ŠKOLA MOLEKULÁRNÍCH BIOTECHNOLOGIÍ PROFESSION. Studijní texty k teoretickým modulům

Transkript

1 ŠKOLA MOLEKULÁRNÍCH BIOTECHNOLOGIÍ PROFESSION Studijní texty k teoretickým modulům Olomouc 2010

2

3 Kolektiv autorů: Prof. MUDr. Evţen Weigl, CSc.; Doc. MUDr. Milan Raška, Ph.D.; RNDr. Petr Šíma, CSc.; RNDr. Jaroslav Turánek, CSc.; Bc. Jan Frömmel, RNDr. Leona Raskova Kafkova, Ph.D.

4 OBSAH 1. ÚVODNÍ SLOVO 8 2. MOLEKULÁRNĚ BIOLOGICKÁ ČÁST 10 Úvod do problematiky projektu 10 Vybrané pojmy (operon, promotor, čtecí rámec, komplementarita bází, GMO) 12 E. coli jako nezastupitelný pomocník při klonování DNA 19 Mikroorganismy pro produkci polysacharidů a rekombinantních proteinů 23 Bakteriální expresní systémy 25 Kvasinkové expresní systémy 30 Hmyzí expresní systémy 35 Savčí expresní systémy 37 Výběr genu a jeho izolace 41 Specifika prokaryontních genů kódujících rekombinantní protein 41 Specifika eukaryontních genů kódujících rekombinantní protein 42 Techniky izolace známého genu a cdna (PCR, RT-PCR, RACE) 45 Práce s genovými a proteinovými databázemi 51 Klonovací a expresní plasmidy 52 Základní technika klonování (restrikce ligace) 55 Minipreparace a maxipreparace DNA 56 Restrikční analýza a dělení NK v agarosovém gelu. 57 Lokalizace transgenu v buňce - extrachromosomální, rekombinace do genomu 60 Vnesení plasmidů do buněk transformace 60 Chemická transformace principy, příprava kompetentních buněk 60 Elektroporace princip, příprava kompetentních buněk, podmínky 61 Stabilita plasmidů v buňkách 63 Episomální DNA 63 Antibiotická selekce 63 Homologní rekombinace 65 Ověření exprese genů na laboratorní úrovni 65 Fenotypová analýza, PCR analýza 65 Skríning produkce rekombinantních proteinů BIOTECHNOLOGICKÉ KULTIVACE MIKROORGANISMŮ 68 Principy pilotní a průmyslové kultivace mikroorganismů 68 Bioreaktor 68 Klasifikace typů bioreaktorů 69 Kultivace SSC a SLC 70 Ideální bioreaktor 71 Submerzní kultivace v kapalném médiu 72 Speciální bioreaktory 72

5 Míchání bioreaktorů 73 Pneumatické míchání bioreaktorů 73 Bioreaktory s fluidním ložem 74 Mechanicky míchané bioreaktory 74 Základní typy míchadel 76 Přestup tepla 77 Aerace a přestup kyslíku 78 Kultivační půdy média 79 Příprava inokula 80 Sterilizace u bioreaktorů 80 Hodnocení sterility 81 Sterilizace vzduchu a odplynů 81 Inokulace 81 Základní typy kultivačních procesů 82 Vsádková kultivace (batch) 82 Přítokovaná kultivace (fed-batch) 84 Strategie řízení přítokování 84 Kontinuální kultivace 84 Optimalizace bioprocesu 85 Optimalizace složení média 85 Optimalizace kultivačních parametrů 86 Monitoring a automatizace 86 Kultivace rekombinantních mikroorganismů 87 Prokaryotní expresní systém E. coli 87 Eukaryotní expresní systém - Pichia pastoris 87 Použité zdroje SEPARACE BIOMASY A HRUBÁ IZOLACE CÍLOVÝCH MOLEKUL 89 Separace biomasy od kultivačního média 89 Ssedimentace 89 Filtrace 89 Tangenciální filtrace 89 Průtoková centrifugace 89 Spůsoby dezintegrace biomasy a izolace produktu z ní 89 Fyzikální metody dezintegrace 89 Chemické metody dezintegrace METODY PURIFIKACE PRODUKTŮ 90 Selektivní precipitace 90 Chromatografické metody 91 Afinitní purifikace 93 Iontově výměnná chromatografie 94 Gelová filtrace 95

6 Hydrofobní chromatografie 96 Ultrafiltrace a dialýza nízkomolekulárních kontaminant 98 Uvolnění cílové podjednotky z fúzního proteinu 100 Štěpení fúzního proteinu specifickou endoproteázou 100 Autokatalitická technika odštěpení fúzní kotvy od rekombinantního proteinu 100 Izolace proteinu z inkluzních tělísek a jejich refoldování 101 Metody sušení produktů 105 Stabilizace biopolymerů a rekombinantních proteinů 105 Krystaly makromolekul 105 Sušení za zvýšené teploty sušárny, sprejové sušení 106 Sušení za snížené teploty evaporační centrifugace, lyofilizace 106 Speciální část frakcionace biopolymerů HA 106 Redukce molekulové hmotnosti biopolymerů kyselou hydrolýzou 106 Příprava oligosacharidů enzymatickým štěpením OVĚŘENÍ ČISTOTY A CHARAKTERIZACE BIOMOLEKUL 108 Ověření čistoty proteinů, peptidů a polysacharidů a jejich charakterizace HPLC 108 Vlastnosti peptidů a proteinů a jejich implikace pro vývoj HPLC metod 108 Parametry mobilní a stacionární fáze 108 Detekce peptidů a proteinů HPLC 109 Afinitní kapalinová chromatografie (bioafinitní chromatografie) 109 Gelová permeační chromatografie (SEC) 110 Iontově výměnná chromatografie 110 Hydrofobní interakční chromatografie HIC 111 Stanovení molekulových hmotností pomocí SEC-MALS HPLC (size-exclusion chromatography plus multi-angle light scattering) 111 Charakterizace proteinů a polypeptidů pomocí elektroforézy 112 Jednorozměrná denaturační elektroforéza 112 Jednorozměrná elektroforéza za nativních podmínek 113 Dvourozměrná gelová elektroforéza 113 Izoelektrická fokusace (IEF) 114 Kapilární elektroforéza 114 Volná kapilární elektroforéza 114 Stanovení molekulových hmotností proteinů a peptidů pomocí SDS-PAGE 115 Flow field flow frakcionace (FFFF) 115 Stanovení hydrodynamického poloměru pomocí DLS (Dynamic light scattering) 119 Rozptyl světla 119 Brownův pohyb 120 Hydrodynamický poloměr proteinu (R h ) 121 Princip metody DLS 122 Vyjádření výsledků distribuce velikosti 126 Vliv prostředí na difuzní koeficient a tvar nanočástic 127 Přístroje pro měření pomocí DLS 127 Výhody a omezení DLS 129 Ukázka praktické aplikace 131 Diferenciální skenovací kalorimetrie (DSC) 132

7 7. HORIZONTÁLNÍ PŘENOS GENETICKÉ INFORMACE 136 Historie 136 Výměna genetické informace 137 Bakterie 137 Eukaryota 138 Vznik imunity jako obrany integrity 140 Genom člověka 141 Pangenom 143 Závěry 144

8 1. ÚVODNÍ SLOVO Biotechnologie jako vědní disciplína je arbitrárně vymezený obor, který zahrnuje široké spektrum odborných aktivit s vyuţitím biologických postupů. Základní biotechnologické procesy provázejí člověka v téměř celé jeho kulturní historii. Jde především o postupy jako je kvašení, izolace různých látek z biologického materiálu, koţeluţství a podobně. Specializovanější biotechnologické postupy se historicky objevují v době, kdy technický pokrok umoţnil vyuţití biologických principů v řadě průmyslových odvětví, jako je farmacie, energetika, potravinářství, zemědělství apod. Formulace termínu biotechnologie je přikládána maďarskému inţenýrovi Karl Eerekimu, který v roce 1917 pouţil tohoto termínu k popisu procesů, při nichţ se na tvorbě výsledného produktu podílejí ţivé organismy. Dnes je tato disciplína definována jako jakákoliv technologie, která vyuţívá biologické systémy, ţivé organismy nebo jejich části k výrobě nebo přeměně látek, případně jinému specifickému cíli. Cíle biotechnologických procesů jsou pouze ojediněle ryze humanistické. Základním motivem je ekonomika moţnost přinést na trh produkty nedostupné klasickými cestami, případně zavést procesy, u nichţ je efektivně dosaţeno větší čistoty nebo většího objemů produktů, případně, s vyuţitím biologických systémů, nových molekulárních transformací. Ekonomická efektivnost biotechnologií se stala stimulem pro cílený (aplikovaný) rozvoj základních vědních disciplín orientovaných do biotechnologických aplikací. Poznání biochemických procesů v metabolismu rostlin i ţivočichů vedlo k rozvoji velmi sofistikovaných postupů, při nichţ se klasická průmyslová cesta kombinovala s biologickými procesy s vyuţitím extraktů nebo izolovaných enzymů. Tyto postupy byly povaţovány za mimořádný pokrok. Nicméně v posledních dvou aţ třech desetiletích byly nastartovány molekulárně biologické procesy umoţňující manipulace přímo s genetickou informací. Jejich převedení do forem pouţitelných v průmyslovém měřítku znamenalo novu dimenzi biotechnologií - molekulární biotechnologie. Nejde o přesně vymezenou disciplínu. Postupy zaloţené na manipulaci s genetickou informací mají výstupy do řady významných oborů průmyslu a biomedicínckých věd. Spektrum moţného vyuţití molekulárně biotechnologických principů se táhne od bioenergetiky přes farmacii, zemědělství, potravinářský průmysl aţ po přípravu transgenních savců a klonování evolučně vyspělých organismů. Vyuţití molekulární biologie v průmyslové dimenzi je mimořádně náročné na vědecké zázemí, ale téţ na kvalifikaci pracovníků ve výrobě. Dalším faktorem náročnosti jsou mimořádné investice nezbytné k průmyslové realizaci biotechnologických postupů. Vstup do této oblasti je tedy limitován vytvořením dostatečně široké základny pracovních sil (lidských zdrojů) a ekonomickou úrovní potenciálních investorů. 8

