Mikroskopická obrazová analýza

Transkript

1 Návod pro laboratorní úlohu z měřicí techniky Práce O1 Mikroskopická obrazová analýza

2 1 Úvod: Tato laboratorní úloha je koncipována jako seznámení se s principy snímání mikroskopických obrazů a jejich následnou obrazovou analýzou pomocí vhodných softwarových prostředků. Základním předpokladem pro úspěšné provedení obrazové analýzy je správné sejmutí obrazu analyzovaného materiálu. Tento proces je ovlivňován mnoha faktory, z nichž nejdůležitějšími jsou osvětlení, podklad a kvalita snímacích zařízení. Hlavním zde uvedeným zařízením, které nám pomáhá co nejlépe sejmout obraz sledovaného vzorku, je světelný mikroskop Nikon s kamerou SONY DFW-SX910. Výběr zařízení, pomocí kterých můžeme sejmout obraz analyzované směsi, je v dnešní době velmi široký. Aby bylo možné obraz následně počítačově zpracovat, je vhodné jej získat přímo v digitální formě. K tomuto účelu slouží digitální fotoaparáty a kamery, které mají v sobě zabudovaný vhodný snímací prvek. V dnešní době jsou nejpoužívanějšími typy CCD (charge-coupled device) a CMOS (Complementary metal-oxide semicoductor) senzory. Oba druhy mají svůj zcela základní princip společný: převádějí světelnou energii na elektrickou. Velmi zjednodušeně lze tento proces popsat tak, že tisíce až milióny buněk citlivých na světlo jsou uspořádány do plošné matice. Velikost matice, tedy součin počtu sloupců a řádků matice, udává rozlišovací schopnost jednotlivých přístrojů. Každá buňka převádí světelnou informaci ze své malé části obrazu na elektrický signál. Hodnoty náboje jednotlivých buněk je poté potřeba přečíst. U systému CCD, používaným v této práci, je nakumulovaný náboj ve formě analogového signálu přesouván přes matici tvořenou Shottkyho diodami, která se tedy chová obdobně jako posuvný registr, a jedním rohem matice přechází do vyhodnocovacího zařízení. Analogově/digitální převodník poté převede každou hodnotu buňky do digitální podoby. Protože jsou jednotlivé elementy citlivé především na intenzitu světla a méně na barvu, je takto získaný obrázek černobílý. Barevného obrázku se většinou dosahuje předřazením příslušného barevného filtru. Pro vytvoření jednoho barevného bodu (pixelu) výsledného snímku proto potřebujeme nejméně tři buňky matice. V praxi se však na jednom pixelu barevného obrazu podílí většinou čtyři buňky CCD senzoru. Je zde totiž dvakrát zařazen zelený filtr, čímž je simulována větší citlivost lidského oka právě na zelenou barvu. Výsledný barevný bod pak vzniká aditivním smícháním těchto tří barev. Nevýhodou CCD detektorů je vzájemné ovlivňování nábojů v sousedních buňkách, malý rozsah intenzit a nemožnost adresovat jednotlivé buňky. Naopak výhodami tohoto detektoru oproti druhému typu je vysoké rozlišení, vysoká rychlost převodu signálu a nízký šum ve výsledném obraze. CCD detektory bývají využívány pro práci na vysoce kvalitních snímcích, s mnoha dokonale zhodnocenými pixely a za vyšší citlivosti ke světlu. Naopak senzory CMOS mívají obrazovou kvalitu nižší, nižší rozlišovací schopnost a nižší citlivost. Na druhou stranu přístroje s CMOS senzory jsou mnohem levnější a mají nižší spotřebu energie, proto jsou vhodné pro přístroje, používající jako zdroje energie baterie. Vlastnosti senzoru, díky kterému je světelný signál převáděn na elektrický, jsou sice nejdůležitější, ale ne jedinou charakteristikou snímacího zařízení. Při volbě vhodnosti použití jednotlivých zařízení pro danou aplikaci je nutné brát v úvahu také další schopnosti zařízení. Jedná se například o charakter připojení přístroje k počítači, formát získaných snímků nebo schopnost sejmout digitální videozáznam. 1

