanismy transportu přes membránu? 1. Aktivní transport (aktivní přenašečový transport): Při tomto přesunu látek se spotřebovává energie která je získávána hydrolýzou ATP (a díky energii je i zvýšena rychlost pohybu solutu přes membránu). Tento přesun by nebyl možný bez speciálních proteinů (enzymů), resp. membránových transportních ATPáz (obr. 10.). Přenašeče jsou součástí selektivně propustné plazmatické membrány, jsou schopné specificky vázat určité molekuly a tím je i přepravovat. Též je důležité, že tento proces může probíhat i proti koncentračnímu spádu. Do 2. pasivního transportu (obr. 11.) řadíme: volnou (prostou) difúzi, zvláštní případ difúze osmózu, pasivní přenašečový transport (neboli zprostředkovanou usnadněnou - difúzi) a přenos pomocí dalších proteinů - membránových kanálů. (Při pasivním transportu difunduje látka ve směru osmotického, koncentračního nebo elektrochemického gradientu) Difúze je děj zcela nezávislý na dodávce energie a je realizován Brownovým pohybem. Jde o samovolný pohyb molekul (iontů), vlivem jejich tepelného pohybu, směřující k rovnoměrnému rozptýlení v prostoru. Umožněn je tedy pohyb látky z jednoho místa na druhé podle koncentračního spádu, tzn. z místa s vyšší koncentrací do místa s nižší. Buňka nemůže difúzi regulovat, proto probíhá do termodynamické rovnováhy, tedy až se koncentrace na obou stranách vyrovnají. Tzv. koeficient permeability vyjadřuje schopnost daného solutu procházet danou membránou. Velký význam má ale i náboj - tam, kde není rozdíl 10

16 v koncentracích na obou stranách membrány, ale v náboji, putují soluty podle gradientu náboje. Do pasivního transportu řadíme i osmózu. Je to samovolné pronikání molekul rozpouštědla (vody) z méně koncentrovaného roztoku do roztoku koncentrovanějšího přes semipermeabilní membránu (pohyb solventu přes membránu je dán rozdílem koncentrace solutu na obou stranách membrány a její impermeabilitou). Výsledkem je dosažení stejné osmotické aktivity rozpouštědla na obou stranách membrány. Osmózou je v ledvinách transportována především voda z kanálků zpět do krevního oběhu. Usnadněná difúze (pasivní přenašečový transport) se liší od prosté tím, že umožní větší rychlost pohybu solutu přes membránu a musí zde fungovat přenašeče. Ovšem stejně jako u volné není vyžadována energie a transport jde po koncentračním spádu. obr. 11. Mechanismy průchodu molekul přes membránu. Aktivní transport postupuje proti elektrochemickému gradientu. Posledním uvedeným příkladem pasivního transportu byly membránové kanály, což je mechanismus taktéž závislý (stejně jako přenašečové transporty) na speciálních membránových proteinech na rozdíl od prosté difúze, která byla závislá jen na fyzikálních vlastnostech membrány + molekul. Proteiny vytvářejí napříč membránou jakési póry či kanály, kterými mohou molekuly proudit oba směry, přičemž jejich tok probíhá podle koncentračního spádu. Je to tedy též usnadněná difúze tentokrát preformovanými póry. Množství částic, které protečou do buňky je dáno koncentračním spádem (koncentrací částic na obou stranách 11

17 membrány) a množstvím kanálů. Tok částic kanálem může být regulován otevřením či uzavřením kanálu. Význam ledvin tedy spočívá hlavně v udržení homeostázy (stálého vnitřního prostředí), tj. udržují stabilní osmotický tlak, koncentraci základních minerálů a vodíkových iontů stálé ph (tzn. při acidóze vylučují kyselou moč a šetří organismu hydrogenkarbonátové báze, které při alkalóze naopak vylučují. Většina přijímané potravy je totiž kyselinotvorná, a proto se kyselých látek organismus zbavuje mimo jiné i močí). Ledviny dokáží vyloučit odpadní- nepotřebné látky (zejména zplodiny látkové přeměny bílkovin- katabolity, jejichž nahromadění by působilo toxicky), dále látky pro tělo cizí (léky) a popř. látky toxické. Mohou ale vylučovat i látky tělu potřebné (vodu, elektrolyty), jsou- li v přebytku nebo naopak je zadržují, jsou- li v nedostatku. Do definitivní moče by se neměly dostat bílkoviny, glukóza, apod. (Při zánětech se rozšiřují póry a bílkoviny v moči nacházíme = proteinurie.) Avšak na druhou stranu by v ní měly být odpadní látky, jako je např. močovina, kyselina močová, amonné ionty, kreatinin, metabolity hormonů, mnohé léky či jejich metabolity apod. Ledviny tvoří i některé biologicky aktivní látky (renin, erytopoetin, kalcitriol, kalikrein- kinin, prostaglandiny), což je další jejich význam (endokrinní činnost) a též mají funkci metabolickou glukoneogeneze a degradace aminokyselin. 12

18 2. HISTOLOGIE A HISTOFYZIOLOFIE LEDVIN Histologicky má ledvina stavbu složené tubulózní žlázy. Co se jednotlivých částí nefronu týče a jejich histologické stavby (obr. 12. příloha) Renální tělísko Nejprve začnu s popisem Bawmanova pouzdra (obr. 13., 14., 15. příloha). Parietální list (zevní vrstva pouzdra) obsahuje epitel jednovrstevný dlaždicový, který je ještě zpevněn bazální membránou a slabou vrstvou retikulárních vláken. Epitel tohoto listu se však mění na močovém pólu a to na jednovrstevný cylindrický. Viscerální list (vnitřní vrstva pouzdra) obsahuje buňky zvané podocyty. Tyto buňky mají primární výběžky a z primárních výběžků jsou ještě vysílány další- sekundární výběžky, kterým říkáme pedikly (obr. 16. a 17.) obr. 16. Schéma viscerálního listu Bowamanova pouzdra, který povléká stěnu kapiláry glomerulu 1- sekundární výběžky podocytů 2- primární výběžky podocytů, 3- tělo podocytu se zřetelným jádrem, 4- pórovaný endotel kapiláry Tyto Sekundární výběžky objímají kapiláry klubka, přičemž výběžky jediného podocytu objímají více než jednu kapiláru, protože na jediné kapiláře se pravidelně střídají pedikly dvou podocytů. V cytoplazmě podocytů najdeme četné volné ribosomy a Golgiho aparát a v cytoplazmě pediklů zase hojné mikrofilamenta a mikrotubuly. Dále je důležité zmínit, že se sekundární výběžky 13

19 přibližují k bazální lamině, resp. jsou s ní v kontaktu, na rozdíl od výběžků primárních. Také se mezi sebou pedikly proplétají a tím mezi nimi zůstanou prostory, kterým říkáme filtrační štěrbiny a které přemosťuje membrána. Již zmíněná bazální membrána vzniká splynutím bazálních lamin, které jsou tvořené jednak buňkami kapilár a jednak podocyty. V glomerulu slouží jako vlastní filtrační bariéra, jež dělí močový prostor (kde proudí primární moč) od krve proudící v kapilárách. Tato vlastnost je dána vrstvami, které můžeme v lamině ještě rozlišit. Jedná se o střední, tmavší a elektronopticky hustší lamina densa a po obou jejích okrajích jsou světlejší lamina rarae. Obě světlé okrajní a jedna tmavá centrální zóna mají rozličné biochemické složení. Na základě toho dokáže potom bazální membrána glomerulu selektovat (filtrovat) různé molekuly. Pokud bychom si tedy znovu shrnuly stavbu glomerulární kapiláry, resp. filtrační membrány. Její vrstvy jsou odlišné anatomicky, chemicky i původem. Na svrchní straně najdeme podocyty- epitelové buňky Bowmanova pouzdra, dále silnou bazální laminu, (jak laminu podocytů, tak endotelu vlásečnic) a nakonec je tedy vrstva plochých endotelových buňek (fenestrované endotelie kapilár klubíčka). obr. 17. Pohled na viscerální list elektron. mikroskopem, a - tělo podocytu, b - pedikly, c - primární výběžek podocytu Nutno dodat, že ke stěnám glomerulární kapiláry přisedají mezangiální buňky, jež představují asi třetinu buněk v glomerulu. Tyto mononukleární hvězdicovité (s výběžky) buňky jsou zanořené do extracelulární amorfní matrix a tvoří tím, tzv. mezangium (zvláštní buněčnou strukturu tvořící centrum glomerulu a obklopenou kapilárními kličkami- obr. 18. v příloze) pro zpevnění kapilární stěny. 14