9 Z tohoto úhlu pohledu nacházíme veliké rozdíly jak mezi jednotlivými státy, tak i uvnitř těchto států mezi regiony. Oblast molekulárních biotechnologií se tak stává doménou bohatých nadnárodních společností, zejména farmaceutického zaměření, některých zemědělských a energetických komplexů a v neposlední řadě bohatých firem z jiných výsečí průmyslového světa, které hledají budoucnost pro současné kapitálové přebytky (ocelářské společnosti, tabákové koncerny, naftový průmysl, atd.). Jak je to s moderními biotechnologiemi na molekulární úrovni v České republice? S výjimkou několika málo podniků, které jsou derivátem velkých zahraničních koncernů a mají svůj specifický program s importovaným vývojem, nemá Česká republika příliš mnoho biotechnologických firem, které by rozvíjely vlastní know-how na úrovni molekulární biotechnologie. Ke světlým příkladům patří např. firma Contipro Group a.s.. Její odborný představitel Dr. Velebný, CSc. (a současně i spolumajitel) měl jednu z úvodních přednášek ve výukovém projektu Škola molekulárních biotechnologií Profession, v níţ mj. shrnul úskalí tohoto podnikání. Na základě konzultací s představiteli některých významných biotechnologických subjektů fungujících na území ČR vystoupilo do popředí téměř jednotné stanovisko: jejich představitelé nebudou investovat do moderních biotechnologických procesů na územích, kde je nedostatek vysoce kvalifikovaného personálu. Teprve přesvědčivý dostatek, eventuelně nadbytek vysoce kvalifikovaných pracovníků přivede investory na naše území. Tato skutečnost je jedním z motivů, které vedly k přípravě a realizaci projektu OPVK Škola molekulárních biotechnologií-profession. Projekt je finančně podporovaný z fondů EU. Klade si za cíl seznámit kompetentní uchazeče s teoretickým zázemím a vybranými metodickými přístupy moderních biotechnologických postupů. Jak název napovídá, projekt je zaměřen do oblasti molekulárních biotechnologií. Ty dnes představují relativně vymezenou disciplínu sahající od identifikace a izolace vybrané genové struktury aţ po její realizaci ve vhodném produkčním systému, ať uţ se jedná o mikroorganismus nebo vyspělý eukaryontní systém. Biotechnologie na všech úrovních a v oblasti molekulárně biologické zvlášť, jsou syntetickým oborem vyţadujícím speciální znalosti různých disciplín. Nejčastěji jsou uváděny: biochemie, mikrobiologie, imunologie, genetika, molekulární a buněčná biologie, organická chemie a další. Segmenty těchto oborů jsou ve svém rozsahu i spektru určovány zpravidla konkrétními technologickými postupy a realizačními výstupy. V tomto ohledu jde tedy o velmi dynamický obor. Milníkem na cestě rozvoje molekulárních biotechnologií byla práce Cohena at al, z roku 1973 potvrzující moţnost přenosu funkční DNA z jednoho mikroorganismu do druhého. Byl tak poloţen základ rekombinantním technologiím. Jejich pionýrské práce potvrdily reálnost principu genových a buněčných manipulací, případně inţenýrství. Tím je myšlena příprava nových biologických konstruktů od genové úrovně po mnohobuněčné systémy. Hranice těchto procesů nejsou zatím stanoveny. Limitem 9

10 pravděpodobně nebudou ani tak otázky vědecké, jako spíše etické, legislativní, nebo otázky bezpečnostních rizik. V biotechnologické problematice se více neţ v jiných oborech promítá současná nerovnováha ve vyspělosti společnosti v kategoriích vědeckých a vývojových na straně jedné a v otázkách mravních, filozofických, náboţenských a legislativních na straně druhé. Obory molekulárních biotechnologií a jejich potenciál jsou v kaţdém případě stimulem pro diskusi v tomto směru. Jak je uvedeno shora, motorem biotechnologického výzkumu jsou ekonomické faktory. V komerční sféře je dokonce zrod molekulárních biotechnologií spojován s burzovním úspěchem firmy Genetech a datem 14. řijna Toho dne byl zaznamenán dramatický vzestup ceny akcií této firmy na New Yorkské burze. Vzestup ceny akcie z 35 dolarů na 89 dolarů byl v té době rekordním vzestupem ceny veřejně obchodovatelných akcií. Ekonomický úspěch se opíral o novou technologii firmy, která umoţňovala výrobu dvou řetězců lidského inzulínu rekombinantní cestou v mikroorganismu Escherichia coli. Tento postup znamenal pro laickou veřejnost revoluční převrat v dosavadních technologických moţnostech a cestu k naplnění mnoha vizí lidské společnosti. Není při tom podstatné, ţe některé vize jsou naivní a zatím nereálné. Motor byl nastartován a ekonomické výsledky byly a jsou inspirativní a motivující. Není proto překvapením, ţe v průběhu následujících pěti let (do r. 1985) bylo v USA zaloţeno kolem 400 nových společností orientovaných na genové manipulace. Současná čísla je obtíţné odhadovat. Je nicméně nesporné, ţe molekulární biotechnologie představují jedno z nejefektivnějších odvětví současného průmyslu a zatím jednu z nejreálnějších představ o výzkumu jako výrobním nástroji. 2. MOLEKULÁRNĚ BIOLOGICKÁ ČÁST Úvod do problematiky projektu Základním cílem projektu je demonstrace a praktické provedení dílčích experimentů vedoucích k biotechnologické produkci hyaluronové kyseliny (HA), pouţitelné pro farmakologické účely. U člověka se HA tvoří jako součást chrupavky kloubů, synoviální tekutiny kloubů, ale i kůţe, kde významnou měrou přispívá k hojení ran. Na HA, jako součást mimobuněčné hmoty (extracelulární matrix), se prostřednictvím receptoru (CD44) váţou buňky imunitní, aby zde mohly zahájit svou obrannou funkci. HA je dále zapojena například do vývoje nervové soustavy. V neposlední řadě se HA uplatňuje při nádorovém bujení a rozvoji metastáz. Z chemického hlediska je ha lineární polymer tvořený opakující se sekvencí dvou jednotek: D-glukuronové kyseliny a D-N-acetyglukosaminu spojených střídavými glykosidickými vazbami β-1,4 a β-1,3 (Obr. 2.1). 10

11 Obrázek 2.1. Struktura kyseliny hyaluronové Je známo, ţe některé bakterie z řádu Lactobacillales tvoří HA jako součást bakteriálního pouzdra chránícího bakterii před působením imunitního systému hostitele. Její struktura je identická s ha lidskou. Streptococcus equi subsp. zooepidemicus představuje jednu z bakterií pouţívaných k biotechnologické přípravě HA. Bakterie produkuje mimo jiné enzym -glukuronidasu, odštěpující z neredukujícího konce HA glukuronovou kyselinu (GK) viz. Obrázek. 2.2, která je dále metabolizována jako zdroj energie. Geny podílející se na metabolismu GK jsou sdruţeny v jednom operonu (βglucuronic-acid-utilizing operon), jehoţ exprese je přítomností volné GK aktivována. Aktivace operonu, ač finálně vedoucí k zisku energie z GK, představuje pro bakterii významnou metabolickou zátěţ spojenou se zpomalením rychlosti dělení buněk. Obrázek glukuronidasa štěpí glukuronosid na glukuronát 11

12 V této kapitole bude probrána základní terminologie a molekulárně biologické techniky umoţňující pochopení veškerých dílčích metodických postupů vedoucích k přípravě mutantního kmene Streptococcus equi subsp. zooepidemicus, který neexprimuje enzym β-glukuronidasu v důsledku navozené ztrátové (deleční) mutace příslušného genu (gusa). Principiální výhodou biotechnologického pouţití bakteriálního kmene, který netvoří β-glukuronidasu, je zvýšení rychlosti růstu mutantních bakterií a následné zvýšení výtěţku ha z jednotkového objemu bakteriální kultury v důsledku energetické úspory inaktivací β-glucuronic-acid-utilizing operonu. Vybrané pojmy (operon, promotor, čtecí rámec, komplementarita bází, GMO) Jelikoţ v následujících kapitolách budou pouţívány některé pojmy, které usnadňují popis metod molekulárního klonování, nejdříve uvedeme jejich definice, případně vysvětlení souvislostí. Operon skupina genů nebo segment DNA, které fungují jako jedna transkripční jednotka. Zahrnuje operátor, promotor a jeden nebo více strukturních genů, které jsou transkribovány do polycistronické mrna. Gen základní, fyzická a funkční jednotka dědičnosti. Strukturní gen úsek DNA zapojený do produkce polypeptidového řetězce. Určuje strukturu proteinu a RNA molekuly, ale zahrnuje i oblasti zapojené do regulace jejich exprese. 12

13 Operátor oblast DNA, na kterou se váţe specifický protein (represor) bránící iniciaci transkripce z přilehlého promotoru. Promotor oblast DNA, na kterou se váţe RNA polymerasa a transkripční faktory, zahajující transkripci mrna. Cis-trans komplementační test párovací test, slouţící k určení toho, zda dvě různé recesivní mutace na opačných chromozomech diploidního organismu (pozice in trans) se vzájemně kompenzují (komplementují). Pokud ano, postihují různé geny, pokud ne, postihují stejný gen. Tento test se označuje i jako test alelismu (Obr. 2.3). Cistron nejmenší genetická jednotka nevykazující genetickou komplementaci ve výše zmíněném cis-trans testu, ale vykazující genetickou komplementaci, jestliţe tytéţ mutace jsou na jednom chromozomu (v poloze in cis). Cistron je tedy slučitelný s pojmem kódující částí jednoho genu. Cis regulace odpovídající cis poloze v cis-trans testu. Polycistronická mrna mrna kódující více neţ jeden protein. Vnitřní místo nasedání ribozomů vzhledem k tomu, ţe z polycistronické mrna se přepisují různé proteiny, musí docházet k nasedání a sestavení ribozomu i mezi úseky mrna kódující jednotlivé proteiny. Obrázek 2.3. Princip segregačního cis-trans testu 13

14 Čtecí rámec transferové RNA (trna) nasedají na templátovou mrna a přinášejí nově syntetizovanému peptidu další aminokyseliny k jeho prodluţování. Jednotlivé trna rozlišují podle principu komplementarity příslušnou trojici nukleotidů na mrna. Z takovýchto trojic je souvisle vytvořena kódující část mrna. Při návrhu klonovacích postupů spojujících dvě oblasti genů kódujících budoucí fúzní protein je třeba bedlivě dbát, aby při spojování dvou DNA vznikl opět souvislý sled tripletů bez vmezeření či výpadku báze DNA, neboť jinak by došlo k posunutí čtení tripletů a k přepisu nesmyslného proteinu. Komplementarita bází báze se spojují vţdy A-T nebo C-G. Toto pravidlo je nutné dodrţet při navrhování překryvných míst a kohezivních konců DNA během klonování. Kohezivní konce dvouvláknové DNA jednovláknový úsek DNA molekuly přesahující buď na 5 nebo 3 konci dvouvláknovou DNA, který v rámci komplementarity bází můţe vázat komplementární úsek jiné DNA molekuly. Pokud na obou koncích DNA molekuly A1 jsou přesahující konce odlišné sekvence (vzájemně nekomplementární) a DNA B2 je ukončena konci komplementárními k úsekům molekuly A1, můţeme tyto dvě molekuly spojit (ligovat) tak, ţe je předem zajištěna správná orientace obou úseků DNA vůči sobě (Obr. 2.4). Kohezivní konce můţeme připravit štěpením DNA dvojšroubovice DNA endonukleázou. Pokud pouţijeme dvě odlišně štěpící endonukleasy, vznikne DNA úsek se dvěma různými kohezivními konci. Stejným ošetřením jiné molekuly vytvoříme 14

15 pár dvou DNA fragmentů, které je moţno následně stranově specificky spojit (Obr. 2.4). Pouţitím restrikčních endonukleáz, které po rozštěpení DNA vytvoří přesahující konec ve formě palindromu, je zajištěna komplementarita všech konců vzniklých štěpením jednou endonukleázou. Palindrom sekvence DNA, která je vzájemně komplementární podle svého středu (AGCCT nebo ACTGCAGT). Obrázek 2.4. Využití kohezivních konců pro jednosměrné klonování Pro snadnější pochopení některých výše uvedených pojmů popišme stručně Lac operon E. coli. Představuje jeden z prvních popsaných operonů. Je tvořen skupinou přilehlých společně regulovaných genů zapojených do metabolismu laktózy lacz, lacy a laca. Pokud buňky rostou v médiu bohatém na glukózu, exprese genů lac operonu je blokována lac represorem (produkt přilehlého laci genu), který se váţe na operátor a brání tak nasedání RNA polymerasy. Pokud však buňky rostou v médiu obsahujícím laktózu nebo její nemetabolizovatelné analogy jako isopropyl-1-thio-β-d-galaktosid (IPTG), represor je vazbou β-galaktosidů uvolněn z vazby na operátoru a RNA polymerasa můţe nasedat a zahájit transkripci polycistronické mrna lac operonu. Gen 15