3 2 Zařízení používaná v této práci 2.1 Mikroskop Nikon Eclipse LV100D Mikroskopy Nikon řady Elipse LV jsou určeny pro celou řadu nejrůznějších oborů, jako například výroba, výzkum a vývoj polovodičů, elektroniky, léků, dále pak v obecné metalurgii, krystalografii a ve výzkumu, vývoji a výrobě keramických materiálů. Mikroskop má zabudovánu nekonečnou optiku CFI60, která koriguje chromatickou vadu v celém zorném poli. Obraz je tedy extrémně ostrý, s vysokým kontrastem a minimálním kolísáním jasu. Navíc parfokální vzdálenost 60 mm (tj. vzdálenost v milimetrech od závitu objektivu k povrchu preparátu, případně krycího skla) a větší průměr objektivu zajišťují jak větší pracovní vzdálenost tak větší numerickou aperturu. Větší pracovní vzdálenost, je obzvlášť výhodná při pozorování silných preparátů. Ve stojanu mikroskopu je zabudovaný světelný zdroj pro diaskopické osvětlení a páčka přepínání osvětlení dia/epi. Dostatečně velký stolek (6" x 4") usnadňuje pozorování ve všech průmyslových aplikacích. Pohodlí při pozorování preparátů zajišťuje také ergonomické uspořádání ovládacích prvků stolku a zaostření mikroskopu. Soustředné knoflíky jemného a hrubého zaostření jsou umístěny pouze několik centimetrů nad úrovní stolu a ovládací prvky posunu stolku a zaostření jsou v těsné blízkosti. Stolek i zaostření lze tedy ovládat jednou rukou a druhou rukou je možné například nastavovat osvětlení případně clony a filtry. Na následujících obrázcích je popis základních prvků tohoto mikroskopu. Pohled zprava: 2

4 Pohled zleva (detail ovládacích prvků): Zacházení s mikroskopem bude navíc před začátkem laboratorní práce demonstrováno asistentem. Při práci s mikroskopem dbejte na pokyny asistenta, nezacházejte s žádným ovládacím prvkem hrubě a nezkoušejte nic, co vám asistent neukáže nebo nedovolí. Tento mikroskop je velmi nákladná součást laboratoře (cca 650 tisíc Kč) a jakákoliv oprava je nejen finančně, ale také časově náročná a výrazně by narušila chod laboratoří. 2.2 Digitální kamera SONY DFW-SX910 Tato kamera má jako snímací prvek CCD detektor, jehož rozlišení je pixelů. Napájení kamery je zajišťováno pomocí standardního rozhraní IEEE 1394 (neboli FireWire). Přes toto rozhraní je také kamera ovládána buď pomocí software LUCIA nebo jiných programů pro ovládání FireWire kamer (mimo jiné i LabVIEW). Rychlost snímkování kamery je až 7,5 snímků za sekundu, této rychlosti je ovšem možné dosáhnout pouze při nižším rozlišení. Kamera nemá vestavěný objektiv, aby bylo možné získávat snímky, je tedy nutné přes standardní C-závit připevnit vhodný objektiv v závislosti na velikosti sledovaného materiálu. V této úloze je objektiv nahrazen mikroskopem Nikon. 3

