MENÍ A INTERPRETACE SPEKTER BIOMOLEKUL. Miloslav Šanda

HTML
DOWNLOAD

Rozměr: px

Začít zobrazení ze stránky:

Download "MENÍ A INTERPRETACE SPEKTER BIOMOLEKUL. Miloslav Šanda"

Jakub Sedláček
před 9 lety
Počet zobrazení:

1 MENÍ A INTERPRETACE SPEKTER BIOMOLEKUL Miloslav Šanda

2 Ionizaní techniky využívané k analýze biomolekul (biopolymer) MALDI : proteiny, peptidy, oligonukleotidy, sacharidy ESI : proteiny, peptidy, oligonukleotidy, sacharidy APCI: syntetické polymery, nepolární analyty jako triacylglyceroly..

sacharidy ESI : proteiny, peptidy, oligonukleotidy,

3 MALDI intaktních protein Tvorba 1x nabitých iont molekulárních adukt V minoritním množství tvorba 2x nabitých iont a tvorba dimer Pi prosté MALDI-TOF analýze nejsou zpravidla patrné fragmentaní ionty Používané matrice kyselina sinapová, v menší míe α-hydroxyskoicová kyselina a DHB

MALDI-TOF analýze nejsou zpravidla patrné fragmentaní ionty Používané

4 MALDI/MS spektrum protein

5 ESI/MS intaktních protein Tvorba vícenásobn nabitých iont možná analýza velkých protein spektrometry s nižším rozsahem hmot Pi použití analyzátoru s vyšším rozlišením možnost stanovení MW proteinu s pesností Da 0,1Da v závislosti na rozlišení instrumentu

použití analyzátoru s vyšším rozlišením možnost stanovení MW

6 ESI/MS intaktního proteinu

7 Výpoet molekulové hmotnosti proteinu z m/z sousedních pík M MW proteinu, z nábojový stav Y pík s nižší m/z, X pík s vyšší m/z X = (M+z)/z, Y = (M+z+1)/(z+1) nábojový stav píku X z X = (Y-1)/(X-Y) MW = (X*z X )-z X = (Y*z Y )-z Y

8 MALDI-MS peptid Tvorba 1x nabitých iont V pípad zasolení vzork možná tvorba adukt se složkami solí Vhodné matrice α-hydroxyskoicová kyselina, DHB Pi volb vysoké intensity laseru prolínání a potlaení nižších hmot ionty matrice

α-hydroxyskoicová kyselina, DHB Pi volb vysoké intensity

9 Využití MALDI/MS peptid V analýze molekulové hmotnosti peptidu Identifikace proteinu po naštpení pomocí specifického enzymu (peptide mass fingerprinting) srovnání nameného spektra s databází aminokyselinových sekvencí protein a poítaov vytvoených teoretických digest (smsí teoretických peptid)

mass fingerprinting) srovnání nameného spektra s databází

10 Používané specifické štpení

11 Výhody a nevýhody MALDI/MS peptid + relativn snadná interpretace spekter, jednoduchost experimentu a instrumentace - vysoké nároky na pesnost zmených spekter - problémy interpretace spekter pi smsi protein nebo pi identifikaci protein s možnou mutací nebo nedostaten známou sekvencí

pesnost zmených spekter - problémy interpretace spekter pi smsi

12 MALDI/MS digestu proteinu

13 Vyhledávací program MASCOT

15 LC-MS/MS (MALDI/MS/MS) peptid Potvrzení pesnjší identifikace pomocí hmotnosti peptidu a fragmentaního spektra peptidu Možnost popisu sekvence peptidu z fragmentaního spektra (DE-NOVO sekvenování) Možnost analýzy digest celých organel nebo ástí organism popípad smsí protein Možná analýza posttranslaních modifikací pomocí MS/MS

fragmentaního spektra (DE-NOVO sekvenování) Možnost analýzy digest celých organel