16 lacz kóduje β-galaktosidasu, gen lacy kóduje permeasu pro β-galaktosidy a gen laca kóduje galaktosid-acetyltransferasu, enzymy nezbytné pro metabolické vyuţití laktózy. Plasmid extrachromozomální DNA, která se replikuje a můţe se přenášet z generace na generaci, pokud je to pro hostitelskou bakterii výhodné. Příkladem výhodnosti je, ţe plasmid kóduje protein zajišťující rezistenci na určité antibiotikum. Jiný příklad je, ţe plasmid kóduje proteiny nezbytné pro vazbu bakterií na hostitelské tkáně v průběhu infekce nebo umoţňuje bakterii lépe se bránit imunitnímu dozoru hostitele (například povrchové antigeny borelií). Plasmid můţe být cirkulární (většina) nebo lineární (znám u laktobacillů, borelií, streptomycet). Aby mohl být plasmid replikován, musí obsahovat místo, kde je replikace zahájena. Nejčastěji pouţívané plasmidy jsou deriváty dvou E. coli plasmidů ColE1 a pmb1. Oba plasmidy se vyskytují v hostitelské buňce v počtu kopií. Toto číslo je kontrolováno plasmidovým replikátorem, coţ je úsek plasmidu nesoucí začátek replikace ori a další regulační sekvence či geny kódující regulační proteiny, nikoliv však polymerasy a endonukleasy. Replikátory ColE1 a pmb1 jsou podobné. Replikátor ColE1 je dlouhý 600 párů bází, kóduje ori místo zahájení replikace hostitelskou DNA polymerázou, RNA primer a dva negativní regulátory RNAI a protein Rop. Všechny enzymy účastnící se procesu replikace pochází z hostitelské bakterie. Kritickým bodem zahájení replikace je vytvoření správné sekundární struktury dočasně vytvořeného RNAII transkriptu, syntetizovaného hostitelskou RNA polymerázou, která spouští jeho rozštěpení hostitelskou RNázouH, a následné zahájení replikace hostitelskou DNA polymerázou. Regulace replikace spočívá v narušení sekundární struktury RNAII transkriptu vazbou regulační RNAI a stabilizací této vazby proteinem Rop, coţ znemoţní zahájení replikace (Obr. 2.5). Mutací sekvencí RNAI či rop genů je moţné značně zvýšit počet kopií plasmidu na jednu buňku. Některé mutace replikátoru vedou k počtu kopií na jednu buňku aţ Na druhou stranu plasmidy s velmi nízkým počtem kopií se replikují synchronně s buněčným cyklem hostitelské bakterie, neboť pro zahájení své replikace vyţadují některé hostitelské proteiny, jejich exprese je spojena se zahájením buněčného dělení. Tyto plasmidy většinou nesou geny zajišťující regulovanou segregaci plasmidů mezi dceřiné buňky. Přehled replikátorů pouţívaných v molekulárním klonování je uveden v Tab Tabulka 2.1. Nejčastěji používané replikátory Název Příklad Délka (bp) Selekční znak prototypu Počet kopií a Reference Pmb1 Pbr322 4, 362 Ap r, Tet r Vysoký; Bolivar et al.,

17 Cole1 Pmk16 ~ 4,500 Kan r, Tet r, Cole1 imm Vysoký; > 15 Kahn et al., 1979 P15a Pacyc184 ~ 4,000 Eml r, Tet r Vysoký; ~ 15 Chang et al., 1978 Psc101 Plg338 ~ 7,300 Kan r, Tet r Nízký; ~ 6 Stoker et al., 1982 F Pdf41 ~ 12,800 Trpe Nízký; 1 2 Kahn et al., 1979 R6k Prk353 ~ 11,100 Trpe Nízký; < 15 Kahn et al., 1979 R1 r1drd-17 Pbeu50 ~ 10,000 Ap r, Tet r Nízký pod 30 C Vysoký nad 35 C b Uhlin et al., 1983 Rk2 Prk2501 ~ 11,100 Kan r, Tet r Nízký; 2 4 Kahn et al., 1979 a počet kopií odpovídá prototypovému plasmidu. Mutace v replikátoru můţe značně ovlivnit počet kopií. Například u puc řady (pmb1) mutace replikátorů vedou aţ k kopiím na jednu buňku. Převzato z Current Protocols in molecular biology, Wiley, New York. b citlivé na teplotu kultivace. Inkompatibilita plasmidů je stav, kdy dva neidentické plasmidy nemohou společně koexistovat v jedné buňce dlouhou dobu, pokud nejsou oba udrţovány pomocí rozdílných selekčních znaků, například antibiotik. K inkompatibilitě dochází zejména, pokud dva plasmidy sdílejí podobné regulační mechanismy replikace. Inkompatibilita je důsledkem neschopnosti korigovat fluktuace vyplývající z náhodné selekce jednotlivých kopií k iniciaci replikace a následnému rozdělení plasmidů do dceřiných buněk. Jelikoţ ColE1 a pmb1 mají podobné replikátory, a jsou tedy podobně regulovány RNAI, jsou ve stejné skupině inkompatibility a nemohou dlouhodobě koexistovat v jedné buňce. Pozor, dva plasmidy vzniklé rekombinací (například vnesením dvou velmi podobných inzertů) se liší pouze svou velikostí a jsou rovněţ inkompatibilní. Episom DNA element, který se můţe replikovat nezávisle na replikaci chromozomu (stejně jako plasmid) nebo se můţe integrovat do chromozomu a zde se replikovat společně s chromozomální DNA. Po opětném vystřiţení z chromozomu existuje jako cirkulární extrachromozomální DNA, která obsahuje i geny pocházející z chromozomu. Obrázek 2.5. Regulace replikace ColE1 a pmb1 plasmidu pomocí RNAII a Rop 17

18 MCS místo v klonovacím plasmidu určené pro vnášení cizorodé DNA. Je tvořeno úsekem DNA sloţeným z krátkých sekvencí rozlišovaných různými restrikčními endonukleasami. Pro smysluplnost postupu tato restrikční místa nesmí být umístěna v jiných oblastech plasmidu. V mnoha plasmidech je MCS umístěno uvnitř genu lacz jako součást lac operonu. GMO geneticky modifikovaný organismus. V průběhu molekulárního klonování vnášíme různé DNA úseky do plasmidů a tyto vnášíme do hostitelských bakterií za účelem selekce a amplifikace plasmidů. Vnesením cizorodé DNA jinou neţ přirozenou cestou (jako je infekce bakteriofágem či virem, konjugace přirozených plasmidů atd.). Vzniká buňka, která obsahuje laboratorně manipulovanou DNA a podle definice se jedná o geneticky modifikovaný organismus. Pro manipulace vedoucí ke vzniku GMO je nutné, aby měla laboratoř povolení k této manipulaci od Ministerstva ţivotního prostředí MŢP (v kategorii rizika i stačí podat oznámení MŢP) a aby pravidelně, jednou za rok, oznámila MŢP formou ročního hlášení (vţdy k 15. únoru následujícího roku), jak nakládala s GMO. Legislativa související s manipulací s GMO, jednotlivé kategorie a způsoby nakládání jsou definovány zákony a vyhláškami České republiky (zákon 18

19 178/2001; 185/2001; 78/2004; 346/2005; vyhláška 209/2004; 195/2005; 86/2006) a nařízeními Evropského parlamentu a rady (ES) (1830/2003; 1946/2003). V ročním hlášení je kladen důraz na dodrţení podmínek deklarovaných v oznámení o nakládání. Toto roční hlášení musí schválit odborný poradce pro GMO, který je u kaţdé instituce jmenován statutárním zástupcem. Pracovníci nakládající s GMO musí být pravidelně školeni. Příklad obsahu pravidelné roční zprávy je uveden v Tab Tabulka 2.2. Formulář ročního hlášení pro uzavřené nakládání s GMO Uţivatel Datum a číslo rozhodnutí o zápisu do seznamu uţivatelů Pouţívané GMO (podle zápisu GMO v seznamu uţivatelů) Odborný poradce Účel nakládání s GMO Pracoviště Kontaktní osoba na pracovišti Kategorie rizika Přibliţné mnoţství pouţitých GMO Veškeré změny v nakládání proti údajům uvedeným v ţádosti o zápis do seznamu uţivatelů (např. Pokud nebyly některé GMO v uplynulém roce pouţívány) Likvidace GMO Mimořádné události v průběhu nakládání s GMO a přijatá opatření Kontroly výskytu GMO mimo uzavřený prostor Jakákoliv pozorovaná souvislost s přímým či nepřímým ohroţením lidského zdraví Další poznatky získané při nakládání s GMO, které mají vliv na hodnocení rizika Bude uzavřené nakládání s GMO pokračovat v dalším roce? Pokud ne, uvést důvod ukončení. Pokud ano, jsou plánovány nějaké změny? Shrnutí (porovnání skutečného průběhu nakládání s GMO s údaji uvedenými v ţádosti o zapsání do seznamu uţivatelů) E. coli jako nezastupitelný pomocník při klonování DNA V průběhu molekulárního klonování se téměř kaţdý experimentátor setká s nutností vyuţít nějaký klonovací či expresní plasmid. Jejich konstrukce a amplifikace se, 19

20 s výhodou danou jejich původem, provádí s pomocí hostitelského mikroorganismu, jakým je nejčastěji E. coli. Tato jedna z nejlépe prostudovaných bakterií umoţňuje velmi přesně amplifikovat plasmidovou DNA, selektovat připravené rekombinantní varianty plasmidu a v mnoha případech získat s vysokým výtěţkem i rekombinantní proteiny plasmidem kódované. E. coli je Gram negativní tyčka s cirkulárním chromozomem o velikosti zhruba párů bází. Je schopna růstu na minimálním médiu obsahujícím zdroj uhlíku jako je glukóza a soli, které jsou zdrojem dusíku, fosforu a stopových kovů. Na médiích obohacených aminokyselinami, prekurzory nukleotidů, vitamíny atd. však roste mnohem rychleji. Po naočkování malého mnoţství bakterií (inokula) do obohacených médií se bakterie po úvodní fázi lag dělí exponenciálně se zdvojovacím časem minut. Tato exponenciální fáze se nazývá log fáze. V log fázi růstu setrvává bakterie, dokud nespotřebuje veškeré ţiviny či kyslík, nebo pokud mnoţství zplodin metabolismu, jako jsou například kyseliny, nepřesáhne hranici inhibice růstu. Většina kmenů E. coli pouţívaných při rekombinaci DNA je derivována z nepatogenní linie E. coli K-12, izolované v roce 1922 ze stolice pacienta uzdravujícího se z difterie v Palo Alto v Kalifornii. F faktor fertility (nebo sex) faktor umoţňuje přenos genetického materiálu z jedné E. coli, která F faktor obsahuje (F +, samčí, dárcovská) do druhé, která F faktor neobsahuje (f -, samičí, příjemcovská) při procesu zvaném konjugace. F faktor můţe být v buňce ve formě plasmidu, episomu, nebo jako součást bakteriálního chromozomu (Hfr high frequency of recombination). F plasmid tak, jak byl původně popsán, má délku téměř 10 5 párů bází. Pro molekulárně biologické aplikace se pouţívá minimalizovaná verze, která kromě genů záměrně vnesených do f plasmidu (nebo f episomu) obsahuje ori místo pro zahájení replikace, rep gen kódující replikasu, případně par segregační geny kódující jednotlivé podjednotky topoizomerasy IV a ccd (ccd stands for coupled cell division) geny. S výhodou jsou do F plasmidu vnášeny geny rezistence na antibiotikum, pomocí kterého je plasmid udrţován v následujících generacích a dále například gen kódující ω fragment -galaktosidasy umoţňující α komplementaci. Příkladem je F episom v bakterii XL-1 Blue F [::tn10 proab + laci q δ(lacz)m15]. F označuje, ţe se jedná o bakterii, která je potomkem kmene, v němţ se F faktor integrovaný do chromozomu uvolnil i s několika chromozomovými geny a dále setrvává ve formě episomu. Geny získané z chromozomální DNA jsou uvnitř hranatých závorek. Zde se jedná o část transpozonu Tn10 nesoucího gen rezistence na tetracyklin, geny proab kódující γ-glutamyl fosfát reduktasu a kinasu, účastnící se metabolismu prolinu, dále represor laktózového operonu laci, který je z tohoto episomu nadprodukován, a gen kódující ω fragment -galaktosidasy δ(lacz)m15. 20