5 3 Použitý software 3.1 LUCIA General 5.2 Program Lucia (od srpna 2006 s názvem změněným na NIS-Elements) je nejpoužívanějším software pro obrazovou analýzy na VŠCHT a jedním z nejpoužívanějších v ČR. Důvodem této obliby je to, že má českého výrobce Laboratory Imaging s.r.o. a tudíž i českou jazykovou verzi, což je především pro výuku velmi výhodné. LUCIA je systém obrazové analýzy určený ke sledování, snímání, archivaci a ručnímu nebo automatizovanému měření preparátů. Používaný snímací systém nejčastěji tvoří optický přístroj (mikroskop, stereomikroskop resp. makrooptika), dále kamera nebo digitální fotoaparát, nezbytný počítač a softwarové vybavení. Vybavení programu Lucia je možné rozdělit do několika stupňů rozdělených podle náročnosti prováděné obrazové analýzy, v této laboratoři je používán III. stupeň nazvaný LUCIA General. LUCIA General - III. stupeň Softwarové vybavení určené pro plně automatizované a náročné úlohy, často spojené s rozhodovacími procesy během měření. General obsahuje veškeré možnosti Measurementu; většina funkcí je však posílena o doplňky k speciálnímu použití. V základní programové výbavě LUCIA General jsou následující prvky: Nastavení a ovládání snímací kamery Živé zobrazení na monitoru resp. výběr části obrazovky, kde je živý obraz Snímání jednotlivých snímků, sekvence (sady) snímků, snímání velkých obrázků Úprava sejmutého obrazu základními nástroji (kontrast, SW doostření, SW vyhlazení) Rozměrová kalibrace systému pro jednotlivé optické konfigurace (pro více zvětšení) Ruční proměřování délek, ploch a úhlů pomocí myši s výstupem dat Prahování, segmentace obrazu na objekty a pozadí Základní binární operace na segmentovaném obrazu (eroze, dilatace, otevření, zavření, zaplnění děr, obrysy...) Ruční editor binárního obrazu Automatizované měření planimetrických veličin (plocha, max. a min. rozměry, protažení, cirkularita, délka, šířka.) Programování - vytváření maker pro opakující se úlohy Úprava barevných obrazů obsahuje morfologické funkce (erozi, dilataci, morfologický gradient, detekci hran.) Úprava binárních obrazů obsahuje rozšířené funkce (separaci binárních objektů, skeleton, ořezání konců čar, zóny vlivu, jednobodové značení.) Srovnávací funkce pro dva barevné obrazy (vzájemné posuny, otočení, smrštění nebo roztažení, diferenční funkce) Kombinace více binárních obrazů - binární operace (průnik, sjednocení, porovnávání, odečítání) Měření v masce - lze měřit v libovolně velké ploše různého tvaru, může být složena i s více vzájemně nepropojených oblastí; masku lze vytvořit prahováním nebo ručním editorem; lze vzájemně propojit masku a binární obrazy Měření s omezením veličin (např. jen objekty s plochou větší než 50 µm) a řada dalších funkcí 4

6 Příklad využití funkcí měření v programu LUCIA (zdrojem obrazů je prospekt k programu LUCIA vydaný firmou Laboratory Imaging s.r.o.) Pro náročnější a speciální operace obrazové analýzy lze k základnímu programu LUCIA General (příp. LUCIA Image resp. Measurement) zakoupit další přídavné moduly, které nám umožní např. rozšířené ovládání zařízení mikroskopu nebo náročnější analýzu získaných snímků. Obecný postup analýzy obrazu programem LUCIA General je následující: 1. Sejmutí obrazu V této úloze je obraz snímán programem ScanSoft Paper Port, touto funkcí programu LUCIA se tedy budeme zabývat v dalších úlohách (při použití mikroskopů nebo získávání makrosnímků). Pokud snímáme obraz jinak než kamerou, připojenou k počítači, objeví se při spuštění LUCIA varování, že Kameru nelze otevřít!. Po potvrzení tlačítkem OK se program bez problémů spustí a budou fungovat všechny funkce obrazové analýzy (samozřejmě kromě funkcí pro snímání obrazu). 2. Otevření obrazu Obraz sejmutý jinak než přímo online kamerou se otevírá jednoduše příkazem Otevřít v nabídce Soubor. 5