20 Extracelulární amorfní matrix je neustále syntetizována a odbourávána mezangiálními buňkami, vyplňuje prostor kolem těchto buněk a poskytuje jim strukturní oporu, ovlivňuje jejich funkci, sekreci, proliferaci ap. Tyto buňky jsou asi mezenchymového původu, neboť vykazují kontraktilní schopnost podobnou buňkám hladkého svalu. Jejich výběžky totiž obsahují četné mikrotubuly a mikrofilamenta, které jsou tvořené kontraktilními proteiny- aktinem a myosinem. Svým stahem mohou regulovat velikost filtrační plochy stěn kapilár (jsou s kapilárami v přímém kontaktu), zejména na podnět vasoaktivních látek. Kontrahují se pod vlivem např. histaminu, angiotenzinu II, vasopresinu apod. Dále mezangiální buňky vykazují sekreční aktivitu. Produkují např.: endotelin, prostaglandiny, cytokiny, interleukiny, atd. Také část z nich může plnit funkci makrofágů fagocytovat. Při poškození ledvin se jejich počet zvyšuje. Asi 5% mesangiových buněk pochází z kostní dřeně a jsou to buňky monocytomakrofágové řady, schopné fagocytózy, které čistí glomerulární filtr od buněčných zbytků, imunitních komplexů apod Proximální kanálek Proximální stočený kanálek (obr. 19., 20., 21.) má široké lumen a obklopují ho peritubulární sítě kapilár. Dlouhý je asi 15mm. Jeho první úsek se nazývá pars contorta část složená v řadu kliček v blízkosti corpusculum renale, druhý úsek neboli pars recta je úsek přímý, navazuje na předchozí a míří do medully. Po vstupu do ní pokračuje jako Henleova klička (viz. níže) Tento kanálek je zodpovědný za resorpci (nezávislé na hormonech) největšího podílu glomerulárního filtrátu. Za fyziologických podmínek je zde vstřebávána veškerá glukóza a aminokyseliny, dále sodík (asi 85% musí být pro udržení elektroneutrality doprovázen Cl - a HCO - 3 ), 65% draslíku (secernuje se v distálním tubulu pod vedením aldosteronu) a též např. albuminy z glomerulárního filtrátu (primární moč totiž obsahuje ještě nějaké proteiny, které byly schopné se do ní dostat glomerulární filtrací), tedy ty látky, které jsou ještě užitečné pro metabolismus. Současně se do tubulu transportují ionty H +, kreatinin, léky a tělu cizí látkysekrecí. Asi 70% vody glomerulárního filtrátu se zde, bez ohledu (= obligátní 15

21 resorpce) na stav hospodaření s vodou, vstřebá. Tekutina na konci tohoto tubulu je izoosmotická s krevní plazmou. Jeho buňky podávají nevětší transportní výkon ze všech buněk těla. Absorpci jednotlivých látek lze přesně lokalizovat, neboť různé látky jsou vstřebávány na odlišných místech. Glukóza, aminokyseliny i natrium jsou absorbovány buňkami tubulů aktivním procesem, využívajícím Na + /K + -ATPázy lokalizované v bazolaterálních buněčných membránách (Pro funkci buněk proximálního kanálku je i důležité jejich uspořádání. Stěny sousedních buněk k sobě nepřiléhají, vznikají tím mezi nimi štěrbiny, které jsou uzavřené v blízkosti lumen.) Mimo aktivní transport některých iontů prochází voda a dalších ionty buňkou i pasivně díky osmotickým a nábojovým gradientům solutu. obr. 19. Pars convoluta proximálního kanálku obr.20. Pars recta proximálního kanálku obr.21. Schéma struktury proximálního kanálku, 1 - mikroklky na apikální straně, 2 - mitochondrie, 3 - bazální membrána. Šipky značí směr transportu látek. Kanálek je vystlán jednovrstevným kubickým až cylindrickým epitelem, jehož povrch je opatřen kartáčovým lemem. Buňky mají acidofilní (eozinofilní) cytoplazmu, což je způsobeno přítomností hojných mitochondrií orientovaných spíše v bazální části. Tubulární epitel je pokračování epitelu renalního tělíska, 16

22 resp. parietálního listu Bawmanova pouzdra a bazální membrána tubulu je pokračování glomerulární bazální membrány. Na apikální straně (luminální povrch kanálku) má cytoplazma tedy velké množství pravidelných mikroklků, jež tvoří kartáčový lem a na nějž je vázán enzym alkalická fosfatáza. Těmito mikroklky se ohromě zvětšuje plocha styku buněk s tubulární tekutinou- zajišťují velkou resorpční plochu. Buňky proximálního tubulu celkově obsahují spoustu transportních a jiných velmi důležitých enzymů. Našli bychom zde také kanálky probíhající mezi mikroklky. Vychlípení membrán, též na apikální straně tubulu, dá vzniknout tzv. pinocytárním váčkům, jejichž funkce je velmi důležitá. Tyto váčky obsahují (zachytí) totiž makromolekuly (především bílkoviny), které prošly glomerulárním filtrem, ale neměli by se dostat do definitivní moče. Váčky dokáží molekuly degradovat (pomocí lysozomů, se kterými váčky splývají) a degradační produkty těchto makromolekul se potom snadno dostanou přes membránu (pinocytózou) zpět do cirkulace. Bazální strana kanálku (lamina basalis) je rozčleněna úzkými záhyby (vzniklé vychlípením membrány = invaginace membrán) ve výběžky (navzájem propletenými = interdigitace díky interdigitacím bočních membrán jsou hranice mezi jednotlivými buňkami tubulu nezřetelné, viz výše) a mezi nimi jsou mitochondrie sloužící jako zdroj energie. Také bychom zde našli buňky schopné aktivně transportovat ionty proti koncentračnímu gradientu s použitím energie od mitochondrií. Tyto buňky obsahují enzymy nutné pro transportní pochody Henleova klička Jde dření směrem k papile, potom se obrací zpět formou písmene U a vrací se do kůry. Henleova klička je dlouhá u nefronů umístěných blízko dřeně (=juxtamedulární, viz str. 6.) a kratší u nefronů, které jsou vysoko v kůře (= kortikální; též superficiální; u povrchu ledviny). (Tohle rozdělení není však úplně striktní, oba typy nefronů mohou mít dlouhé i krátké kličky. Poslední typ nefrony, označované jako intermediární, mají glomeruly ve středních vrstvách kůry a kličky asi v polovině vnitřní zóny dřeně. Obecně platí, že 85% je superficiálních + intermediárních a 15% juxtamedulárních.) Skládá se: z tlustého sestupného (descendentního) raménka, tenkého sestupného raménka, tenkého vzestupného 17

23 (ascendentního) raménka a tlustého vzestupného raménka. (Je zajímavé, že se vzestupné raménko vždy vrací k cévnímu pólu vlastního nefronu). Tlusté raménko je kanálek přibližně dvojnásobné tloušťky oproti tenkému. Raménka mají též odlišnou stavbu, co se histologie týká. Tenký úsek má totiž nízké a ploché epitelové buňky (tvořící jednu vrstvu), tzn., že průsvit v této části nefronu je dosti široký. Našli bychom zde i nepravidelně rozmístěné mikroklky (bez kartáčového lemu) a málo organel. Stavba tenkého úseku kličky není zcela homogenní, v zevní dřeni a vnitřní dřeni se liší- čím hlouběji klička zasahuje, tím jsou buňky chudší na organely a plošší. Tohle raménko může připomínat krevní kapiláry, proto s nimi může být snadno zaměněno. Tlustý úsek Henleovy kličky je tvořený cylindrickými buňkami s mitochondriemi, bazálními invaginacemi a kratšími, řidšími mikroklky na luminální straně buněk. Stěna dřeňové části tlustého vzestupného raménka je nepropustná pro vodu a její buňky vykazují největší aktivitu sodíko- draslíkové pumpy z celého nefronu. Je to klíčové místo mechanismu koncentrace moči. A co se vlastně v této části nefronu děje? Do Henleovy kličky vstupuje už jen okolo 20% tekutiny z původního glomerulárního filtrátu, která je stále izoosmotická s krevní plazmou, avšak na v této části nefonu nabude tato tekutina charakter hypotonicity, a takhle se dostane i do distálního tubulu. Aby tomu tak bylo, musí klička pracovat jako multiplikační systém (obr. 29.). Ten vytvoří koncentrovaný roztok, aniž by potřeboval větší množství energie. obr.22. Buňky tenkého úseku Henleovy kličky Epitel tlustého vzestupného raménka aktivně resorbuje NaCl ven do intersticia, ovšem tohle odčerpávání iontů není následováno vodou, tzn. resorpce není izoosmotická. Stěna vzestupného raménka není pro vodu propustná. Tato nepropustnost ascendentního raménka pro vodu je základní podmínkou úspěšné 18