21 α komplementace je fenomén, kdy exprese dvou genů, z nichţ jeden kóduje N terminální úsek -galaktosidasy (α fragment) a druhý kóduje C terminální úsek - galaktosidasy (ω fragment), vede k vytvoření funkčního enzymu sestavením dvou polypeptidových podjednotek po jejich translaci. To umoţňuje prokázat přítomnost obou genů při kultivaci buněk v přítomnosti substrátu -galaktosidasy [X-Gal, (5-bromo-4- chloro-3-indolyl- d-galaktosid)], vedoucí k modrému zabarvení buněk. Příkladem vyuţití tohoto fenoménu je rychlé monitorování úspěšnosti vnášení DNA fragmentů do klonovacích plasmidů. -galaktosidasa zde slouţí jako reporterový gen. Plasmidy vhodné pro tyto aplikace mají MCS umístěné uvnitř genu lacz, kódujícího fragment - galaktosidasy, jako součást modifikovaného lac operonu. Hostitelské E. coli exprimují ω fragment -galaktosidasy nejčastěji z F episomu. Při vnesení DNA inzertu do MCS dojde při translaci lacz genu k porušení aminokyselinové sekvence fragmentu - galaktosidasy, která nemůţe komplementací vytvořit funkční protein -galaktosidasu, coţ je viditelné po naočkování bakterií na pevnou agarovou půdu s X-Gal a IPTG. Kolonie bakterií nesoucích nerekombinovaný plasmid (bez DNA sekvence vnesené dovnitř genu pro fragment) jsou modré, kdeţto kolonie s vneseným DNA inzertem modré nejsou (Obr. 2.6). Obrázek 2.6. Modrá-bílá selekce transformovaných bakterií 21

22 Kanamycin Gentamici n Chloramfenikol v metanolu Ampicilin Antibiotika antibiotika představují neodmyslitelný nástroj v molekulárním klonování. Umoţňují selektovat bakteriální linie, do nichţ byl úspěšně vpraven plasmid kódující protein inaktivující pouţité antibiotikum. Gen pro tento protein (antibiotickou rezistenci) se nachází mimo klonovací místo (oblast vnášení cizorodé DNA). Pomocí dalšího antibiotika, nebo antibiotik, je dále moţné udrţovat v bakterii pomocné plasmidy či episomy, pokud nesou příslušné geny rezistence. Takové plasmidy a episomy zajišťují potřebné fenotypové vlastnosti konkrétního bakteriálního kmene. Antibiotika jsou pouţitelná i pro selekci transfekovaných savčích buněčných linií. Selekční tlak antibiotik umoţňuje mimo jiné selektovat buněčný klon, u nějţ se plasmid integroval do genomické DNA, se kterou se přenáší na následující dceřiné generace. Vzniká tak stabilně transfekovaná buněčná linie. Pokud byl integrován plasmid nesoucí nejen gen rezistence na antibiotikum, ale i gen kódující rekombinantní protein, můţeme selekcí získat klon s dostatečně vysokou produkcí daného rekombinantního proteinu. Nejčastěji pouţívaná antibiotika při selekci bakterií jsou uvedena v Tab Tabulka 2.3. Antibiotika používaná v molekulárním klonování Název Pracovní Mechanismus působení Mechanismus rezistence (mg/ml) Baktericidní; zabíjí rostoucí E. coli, inhibuje syntézu stěny potlačením tvorby příčných vazeb mezi peptidoglykany -laktamasa hydrolyzuje ampicilin dříve, neţ se dostane do buňky 20 Bakteriostatický; inhibuje proteosyntézu interakcí s 50s podjednotkou ribozomu a inhibuje reakci peptidyltransferasy Chloramfenikol acetyltransferasa inaktivuje chloramfenikol 15 Baktericidní; inhibuje proteosyntézu interakcí s l6 proteinem 50s podjednotky ribozomu 30 Baktericidní; inhibuje proteosyntézu, inhibuje translokaci a vyvolává poruchy čtení tripletů Aminoglykozid acetyltransferasa a aminoglykozid nukleotidyl transferasa inaktivuje gentamicin; mutace v rplf brání vazbě gentamicinu Aminoglykozid (neomycin) fosfotransferasa, aminoglykozid acetyltransferasa a aminoglykozid nukleotidyl transferasa inaktivuje gentamicin a kanamycin 22

23 Tetracyklin v 70% etanolu 12 Bakteriostatický; inhibuje proteosyntézu bránění ve vazbě aminoacyl trna na místo a ribozomu Aktivní eflux tetracyklinu z buňky Nonsense suppression potlačení efektu stop kodonů v důsledku přítomnosti abnormálních trna, které se váţou na stop triplet, přinášejí aminokyselinu a umoţňují další průběh translace. Na moţnou přítomnost abnormálních trna je nutno myslet při výběru E. coli pro zamýšlený experiment. Supresorové geny jsou uvedeny v genotypu bakterie. Příklady supresorových genů jsou supd, supe atd. Většina supresorových trna nasedá na stop kodony Amber (UAG) nebo Orche (UAA). Mikroorganismy pro produkci polysacharidů a rekombinantních proteinů Při práci s mikroorganismy i tkáňovými kulturami je třeba dodrţovat zásady sterilní práce, zejména při přípravě bakteriálního inokula. Ač je často komplikované kultivovat zvolenou populaci buněk, kontaminace se můţe objevit, aniţ bychom jí to jakkoliv usnadňovali. Nicméně zásady sterilní práce umoţňují minimalizovat toto riziko. Pro přípravu sterilních kultivačních médií pro kultivaci bakterií, pufrů a vody se nejčastěji pouţívá sterilizace autoklávováním. Při autoklávování se mikroorganismy ničí nasycenou vodní parou při teplotě nejčastěji 121 C, po dobu minimálně minut a zvýšeném tlaku. Autoklávování je moţné opakovat za hodin, coţ je čas nezbytný pro vyklíčení eventuálně přítomných spór, které jsou jinak k autoklávování rezistentní. Sklo, plast a nástroje se autoklávují za teploty 134 C po dobu minut. Autoklávovat lze i citlivější materiály, jako jsou plasty (polyetylen, polykarbonát, silikon; nevhodný k autoklávování je polystyren, částečně se můţe poškodit polypropylen). Doporučení je vţdy otestovat vhodnost konkrétního plastu pro autoklávování. Autoklávování se nepouţívá pro sterilizaci médií pro tkáňové kultury. Nástroje a sklo je moţné dále sterilizovat horkovzdušnou sterilizací za teploty 180 C po dobu 1 2 hodiny. Horkovzdušná sterilizace se kromě vlastní sterilizace pouţívá i k inaktivaci RNA pro účely přípravy materiálu na izolaci RNA. Zde je však nutné pouţít mnohem drastičtější podmínky, a to 180 C po dobu 8 hodin. Horkovzdušná sterilizace je vhodná zejména pro sterilizaci skla a nástrojů z nerez oceli. Není vhodná pro sterilizaci ostrých nástrojů, neboť ostří se při opakovaném vystavení vysoké teplotě vzduchu rychle tupí. 23

24 Komerčně dodávaný plast a pomůcky pro sterilní manipulaci se průmyslově sterilizují zářením. Sterilizace etylenoxidem nebo formaldehydem není vhodná zejména pro materiály přicházející do kontaktu s tkáňovými kulturami, neboť i nepatrné zbytky těchto látek mohou působit toxicky na kultivované buňky. Izolace rekombinantního proteinu je procedura, která sestává z několika klíčových kroků. V první řadě je nutné zváţit, jaký expresní systém bude vhodný pro produkci rekombinantního proteinu. Tomu je nutné přizpůsobit následující klonovací postup. Volba expresního systému je ovlivněna velikostí rekombinovaného proteinu, potřebou zachovat nezbytné posttranslační modifikace, rozpustnost proteinu a poţadované mnoţství (Tab. 2.4, 2.5). Následuje izolace cdna kódující daný protein. V dalším kroku je třeba navrhnout, sestavit, izolovat a namnoţit plasmid, který umoţní expresi rekombinantního proteinu. Na závěr je tento plasmid vnesen do vhodného hostitele, který podle něj vytváří rekombinantní protein. E. coli zde slouţí jako vysoce přesný nástroj umoţňující selekci a amplifikaci rekombinovaných plasmidů vzniklých molekulárním klonováním a vnesených do E. coli některou z takzvaných transformačních metod. Transformované bakterie jsou naočkovány na tuhé agarové kultivační půdy tak, aby kolonie, které zde vyrostou, byly od sebe dostatečně prostorově separovány. Díky fenoménu inkompatibility plasmidů nesou kolonie, které vyrostou z bakterií naočkovaných na tuhou půdu, jen jednu variantu rekombinovaného plasmidu. Aby na tuhé půdě narostly pouze E. coli, které nesou rekombinovaný plasmid, obsahuje kultivační půda antibiotikum, ke kterému jsou odolné pouze bakterie obsahující plasmid (plasmidem transformované bakterie, rekombinované bakterie), neboť plasmid kóduje znak rezistence na příslušné antibiotikum. Selekce jednotlivých kolonií nesoucích plasmid je nezbytná proto, ţe rekombinované plasmidy vzniklé molekulárním klonováním nejsou vţdy správně sestavené, mohou obsahovat kontaminující DNA, mohou nést různé mutace, nemusí obsahovat ţádnou vnesenou cdna, či mohou obsahovat vnesenou cdna v nesprávné orientaci atd.. Jiná situace nastává při produkci polysacharidu jako ha. Zde vycházíme ze spontánní tvorby dané makromolekuly (HA), molekulární klonování a manipulace s expresní bakteriální linií slouţí pouze ke zvýšení výtěţku makromolekuly produkované vybraným kmenem bakterií přirozeně se vyskytujícím v přírodě. Tabulka 3.4. Velikost rekombinantního proteinu a expresní systémy Velikost proteinu Povaha proteinu E. coli Kvasinky Hmyzí buňky Savčí buňky 24