7 3. Úprava barevného obrazu nabídka Obraz Oříznout pokud naskenovaný obraz obsahuje zbytečně mnoho pozadí a objektů, které nebudou analyzovány, je možné příkazem Oříznout upravit velikost obrazu tak, aby obsahoval pokud možno minimum rušivých částí a všechny objety, které mají být analyzovány; oříznout je možné pouze do tvaru obdélníku a výběr se nastaví táhnutím myši a potvrdí tlačítkem Enter Kontrast pokud se sledované detaily v obraze svou světlostí málo liší od ostatních objektů, pak je možné jejich kontrast zvýšit funkcí Kontrast (pro šedý obraz) příp. Kontrast složek pro zvýraznění barevných složek obrazu; při posouvání hodnot kontrastu na stupnici se v náhledu zobrazuje porovnání původního a upraveného obrazu Upravit obraz funkce v nabídce Upravit obraz umožňují další změny barev a intenzity v obraze, jako jsou například matematické transformace jednotlivých barev, změna sytosti nebo odstínu Vyhladit/Zaostřit tyto funkce potlačí resp. zvýrazní detaily v obraze Velikost/Otočit/Převrátit/Posunout tyto funkce manipulují s obrazem a upravují jeho rozměry Detekce funkce v menu Detekce vyhledávají a zvýrazní (zvýšením světlosti) určité vlastnosti obrazu, jako jsou hrany nebo oblasti, kde hodnoty světlosti vytvářejí tzv. údolí nebo vrcholy, lokální maxima nebo minima Morfologie morfologické funkce upravují objekty v obraze tak, že je zmenší příp. odstraní (Eroze), zvětší příp. spojí (Dilatace), vyhladí kontury, odstraní malé objekty, rozpojí objekty spojené tenkou šíjí (Otevření) nebo zaplní díry, vyhladí okrajové trhliny a spojí blízké objekty (Zavření) 4. Transformace obrazu Konverze tato funkce z nabídky Obraz převání barevný obraz na šedý (Převést do šedého obrazu), obraz vyjádřený RGB (červená, zelená, modrá) stupnicí převedou na HSI (odstín, sytost, světlosti) stupnici (Převést RGB na HSI) a naopak (Převést HSI na RGB) a dále je možné z obrazu vybrat jednu barevnou vrstvu příp. určitou hodnotu světlosti, odstínu a převést ji do šedé stupnice (Vytáhnout složku - výsledkem je tedy šedý obraz vytvořený na základě specifických požadavků uživatele) Prahování prahování je jedna z nejdůležitějších funkcí obrazové analýzy, která převádí barevný nebo šedý obraz na binární; program LUCIA dovoluje prahovat (tedy stanovit práh mezi pozadím a objekty v binárním obraze) podle jednotlivých barevných složek obrazu (Prahování resp. Prahování po složkách), podle hodnot HSI (Prahovat podle HSI) a nebo podle předem stanovené reference (Prahování podle reference) 5. Editace binárního obrazu nabídka Binární Otevření/Uzavření/Eroze/Dilatace/Vyčištění/Vyhlazení tyto funkce jsou obdobou výše zmíněných funkcí pro barevný obraz, pouze pracují s binárním obrazem 6

8 Uzavřít díry/zaplnit díry tyto funkce se používají v těch případech, kdy chceme např. měřit plochu objektů, ve kterých vznikly během prahování a jiných úprav kvůli odleskům nebo jiným jasovým odchylkám díry; první funkce uzavře díry, které jsou v úzkém místě otevřeny a druhá funkce pak takto uzavřené díry vyplní Konvexní obálka funkce vytvoří konvexní obal kolem objektů (někdy to může pomoci, např. při pouhém počítání objektů, ale při měření plochy částic se tato funkce nedoporučuje vzhledem k tomu, že přidává objektům další pixely navíc, které by mohly rušit přesné měření) Obrysy - tato funkce vyhledá a zvýrazní obrysy objektů Morfologická separace objektů tato funkce umí rozdělit objekty, které se překrývají nebo dotýkají (oddělit objekty je možné i manuálně, nakreslením čáry do obrazu viz Vložit čáru, kruh, elipsu) Lineární/Pokročilá morfologie tyto funkce provádějí jednoduché i velmi složité morfologické operace s objekty v obraze (pracují tedy s rozměry a tvarem objektů a mění je podle druhu funkce a požadavků uživatele) Zpracování po objektech tato funkce umožňuje provádět příkazy (funkce) pro každý objekt zvlášť (příkazy se zadávají textově nebo výběrem ze seznamu) Vložit čáru, kruh, elipsu pomocí této funkce je možné do obrazu vložit geometrický tvar v barvě objektů (např. pro dokreslení objektu, pokud se jeho část prahováním odstranila a nebo přidání objektu, který při prahování zcela zmizel) nebo pozadí (pro již zmíněnou separaci nakreslením úsečky mezi dvěma dotýkajícími se objekty nebo vymazání nežádoucích objektů) 6. Výběr objektů v obraze nabídka Měření Editace masky Editor masky slouží k úpravě barevného i binárního obrazu tak, aby neobsahoval nežádoucí objekty, které by mohly rušit analýzu nebo naopak k výběru požadovaných objektů. Po spuštění editoru se změní levá i horní lišta programu. V levém rohu si zvolte, zda budete definovat objekty, které se budou následně analyzovat (přepněte čtvercové políčko na pozici FG - ), nebo naopak objekty, které chcete přesunout do pozadí (pozice BG ). Dále si zvolíte nástroj, kterým chcete masku vytvořit (obdélník, kruh, linii, elipsu či libovolný jiný i nepravidelný tvar). Pravidelné tvary vytvoříte pouhým zakreslením tvaru do obrazu potažením myši, nepravidelný tvar vytvoříte vyznačením několika bodů určujících rozměry a tvar masky a nakonec potvrzením vykreslení masky pravým tlačítkem myši. Když je maska hotová (může mít i několik částí), editor se zavře a pokračují další úpravy a analýzy obrazu. 7. Měření nabídka Měření Interaktivní měření toto měření umožňuje uživateli provádět přímá měření objektů s okamžitým výstupem naměřených údajů ve zvolených jednotkách; můžeme si vybrat z těchto parametrů: Délka, Plocha, Profil intenzity, Taxonomie, Počet, Poloměr, Poloosy, Úhel 7

