Biochemie I. Aminokyseliny a peptidy

Transkript

1 Biochemie I Aminokyseliny a peptidy

2 AMINOKYSELINY Když se řekne AK ( -COOH, -NH 2 nebo -NH-) prostorový vztah aminoskupiny a karboxylové skupiny: - (=2-), -(=3-)... -(= poslední) -alanin součástí koenzymu A : + H 3 N-CH 2 -CH 2 -COO - kyselina γ-aminomáselná ( -aminobutyrát; GABA) neutrotransmiter v mozku:

3 AMINOKYSELINY -aminokyseliny: konfigurace (podle Fischera) COO - COO - D: H C NH + 3 L: NH 3+ C H R R Kódované aminokyseliny (20): -aminokyseliny (kromě prolinu NH skupina zabudována do cyklu). Alfa = aminoskupina na uhlíku, který nese karboxylovou skupinu. D-aminokyseliny v peptidech D-aminokyseliny jsou součástí některých peptidových řetězců v buněčných stěnách bakterií, peptidových antibiotik či hadích jedů. Uvádí se, že právě přítomnost D-aminokyselin chrání tyto molekuly před štěpením proteolytickými enzymy.

4 AMINOKYSELINY L- -aminokyseliny: kódované (= proteinogenní, viz dále) nekódované: - odvozené od kódovaných aminokyselin -Tyr katecholaminy (dopamin, adrenalin, tyroxin...) -vzniklé modifikacemi bílkovin (posttranslační modifikace) - metabolické meziprodukty (ornithin, citrulin) Vznik názvů aminokyselin Triviální názvy aminokyselin byly často vytvořeny podle zdroje, z nějž byly poprvé izolovány. Tak např. asparagin má název odvozený z latinského asparagus (chřest), tyrosin z řeckého tyros (sýr) apod. Glycin byl nazván podle své sladké chuti (řecky glýkos).

5 Naučit se kódované AK včetně označení /hydrofobní

6 21. Aminokyselina? -selenový analog cysteinu, zvaný selenocystein (SeCys), v němž je síra zaměněna za selen. -obsažena např. v savčí glutathionperoxidase a některých bakteriálních enzymech a označuje se jako 21. proteinogenní aminokyselina Selen také antioxidační vlastnosti; Selenocystein tedy kladně hodnoceno jako složka rostlinných produktů v potravinářství.

7 Rozdělení AK podle dalších kriterií Esenciální aminokyseliny (definice): Pro člověka: Val, Leu, Ile, Phe, Trp, Lys, Met a Thr, u novorozenců je kritický též Arg. Větvené aminokyseliny leucin, valin, izoleucin nezbytné v těžkých stavech (sepse, polytraumata)

8 Rozdělení podle chemické povahy postranních řetězců Funkční skupiny: Alifatické Aromatické Hydroxylové Sulfhydrylové Kyselé Basické Polární Nepolární

9 Nábojové vlastnosti aminokyselin Proč jsou uváděny vzorce AK s náboji? obojetné ionty = amfionty COO - H C NH 3 + H volný náboj amfiontu: algebraický součet nábojů (pro Gly v ph 7 = 0)

10 Acidobazické vlastnosti aminokyselin připomenutí teorie elektrolytické disociace kyselina: HA H + + A - např. CH 3 -COOH H + + CH 3 -COO - -disociovatelné skupiny v aminokyselinách se chovají jako slabé jednosytné kyseliny: stupeň disociace je charakterizován rovnovážnou disociační konstantou : K A + H - A HA

11 - úpravou definičního vztahu disociační konstanty získáme rovnici: Vyjádříme-li koncentraci vodíkových iontů jako ph, dostaneme Hendersonovu-Hasselbalchovu rovnici: A ph pk A log HA

12 KYSELÉ DISOCIAČNÍ KONSTANTY pk A SKUPIN VYSKYTUJÍCÍCH SE V BÍLKOVINÁCH (přibližné hodnoty) -COOH, -COOH imidazolium -SH -NH 3 + fenol -NH 3 + guanidinium 2,5 4,0 6,0 8,3 9,5 10,1 10,5 12,5

13 Funkční skupina Aminokyselina Hodnoty pk A volných aminokyselin Hodnoty pk A v bílkovinách -karboxylová Všechny AK + C-koncová v bílkovinách 1,7-2,6 1,8-3,6, -karboxylová Asp, Glu 3,86; 4,25 3,0-4,7 imidazolová His 6,0 5,6-7,0 -aminová Všechny AK + N-koncová v bílkovinách 8,8-10,7 7,9-10,6 -aminová Lys 10,53 9,4-11,0 thiolová Cys 8,33 8,3-8,6 fenolová Tyr 10,07 9,8-10,8 guanidylová Arg 12,48 11,6-12,6

14 TITRAČNÍ KŘIVKY SLABÝCH KYSELIN Máme roztok slabé kyseliny. Jak se bude měnit ph, když budu přidávat NaOH? HA H + + A - CH 3 -COOH H + + CH 3 -COO -