16 Postup identifikace protein pomocí ESI-MS/MS

17 ESI-MS/MS spektrum peptidu

18 Fragmentace peptidu

19 Majoritní fragmenty peptid

20 Další pozorované fragmenty immoniový iont

21 Hodnoty hmot píspvk jednotlivých aminokyselin a jejich immoniových iont

22 MS/MS peptid Fragmentaní spektrum pomocí CID obsahuje pevážn y a b ionty a v menší míe potom ostatní fragmentaní ionty Pi analýze posttranslaních modifikací lze krom neutrálních ztrát pozorovat i ionty modifikací Volba rzných kolizních energií pro rzn nabité ionty peptid

23 Instrumenty používané pro CID fragmentaci v proteomických laboratoích ESI-IT, ESI-LIT ESI-QQQ ESI-Q-TOF, ESI-Q-TRAP MALDI-Q-TOF MALDI-TOF/TOF Mén rozšíené jsou ESI/MALDI-FT-ICR, ESI-ORBITRAP

24 Nízkoenergetické fragmentace ECD,ETD Disociace záchytem elektronu ECD nebo penosem elektronu ETD Pi použití nízkoenergetické ECD nebo ETD fragmentace disociují pevážn peptidové vazby za tvorby c a z iont

25 MS/MS peptid CID vs. ECD,ETD Pi analýze posttranslaních modifikací v pípad více modifikaních míst v jednom peptidu nelze pro zjištní místa modifikace použít CID fragmentaci (vysoká disocianí energie, disociace peptidové vazby a souasn vazby modifikace) V pípad ETD, ECD vznikají jednodušší spektra obsahující pouze dva druhy iont c a z

26 CID vs ECD, ETD

27 Nkteré proteinové databáze

28 Programy pro zpracování proteomických dat a vyhledávání v databázích MASCOT (Matrixscience) Proteinlynx ( Waters) Protein prospektor (UC SF) a mnoho dalších k nalezení napíklad na: (

29 TOP-DOWN Proteomika Analýza na úrovni intaktních protein Fragmentace CID, ETD, ECD Neztrácíme nkteré informace o které mžeme pijít pi chemickém (enzymatickém) zpracování proteinu Nutnost náronjší MS instrumentace, než u analýzy digest

30 Kvantifikace zmn koncentrace protein A, absolutní kvantifikace pomocí isotopov znaeného peptidu (AQUA ) B, pomocí dalších technik se kvantifikují zmny koncentrací protein pomocí isotopických znaek (ICAT, ITRAQ..) nebo isotopicky znaených aminokyselin (SILAC ), popípad znaení pi digestu (voda O 18 ) V poslední dob se stále více uplatuje kvantifikace bez nutnosti znaení

31 itraq metoda

32 Stanovení oligonukleotid pomocí hmotnostní spektrometrie MALDI/MS Nejlepší výtžnost ionizace v negativním módu Obvyklé matrice PA, 3-HPA, 2,3,6-trihydroxyacetophenon Mnohem menší výtžnost ionizace oproti peptidm Spektra jsou komplikovaná tvorbou fragment Nutné dostatené odsolení, velmi náchylné k tvorb adukt s ionty alkalických kov

33 Vliv solí na stanovení oligonukleotid pomocí MALDI/MS

34 Stanovení sacharid pomocí hmotnostní spektrometrie Používají se pedevším mkké ionizaní techniky pro stanovení sekvence a struktury (ESI, MALDI) ve spojení s MS n Stanovení polysacharid je mnohem složitjší než stanovení protein, peptid nebo nukleových kyselin díky isomerické povaze základních stavebních kamen a jejich možnému vtvení

35 Fragmetace glykopeptidu

36 Fragmentace glykopeptidu

37 Dkuji za pozornost

Podobné dokumenty

Zdroje iont používané v hmotnostní spektrometrii. Miloslav Šanda

Zdroje iont používané v hmotnostní spektrometrii Miloslav Šanda Ionizace v MS Hmotnostní spektrometrie je fyzikáln chemická metoda, pi které se provádí separace iont podle jejich hmotnosti a náboje m/z