25 < 8 kda Fúzní > 8 kda Intracelulární 8 50 kda Sekretované > 50 kda Sekretované a povrchové Bakteriální expresní systémy Bakteriální systémy jsou pouţívány pro klonování DNA i pro expresi rekombinantních proteinů. Výhodou bakteriálního systému, zejména E. coli, je dobrá znalost jejich chování a kultivačních podmínek, krátký zdvojovací čas E. coli, dostupnost efektivních metod pro transformaci, izolaci DNA i rekombinantních proteinů atd. Vhodné linie E. coli jsou schopny amplifikovat malé plasmidy, ale i obří plasmidy bacmidy, které mají velikost několika stovek párů bází. E. coli rostou jak v tekutých, tak na tuhých plotnách v normální atmosféře při teplotách od 23 C do 37 C. Při klonování DNA se pouţívá standardně 37 C. Pro expresi rekombinantních proteinů je moţno pouţít teplotu 37 C, nebo teplotu sníţit, čímţ se můţe sníţit i potenciální toxicita rekombinantního proteinu. Při produkci rekombinantního proteinu v E. coli dosahujeme obecně nejvyšších výtěţků dosahujících aţ 5 gramů proteinu na 1 litr biomasy (Tab. 2.5). Rekombinantní proteiny produkované v E. coli však nejsou dostatečně posttranslačně modifikovány (chybí obecně: N-glykozylace, C-glykozylace, tvorba disulfidických můstků, štěpení prekurzorových proteinů specifickými proteasami, skládání proteinu). Jelikoţ jejich intracelulární transport je většinou odlišný od situace při jejich přirozené produkci a asistenční proteiny, jako proteiny tepelného šoku (hsp), mohou mít poněkud odlišné funkce v bakteriálním hostiteli, mohou se rekombinantní proteiny exprimované v E. coli shlukovat do inkluzních tělísek lokalizovaných v cytoplasmatickém nebo periplasmatickém prostoru. Tabulka 2.5. Výtěžky expresních systémů v průmyslové praxi 25

26 Protein E. coli Kvasinky P. pastoris, S.cerevisiae Hmyzí buňky Savčí buňky Sekretovaný [g/l biomasy] Intracelulární rozpustný [g/l biomasy] Intracelulární inkluze [g/l biomasy] < 0,5 0,2 4 0,25 0,001 0,5 0,001 0,1 0,5 5 0, ,001 0, E. coli vytváří inkluzní tělíska přirozeně za účelem ukládání zásob. U savčích buněk vznikají inkluzní tělíska nejčastěji z virových kapsidových proteinů. Nejsou ohraničena membránou. Inkluzní tělíska z rekombinantních proteinů jsou tvořena nerozpustnými agregáty nesprávně sloţeného proteinu bez biologické aktivity. Velikost inkluzních tělísek se pohybuje od 0,2 do 0,6 m. Jsou pozorovatelná ve fázovém kontrastu jako temná intracelulární tělíska. Sekrece rekombinantního proteinu je jednou z cest minimalizace tvorby inkluzí. Sekrece proteinů přes dvojitou buněčnou membránu E. coli je však velmi málo efektivní a pro velké rekombinantní proteiny většinou dosud technologicky nezvládnutá. Nicméně jsou popsány mechanismy, které zřejmě v budoucnu umoţní modifikaci rekombinantních proteinů k efektivní sekreci. Sekrece se děje prostřednictvím transportních drah, kterých bylo u E. coli popsáno šest. Sekrece typu I je závislá na ABC transporterech (ATP-binding cassette) a proteiny prochází periplasmatickým prostorem pomocí kanálu, který je od něj do jisté míry izoluje. Vyuţití sekrečního mechanismu typu i je limitováno velikostí efektivně sekretovaných proteinů. Její hodnota je pod 200 aminokyselin. Sekrece je navozena připojením sekretorního signálu (HlyA) k C konci rekombinantního proteinu, který je moţné po izolaci proteinu odstranit enzymaticky. Sekrece typu II je závislá na SEC (SecB), SRP (signal recognition particle) nebo TAT (twin-arginin translocation) drahách. Tyto dráhy jsou zodpovědné za první krok sekrečního mechanismu typu II transport do periplasmatického prostoru. 1) SEC sekrece je zodpovědná za sekreci většiny rekombinantních proteinů do periplasmatického prostoru. U proteinu je před transportem přes sec nejdříve rozvolněna vyšší konformační struktura a po vstupu do periplasmatického prostoru je protein opět sloţen do vyšší konformace. Na této dráze je zapojeno minimálně 9 proteinů (Trigger Factor, SecA, SecB, SecY, SecE, SecG, SecD, SecF a YajC). 2) SRP závislá sekrece probíhá jako 26

27 jediná kotranslačním mechanismem, coţ znamená, ţe protein je translokován do periplasmatického prostoru dříve, neţ se poprvé sloţí. Tato dráha je biotechnologicky vyuţitelná pro rychle se skládající proteiny, jako jsou DARP proteiny (designed ankyrin repeat proteins). 3) dráha TAT je jediná, která translokuje plně sloţené proteiny přes vnitřní membránu buňky. Signální sekvence vyuţitelné pro transport rekombinantních proteinů jsou známy. Ne kaţdý rekombinantní protein však můţe být transportován uvedenými drahami a je nutné laboratorně ověřit jejich vhodnost. Následující sekrece proteinu mimo buňku je realizována zřejmě společným transportním mechanismem, který je zprostředkován komplexem proteinů, které jsou doposud málo popsány a které nejsou efektivně exprimovány za laboratorních podmínek. Sekrece typu II je mechanismus zodpovědný za kumulaci mnoha rekombinantních proteinů v periplasmatickém prostoru, kde mohou vytvářet inkluzní tělíska. Výhoda sekrece rekombinantního proteinu v E. coli spočívá v tom, ţe proteiny prochází periplasmatickým prostorem, kde jsou vystaveny lokálním disulfid-izomerasam a foldasam, které přispívají ke správnému sloţení proteinu. V periplasmatickém prostoru je navíc méně proteas neţ v cytoplasmě (Obr. 2.7). Obrázek 2.7. Sekretorní dráha typu II v E. coli 27

28 Tvorba inkluzních tělísek můţe být potlačena sníţením teploty kultivace E. coli, pouţitím slabšího promotoru nebo sníţením koncentrace induktoru exprese (například IPTG u proteinů exprimovaných z laktózového operonu). Vznik inkluzních tělísek komplikuje izolaci proteinu a často vyţaduje pouţití denaturačních činidel k jejich rozpuštění. Na druhou stranu je moţné inkluzní tělíska nejdříve separovat centrifugací, potom rozpustit a protein následně renaturovat takzvaným refoldováním proteinu do jeho správné vyšší konformace, coţ můţe vést k dosaţení vyšší finální čistoty rekombinantního proteinu. Problémem produkce proteinů v E. coli se můţe stát kontaminace lipopolysacharidem lipofilní sloţkou buněčné stěny Gram negativních bakterií, která v savčím organismu vyvolává reakci imunitního systému spojenou se zvýšenou teplotou a vyplavením prozánětlivých cytokinů (Obr. 2.8). Působí tedy jako tzv. pyrogen. Pokud je lipopolysacharidu, taky zvaného endotoxin, aplikováno větší mnoţství aplikováno do krevního oběhu, můţe vyvolat aţ šokový stav ohroţující jedince na ţivotě. Přítomnost endotoxinu můţe být tolerovatelná při aplikacích produktu in vitro, ale pro aplikace in vivo je vţdy nutná depyrogenace. Ta se dá provádět metodami chromatografickými, ať uţ jde o iontoměničovou chromatografii, gelovou permeační chromatografii či chromatografii afinitní (např. Za vyuţití imobilizovaného polymyxinu, polylyzinu nebo proteinu váţícího lipopolysacharid - LBP). Je také moţno vyuţít extrakci endotoxinu do organické fáze tvořené detergentem, např. Tritonem-X114. Tyto metody však často sniţují finální výtěţek produktu a mohou ovlivnit stabilitu a nativní konfiguraci proteinu. Náročné je také testování obsahu endotoxinu. Pro velkou biologickou aktivitu jiţ malého mnoţství je nutno provádět bilogický test zaloţení na lyzátu amebocytů hrotnatce druhu Limulus polyphemus (LAL limulus amebocyte lysate). 28

29 Obrázek 2.8. Struktura molekuly lipopolysacharidu E. coli je moţné kultivovat v různých modifikacích minimálních nebo obohacených kultivačních médií (bujónů). Minimální médium: A médium: obsahuje v 1 litru média 1 g (NH 4 ) 2 SO 4 ; 4,5 g KH 2 PO 4 ; 10,5 g K 2 HPO 4 ; 0,5 g citrát sodný 2H 2 O; 1 mm MgSO 4 x 7H 2 O; 0,2% glycerol (nebo cukr). Bohatá média: Luria-Bertani nebo Lenox Broth (LB): obsahuje v 1 litru média 10 g tryptonu; 5 g kvasničného autolyzátu; 5 g NaCl; (1 mn NaOH). H medium: obsahuje v 1 litru média 10 g tryptonu; 8 g NaCl. Lambda broth: obsahuje v 1 litru média 10 g tryptonu; 2,5 g NaCl. E. coli přes uvedené limitace představují jeden z nejvíce pouţívaných expresních systémů. V případě nutnosti zachovat nezbytné posttranslační modifikace se pouţívá evolučně vyšší, ale finančně náročnější expresní systém nejčastěji kvasinkový nebo savčí. Srovnání zastoupení jednotlivých expresních systémů pro komerční produkci rekombinantních proteinů je uvedeno v Tab

30 Tabulka 2.6. Posttranslační modifikace rekombinantních proteinů Expresní systém Posttranslační modifikace N-glykozylace O-glykozylace Fosforylace Acetylace Acylace γ-karboxylace E. coli Chybí Kvasinky Vysoce manosilované glykany Hmyzí buňky Jednoduchá, bez sializace Savčí buňky Komplexní Kvasinkové expresní systémy Kvasinky představují eukaryontní expresní systém, který obecně mnohem vhodněji posttranslačně modifikuje rekombinantní proteiny eukaryontního původu. Rovněţ sekrece proteinu je dobře realizovatelná připojením sekretorních signálů. Příprava expresního systému je oproti E. coli mnohem delší a je nezbytné selektovat a charakterizovat několik expresních kvasinkových klonů, neboť obvykle se intenzita tvorby rekombinantního proteinu značně liší klon od klonu. Nicméně produkce rekombinantních proteinů v kvasinkách je oproti savčím expresním systémům levná. Kvasinky je moţné kultivovat do vysokých koncentrací buněčné suspenze a zdvojovací čas kvasinek je oproti savčím buňkám mnohem kratší. Nejčastěji se pouţívají Sacharomyces cerevisiae a Pichia pastoris. Obě kvasinky se zásadně liší zejména v dosaţitelné sekreci rekombinantního proteinu a podílu sekretovaného proteinu z celkového mnoţství proteinů syntetizovaných buňkou, které pro S. serevisiae dosahuje maximálně 1 % kdeţto u P. pastoris aţ 10 % (Tab. 2.7). Tabulka 2.7. Srovnání četnosti komerčního využití jednotlivých expresních systémů Produkt Společnost Systém Koagulační faktory (VII, VIII, IX) Novo-Nordisk/Bayer/Centeon BHK buňky Genetics Baxter/Centeon/Wyeth CHO buňky Calcitonin Unigene E. coli CHO buňky 30