15 Titrační křivka glycinu

16

17 Hodnotu ph prostředí, při němž je aminokyselina ve formě amfiontu (volný náboj = 0) nazýváme isoelektrický bod a označujeme pi. ISOELEKTRICKÝ BOD Isoelektrický bod je definován jako ph, při němž se amfion nepohybuje ve stejnosměrném elektrickém poli. Vypočítáme jako aritmetický průměr disociačních konstant skupin disociujících v okolí isoelektrického bodu. Např. pro neutrální AK (i kyselou): pi = 1/2 (pk 1 + pk 2 ) Pro bazickou: pi = 1/2 (pk 2 + pk 3 ) Isoionický bod: ph, při němž je v destilované vodě volný náboj iontu nulový.

18 Více disociovatelných skupin: rozhodují ty, které "sousedí" s pi (nutno načrtnout titrační křivku) Pro polyionty (např. bílkoviny) tuto rovnici nelze použít (příliš mnoho pk A v okolí pi) Isoelektrické body kódovaných aminokyselin AK pi AK pi AK pi AK pi Gly 6,0 Ser 5,7 Phe 5,5 His 7,6 Ala 6,0 Thr 5,6 Tyr 5,7 Lys 9,6 Val 6,0 Cys 5,0 Trp 5,9 Arg 10,8 Leu 6,0 Met 5,7 Asn 5,4 Asp 3,0 Ile 6,0 Pro 6,4 Gln 5,6 Glu 3,2

19 -COOH, -COOH imidazolium -SH -NH 3+ fenol -NH 3+ guanidinium 2,5 4,0 6,0 8,2 9,5 10,1 10,5 12,5 Nakreslete Lys-Pro-Cys v ph 7 NH + 3 CH CO N CH CO NH CH COO - (CH 2 ) 4 CH 2 CH 2 CH 2 NH + 3 CH 2 SH V pi již bude ve formě S -. Určete pi tohoto tripeptidu 2 8,2 9,5 10,5 -NH + 3 -COOH -NH + 3 SH pi = (8,2 + 9,5) / 2 pi = 8,85 Volný náboj tripeptidu:

20 Cystin = cystinylcystein má symetrickou molekulu Zjištěné hodnoty pk pro karboxyly a aminoskupiny se však vzájemně výrazně liší (1,04 vs. 2,05 a 8,0 vs. 10,25). Proč? Po disociaci jedné z karboxylových skupin se změní volný náboj molekuly z +2 na +1 a proton z dalšího karboxylu je tedy odpuzován slaběji (pk A2 je o jednotku vyšší než pk A1 ). Stejně tak v případě obou aminoskupin.

21 SPEKTRÁLNÍ VLASTNOSTI Absorpce UV záření: aromatické (především Tyr a Trp) u 280 nm

22 Chemické reakce AK Reakce SH skupiny cysteinu -snadno se oxiduje za vzniku disulfidové vazby: 2 R SH + O 2 R S S R + H 2 O 2 -rozštěpena může být redukcí (in vitro obvykle merkaptoethanolem nebo dithiotreitolem): R S S R + HS CH 2 CH 2 OH (2-merkatoethanol) 2 RSH + HOCH 2 CH 2 S S CH 2 CH 2 OH -pro ochranu thiolových skupin peptidů nebo proteinů proti oxidaci nebo redukci se často využívá jejich reakce s jodacetamidem: R CH 2 SH + I CH 2 CONH 2 R CH 2 S CH 2 CONH 2 + HI

23 Chemické reakce AK Stanovení AK (reakce aminoskupin): ninhydrin, Sangerovo činidlo, dansylchlorid

24 Specifické modifikace různých zbytků AK; např.: R2 R2 CO CO H C CH 2 OH + I 2 H C CH 2 OH NH R1 NH R1 I Využití např. : -značení radioaktivním I - vyšetřování které AK zbytky jsou na povrcho bílkoviny a které uvnitř; peptidové mapování/ms

25 ICAT (Isotope Coded Afinity Tags)

26 Kvantifikace proteinů s využitím itraq

27 Chemické reakce AK Nejdůležitější reakce (samovolně - nikoliv): vznik peptidové vazby je třeba karboxylovou skupinu aktivovat chemickou modifikací, což se při syntéze peptidů in vitro děje pomocí různých modifikačních reakcí; pro syntézu bílkovin in vivo se aminokyseliny aktivují vazbou na trna