9 Měření jednotlivých objektů při použití této funkce program změří předem nastavené parametry všech objektů v binárním obraze; nejprve je nutné nastavit Příznaky pro měření objektů, příp. Omezení hodnot příznaků (tedy nastavení mezí měření), poté Změřit objekty a nakonec je možné přečíst Výsledky měření objektů Měření polí obdobně jako jednotlivé objekty je možná měřit pole, kdy jsou změřeny zvolené parametry objektů (Příznaky pro měření polí) a zprůměrňovány pro všechny objekty dohromady (tj. za celé pole) Měřicí rámeček toto je velmi důležité nastavení rámečku, který určuje, které objekty v obraze budou (uvnitř rámečku) a které nebudou (vně rámečku) měřeny; rámeček je možné upravit i po stisknutí klávesy F popotažením jeho okrajů myší 8. Vytvoření makra nabídka Makro Makro slouží k tomu, aby uživatel nemusel při opakovaných analýzách vždy znovu nastavovat všechny použité funkce, ale mohl celý sled funkcí spustit pouhým jedním kliknutím. Nové, Otevřít - zde si vytvoříte a uložíte nové makro nebo otevřete makro již hotové; to je nutné udělat před začátkem nahrávání makra, jinak bude sled funkcí zapisován do přednastaveného makra s názvem pracovní.mac Záznam (F3) - pokud máte zvoleno makro (nové, již dříve vytvořené nebo pracovní), spustíte záznam funkcí a dále provádíte analýzu tak, jak jste si předem vyzkoušeli; u dříve vytvořeného nebo pracovního makra budou funkce; Po provedení všech úprav a měření v obrazu ukončíte nahrávání makra opět tlačítkem F3 a nebo v nabídce Makro pokynem Zastavit záznam Editovat (F8) zde můžete makro editovat jako textový program, tedy textově měnit parametry funkcí, mazat nebo přidávat funkce; tato funkce je určena především pro zkušenější uživatele programu LUCIA 8