24 funkce protiproudového systému ve dřeni a představuje klíčový moment pro funkci Henleovy kličky při vzniku dřeňové hypertonicity. Resorpce v tlustém segmentu je velmi vydatná a NaCl (bez doprovodu vody) se hromadí v intersticiu, které se stává hypertonickým." Abychom nezapomněli na tenké sestupné raménko vrátíme se tedy zpět před tlusté vzestupné raménko. Tato část Henleovy kličky též prostupuje dření, resp. hypertonickým intersticiem, které bylo vytvořeno právě následujícím vzestupným raménkem. Tato část Henleovy kličky je naopak velmi propustná pro vodu. Voda vystupuje z raménka po osmotickém spádu do intersticia a tekutina v lumen se tím více koncentruje, resp. osmolalita tekutiny v kličce se vyrovnává s intersticiem. Tato koncentrovaná tekutina potom proudí tedy do vzestupného raménka a nabízí spoustu iontů k resorpci, přičemž jejich stálé odčerpávání z tlustého segmentu (nepropustného pro vodu) způsobí, že tekutina odtékající do distálního tubulu je velmi hypotonická. Glomerulární filtrací se nepřetržitě doplňuje proud izotonické tekutiny, obsahující NaCl, takže se celý systém udržuje ve stálé činnosti. Resorpce NaCl v tlustém segmentu je ovlivňována ( ) vazopresinem a tuto resorpci (stimulovanou vazopresinem) omezují prostaglandiny. (Na vysoké dřeňové osmolalitě se kromě NaCl podílí též urea. Ve vnitřní dřeni tvoří asi polovinu osmoticky aktivních solutů. Do Henleovy kličky přitéká v tekutině v menší koncentraci, ale sestupné raménko je pro ni nepropustné, a protože se zde resorbuje voda, koncentrace urei. Další raménka Henleovy kličky už tuto koncentraci nijak zvlášť neovlivní, takže hypotonická tekutina jdoucí do distálního tubulu obsahuje relativně hodně močoviny. V distálním tubulu a spojovacím segmentu se potom nijak koncentrace urei nemění. Až ve sběracích kanálcích, kde se znovu resorbuje voda, její koncentrace stoupá. Terminální úsek sběracího kanálku je sice pro močovinu permeabilní, nicméně tato propustnost je regulována ADH. V jeho přítomnosti se urea vydatně resorbuje přispívá k hypertonicitě dřeně). 19

25 2.4. Distální tubulus Začíná jako pars recta, přímý úsek a pokračuje v pars contorta, úsek stočený. Jeho krátký konečný úsek se nazývá spojovací segment a jde o poslední část nefronu, která navazuje na sběrací a odvodné kanálky. Distální tubulus je poslední segment nefronu, je vystlaný jednovrstevným kubickým epitelem a nachází se v kůře ledviny. Je také mnohonásobně stočený jako tubulus proximální a s ním bychom ho mohli i srovnat neboť co do histologické stavby, jsou si podobné, avšak rozdíly bychom našli - a jsou následující: proximální kanálek má větší buňky, dále kartáčový lem a díky velkému množství mitochondrií jsou jeho buňky acidofilnější. obr. 24. Topografické začlenění juxtaglomerulárního aparátu Distální kanálek má zase větší průsvit, takže i plošší a menší buňky. Chybí mu též kanálky a váčky na apikální straně, na straně bazální jsou ale četné záhyby membrán a mitochondrie. Hranice mezi buňkami jsou stejně jako u kanálku proximálního nezřetelné díky interdigitacím na bazolaterální straně buněk. Distální tubulus má na rozdíl od proximálního pravidelný průsvit. Část distálního tubulu, která se dotýká vaskulárního pólu tělíska (a vždy se dotýká svého mateřského nefronu) se nazývá macula densa. Jedná se o úsek tohoto tubulu, jenž je histologicky pozměněný. Buňky (asi 40) se zde zvyšují a jádra jsou těsně u sebe. Velmi důležité ale je, že macula densa tvoří spolu s juxtaglomerulárními 20

26 buňkami a pólovým polštářkem tzv. juxtaglomerulární aparát (obr. 24. a obr. 25.). Juxtaglomerulární buňky jsou velké, přeměněné buňky hladké svaloviny a. efferens. Mají velká jádra, nacházejí se u cévního pólu corpusculum renis a obsahují sekreční granula, která exocytózou secernují enzym renin obr.25. Detail juxtaglomerulárního aparátu, 1 - vas afferens, 2 - vas efferens, 3 - buňky pólového polštářku, 4 - distální tubulus s macula densa, 5 - juxtaglomerulární buňky V místě, kde se arteriola afferens přimyká k renálnímu tělísku, obsahuje její tunica media modifikované buňky hladkého svalstva. Tyto elementy, zvané juxtaglomerulární buňky (JG), mají oválná jádra a cytoplazmu naplněnou granuly, které se barví metodou PAS. obr.26. buňky distálního tubulu 21

27 Buňky pólového polštářku (pólový polštářek) jsou extraglomerulární mesangiové a světle se barvící buňky, také se nacházející při cévním pólu corpusculum renis. Někdy jsou označovány jako síťové buňky, a to proto, že mají hvězdicovitý tvar a jejich výběžky tvoří síť. A jak juxtaglomerulární aparát funguje? Juxtaglomerulární buňky produkují ve svých vesikulách renin. To je enzym, který se uvolňuje při snížení krevního tlaku + při snížení množství Na + v krvi (nestoupá osmolalita ECT; stoupá hemokoncentrcace ) a to díky signálům z baroreceptorů a. afferens a signálům z chemoreceptorů macula densa. Renin je schopen změnit bílkovinu krevní plazmy, tzv. angiotensinogen (polypeptid) na angiotensin I. obr. 27. Schéma řízení sekrece aldosteronu. Aldosteron zvyšuje zadržování sodíku a vody a zvyšuje vylučování draslíku, dokáže indukovat Na + K + -ATPázu. Angiotennzin I je ale stále ještě neaktivní (dekapeptid), a proto je měněn konvertujícím enzymem (enzym je produkovaný endotelem plicních kapilár, tzv. ACE). Inaktivnímu angiotenzinu I odebere dvě aminokyseliny a tím se z něj stane aktivní oktapeptid nazývaný angiotensin II, jehož účinky zahrnují vzestup krevního tlaku (tzn. GF) díky konstrikci arteriol a stimulaci sekrece hormonu aldosteronu z kůry nadledvin. 22

28 Aldosteron působí vzestup resorpce Na + a Cl - z distálního stočeného kanálku, čímž se zvětší objem extracelulárních tekutin, resp. krevní tlak. Činnost juxtaglomerulárního aparátu se tedy jeví jako zpětnovazebný pokyn, regulující jednak průtok glomerulárním filtrem, jednak iontovou resorpci z tubulu tedy jako působení určující konečnou koncentraci moče. Produkce reninu je kontrolována trojím mechanismem: 1. tlakem v arteriola afferens, působícím na sekreční aktivitu juxtaglomerulárních buněk, 2. aktivitou macula densa, která reaguje na změny složení tekutiny, jež přes ni v distálním tubulu přechází, 3. stimulací sympatických nervových zakončení při juxtaglomerulárních buňkách. Tento složitý kaskádovitý systém se spouští např. závažnějším krvácení, dehydrataci či úbytku sodíku v těle (při ztrátě izotonické tekutiny). (J.A. dokáže ovlivnit průsvit arteriol a tím nastavovat velikost GF). obr. 29. Protiproudový mechanismus. Tmavé šipky znázorňují aktivní transport, tmavé šipky uvnitř- směr proudu a prázdné šipky pasivní transport. Juxtamedulární nefrony zasahující hluboko do dřeně (resp. jejich Henleovy kličky) a mají tedy též zásadní význam při vytváření gradientu hypertonicity, který se nachází v ledvinném intersticiu. Důležité je také zmínit, že arteriolae 23