31 DNasa (cystická fobróza) Roche CHO buňky Erythropoetin Janssen Cilag/Amgen/Boehringer CHO buňky Darbepoetin Amgen CHO buňky Folikuly stimulující hormon Serono/Organon CHO buňky Luteinizační hormon Serono CHO buňky Gonadotropin Serono CHO buňky Glukagon Novo-Nordisk S. cerevisiae Glukocerebrosidasa (Gaucherova nemoc) Genzyme CHO buňky Růstové hormony (somatotropiny) Upjohn/Lilly/Novo-Nordisk/Ferring E. coli Serono Serono/Bio-Technology Gener. Corp Myší linie CHO buňky Eutropin Lg Chemical S. cerevisiae Growth factors (GCSF, GMCSF) Novartis/Essex/Amgen/Roche E. coli Chugai Pharmaceuticals CHO buňky Platelet derived growth factor (PDGF) Janssen-Cilag S. cerevisiae PDGF-agonista Zymogenetics S. cerevisiae Hepatitis B vakcína Glaxosmithkline S. cerevisiae Rhein-Biotech H. polymorpha Hirudin Aventis/Novartis S. cerevisiae Insulin a muteiny Aventis/Lilly/Berlin-Chemie E. coli Insulin Bio-Technology General Corp E. coli Novo-Nordisk S. cerevisiae Interferon alpha a muteins Roche/Essex/Yamanouchi E. coli Interferon beta Schering E. coli Biogen/Serono CHO buňky Interferon gamma (mutein) Amgen/Boehringer E. coli Interleukin 2 Chiron E. coli Oprelvekin (agonista IL-11) Wyeth Romi 8866 Op-1 (osteogenní, neuroprotekt. fakt) Curis/Striker E. coli Tkáňový aktivátor plasminogenu Genentech/Roche/Boehringer CHO buňky Aktivátor plasminogenu Genentech/Roche/Boehringer E. coli Faktor kmenových buněk (SCF) Amgen CHO buňky 31

32 Tumor nekrosis faktor (TNF) Boehringer E. coli Modifikováno podle Schmidt, 2004 Kvasinky, na rozdíl od savčích buněk, tvoří jiné struktury N-glykanů (převáţně vysoce manosilované, high mannose), které připomínají savčí prekurzory nacházející se v endoplasmatickém retikulu. Tyto jsou savčími buňkami většinou dále modifikovány na kratší řetězce, v nichţ terminální manosa je nahrazována N-acetylglukozaminem, galaktózou, fukózou a sialovou kyselinou za vzniku hybridních a komplexních n- oligosacharidů. Kvasinkové buňky je moţné modifikovat vnesením vektorů kódujících nezbytné manosidasy (MI a MIIx) a glykozidasy (Obr. 2.9, 2.10). U rekombinantního glykoproteinu musí být tedy předem podrobně analyzována glykozylace. Exprese glykozyltransferáz musí být pak upravena výměnou odpovídajících promotorů za silnější či slabší, nebo musí být pouţita rekombinovaná hostitelská linie, která produkuje potřebné glykozyltransferasy a podobně. To samozřejmě komplikuje proces přípravy vhodného kvasinkového klonu pro expresi rekombinantního proteinu. Obrázek 2.9. Struktura N- a O-oligosacharidů u savčích glykoproteinů 32

33 Fukozylace je proces připojování fukózy na různé pozice zejména O- oligosacharidů. Kvasinky normálně nepřipojují fukózu k oligosacharidům na tvořených glykoproteinech. Proto expresi fukozylovaných proteinů je tedy nezbytné pouţít 33

34 geneticky modifikované kvasinky, nebo přejít na evolučně vyšší expresní systém. Genetická modifikace kvasinek k produkci fukozylovaných proteinů byla publikována poprvé v roce Obrázek Syntéza 1,6 GlcNAc rozvětvených N-oligosacharidů O-glykozylace představuje další rozdíl v posttranslační modifikaci mezi savčími a kvasinkovými expresními systémy. U kvasinek a jiných houbových mikroorganismů je o- glykozylace zahájena v endoplasmatickém retikulu přenosem manosových zbytků z dolichyl fosfát D-manosy na specifický serin nebo treonin aminokyselinové páteře proteinu. V této chvíli je jiţ protein sloţen a lokální poměry rozhodují o průběhu O- glykozylace. To, který z uvedených serinů a treoninů bude O-glykozylován, je velmi těţké předpovědět a prakticky se to dá s jistotou říci jedině aţ na základě analýzy glykozylace vytvořeného proteinu. Experimentální průkaz O-glykozylace IGF (insulinu podobný růstový faktor) a IL-2 produkovaných v kvasinkách a v savčích buňkách ukázal zásadní rozdíly mezi oběma systémy. Jiné proteiny jsou glykozylovány v obou systémech identicky (hgm-csf). Odhadnout glykozylaci proteinu je moţné pomocí některých predikčních programů pracujících na principu neuronálních sítí. Tyto programy pracují většinou tak, ţe hledají strukturní podobnosti s jinými proteiny, u nichţ byla glykozylace experimentálně popsána. Příkladem je server dánského technického institutu ( který předpovídá pravděpodobnost připojení 34

35 O-vázaných oligosacharidů v savčích buňkách. Prostřednictvím serveru je moţné provádět odhad i mnoha dalších posttranslačních modifikací ( Pro kvasinkové expresní systémy však specifický predikční nástroj zatím není vyvinut. Hmyzí expresní systémy Jedním ze systémů majících výhody jak eukaryontních, tak částečně i prokaryontních expresních systémů jsou systémy hmyzí bakulovirové, označované podle hlavního nástroje vnášení DNA do hostitelských buněk bakuloviru, velkého hmyzího dvouvláknového DNA viru Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV) nevirulentního pro savce. Tento expresní systém na rozdíl od ostatních pracuje v standardním uspořádání tak, ţe exprese proteinu se neděje z buněčných linií stabilně transfekovaných, jako je tomu u savčího systému a v podstatě i u bakteriálního systému, ale DNA kódující rekombinantní protein je vnášena do kultury hmyzích buněk formou infekce rekombinovaným bakulovirem. Příprava, ověření a udrţování dostatečného mnoţství infekčních virových partikulí (viral stock) představuje nejnáročnější krok celé bakulovirové technologie. Jako hostitelské buňky slouţí larvální kultura buněk můry autographa californica nebo Spodoptera frugiperda (Sf9) (Obr. 2.11). V současnosti jsou komerčně dostupné i vektory pro přípravu stabilně transfekovaných linií hmyzích buněk umoţňující vynechat náročné udrţování a kontrolu suspenze rekombinovaných virů. Obrázek Postup přípravy rekombinovaného bakuloviru 35

36 Výhody bakulovirového expresního systému spočívají zejména ve vysoké výtěţnosti a nepřítomnosti endotoxinu, v podobnosti posttranslační modifikace proteinu s modifikací probíhající v savčích buňkách, v efektivní efektivní sekreci proteinů a v dostupnosti bezsérových médií usnadňující purifikaci sekretovaných rekombinantních proteinů. N-glykozylace rekombinantních proteinů v hmyzích buňkách je převáţně typu vysoce manosylovaných oligosacharidů (high mannose). O-glykozylace je podobná savčí glykozylaci, nicméně místa připojení cukrů Ser, Thr jsou opět dána specifickým rozlišením glykozylačních motivů, které nemusí být vţdy identické se savčími. V současnosti je dostupná hmyzí linie Mimic Sf9, která stabilně exprimuje několik savčích glykozyltransferas umoţňujících tvořit rekombinantní proteiny s dvojitě větvenými N-vázanými oligosacharidy (nesou dva N-acetylglukosaminy na první větvičce manosy), které jsou terminálně sialylované, čímţ se více podobají savčím proteinům. 36

37 Savčí expresní systémy Vlastnosti jednotlivých buněčných populací v následujících kapitolách budou uvedeny zejména ve vztahu k biotechnologickým potřebám produkce rekombinantních proteinů a glykoproteinů. V závislosti na původu proteinu či glykoproteinu, který chceme připravit rekombinantní technologií a v závislosti na vlastnostech, které od něj poţadujeme, je nutné volit expresní systém. Pro savčí proteiny je nejvhodnější pouţít příslušný savčí systém. Tím je zajištěna adekvátní posttranslační modifikace, jako je acylace, fosforylace, lipidizace, glykozylace, citrulinace, tvorba disulfidických můstků a mnoho dalších, které evolučně niţší systémy většinou realizují jen částečně. Problém exprese rekombinantních proteinů v savčích liniích spočívá ve vysoké finanční náročnosti a relativně nízkém výtěţku. Z našich zkušeností vyplývá, ţe očekávaný výtěţek z kultury adherentních buněk kultivovaných na ploše 1 m 2 je řádově ve stovkách mikrogramů aţ jednotkách miligramů. Významným faktorem je zde buněčná linie pouţitá k expresi glykoproteinu. Nejvyšší výtěţnost dosahují linie lidských embryonálních ledvinných buněk HEK (293T) a linie ovariálních buněk křečka čínského (CHO). I zde se však ukazuje, ţe buněčné linie pocházející z tkání téhoţ organismu produkují proteiny lišící se v posttranslační modifikaci, coţ můţe představovat překáţku následného pouţití glykoproteinu například pro imunizaci, jejímţ cílem je navození protilátek proti cukerné komponentě antigenu. Pro dosaţení vysokého výtěţku je nutné připravit stabilně transfekovanou linii buněk, coţ znamená, ţe vnesený gen kódující příslušný rekombinantní protein se musí integrovat do genomu buněk a potom se mnoţí společně s mnoţícími se buňkami. Příprava stabilně transfekované buněčné linie se provádí pomocí recesivní nebo dominantní selekce. Dominantní selekce znamená pouţití chemikálie normálně toxické pro buňky, která je detoxifikována pomocí proteinu, jenţ se produkuje z genu lokalizovaného vedle genu kódujícího rekombinantní protein. Nejdříve tedy v plasmidu, který vneseme do buňky, a posléze v genomu, kam se plasmid integroval. Selekce stabilně transfekované linie trvá několik týdnů a vyţaduje průběţné monitorování míry exprese proteinu, neboť se můţe stát, ţe jinak dojde k selektování klonu rezistentního na selekční marker, ale neprodukujícího dostatečné mnoţství rekombinantního proteinu. Příčinou je to, ţe v genomu hostitelské buňky je integrována jen část plasmidu kódujícího rezistenci na selekční marker nebo ţe exprese rekombinantního proteinu, která zatěţuje metabolicky buňku, je potlačena. Produkci rekombinantního proteinu je moţné zvýšit procesem amplifikace genu kódujícího rekombinantní protein po genomu buňky dlouhodobou kultivací (několik týdnů) buněk za selekčních podmínek (Tab. 2.8). 37