10 4 Laboratorní práce 1 (rostlinné buňky) 4.1 Úkoly 1. Sejmout obraz části listu v co největší kvalitě pomocí mikroskopu Nikon, digitální kamery SONY a softwaru LUCIA. 2. Pomocí software LUCIA sestavit posloupnost funkcí pro vyhodnocení velikosti rostlinných buněk. 3. Výsledky analýzy exportovat do programu Excel a vyhodnotit tabulkou i grafem. 4.2 Postup práce Příprava vzorku Prvním úkolem je vytvořit z listu pokojové rostliny dva preparáty (tj. vyříznout z něj dvě vhodně velké části, položit jednu vnější a druhou vnitřní stranou na podložní sklíčko a překrýt ho sklíčkem krycím). Jeden preparát vložte pod objektiv mikroskopu s nejmenším zvětšením. Zaostřete mikroskop a nastavte zvětšení pootočením karuselem objektivů tak, abyste v okulárech viděli rostlinné buňky stejně, jako je můžete vidět na vzorovém snímku (viz příloha zadání). Celkové zvětšení mikroskopu se vypočítá pouhým vynásobením hodnoty nastaveného zvětšení 10x (neboť samotný objektiv zvětšuje 10x). Zvětšení výsledného obrazu je dáno rozlišením kamery a softwarovým zvětšením v počítači A) Sejmutí obrazu - jeden snímek Spusťte program LUCIA, stiskněte tlačítko Živý obraz na horní liště. V hlavním okně programu uvidíte aktuální obraz, který snímá kamera. Podle obrazu kamery ještě dolaďte zaostření na mikroskopu (případně i umístění preparátu) a poté stiskněte tlačítko Sejmout na horní liště. Tak převedete obrázek do počítače. Obraz ihned uložte do počítače (Soubor Uložit), abyste o něj nepřišli při snímání druhého preparátu a kalibračního obrazu. B) Sejmutí obrazu - sekvence snímků (EDF modul) Pokud je list natolik ohnutý, že se vám nepodaří sejmout tak, aby byla alespoň polovina snímku zaostřená (alespoň tři rostlinné buňky), je vhodnější sejmout sekvenci snímků s postupným zaostřováním jednotlivých částí listu a z této sekvence snímků poté vytvořit zcela zaostřený obraz tj. použít přídavný EDF modul programu NIS Elements. V tomto případě postupujte tak, že si nejprve na mikroskopu vyzkoušíte, jak je potřeba postupně zaostřovat obraz listu (kterým směrem se točí zaostřovacím prvkem a jaký krok pootočení je nejlepší), poté si zaostřete nejnižší část listu a v nabídce Snímání zvolte položku Snímání Z-série Snímání ručně. Zadejte Z-krok (jak jste si předem vyzkoušeli jeden dílek stupnice odpovídá jednomu mikrometru). Nyní již jen stisknete tlačítko Další >>, právě sledovaný snímek se převede do počítače, můžete doostřit na další část a opět sejmout další snímek. Takto postupujete tak dlouho, dokud nesejmete ostře všechny části obrazu listu. Poté snímání ukončíte a zobrazí se vám sekvence získaných snímků. Zcela zaostřený snímek z této sekvence vytvoříte stiskem tlačítka Zobrazit EDF zaostřený obraz na horní listě programu. Tento obraz bude ještě nutné zkalibrovat na ose X a Y 9