29 glomerulares efferentes juxtamedulárních glomerulů jsou základem cévního zásobení dřeně ledviny (mohou být ještě doplněny např. arteriolami z interlobulárních tepen). Tyto artérie juxtamedulárních nefronů se dělí na cca 20 větví, jako vasa recta sestupují různě hluboko do dřeně a tvoří pleteně kolem kanálků. Specifická je vasa recta na Henleově kličce (je velmi důležité její uspořádání - není uspořádaná lineárně, což je podstatné proto, aby se dokázaly přizpůsobit osmolalitě Henleovy kličky v dřeňovém intersticiu i když k úplnému vyrovnání s kličkou nedojde a rychle neodnesly vstřebané molekuly). Je zřejmé, že existují v dřeni i venulae rectae. Ty začínají z venozních kapilárních sítí a ústí do venae arcuatae. A co se vlastně stane s tekutinou proudící přes tuto část nefronu (obr. 28.)? Přichází sem hypotonická tekutina ze vzestupné části Henleovy kličky, přičemž se zde tato hypotonicita vyrovnává resorpcí vody z lumen, ale pokud se organismus má zbavit přebytečné vody, potom stačí, aby tato hypotonická tekutina protekla bez resorpce vody do vývodných cest. (Velmi důležitá je potom nepřítomnost ADH - obr. 24. příloha). Množství tubulární tekutiny se zde redukuje asi na 5% z pů-vodního glomerulárního filtrátu. (Resorbuje se zde též Na + kotransportem s Cl -, ovšem i tato resorpce NaCl a celkově malá propustnost distálního tubulu pro vodu způsobuje značnou a častou hypotonicitu tekutiny v tomto úseku nefronu oproti krvi a etratubulární tekutině). Probíhá zde selektivní resorpce některých iontů a látek z moče a dále aktivní sekrece některých iontů do moče. Tím se kontroluje celkové množství soli v organismu a acidobazická rovnováha Sběrací a odvodné kanálky Jsou jiného vývojového původu než nefrony. Do každého sběracího kanálku ústí 5-10 nefronů. Sběrací kanálky - tubuli colligentes se spojují v ductus papillares a tyto papilární vývody ústí do renálních papilár - foramina papillaria (otvůrky papil, v nichž končí odvodné kanálky ledvin). Jinak jsou vystlány jednovrstevným kubickým epitelem. Hlouběji ve dřeni bychom ale našli vyšší epitelcylindrický. 24

30 Při běžném barvení se buňky sběracích kanálků a vývodů barví světle (jejich cytoplazma se špatně barví). Celkově tyto buňky obsahují málo organel a téměř žádné invaginace bazálních membrán. Rozhraní jednotlivých buněk jsou patrná, neboť buňky jsou bez interdigitací. Krom světle se barvících buněk se zde nachází i tmavé, tzv. ICC (intercalated cells= vsunuté buňky), se kterými se setkáváme už i v distálním tubulu. Těchto buněk je podstatně méně než buněk hlavních světlých a mezi světlými jsou roztroušeny. ICC obsahují spoustu mitochondrií a hrají důležitou úlohu při udržování acidobazické rovnováhy. obr. 30. Buňky sběracího kanálku Hlavní buňky zase resorbují sodík (v distálním tubulu a sběracím kanálku se resorbuje asi 5-10% filtrovaného sodíku) a vodu a secernují draslík. (viz obr. 28. v příloze). Tyto kanálky rozhodují o konečném objemu a osmolalitě moče. Zde hraje důležitou též ADH. Totiž bez vazopresinu zůstane stěna sběracího kanálku téměř nepropustná pro vodu - nedostane se do intersticia a definitivní moč je hypotonická. V opačném případě- má-li organismus vody nedostatek, osmola-lita vnitřního prostředí stoupá, uvolní se ADH a propustnost stěny pro vodu do intersticia. Tímto hypotonická tekutina, která sem přitekla, ztrácí vodu. Můžeme tedy uvést, že permeabilita těchto kanálků pro vodu je proměnlivá díky hormonu vazopresinu Ledvinové intersticium Jeho složky jsou: extracelulární matrix, několik typů intersticiálních buněk a intersticiální tekutina. Kromě glomerulárních kapilár obklopuje celý renální 25

31 tubulární i cévní systém - především jim poskytuje strukturní oporu. Je součástí ledvinového parenchymu, ovlivňuje růst a diferenciaci parenchymových buněk ledvin. Též produkuje různé hormony a cytokiny. V kůře činí asi 8% celkové tkáně a ve dřeni 30-40%. 3. ZPRACOVÁNÍ TKÁNĚ PRO HISTOLOGICKÉ VYŠETŘENÍ 3.1. Odběr Získaný materiál z živého člověka (získaný buď probatorní excizní = vyříznutím kousku tkáně k diagnostickým účelům nebo kyretáží = seškrábnutí tkáně kyretou- takhle se získává např. endometrium a také je možné získat tkáň probatorní punkcí = napíchnutí a nasátí dutou jehlou, obtiskem, výtěrem nebo endoskopickým výkonem- sondou = mikroexcize), tzv. biopsie musí být ihned (čerstvá) fixována ( viz ). obr. 33. Odběrová fixační nádobka 26

32 Nekropsie je tkáň ze zemřelého. Také se musí tkáň označit vyplní se tzv. Průvodní list k zásilce histologického materiálu, který obsahuje všechny potřebné údaje, dále se na nádobku s tkání se lepí štítek se základními údaji a ještě přímo ke tkáni se musí dát papírek s údaji, kdyby došlo k odloupnutí štítku nebo k jeho poškození, tak aby posloužil alespoň tento papírek, a samozřejmě slouží i proto, aby se nezaměnil materiál (obr. 33. Odběrová nádobka) 3.2. Fixace Materiál musí být fixován. Tkáně a orgány po zástavě přísunu kyslíku rychle podléhají autolýze a fixace zabraňuje autolýze, nebo-li samovolnému rozkladu tkáně (způsobená nekoordinovanou činnosti enzymů, které jsou většinou lysozomálního původu). Díky ní je struktura tkáně zachována, ovšem fixační prostředek, který by strukturu tkáně vůbec nezměnil, se zatím nenašel. Také, kromě zachování struktury tkáně, nás zajímá to, aby FP rychle a stejnoměrně pronikal do celé tkáně (nesmí proto být vzorek příliš velký a fixační tekutiny musí být dostatečně mnoho) a nesnižoval barvitelnost tkáně. Během fixace dochází především ke koagulaci a denaturaci bílkovin buněk a ke smrštění tkáně, rychle se usmrtí přežívající buňky a tkáně nebo v případě nekropsie se zastaví již započaté autotytické pochody. Mezi nejčastěji používané chemické FP (= fixační tekutiny) patří především 10% formol (neboli formalín, který je nutno uchovávat v tmavých lahvích, aby nevznikala HCOOH; ve formalínu lze nechat tkáň 24-48h, i déle - nepřefiuje se ),dále brómformol (použití v neurohistilogii), Tekutina Bouinova (obsahuje kyselinu pikrovou, nelze jí ale použít na fixaci tkání obsahující krev, protože krev hemolyzuje na tvrdou a těžko krájitelnou hmotu), Tekutina Bakerova (obsahuje mimo jiné formol a používá se na průkaz lipidů), fixační tekutiny se sublimátem (Susa, Zenker), u těchto FP je nevýhoda to, že tvoří černé sublimátové sraženiny, které zatěžují krájení bločku a musí se odstranit jódováním (jodovou tinkturou, Lugolovým roztokem). Také se často k fixaci požívá oxid osmičelý nebo glutaraldehyd. 27

33 Méně často se používají fixační prostředky fyzikální (suché teplo- bakteriologie; var, vysušení za nízké teploty - např. k průkazu enzymů, v tomto případě si proteiny nechávají antigenní vlastnosti) Zalití tkáně do parafínu Co nastává po fixaci FT? Je třeba z tkáně odstranit nadbytečný fixační roztok. To se provede praním fixovaných bločků v pramenité vodě, někdy se používá 80% ethanol. Další postup se odvíjí od toho, jestli zaléváme tkáň do látek ve vodě rozpustných nebo nerozpustných. Pokud do látek ve vodě nerozpustných, což je nejběžnější postup, je zde několik kroků: a) Tkáň se přenese do 70% etanolu musíme ji dostatečně odvodnit, neboť všechny fixační tekutiny obsahují vodu, a pokud by se tkáň po fixaci neodvodnila, příliš by ztvrdla a nebylo by možné ji pak řezat. Postupně tedy vkládáme tkáň do tzv. stoupající řady ethanolu, což je řada, kde postupně stoupá koncentrace ethanolu: od 70% (2h) 80% (4h) 96% (6h) 100% (100% jest bezvodý, připravuje se odvodněním 96% ethanolu a tkáň se v něm nechává 3krát po 2h). Ne vždy se 70% ethanolem začíná, záleží na použití předchozí fixační tekutiny. b) Po odvodnění se musí tkáň prosytit látkou (intermediem) rozpouštějící parafín (rozpouštědlem) a zároveň se tato látka musí mísit s bezvodým ethanolem. (Ethanol je totiž třeba v tomto kroku dokonale odstranit, aby se tkáň dobře krájela.) Mezi látky s takovýmito vlastnostmi patří např.: benzen (3krát vyměněná lázeň po 15min), xylen, methylbenzoát (prosycení trvá několik hodin), methylsalicát. c) V dalším kroku se tkáň prosytí zkvalitněným parafínem. Vložíme ji tedy po prosycení inetrmediem do otevřené kyvety s čistým tekutým parafínem (potřebujeme se zbavit intermedia). Tento parafín je vyhřátý na C (teplota nesmí být vyšší jak 58 C, aby se tkáň neznehodnotila). Prosycuje postupně ve třech lázních (v první cca 3h, ve druhé 5h, ve třetí 10h). Někdy se tkáň z intermedia nepřenáší rovnou do rozehřátého parafínu, ale nejdříve se prosycuje asi 30min v uzavřené kyvetě s benzen - parafínem a potom teprve se vkládá do rozehřátého parafínu. 28