38 Tabulka 2.8. Amplikační markery pro savčí buňky Selekce Adenosin, alanosin a 2 -deoxycoformycin Adenin, azaserin a coformycin -aspartyl hydroxamát nebo albizzin Pala Metotrexát Methionin sulfoximin Cadmium -difluorometylornithin 6-azauridine nebo pyrazofuran Mykofenolová kyselina Gen Adenosin deaminasa Adenyláte deaminasa Asparagin syntetasa Aspartát transcarbamoylasa Dihydrofolát reduktasa Glutamine syntetasa Metalotionein Ornithin dekarboxylasa Ump syntetasa Xantin-guanin phosphoribosyltransferasa Příkladem je selekce buněk metotrexátem, kdy dochází k amplifikaci genu kódujícího dihydrofolát reduktasu (DHFR), který byl vnesen prostřednictvím rekombinantního plasmidu do buňky s deleční mutací obou alel genu kódujícího DHFR (například linie CHO DG44, Invitrogen). To by samo o sobě nemělo smysl pro produkci zvoleného rekombinantního proteinu. Pokud však plasmid konstruujeme tak, ţe dhfr gen je umístěn za gen kódující rekombinantní protein a oddělen je místem umoţňující nasedání ribozomu, transkribovaná mrna je bicistronická a oba proteiny jsou translatovány z jedné mrna molekuly. Toto uspořádání vylučuje, ţe by se do genomu integroval pouze úsek mrna kódující DHFR, neboť by gen ztratil promotor, a byl by nefunkční. Vnitřní místo pro nasedání ribozomu (internal ribosome entry sites; IRES) bývá v komerčně dostupných plasmidech pro laboratorní aplikace odvozeno například od funkční jednotky popsané u polioviru a viru encefalomyokarditidy. Příkladem je plasmid poptivec (Invitrogen), který obsahuje klonovací místo pro vnášení DNA konstruktu, za kterým následuje IRES odvozené z viru encefalomyokarditidy, z nějţ je zahájena translace následujícího cdna úseku kódující DHFR. Tento plasmid mimo jiné umoţňuje rychlé vnášení cdna amplifikované pomocí PCR s pouţitím polymerasy přidávající na oba 3 konce PCR amplikonu netemplátový da (standardní Taq polymerasa). Efektivita klonování je zvýšena tím, ţe plasmid se dodává jiţ otevřený a na oba konce linearizovaného plasmidu je kovalentně připojena topoizomerasa i viru vakcinie. Ligační reakce pak můţe probíhat pouhých 5 minut za pokojové teploty (Obr. 2.12). 38

39 Při produkci virových proteinů v savčím expresním systému se můţeme setkat s nečekaně nízkou výtěţností. To můţe být způsobeno tím, ţe virem kódovaná mrna má jiné zastoupení tripletů (kodonů) neţ běţná zdravá savčí buňka. Důsledkem je, ţe buňka nemá dostatek některých trna pro translaci proteinu. Řešení nabízí takzvaná procedura optimalizace kodonů (codon optimisation), kterou je moţné dnes provést pomocí různých webovských aplikací in silico. Princip spočívá v tom, ţe cdna daného proteinu se přepíše do sekvence aminokyselin a zpětně se přiřadí nová cdna tak, aby poměrné zastoupení trna v hostitelské buňce odpovídalo poměrnému zastoupení příslušných tripletů. Nově navrţenou cdna pak musíme připravit buď cílenou mutagenzou, pokud mnoţství záměn nukleotidů není velké, nebo je moţné syntetizovat úseky cdna lišící se od původní cdna a těmito nahradit původní nebo syntetizovat celou cdna. Výtěţek rekombinantního proteinu se obvykle zvyšuje v rozsahu jednoho řádu, ale i to je významné zlepšení. Kodonová optimalizace můţe významnou měrou zefektivnit například i DNA vakcinaci, zejména pokud antigen kódovaný DNA vakcínou pochází z evolučně vzdáleného organismu, jako jsou houby, bakterie anebo jiţ zmíněné viry. Před přistoupením ke kodonové optimalizaci in vitro je nejdříve nutno zváţit její potenciální přínos, nejlépe pilotním laboratorním experimentem. Obrázek Bicistronický plasmid při amplifikaci genu pomocí DHFR 39

40 Tkáňové kultury savčích buněk jsou z hlediska poţadavků na zkušenosti experimentátora nejnáročnější. Jak jiţ bylo uvedeno na začátku kapitoly, je nezbytné zachovat aseptičnost veškeré manipulace s buňkami. Jako pojistka se do tkáňových kultur přidávají antibiotika, bránící růstu eventuální kontaminace. V některých situacích však jejich přítomnost můţe sniţovat efektivitu některých nezbytných kroků, jako je vnášení rekombinovaných expresních plasmidů (transfekce) do buněk. Nejčastěji pouţívaná antibiotika a jejich pracovní koncentrace jsou uvedena v Tab Obvykle se pouţívá trvale kombinace penicilinu a streptomycinu. Tabulka 2.9. Antibiotika používaná standardně pro tkáňové kultury 40

41 Antibiotikum Penicilin Streptomycin sulfát Kanamycin Gentamicin Mykostatin Amfotericin b Finální koncentrace u/ml g/ml 100 g/ml 50 g/ml 20 g/ml 0,25 g/ml Pro kultivaci savčích buněk se většinou pouţívají komerčně dodávaná média, která se doplňují L-glutaminem, bovinním fetálním sérem jako zdrojem nutrientů a růstových faktorů a antibiotiky. Základní média jsou: BME (basal medium Eagle s): originální Eaglovo médium pro HeLa buňky v kultuře obsahuje Earleyho balancovaný solný roztok. MEM, E-MEM (minimum essential medium): Eaglem modifikované BME. Vyšší koncentrace aminokyseli. Obsahují Earleyho balancovaný solný roztok nebo Hankův solný roztok, obohacena o neesenciální aminokyseliny. Obsahuje 2 mm L-glutamin. DMEM (Dulbeccos modified Eagle s medium): Dulbekova modifikace bazálního Eaglova média. Obsahuje 4x vyšší koncentraci aminokyselin a vitamínů. Dvě modifikace: high (4,5 g/l glukózy) a low (1,0 g/l glukózy). Dále obsahuje 4 mm L- glutamin a 110 mg/l pyruvátu sodného. RPMI 1640 (Rosswell park memorial institute): 1966 Moor, je modifikací McCoyova basálního 5A média. Při ph > 8 růţová barva a zákal obsahuje fenolovou červeň. Je to způsobeno volnými bazickými amonokyselinami, které jsou méně rozpustné při bazickém ph. Při neutrálním ph je čiré a má růţovou barvu, jako ostatní média. Obsahuje 2 mm L-glutamin. Výběr genu a jeho izolace Specifika prokaryontních genů kódujících rekombinantní protein Prokaryontní geny jsou bez intronu. Pro klonování tedy není nutné pracovat s mrna tak, jak je tomu v případě eukaryontních genů. Moţnosti identifikace genu pro izolaci cdna umoţňující přípravu rekombinantního proteinu jsou principiálně podobné jako u eukaryot. Pokud je známa sekvence poţadovaného genu, je moţné s výhodou pouţít PCR amplifikaci s pomocí specifických primerů. 41

42 Specifika eukaryontních genů kódujících rekombinantní protein Eukaryontní geny jsou mnohem sloţitější. Genomická DNA obsahuje nejen oblasti, které kódují strukturu proteinu, ale i introny a dlouhé 5 a 3 nepřekládané oblasti. Proto při izolaci genu se nejčastěji pracuje s cdna připravenou reverzní transkripcí mrna izolované z buněk. Odpadá tím komplikovaná a ne vţdy přímá cesta eliminace intronů, respektive identifikace rozhraní mezi jednotlivými exony a introny. Příkladem webovské aplikace vyhledávání intron-exon rozhraní je například NetGene2 server ( Výhodné je pouţít genové databáze, ve kterých jsou uloţeny sekvence značného mnoţství proteinů, cdna nebo mrna. Porovnáním sekvence izolovaného genu je tak moţno odhadnout strukturu mrna. Jednodušší cesta přípravy cdna reverzní transkripcí mrna je usnadněna tím, ţe eukaryontní mrna má specifické struktury na obou koncích. Na 5 konci mrna se nachází metylační čepička, kterou je moţné pouţít při izolaci mrna v plné délce například metodou GeneRacer (Invitrogen), kdy je metylační čepička na 5 konci mrna odstraněna kyselou pyrofosfatasou (TAP) a k uvolněnému terminálnímu fosfátu je připojen syntetický RNA oligonukleotid (budoucí místo nasedání PCR primeru) pomocí T4 RNA ligasy. Aby nebyly tytéţ RNA oligonukleotidy připojeny i k fragmentům RNA, které byly izolovány společně s mrna, provádí se před odstraněním čepičky defosforylace volných konců izolované RNA pomocí alkalické fosfatasy (CIP). Po připojení RNA primeru na 5 konec mrna se provede standardní reverzní transkripce pomocí reverzní transkriptasy a oligo dt primeru a získaná cdna je pouţitelná k amplifikaci 5 a 3 úseků cdna pomocí PCR s kombinací primerů genově specifického (GSP) a komplementárního k výše připojenému RNA primeru (pro 5 oblast cdna) nebo genově specifického a oligo da (pro 3 oblast cdna). Spojením obou PCR produktů je moţné připravit cdna kódující kompletní rekombinantní protein a identifikovat kompletní 5 a 3 nepřekládané oblasti mrna (Obr. 2.13). Pro dosaţení maximální přesnosti je nutné pouţít přesnou DNA polymerasu s opravnou funkcí, takzvanou proofreading. Tato metoda vyţaduje znalost aspoň krátkého úseku cdna umoţňujícího navrhnout vnitřní primery. Alternativně je moţné získat 5 koncovou oblast mrna pomocí reverzní transkripce mrna s pouţitím sekvenčně specifického primeru, po níţ je k 3 konci vzniklé cdna připojen netemplátový oligo dc pomocí terminální deoxyribonukleotidyl transferasy (TdT). Tento oligo dc společně se sekvenčně specifickým primerem umoţňuje namnoţit DNA fragment odpovídající 5 oblasti mrna. Metoda je vhodná pro identifikaci 5 konců i minoritních mrna. V úvodní kapitole byla zmíněna kodonová optimalizace (CUO) cdna za účelem dosaţení vyšší produkce proteinu přizpůsobením četnosti tripletů organismu, v němţ bude rekombinantní gen syntetizován. Níţe je uvedený příklad provedené optimalizace DNA kódující cystein dioxygenasu houby Trichophyton mentagrophytes pro expresi 42

43 v lidských CHO buňkách. K analýze byl pouţit server a databáze pouţívaných kodonů Výsledek naznačuje, ţe pokud bychom chtěli exprimovat s maximální účinností tento protein v CHO, museli bychom připravit cdna synteticky. První část ukazuje přehled nutných záměn tripletů mezi T. mentagrophytes a lidskými CHO buňkami. V druhé části je ukázán příklad situace na úrovni cdna nukleotidů (Tab. 2.10). Obrázek Příprava mrna plné délky pomocí GeneRacer (Invitrogen) 43

44 Tabulka CUO T. mentagrophytes (query) a lidské (optimized) cdna 44

45 Techniky izolace známého genu a cdna (PCR, RT-PCR, RACE) Nukleové kyseliny jsou přítomny v různých buněčných kompartmentech jádro, mitochondrie, cytoplasma. Postupy izolace DNA a RNA mohou respektovat tuto kompartmentaci a izolovat nukleovou kyselinu specificky obsaţenou v některém z nich, nebo umoţňují izolovat DNA nebo RNA obsaţenou v celé buňce. Zde se budeme věnovat izolaci celkové genomické DNA, celkové RNA a mrna. Při izolaci jakékoliv nukleové kyseliny je třeba volit metodu v závislosti na poţadované čistotě a mnoţství finální NK a na typu buněk, z nichţ má být NK izolována. Pro naprostou většinu následných aplikací (zejména enzymatických) je výhodnější dosáhnout vyšší kvality třeba i na úkor celkového mnoţství NK, neboť pro metody jako 45