11 (osu Z máme zkalibrovanou zadáním Z-kroku, po kalibraci bude možné vytvořit jakýsi 3D snímek listu) Sejmutí kalibračního měřítka Pod mikroskop vložte kalibrační měřítko, obraz zaostřete a sejměte do počítače. V žádném případě NESMÍTE měnit zvětšení mikroskopu a rozlišení obrazu, které jste použili při snímání obrazu listu Analýza obrazu programem LUCIA Prvním krokem je kalibrace obrazu. V nabídce kalibrace zvolte funkci Rychlá kalibrace. Dvěma svislými úsečkami vyznačte předem známou vzdálenost na kalibračním měřítku. Vždy úsečku zakreslete potáhnutím myší, můžete ji posunout a nakonec musíte její polohu potvrdit pravým tlačítkem myši. Stejně postupujete i u druhé úsečky. Poté zapište název kalibrace (např. jméno jednoho z pracovníků) a zadejte skutečnou vzdálenost mezi úsečkami, tak jak je definována měřítkem. Nyní můžete obraz měřítka zavřít (po uložení) a pokračovat analýzou obrazu listu. Úkolem analýzy je určit plochu jednotlivých rostlinných buněk v obou získaných obrazech a také plochu průduchů v obraze vnitřní části listu. Nejprve si otevřete snímek horní strany listu (bez průduchů). Aby bylo možné zjistit skutečné rozměry buněk, musíte obrazu přiřadit kalibraci v nabídce Soubor Informace o obrazu, v poli Kalibrace zvolíte podle názvu tu, kterou jste si vytvořili. Nakonec spustíte měření a zobrazíte si naměřená data. Nyní již pouze změřte plochu buněk. V této úloze si můžete vyzkoušet úpravu snímku a jeho binarizaci, ale protože se jedná o složitý systém s velmi nerovnoměrnou barevností, budete výsledné měření provádět pomocí ručního vyznačení měřené plochy přímo v původním obraze. To se provádí volbou položky Plocha v nabídce Měření. V dolní části obrazovky se objeví tabulka pro naměřené hodnoty a tlačítka výběru nástrojů pro vykreslení měřené plochy. Zvolte si první možnost (Mnohoúhelník ) a postupným kliknutím do rohů rostlinné buňky vyznačte její obvod. Poslední bod obvodu, kterým se buňka uzavře proveďte pravým tlačítkem myši, tím se vaše volba tvaru, který bude hodnocen, potvrdí a do tabulky se zapíše hodnota plochy vybraného tvaru, maximální a minimální rozměr, obvod a řada dalších parametrů. Takto vyznačte maximum rostlinných buněk, které je možné ve snímku změřit. Naměřená data poté exportujte do formátu xls, aby je bylo možné dále zpracovat v programu Excel. Export se provádí volbou funkce Export v nabídce Menu, která leží napravo od tabulky výsledků. Stejně (včetně přiřazení kalibrace!!) postupujte i při analýze druhého snímku, předem ale vynulujte tabulku výsledků tlačítkem Vynulovat v nabídce vpravo od tabulky. V tomto snímku navíc změřte plochu průduchů s použitím funkce 4 bodová elipsa v liště nad tabulkou výsledků. Tato funkce se používá tak, že zakreslíte 4 body elipsy po jejím obvodu (jak je vyznačeno na tlačítku této funkce). Změřte maximum průduchů, které jsou v obraze. Naměřená data opět exportujte do Excelu. Pokud jste snímali sekvenci snímků s následným vytvořením zaostřeného obrazu, můžete si ještě vyzkoušet funkce EDF modulu. Na horní liště vedle funkce pro vytvoření zaostřeného snímku jsou další funkce, které modul poskytuje. Vyzkoušejte si jak vypadá 3D snímek listu, jak 10

12 vypadají jednotlivé řezy na osách X,Y a Z. Pouze EDF anagryf si nevyzkoušíte, protože na ten je nutné se dívat pomocí speciálních brýlí pro 3D vidění Vyhodnocení výsledků V programu Excel (nebo jiném vhodném programu) vyhodnoťte výsledky měření a zobrazte je do grafu. Výsledný protokol by měl obsahovat: a) Tabulku nastavení parametrů snímání obrazu (zvětšení mikroskopu, formát ukládaného obrazu, velikost uloženého obrazu) b) Tabulku funkcí obrazové analýzy (pořadí, název, jednoduchá specifikace tj. funkce ze skupiny Měření - Plocha) c) Tabulku naměřených hodnot plochy (mm 2 ) pro všechny analyzované buňky v obou obrazech d) Vypočtenou průměrnou hodnotu plochy rostlinných buněk a průduchů v mm 2 e) Graf naměřených hodnot (osa x číslo částice, osa y plocha částice v mm 2 ) spolu s vyznačením průměrné hodnoty f) Závěr s vyhodnocením výsledků celého měření 11