34 d) Vlastní zalití tkáně do parafínu a následné rychlé a stejnoměrné ztuhnutí parafínu je posledním krokem zalévacích metod. Používá se též zkvalitněný a přefiltrovaný parafín a především je nutno podotknout, že ne stejný jako při prosycování tkáně parafínem. Zalévá se do zalévací komůrky, nalijeme do ní zahřátý parafín, rychle přeneseme tkáňový bloček, podle potřeby ho naorientujeme, přiložíme zalévací rámeček s číslem a dolijeme ještě parafín.(kromě parafínu se zalévají některé tkáně, především tuhé, jako jsou např. kost, zub apod. také do celoidinu. Též se používá v některých případech želatina a jiné) Krájení tkáňových bloků Z tkáňových bločků se zhotovují histologické řezy tenké několik tisícin mm (µm), optimálně 5-10 µm. V histologické laboratoři se nejčastěji krájejí bločky zalité do parafínu nebo paraplastu. obr. 34. Sáňkový mikrotom 29

35 Podle konstrukce rozeznáváme několik mikrotomů. Rotační mikrotom slouží jen ke krájení parafínových bloků (hlavně tzv. sériových řezů). Mikrotom sáňkový (obr. 34.) slouží ke krájení parafínových i celoidinových řezů. Mikrotom zmrazovací složí ke krájení nezalité tkáně nebo tkáně zalité do želatiny (tkáň je zmrazená CO 2 ). Ovšem častěji se tkáň prosycuje látkou, která má vyšší konzistenci, než je hutnost tkání vzorku, a potom se tedy krájí na sáňkovém nebo rotačním. V kryostatu se krájí při teplotách -20 C a tkáň může být i nativní, tzn. bez fixace. Krájení zmrazených tkání je potřeba např. při průkazu enzymů, barvení tuků, peroperační biopsii a imunohistochemii (speciální zmrazovací mikrotom umístěný v chladícím boxu se nazývá kryostat). Tloušťka řezu se na mikrotomu nastavuje mikrometrickým šroubem Lepení řezů na podložní sklo Řez z mikrotomu opatrně přeneseme na vodní hladinu teplé destilované vody (musíme řezy napnout). Voda musí být ohřátá na cca C, aby parafín změkl a řez se vypnul. K napnutí dochází díky účinku povrchovému napětí vody na zahřátý parafín. Voda nesmí přetéct přes okraj řezu. Potom si označíme čisté (ethanolem odmaštěné) podložní sklíčko, na které budeme řez z hladiny přenášet a také ještě na sklíčko kápneme glycerin - bílek (aby se řez dobře přichytil) a rozneseme jej po celé ploše sklíčka. Potom pomocí např. preparační jehly opatrně přeneseme řez na sklíčko, vodu necháme odkapat a dále můžeme dát sklíčko s řezem do sušárny (cca 38 C) na 24h, kde se odpaří voda. Někdy můžeme řez přenést pomocí preparační jehly rovnou na sklíčko, na kterém je směs glycerolu s bílkem, ovšem sklíčko musí být umístěné na ploténce vyhřáté na C a pomocí jiné preparační jehly řez vypneme. Nutno si též uvědomit, kde je rub lesklý a kde je líc matný řezu. 30

36 3.6. Barvení řezů Barvíme proto, abychom rozeznali pod mikroskopem jednotlivé složky tkáně. Velmi nám pomáhá i skutečnost, že různé části buněk a tkání se barví různými barvivy. Např. cytoplazma (a nejen ona) buněk se barví kyselými barvivy (molekuly tohoto barviva obsahují kyselé radikály) a říkáme o ní, že je eozinofilní, acidofilní nebo také oxyfilní. Eozin je nejpoužívanější kyselé barvivo, řecky oxys = kyselý. Barvivům, které barví cytoplazmu, říkáme plazmatická. Barviva zásaditá, nebo-li bazická, barví zase např. jádra buněk, resp. jaderný chromatin. Jádra jsou tedy bazofilní. Nejpoužívanější bazické barvivo je hematoxylin. Existují také tkáně, které se barví jak (slabě) kyselými, tak (slabě) zásaditými barvivy. Tyto tkáně nazýváme neutrofilní. Podle výsledku se rozlišuje metachromatické zbarvení, při němž se struktura barví odlišně než je tón použitého barviva a zbarvení ortochromatické- struktura je zbarvena stejně jako použité barvivo. Barvení je celá řada: I. Barvení histologických řezů metodami přehledného barvení. Jako příklad uvedu Massonovy trichromy- hlavně při vyšetření kolagenního vaziva (žlutý, modrý a zelený trichrom); Barvení Weigert van Giesonovo (používáme železitý Weigertův hematoxylin); Azan (= azokarmín, anilinová modř, oranž G; tato metoda bývá počítána mezi tzv. trichromová barvení, konkrétně jako modrý trichrom, dříve používaný modrý trichrom = železitý hematoxylin- kyselý fuchsin-ponceau- anilinová modř; nyní se tedy požívá azan); Orcein- znázornění elastických vláken, Hematoxylin - eozin, apod. Kromě barvení se velmi hojně používá i impregnace = prosycení tkáně roztokem soli kovu + následná redukce kovu na strukturách, které k němu mají afinitu. Nejpoužívanější je Impregnace retikulárních vláken dle Gomoriho a impregnace nervových vláken. 31

37 II. Barvení histologických řezů metodami histochemickými, imunohistochemi-ckými, cytologickými a speciálními. Různými histochemickými reakcemi se dají prokázat lipidy, sacharidy (PASreakce), enzymy, pigmenty, některé anorganické látky, nukleové kyseliny apod. Těmito reakcemi zjišťujeme charakter a distribuce chemických látek v buňkách a tkáních histologických řezů. Velmi důležité jsou i imunohistochemické metody založené na reakci Ag - Ab. Obecně se za antigen považuje jakákoliv látka, která vyvolává v organismu imunitní odpověď. Tuto vlastnost mají nejen proteiny a oligopeptidy, ale i mnohé polysacharidy a lipidy (zejména jsou- li vázány na proteinový nosič nebo jádro ). Lze vytvořit specifickou protilátku tak, že podáme nějakému zvířeti injekčně dávku přečištěné bílkoviny, která vyvolá imunitní reakci. Po nějaké době, kdy se vytvořily specifické monoklonální protilátky, se odebere zvířeti sérum a z něj je separují. Na tyto separované protilátky navážeme nějaké látky, které se dají snadno prokázat, říkané jim markery. Protilátky a antiséra se značkují tedy tzv. markery a jsou to např. enzymy, feritin, koloidní zlato, radioizotopy a také např. protilátky konjugované s fluorescenčním barvivem. Tkáňový řez vystavíme vlivu těchto protilátek- takže dojde k vazbě se specifickou bílkovinou (mezi specifické bílkoviny můžeme počítat velké množství látek) a potom se tedy prokazuje značka, kterou jsme navázali na protilátku. Jejich rozložení v řezech sledujeme pod elektronovým, fluorescenčním či světelným mikroskopem. Díky cytologickým barvením můžeme znázornit různé cytologické struktury. Mezi cytologické metody řadíme např. Heidenheinovo barvení a také třeba Barvení jádrovou červení. (cytologické vyšetření buněk v nátěrech využívá barvení podle Papanicolaoua a také je možné barvení podle Pappenheima). Mezi speciální metody můžeme zařadit: Barvení Alciánovou modří - průkaz mucinu v hlenu, Nisslovo barvení (tigroidní) - neurohistologie, Luxolová modřmyelinové pochvy axonů atd. 32