28 Specifické funkce proteinogenních aminokyselin Aminokyselina Vlastnosti, funkční skupiny v postranních řetězcích Funkce Gly nemá postranní řetězec umístění ve flexibilních nebo v prostorově náročných částech polypeptidových řetězců Pro iminokyselina (cyklická) nemožnost umístění v α-helixu, tvoří specifické helixy (kolagen), často v β-ohybech, spolu s hydroxyprolinem se uplatňuje v obranných reakcích rostlin proti stresům (sucho, zasolení půdy, teplotní stres) řada Ala, Val, Leu, Ile růst hydrofobicity a prostorové náročnosti tendence k ukrytí v hydrofobním jádře globulárních bílkovin Phe, Trp, Tyr aromatické aminokyseliny tendence k ukrytí v hydrofobním jádře globulárních bílkovin, možnost vzniku specifických π-π interakcí Ser, Thr, Tyr hydroxyskupiny (-OH) možnost tvorby vodíkových můstků, možnost fosforylace, Ser a Thr: možnost navázání oligosacharidových řetězců glykosidovou vazbou, Ser: katalytická skupina některých enzymů Cys thiolová skupina (po oxidaci disulfidová skupina) prostřednictvím disulfidových můstků stabilizace prostorové struktury bílkovin, katalytická skupina některých enzymů, rozhodující pro udržení přiměřeného redox-potenciálu v buňce Glu, Asp anion karboxylové kyseliny (-COO - ) možnost stabilizovat prostorovou strukturu bílkovin prostřednictvím elektrostatických interakcí, Asp: přímá účast na katalytickém působení mnoha enzymů, Glu: klíčová látka v metabolismu dusíku, nejdůležitější excitační neurotransmiter v mozku Gln, Asn amidová skupina (-CONH 2 ) polární nenabitá skupina možnost vytvářet vodíkové můstky, Asn: možnost připojení oligosacharidových řetězců v glykoproteinech, Gln: zásobárna reaktivního dusíku pro biosyntezy Lys kation aminoskupiny (-NH 3+ ) stabilizace prostorové struktury tvorbou iontových vazeb a vodíkových můstků, vazba některých prostetických skupin v proteinech Arg guanidylová skupina stabilizace prostorové struktury tvorbou iontových vazeb a vodíkových můstků His imidazol v neutrálním prostředí může být ve formě neutrální nebo kationické donor i akceptor protonů, katalytická skupina mnoha enzymů, vazba kovových iontů v metalloproteinech prostřednictvím koordinačních vazeb (donor elektronů)

29 PEPTIDY Nomenklatura peptidů: N- konec (začátek), C-konec (konec) Gly-Ala-His = glycylalanylhistidin (Gly volná NH 2, His volná COOH sk.) Pozor: Ala-Tyr Tyr-Ala + H 3 N O CH CH 3 C NH CH H 2 C OO - + C H N CH C NH CH COO - 3 C H 2 O CH 3 OH OH Zápis primární struktury peptidů: - třípísmenové zkratky AK (nutné znát); např.: Leu-Glu-Asn-Lys-Ala -jednopísmenové zkratky AK (užitečné znát): LENKA

30 - peptidy tvořeny oligopeptidy (dipeptid, tripeptid, tetrapeptid atd.) - 10 a více aminokyselinových zbytků - polypeptidy - rozhraní mezi polypeptidy a proteiny cca 100 aminokyselin nebo molární hmotnost okolo g.mol-1 Způsoby vzniku peptidů: - cestou proteosyntézy polypeptidového řetězce (transkripce, translace na ribozomech), úpravy, výsledný peptid; takovéto peptidy obsahují pouze L-aminokyseliny - specifickou metabolickou drahou typickou pro daný peptid; pak mohou obsahovat i některé neproteinogenní aminokyseliny (β-alanin, ornithin) nebo aminokyseliny v D- konfiguraci. Peptidová vazba může být také tvořena např. γ-karboxylovou skupinou glutamové kyseliny (např. glutathion), cyklické struktury, větvené struktury - uměle laboratorní syntézou

31 SYNTÉZA PEPTIDŮ in vitro a) aktivace (aktivní estery, anhydridy, azidy, karbodiimidová synthesa) b) blokování skupin, které nemají reagovat c) synthesa peptidové vazby d) odblokování

32 Glutathion - kofaktor důležitých oxidoreduktas; odstraňování peroxidu vodíku i volných radikálů - ochrana před oxidačním stresem Vasopresin -(též adiuretin) stimuluje resorpci vody ledvinami, zvyšuje také krevní tlak Oxytocin - způsobuje kontrakce některých hladkých svalů Insulin - ovlivňuje hladinu glukosy Aspartam umělé sladilo Endorfiny jsou skupina tzv. opioidních peptidů (endogenních morfinů), tvořených obvykle aminokyselinovými zbytky; ale i kratší peptidy např.: enkefaliny (methionin-enkefalin a leucin-enkefalin Gramicidin S a valinomycin peptidová antibiotika; ionofory vytvářející kanály v buněčné membráně a přenášející určité ionty zoo a fytotoxiny - (hadi, štíři, apamin, falloidiny a amanitiny: polyaminokyseliny - (buněčné stěny bakterií: poly- -L-Glu, poly- -D-Glu) Amanita phalloides)

33 Glutathion a jeho funkce v organismech kofaktor oxidoreduktas a isomeras chrání volné SH skupiny detoxikace peroxidu a volných radikálů reserva SH skupin

34 Syntéza glutathionu (GSH) Struktura of formy GSSG

35 .