13 Příloha : Vzorové snímky rostlinných buněk získané pomocí mikroskopu Nikon 12

14 5 Laboratorní práce 2 (PVC) 5.1 Úkoly 4. Sejmout obraz analyzované směsi PVC v co největší kvalitě pomocí mikroskopu Nikon, digitální kamery SONY a softwaru LUCIA. 5. Pomocí software LUCIA sestavit posloupnost funkcí pro vyhodnocení plochy a počtu částic PVC na snímku. 6. Výsledky analýzy exportovat do programu Excel a vyhodnotit tabulkou i grafem. 5.2 Postup práce Příprava vzorku Prvním úkolem je rozptýlit analyzovanou směs PVC na podložní sklíčko tak, aby bylo možné zachytit maximální počet částic v objektivu mikroskopu resp. kamery. Dále nastavte zaostření a zvětšení mikroskopu opět tak, abyste v objektivu viděli dostatečně zřetelně dostatečný počet částic (minimálně 10). Celkové zvětšení samotného mikroskopu se vypočítá vynásobením hodnoty nastaveného zvětšení 10x (neboť samotný objektiv zvětšuje 10x). Zvětšení výsledného obrazu je dáno rozlišením kamery a softwarovým zvětšením v počítači Sejmutí obrazu částic máku Spusťte program LUCIA, stiskněte tlačítko Živý obraz na horní liště. V hlavním okně programu uvidíte aktuální obraz, který snímá kamera. Podle obrazu kamery ještě dolaďte zaostření a zvětšení na mikroskopu (případně i rozptýlení částic PVC) a poté stiskněte tlačítko Sejmout na horní liště. Tak převedete obrázek do počítače. Obraz ihned uložte do počítače (Soubor Uložit), abyste o něj nepřišli při snímání kalibračního obrazu Sejmutí kalibračního měřítka Pod mikroskop vložte kalibrační měřítko, obraz zaostřete a sejměte do počítače. V žádném případě NESMÍTE měnit zvětšení mikroskopu a rozlišení obrazu, které jste použili při snímání obrazu máku Analýza obrazu programem LUCIA Prvním krokem je kalibrace obrazu. Otevřete si obraz měřítka a v nabídce kalibrace zvolte funkci Rychlá kalibrace. Dvěma svislými úsečkami vyznačte předem známou vzdálenost na kalibračním měřítku. Poté zapište název kalibrace (např. jméno jednoho z pracovníků) a zadejte skutečnou vzdálenost mezi úsečkami, tak jak je definována měřítkem. Nyní můžete obraz měřítka zavřít (po uložení) a pokračovat analýzou obrazu máku. Úkolem analýzy je určit plochu jednotlivých zrníček PVC. Podle výše zmíněného seznamu si vyberte takové funkce, které jsou pro analýzu vhodné nebo dokonce nezbytné. Důležitá je nejprve úprava snímku tak, abyste zvýraznili PVC a potlačili pozadí (viz funkce pro úpravu barevného obrazu), poté je nutné snímek vhodně naprahovat a převést na binární. Pokud jsou v obraze nějaké binární objekty, které odpovídají pozadí a ne PVC, pak je odstraňte použitím masky. V editoru masky také oddělte dotýkající se částice tak, že mezi ně zakreslíte přímku (musíte mít 13

15 nastaveno, že zakreslujete pozadí BG, viz popis Editoru výše). V binárním obraze pak už jen nastavíte kalibraci a parametry měření tak, aby program změřil plochu vybraných částic ve výše nadefinovaných jednotkách. Kalibraci obrazu přiřadíte v nabídce Soubor Informace o obrazu, v poli Kalibrace zvolíte podle názvu tu, kterou jste si vytvořili. Nakonec spustíte měření a zobrazíte si naměřená data. Doporučený postup je následující: Snímek měřítka: o Kalibrace rychlá kalibrace Snímek máku: o Obraz - upravit kontrast (zvýraznit PVC, potlačit pozadí) o Obraz prahování (převod obrazu na binární) o Binární Editor masky (odstranění nežádoucích částic z obrazu, oddělení dotýkajících se částic) o Soubor Informace o obrazu (přiřazení kalibrace) o Měření příznaky pro měření objektů, omezení hodnot příznaků, změřit objekty o Měření - výsledky měření objektů (naměřená data exportovat do souboru Vyhodnocení výsledků V programu Excel (nebo jiném vhodném programu) vyhodnoťte výsledky měření a zobrazte je do grafu. Výsledný protokol by měl obsahovat: a) Tabulku nastavení parametrů snímání obrazu (zvětšení mikroskopu, rozlišení obrazu, formát ukládaného obrazu, velikost uloženého obrazu) b) Tabulku funkcí obrazové analýzy (pořadí, název, jednoduchá specifikace a hodnoty nastavovaných parametrů) c) Tabulku naměřených hodnot plochy (mm 2 ) pro všechny analyzované částice v obrazu d) Vypočtenou průměrnou hodnotu plochy vybraných částic v mm 2 e) Graf naměřených hodnot (osa x číslo částice, osa y plocha částice v mm 2 ) spolu s vyznačením průměrné hodnoty f) Závěr s vyhodnocením výsledků celého měření 14