38 Základní barvení řezů Hematoxylinem-Eozinem postup a) Musíme zbavit řezy parafínu (protože barvíme převážně vodnými roztoky barviv) - odparafinovat xylenem - 2krát lázeň po 5min. b) Po rozpuštění parafínu dáme řezy do sestupné řady alkoholu (protože xylen se ve vodě také ještě nerozpouští) bezvodý ethanol 5min, potom 96% také 5min c) voda 5min. d) barvení Gillovým hematoxylinem cca 3-10min e) voda opláchnout f) tzv. diferenciace- protože se neobarví hematoxylinem jen jádra (modře), ale i další buněčné složky a to je nežádoucí, ponoříme na několik vteřin sklíčko s řezem do kyselého ethanolu. Tímto odbarvíme některé hematoxylinem přibarvené složky a jestli se diferenciace povedla, kontrolujeme pod mikroskopem. g) několik min. propíráme pod tekoucí vodou h) barvení eozinem 1-5min i) opláchnout v destil. vodě j) diferenciace kyselým ethanolem + kontrola pod mikroskopem k) odvodnění obarvených řezů vzestupnou řadou alkoholů l) projasnění xylenem- 2krát lázeň po 5min m) montování = převrstvení kapkou inertního tuhnoucího media, citace str. 72., vacek: Obarvené řezy uzavíráme, neboli montujeme mezi podložní a krycí sklíčko do uzavírajícího média. Uzavírající médium musí být látka dokonale průhledná, nesmí poškozovat zbarvení tkáně a musí mít vysoký index lomu. Používají se buď látky, které se nemísí s vodou, ale rozpouštějí se v xylenu. A proto, abychom mohly obarvené řezy do těchto látek montovat, musí být odvodněné a prosycené xylenem. Patří sem kanadský balzám, cedrový olej, syntetické pryskyřice, solakryl. Existují také látky, které se s vodou mísí (takže se nemusí odvodňovat) a též slouží k montování. Tyto látky používáme, pokud tkáň 33

39 nemůže přijít do styku s xylenem a koncentrovaným ethanolem. Patří sem glycerin, glycerinová želatina a sirup z arabské gumy. Výsledek barvení H-E: jádra jsou modrá, chrupavky jsou modré, svalstvo je červené a kolagenní vazivo růžové Nutno podotknout, že při přenášení sklíček s řezy z kyvety do kyvety hrozí vyschnutí tkáně, což by způsobilo její smrštění a tedy znehodnocení, a proto to musíme brát v potaz Barvení Toluidinovou modří - postup Odparafínované řezy barvíme 30 min v roztoku oranže s rozinek, opláchneme v destil. vodě, barvíme 1-2 min vodním roztokem toluidinové modři, potom opláchneme destilovanou vodou, dále diferencujeme v 70% ethanolu, zkontrolujeme pod mikroskopem, odvodníme, projasníme a montujeme. Výsledek barvení T.M. - jádra jsou modrá, chrupavka a hlen jsou modrofialové, cytoplazma růžová, vazivo červené, ery oranžové Barvení zeleným Trichromem - postup Odparafínované řezy barvíme 3-5min hematoxylinem, opláchneme ve vodě a diferencujeme v kyselém ethanolu, kontrolujeme pod mikroskopem, 5min pod tekoucí vodou a následné opláchnutí destilovanou vodou, barvení 3-5min kyselým fuchsinem, opláchnutí roztokem kyseliny octové ledové 1%, diferenciace roztokem oranže G a kyseliny fosfomolybdenové, kontrolujeme pod mikroskopemkolagenní vazivo musí být bezbarvé, opět opláchnutí roztokem kyseliny octové ledové, barvení 3-5min roztokem světlé zeleně, oplachujeme v kyselině ledové octové, odvodníme vzestupnou řadou alkoholů, projasníme, montujeme. Výsledek: jádra jsou modrá až hnědočerná, svalstvo červené, ery oranžové, kolagen zelený. 34

40 Pozn. nutno si uvědomit, že zpracování tvrdé tkáně pro histologické vyšetření (kost, zub, chrupavka) má jiný postup než je výše uveden, dále je jiný postup při rychlém zhotovování histologických preparátů, také při vyšetření v elektronovém mikroskopu a při zhotovování nátěrů. Já jsem pracovala s tkání získanou pitvou, která byla fixována ve formalínu, proprána ve vodě, odvodněna ve stoupající řadě alkoholů, prosycena benzenem, prosycena zkvalitněným parafínem a do parafínu byla i zalita. Potom jsem tkáňový bloček krájela na rotačním mikrotomu, napnutý řez jsem přenesla na podložní sklíčko, na které jsem nanesla předtím glycerin - bílek a potom jsem nechala řez 24h sušit. Pokračovala jsem barvením tkáně - konkrétně jsem barvila v hematoxylinu - eozinu, zeleném trichromu a toluidinové modři a samozřejmě jsem řez montovala a to syntetickou pryskyřicí. Mým dalším úkolem bylo rozeznat pod mikroskopem, o jaký typ glomerulonefritidy se jedná (viz dále) 35

41 4. GLOMERULONEFRITIDA Glomerulonefritidy jsou glomerulopatie vznikající zpravidla kvůli aktivaci imunologických mechanismů, někdy se zánětlivými změnami v glomerulech. Zdrojem antigenu vyvolávající imunitní reakci mohou být různá infekční agens. Imunokomplexy potom vznikájí normálně v rámci imunitní odpovědi reakcí Ag- Ab a glomeruly jsou vzhledem k vysokému krevnímu průtoku a vysoké permeabilitě kapilární stěny disponovány k depozici cirkulujících imunokomplexů. (Depozita imuglobulinů, komplementu a fibrinu mohou být různě lokalizovány, např. u IgA nefropatie- mesangiální lokalizace.) Lokalizace imunokomplexů by měla záviset na jejich velikosti (ta je daná poměrem Ag - Ab) velké imunokomplexy by se měly deponovat subendoteliálně, malé subepiteliálně. Rozlišují se 4 hlavní patogenetické typy poškození glomerulu: 1) poškození autoprotilátkou, 2) poškození zprostředkované komplementem 3) poškození cirkulujícími zánětlivými buňkami 4) poškození aktivovanými rezidentními buňkami. Několikrát vyšší výskyt glomerulonefritid je v zemích s nízkým hygienickým standartem, proto je třeba studovat vztah infekce např. HBV, HCV a HIV k různým typům glomerulonefritid. Jsou i endogenní antigeny, které mohou způsobit toto onemocnění, např. tumorózní antigeny či DNA Stanovení diagnózy Základ pro určení diagnózy je renální biopsie (viz str. 40.). Ovšem i tzv. močové syndromy nám často umožňují spolu s klinickým obrazem do jisté míry předvídat histologický nález v ledvinách (a mohou pomoci při rozhodování o indikaci k renální biopsii), ale nelze pouze na nich stavět prognózu onemocnění, neumožňují definitivní diagnózu typu glomerulonefritidy a nejsou dobrým východiskem pro imunosupresivní léčbu. Močový nález je třeba vždy hodnotit v souvislosti s celým klinickým obrazem onemocnění. Hodnocení močových 36

42 syndromů vychází z vyšetření kvantitativní erytrocytourie a kvantitativní proteinurie za 24h (obr. 35.). obr. 35. Izolovaná erytrocytourie Izolovaná erytrocytourie má velmi dobrou prognózu. Izolovaná proteinurie bez nefrotického syndromu je závažnější. Kombinovaná proteinurie s erytocytourií je tím závažnější, čí masivnější je nález. Prognóza nefrotického syndromu závisí na výši erytrocytourie, např. nefrotický syndrom s masivní erytrocytourií je nejzávažnější. Nefrotický syndrom se vyskytuje např. membranózní nefropatie, diabetické glomerulosklerózy apod. U nemocných s glomerulonefritidou můžeme pozorovat i akutní nefritický syndrom. Ten je charakterizován náhlým vznikem otoků, hypertenzí, často oligurií a mikroskopickou hematurií. Vyskytuje se především u akutní GN. pozn. Nefrotický syndrom je soubor příznaků vznikající v důsledku velké proteinurie. V klinickém obraze dominují otoky, laboratorně zjišťujeme kromě proteinurie, hypoproteinémii, hypoalbuminémii a hyperlipidémii. Proteinurie je závislá: 1) na porézním systému bazální membrány - ta za fyziologických podmínek nedovoluje penetraci větších molekul a vylučuje je tak z procesu filtrace. Ovšem při patologických změnách strukturních komponent bazální membrány se postupně zmenšuje a zaniká její schopnost rozlišovat při filtraci molekuly 37

43 plazmatických bílkovin podle jejich velikosti a dochází k jejich neselektivní filtraci, resp. exkreci do moči 2) na selektivitě náboje - aniontový filtr znesnadňuje filtraci aniontových plazmatických bílkovin, především transferinu a albuminu. Elektrostatická repulze neomezuje filtraci tzv. volně filtrovatelných plazma-tických bílkovin. Glomerulární proteinurie je tedy způsobena v tomto případě poklesem denzity elektronegativních nábojů ve stěně glomerulární kapiláry. 3) na změny glomerulární mikrocirkulace a biomechanických vlastností glomerulární stěny mohou ovlivnit dočasně funkci GF. Tyto změny v glomerulu jsou vyvolané např. při a po svalové námaze, při renovaskulární hypertenzi a podílí se tyto změny pravděpodobně na vzniku tzv. ortostatické proteinurie. (vylučování během dne je totiž asi o 50% vyšší než v noci). Co se změn mikrocirkulace týče - při vzestupu efektivního filtračního tlaku (účinek angiotenzinu a glomerulárních prostaglandinů), ale při nezměněných vlastnostech glomerulární stěny, se bude zvyšovat koncentrace plazmatických bílkovin v kapilárách. Za vzestup filtrace plazmatických bílkovin může též zvýšená difuze podle koncentračního gradientu. Následná resorpce bílkovin v proximálním tubulu bude pak méně účinná, a proto dojde k vzestupu exkrece bílkovin do moči. Pokud dojde k biomechanickým změnám bazální membrány, dochází též ke změně permeability pro bílkoviny kvůli odkrytí tzv. zkratových pórů. 4) Pokud dojde při poškození tubulárních buněk k rovnoměrnému poklesu resorpce, bude vzestup exkrece volně filtrovatelných bílkovin asi 3Ox krát vyšší než exkrece albuminu. Proces resorpce probíhá vazbou bílkovin na membránové receptory tubulárních buněk a pokračuje endocytózou a proteolýzou bílkovin. Pro diagnózu glomerulonefritidy je důležité i vyšetření imunologické (ze séra stanovujeme např. ukazatele zánětu- reaktanty akutní fáze, komplement, cirkulující imunokoplexy; protilátky - IgG, IgA, IgM, autoprotilátky- např ANCA, kryoblobuliny) vyšetření biochemické (hledáme vyšší koncentraci kreatininu). Význam má i vyšetření ultrazvukem - ledviny jsou zvětšené (je to neinvazivní zobrazovací metoda a přesto přesná a levná; mezi další zobrazovací metody užívané v nefrologii patří izotopové vyšetření ledvin, počítačová tomografie, 38

44 nukleární magnetická resonance, renální angiografie). Vyšetření serologické (bývá zvýšená koncentrace protilátek proto řadě mikroorganismů) Klasifikace primárních glomerulopatií U primárních glomerulopatií jde jen o izolované postižení ledvin. 1) akutní glomerulonefritida (je charakterizována náhlým začátkem, často s rychlým rozvojem renální insuficience) 2) rychle progredující- subakutní glomerulonefritida (vede obvykle k progresivní ztrátě funkce ledvin, léčba pomáhá funkci obnovit) imunokomplexová antirenální (izolovaná antirenální GN; Goodpastureův syndrom) pauciimunní (izolovaná pauciimunní rychle progredujícígn; Wegenerova granulomatóza s mikroskopickou polyarteritis) 3) chronické glomerulonefritidy (mají velmi pomalou, ale soustavnou a léčebně obtížně ovlivnitelnou progresi; vedou k selhání ledvin) neproliferativní idiopatický nefrotický syndrom ( patří sem nefrotický syndrom s minimálními změnami a fokálně segmentální glomeruloskleróza) membranózní nefropatie lupoidní nefritis typ V. proliferativní mesangioproliferativní ( patří sem IgA nefropatie; Henoch- Schoenleinova purpura; lupoidní nefritis typ II.) membranoproliferativní 39

45 (patří sem lipoidní nefritis typ III. a IV.) (pozn. Goodpastureův syndrom, Wegenerova graulomatóza s mikroskopickou polyarteritis, Henoch - Schoenleinova purpura a lipoidní nefritis typ II-V jsou příklady sekundárních GN s obdobným histologickým nálezem) 4.3. Klasifikace sekundárních glomerulopatíí Postižení glomerulů je jen jedním z projevů systémového, cévního, metabolického nebo genetického onemocnění postihující i jiné orgány. 1) diabetická nefropatie 2) amyloidóza (AA; AL) 3) systémové vaskulitidy s postižením ledvin Wegenerova granolumatóza mikroskopická polyarteritis Churg - Straussův syndrom Henoch- Schoenleinova purpura 4) Postižení ledvin u dalších systémových chorob lupoidní nefritis sklerodermie esenciální kryoglobulinémie sarkoidóza 40

46 4.4. IgA glomerulopatie (mezangiálně proliferativní GN) Onemocnění je často objeveno jako mikroskopická erytrocyourie (polovina nemocných má v anamnéze recidivující makroskopickou hematurii, u druhé poloviny se na onemocnění přijde náhodně). Je to tedy onemocnění glomerulů, které se objevuje až 3krát častěji u mužů než u žen a to v mladém a středním věku. Jedná se nejčastější primární GN všude na světě a tato GN je současně i nejčastější příčinou chronického selhání ledvin. Za 20 let po diagnóze dospěje do stadia ledvinového selhání asi 30-40% pacientů. Poprvé byla popsána v roce 1968 Bergerem a Hinglaisovou, a tak se někdy označuje jako Bergerova nemoc. Klinický obraz počátečního stadia IgA nefropatie bývá charakterizován asymptomatickou erytrocytourií (ovšem při běžném respiračním infektu může být i makroskopická, potom hovoříme o tzv. synfaryngitické hematurii), v pozdějším stadiu se zvyšuje krevní tlak a proteinurie. Čím vyšší proteinurie u IgA nefropatie, tím horší prognóza. Diagnózu stanovíme přesně ale jen díky renální biopsii. Imunofluorescenční mikroskop nám pak ukáže uložené IgA v glomerulech (jde o typické proužky, zrna a cípky v mezangiu; většinou se objevují i Ig jiných tříd: IgG a IgM) a opřít se můžeme i o skutečnost, že bývá zvýšená hladina IgA v séru. Imuokomplexy a složky komplementu se pohybují v normálních mezích. Co se diferenciální diagnózy týká, v první řadě je třeba vyloučit krvácení z vývodných cest močových (postglomerulární erytrocytourie). IgA nefropatie může být i zaměněna s akutní glomerulonefritidou. Významná erytrocytourie bývá i u sportovců po velké fyzické zátěži. A musíme také myslet na hereditární nefritidu. Etiologie a patogeneze nejsou doposud objasněny, a proto neuvádím ani eventuelní předpoklady. Co se léčby týká, specifická léčba IgA nefropatie není. Lze ale zpomalit úbytek ledvinové funkce. Snižuje se příjem bílkovin- úměrně ke snížené funkci ledvin, normalizuje se krevní tlak (ACE inhibitory nebo blokátory receptoru pro angiotenzin II), lze také zpomalit progresi IgA nefropatie podáváním rybího oleje a u pacientů s vysokou proteinurií se podávají glukokortikoidy. 41

47 5. RENÁLNÍ BIOPSIE Poprvé byla provedena v roce 1951 a její zavedení velmi přispělo k pochopení strukturálních a funkčních změn v ledvinách a k objasňování patologických stavů. Nyní pomáhá hlavně při stanovování přesné diagnózy, prognózy, při výběru nejvhodnějšího léčebného postupu a sledování účinnosti léčby. Před provedením RB se vyšetřuje krev - potřeba je znát hodnoty některých hemokoagulačních testů, též krevní skupinu, krevní obraz a sonografii ledvin. Pokud jsou dodrženy indikační a technické zásady, hrozí minimální riziko poškození pacienta. Ovšem i přesto eventuelní komplikace po RB existují a jsou následující: makroskopická hematurie, hematom (pokud vznikne rozsáhlejší perirenální hematom, hrozí rozvoj hypovolemického šoku), arteriovenózní píštěl, aneurysma, punkce jiných orgánů a poruchy funkce ledviny. Indikace renální biopsie dělíme na nesporné a individuální. Nesporné: podezření na rychle progredující GN neobjasněné akutní renální selhání proteinurie > 2, 0g / 24hod. s proporcionální erytrocyturií podezření na nefropatii u systémových chorob močový syndrom převládající erytrocytourie etiologicky nejasná izolovaná proteinurie > 3, 0g/ 24hod Individuální: akutní GN (hlavně u dospělých) izolovaná proteinurie < 2, 0g / 24 hod. izolovaná erytrocytourie diabetická nefropatie (jen za určitých podmínek) postižení ledvin u myelomu, amyloidóza rychlá progrese renální insuficience u definované glomerulopatie Renální biopsie se obvykle provádí tzv. perkutánně (další prováděné postupy jsou: RB otevřenou cestou - chirurgická, provádí se minimálně a RB 42

48 transvazální- vyhrazena pro případy, kdy je kontraindikována perkutánní RB). Provede se určení místa vpichu dle typu použitého zaměření (např. rtg mřížka, CT zaměření, sonografické zaměření a další), lokální anestezie a zavedení jehly. Obvykle se odebírají 2 vzorky tkáně (zajímá nás hlavně kůra kvůli většímu množství glomerulů a jeden vzorek jde na histologii + elektronovou mikroskopii a druhý na imunofluorescenci). Jehla je cílena do dolního pólu ledviny a používá se nyní především plně automatizovaný vyšetřovací aparát biopsy gun, do kterého se vkládá bioptická jehla (viz obr. 31.). Kontraindikace tohoto postupu (perkutánního) biopsie jsou, musí se respektovat a patří sem: hemokoagulační poruchy - především kvůli velké prokrvenosti renál. parenchymu, dále mezi kontraindikace perkutánní RB řadíme anatomické překážky - polycystickou degeneraci ledvin, solitární ledvinu, morbidní obezitu - tohle je technický problém, nekorigovatelná arteriální hypertenze a také pokud je nemocný např. v bezvědomí apod. Biopsie musí být provedena na vrcholu klinických projevů, kdy jsou diagnostické změny v biopsii nejpatrnější, zatímco reziduální změny jsou převážně nespecifické. obr.31. Bioptická jehla 43

49 5.1. Manipulace s bioptickým vzorkem Ihned po vyjmutí bioptického vzorku z těla se musí počítat s tím, že vzorek zasychá a může se zhmoždit, což kdyby se stalo, vznikly by nežádoucí artefakty, které by se již nedaly nijak odstranit. Dobrý vzorek punkční biopsie je váleček tkáně dlouhý asi 5-20mm a silný 1-2mm. Většina vzorků, které jsou delší než 1cm, obsahuje kůru i dřeň. Důležité je, aby vzorek obsahoval dostatečný počet glomerulů- určitý počet lze ale těžko vyjádřit, musí jich být prostě tolik, aby mohla být stanovena diagnóza. Zpracování vzorku je jiné pro histologii, elektronovou mikroskopii i pro imunofluorescenci (viz obr. 32.). obr.32. Výrazná pozitivita stěny kapilárních kliček glomerulů a peritubulárních kapilár při imunofluorescenci. Hodnocení renální biopsie je práce pro klinika a patologa, kteří vzájemně spolupracují. Nejdůležitější změny, po kterých se pátrá u glomerulů jsou: proliferace = Jde o zmnožení mezangiálních, endoteliálních nebo epiteliálních buněk. Proliferace parietálních epiteliálních buněk spolu s exsudací monocytů (vcestovalých monocytů, neboť by měly být uvnitř kapilárního trsu) tvoří na vnitřní straně Bowmanova pouzdra tzv. srpky, které mohou úplně vyplnit močový prostor. A samozřejmě pokud proliferují mezangiální buňky, většinou se zmnoží i 44

50 mezangiální hmota. Další, co sledujeme je exsudace, ztluštění kapilární stěny glomerulů, sklerotizace, hyalinizace a fibrotizace. Exudace (infiltrace glomerulu krevními elementy- lymfocyty, monocyty, neutofily) a proliferace jsou v podstatě zvýšená buněčnost glomerulu ( množství buněk v glomerulu). Tuto zvýšenou buněčnost pozorujeme u glomerulopatií proliferativních. Rozlišujeme postižení difúzní - kdy je postižena většina glomerulů (více jak 80%) a postižení fokální, kdy jsou postiženy jen některé. Segmentální změny znamenají, že jsou postiženy jen některé kapilární kličky a globální změny, že jsou postiženy všechny kapilární obloučky. Patologické změny postihují ale i tubuly (např. atrofie, nekróza), intersticium (např. edém, exsudace) a cévy. 45

51 ZÁVĚR Jak sem již zmiňovala, pracovala jsem s tkání na Ústavu histologie při LF v Plzni. Měla jsem k dispozici vše potřebné, abych mohla ve finále glomerulus poškozený IgA glomerulopatií pozorovat pod mikroskopem a porovnat s glomerulem nijak nepoškozeným. Histologický obraz mi ukázal především zmnožení mezangiální matrix u poškozeného glomerulu. 46

52 PŘÍLOHY obr. 2. řez ledvinou, 1- kůra, 2- dřeň, 3- pyramidy, 4- papily, 5- dírkovaný povrch papily, 6- pruhy kůry zasahující mezi pyramidy, 7- kalichy, 8- pánvička, 9- art.a vena renalis, 10- močovod 47

53 obr. 3. Kalichy a pánvička ledviny 1- kalichy, 2-pánvička, 3- močovod, 4- malé ledvinné kalichy, 5- velké ledvinné kalichy 48

54 obr. 4. Hlavní ledvinové tepny, pohled zpředu, 1a-4a- segmenty ledviny, které jsou vždy samostatně zásobeny jednou z hlavních hilových větví (1-4). Tohle větvení vykazuje jistou variabilitu, proto bylo navrženo více modelů cévní segmentace ledviny. 49

55 obr. 5. Krevní zásobení ledviny, A- kůra, B- dřeň, 1- proximální tubulus, 2- distální tubulus, 3- vena interlobularis, 4- spojovací segment, 5- venula recta, 6- sběrací kanálek, 7- tlustý úsek Henleovy kličky, 8- tenký úsek Henleovy kličky, 9- arteria interlobaris, 10- arteriola recta, 11- arteria interlobularis, 12- arteriola afferens, 13- arteriola efferens 50

56 obr. 6. Větvení cév v ledvině, I, II - kůra, III, IV - dřeň, V - papila, 1 - art. arcuata, 2 - art. interlobularis, 3 - arteriolae glomerulares afferentes, 4 - a. g. efferentes, 5 - peritubulární kapilární pleteň, 6 - art.rectae, 7, 8, 9 - kapilární pleteně s oky, 10 - kapilární pleteně kolem Henleových kliček, 11 - kapilární pleteně kolem ductus papillaris, 12 - v. stellatae, 13 - v. interlobularis, 14 - sbíhající se žíly z peritubulární kapil. pleteně, 15 - v. arcuata, 16 - v. rectae, 17 - kortikální glomerulus, 18 - juxtamedulární glomerulus 51

57 obr. 12. Detaily stavby nefronu, A- průřezy složek nefronu, B- úprava kapilár glomerulu, 1- corpusculum renale, 2- proximální tubulus, 3, 4 - Henleova klička (tenké sestupné, tenké vzestupné a tlusté vzestupné raménko), 5- distální tubulus, 6- ductus papillaris, 7- foramen papillare, mes- mesangiové buňky, 8- foramen papillare, m- místo macula densa 52

58 (B) (C) obr. 13. (B) Detail kapiláry glomerulu, 1- podocyt, 2, 3- pedikly, 4- membrána mezi pedikly podocytů, 5- fenestrovaný endotel kapiláry, 6- pór enndotelu, 7- společná bazální membrána podocytů a buněk endotelu obr. 14. (C) Řez kapilárou, 1- pedikly, 2- fenestrovanný endotel, 3- pór endotelu, 4- společná bazální membrána endotelu a podocytů rozdělená na dvě části rarae a jednu část densa, 5- štěrbin mezi podocyty, 6- erytrocyt 53

59 obr. 15 (A) - Corpusculum renale s glomerulem 1 -vas afferens 2 - vas efferens 3 - zevní list 4 - vnitřní list 5 - začátek proximálního tubulu 6 - distální tubulus s macula densa 7 - buňky pólového polštářku 8 - močový prostor 9 - kartáčový lem 10 - močový pól 11 - cévní pól

60 obr. 18. A - corpusculum renis, B - začátek proximálního tubulu, C - macula densa distálního tubulu, D - juxtaglomerulární aparát, 1, 2, 3- ukazuje na viscerální a parietální list, 4- močový prostor, 5- mezangium - mezangiální buňky zanořené v extracelulární matrix, 6, 7, 8- stavba juxtaglomerulárního aparátu, 9- vas afferens, 10- průsvity glomerulárních kapilár, 11- vas efferens obr. 23. Reakce organismu na ztrátu hypotonické tekutiny následkem ztráty vody je osmolatlity a koncentrace sodíku v ETC. Tohle vyvolá přesun osmoticky aktivních látek z ETC do buněk, tedy přesun vody opačným směrem. Na zvýšení plazmatické osmolality reaguje organismus produkcí ADH. (Pokles cirkulující tekutiny nastává až u pokročilé dehydratace, potom je spuštěn systém renin-angiotenzin, aldosteron-viz. obr.27) 55

61 obr. 28- Přehled transportních dějů v buňce distálního tubulu- DT, hlavní buňce-hb, a ICC buněk subtypu A a B. Přerušení membrány šipkou = iontový kanál Kroužky = transportní proteiny Černé kroužky = ATPázy. tab.1. Koncentrace některých látek v plazmě a v moči 56