46 je PCR, reverzní transkripce a ligace jsou i submikro- a subnanogramová mnoţství vysoce kvalitní NK dostačující. První krok při izolaci NK spočívá v uvolnění NK z buňky pomocí vhodného pufru a následné selektivní izolaci NK, respektive selektivním odstraněním ostatních buněčných komponent. Uvolnění NK z buňky znamená prakticky dezintegraci buněčné membrány, případně buněčné stěny, případně dalších buněčných obalů. Toto můţe být realizováno pomocí detergentů a jiných fyzikálně-chemických postupů. Jiný přístup k dezintegraci zejména tkání a buněčné stěny jsou fyzikálně-chemické neenzymatické postupy. Zejména pro organismy se silnou polysacharidovou stěnou je vhodné pouţít v úvodu izolace fyzikální postupy dezintegrace této stěny zaloţené na působení tření (tření v třecí misce, Potter-Elvehjem homogenizátor, mlýny), na působení nárazu buňky na pevnou stěnu společně s vysokou turbulencí prostředí (odstředivé dezintegrátory) a na rychlých změnách tlaku a působení varu. Fyzikální metody se aplikují na buňky umístěné v pufrech obsahujících kombinaci detergentů (Triton X100, NP-40), které rozpouštějí buněčné membrány, zásad (NaOH denaturuje DNA, z níţ kovalentně uzavřená plasmidová DNA můţe být snadno renaturována při neutrálním ph) a činidel denaturujících proteiny (SDS, guanidin thiokyanát). Z detergentů, například neionogenní NP-40, je moţné pouţít k rozpuštění buněčné membrány při zachování jaderné membrány, coţ umoţní separovat jadernou NK od cytoplasmatické NK. Metody izolace DNA se často doplňují o krok, který specificky eliminuje kontaminující RNA (jeţ se při purifikaci chová podobně jako DNA) přidáním ribonukleasy A do startovního pufru. RNasaA jako většina RNas je značně odolný enzym a alkalické lyzační prostředí pro ni není nebezpečné. Aplikací kombinace jednotlivých výše uvedených činidel je moţné získat NK v rozpustné formě spolu s dalšími buněčnými sloţkami, které je ovšem pro optimální fungování naprosté většiny následných, zejména enzymatických, reakcí a pro poţadavek dostatečné stability NK v průběhu času nutné odstranit. V tomto kroku je moţné pouţít několik přístupů. Jeden z nejstarších, ale stále široce pouţívaných postupů je extrakce proteinové sloţky hrubého lyzátu fenolem. Jedná se o extrakci ze suspenze vodného pufru a fenolu (případně s chloroformem nebo moderněji s bromochloropropanem). Centrifugací se tato suspenze rozdělí na vodnou fázi obsahující NK, rozhraní obsahující část denaturovaných proteinů a fenolickou část obsahující další proteinové molekuly. Fenolová extrakce navíc umoţňuje cílenou izolaci RNA zbavené DNA tak, ţe při pouţití pufru a fenolu s nízkým ph (< 4) a při nízké objemové koncentraci chloroformu (do 20 % pouţitého objemu fenolu) je DNA nerozpustná ve vodě a pouze RNA zůstává ve vodní fázi. Další výhoda této metody spočívá v tom, ţe při pouţití silného deteregentu, jakým je například guanidin thiokyanát nebo guanidin hydrochlorid, je buněčný obsah včetně NK v počáteční bifázické suspenzi (před přidáním chloroformu) stabilní po velmi dlouhou dobu, jestliţe je uchován při 80 C, coţ je zejména vhodné pro snadné prvotní zpracování velkého mnoţství v čase se průběţně kumulujících vzorků, jejichţ finální 46

47 analýza je provedena aţ po relativně dlouhé době. Další výhoda spočívá v moţnosti izolovat z jednoho takto uskladněného vzorku, zvlášť DNA, RNA nebo proteiny. Komerčně jsou dostupné kity obsahující pouze jeden roztok sloţený ze směsi denaturačního pufru a stabilizovaného fenolu, jeţ jsou přímo pouţitelné k uchování a následné izolaci NK bez nutnosti míchat jednotlivé reagencie dohromady (Izogen- Nippon Gene, RNA-Stat 60 Tel-Test, RNAzol B Cinna Scientific, Tri-Pure Isolation Reagent Boehringer Mannheim, TRI Reagent Molecular Research Center, TRIzol Reagent Life Technologies apod.). DNA nebo RNA obsaţená ve vodní fázi izolované výše uvedenými metodami je následně purifikována od kontaminujících solí precipitací DNA pomocí isopropanolu nebo etanolu. NK vypadává z roztoku. Soli zůstávají rozpuštěné v pufru a je moţné je oddělit od pelety. Precipitovaná NK se opakovaně promývá v 70% etanolu a poté se vysuší a rozpustí buď ve vodě, nebo pufru s ph mezi 7 8 pro DNA nebo ve vodě pro RNA. Alternativní postup závěrečného přečištění NK spočívá ve vyuţití chromatografických kolon, kterých je v současnosti na trhu obrovské mnoţství. Základní výhoda kolon spočívá v moţnosti selektivní eluce NK o určité velikosti, coţ je dáno pouţitým ph a iontovou silou promývacích a elučních pufrů. Vzhledem k tomu, ţe při eluci NK se pouţívá poměrně vysoká koncentrace solí, následuje po eluci NK opět precipitace výše uvedeným EtOH nebo isopropanolem. Precipitace se vypouští v případě tzv. minipreparací, které slouţí k izolaci malého mnoţství NK, kde je účinnost precipitace příliš nízká. Podobně jako ionexy umoţňují separovat jednotlivé typy NK, separace genomické DNA, plasmidové DNA a RNA je moţná i pomocí ultracentrifugace v gradientu CsCl (Obr. 2.14). Pro zvýšení efektivity separace se před centrifugací přidává do roztoku interkalační činidlo etidium bromid, který je nutné po centrifugaci odstranit odmýváním například n-butanolem nebo pomocí chromatografické kolony. Horní fáze odpovídá genomické DNA, prostřední fáze, kam míří jehla, odpovídá plasmidové DNA a peleta je tvořena RNA. Obrázek Ultracentrifugační frakcionace plasmidové a genomické DNA 47

48 Izolace genomické DNA. Zvláštnosti izolace genomické DNA spočívají zejména v její obrovské molekulové hmotnosti, délce DNA vláken, a tedy křehkosti izolované molekuly. Pro většinu aplikací (s výjimkou přípravy genomických knihoven) však zlomy DNA vlákna neovlivní efektivitu následných metod, neboť zlomy jsou lokalizovány na DNA vláknu náhodně a vţdy jsou po izolaci získány i fragmenty, na nichţ je kontinuální úsek, který obsahuje sekvenci, jeţ je cílem našeho zájmu. Obecně však lze říci, ţe čím je metoda jednodušší z pohledu mechanické manipulace s DNA, tím je výsledná délka DNA vláken větší. Při izolaci genomické DNA se nejčastěji vyuţívá úvodní dezintegrace materiálu v třecí misce za nízkých teplot (v tekutém dusíku je teplota 196 C) nebo lze pouţít enzymatické štěpení mezibuněčné pojivové hmoty pomocí enzymatického štěpení. Následuje rozpuštění buněčných membrán a denaturace proteinů pomocí ionogenního detergentu (SDS, sarcosyl) a štěpení proteinů proteinasou K, která se nechává působit přes noc při C. Pro ochranu DNA se přidává do lyzačního pufru EDTA, která váţe ionty, jeţ jsou nezbytnými kofaktory DNas. Druhý den se DNA extrahuje opět fenolovou metodou nebo je moţné pouţít solnou extrakci proteinů pomocí NaCl ve výsledné koncentraci 2,2 M. Následuje precipitace etanolem, nebo isopropanolem, umoţňující koncentrovat DNA a odstranit většinu solí. Při izolaci genomické DNA z materiálu s vysokým obsahem polysacharidů (rostliny, houby) je moţné selektivně precipitovat DNA pomocí CTAB. Izolace RNA. Samostatnou kapitolu tvoří metody pro izolaci RNA. Jako kaţdou jinou NK je moţné i RNA izolovat výše uvedenými metodami. Hlavní rozdíl však spočívá v nutnosti postupovat tak, aby nedošlo k degradaci RNA všudypřítomnými RNasami, které jsou značně odolné vůči teplotě, detergentům a nevyţadují pro svou aktivitu ţádné kofaktory. Hlavním zdrojem RNas je samozřejmě izolovaný vzorek. Zde však je degradaci moţné předejít pouţitím nízké teploty během zpracování vzorku před 48

49 umístěním do lyzačního pufru. Lyzační pufry jsou většinou sloţeny z chaotropních činidel (guanidium chlorid, guanidium isothyokyanát), která RNasy inaktivují. Další nebezpečí degradace RNA tedy následuje aţ po odstranění těchto pufrů, tedy ve fázi precipitace RNA etanolem nebo isopropanolem. Po precipitaci je RNA peleta rozpuštěna ve vhodném pufru nebo v deionizované vodě a tyto musí být prosté RNas, neboť jinak hrozí nebezpečí degradace finálního produktu a znehodnocení celého izolačního postupu. Během další manipulace s izolovanou RNA je nutné zabránit moţné kontaminaci vzorku RNasami, jejichţ zdrojem jsou ruce experimentátora, bakteriální kontaminace roztoků a laboratorního materiálu. Ošetření laboratorního materiálu umoţňujícího degradovat RNasy spočívá v ţíhání skleněných pomůcek za vysoké teploty (180 C po 8 hod), nebo ošetření pomůcek chloroformem. Odstranění RNas z vody je moţné přidáním dietylpyrokarbonátu, jenţ musí působit přes noc a poté se degraduje autoklávováním. Povrchy laboratorních přístrojů a pracovních ploch je moţné ošetřit speciálními detergenty ničícími RNas (RNseZAP Sigma). Samozřejmostí je nošení ochranných rukavic, dodrţování čistoty, minimalizace času při zpracování vzorku a hlavně vyuţívání plastu na jedno pouţití, který je certifikován jako RNas prostý. Reverzní transkripce umoţňuje přepis RNA do podoby komplementární DNA (cdna). Při izolaci genu pro produkci rekombinantních proteinů se provádí reverzní transkripce mrna pomocí oligo dt primeru, který umoţní selektivní přepis pouze mrna a enzymu reverzní transkriptasy. V současnosti jsou k dispozici různé modifikace reverzní transkriptasy nejčastěji odvozené z moloneyového viru myší leukémie (MMLV) nebo viru ptačí myeloblastózy (AMV), připravených rekombinantní technologií. Modifikace se týkají a) zvýšení stability enzymu při vyšších teplotách, vedoucí k vyšší specificitě a rychlosti reakce, b) eliminace aktivity RNasyH, která štípe RNA ve vznikajícím heteroduplexu RNA/cDNA a omezuje maximální délku cdna. Vzniklá cdna je potom templátem pro amplifikaci genu například pomocí PCR. cdna můţeme skladovat dlouhodobě, neboť je mnohem stabilnější neţ RNA. Další moţnost je vnesení cdna do klonovacího plasmidu a uchování v podobě transformovaných rekombinovaných E. coli. PCR se většinou provádí bezprostředně po reverzní transkripci. K dosaţení maximální přesnosti se pouţívá polymerasa s proofreading aktivitou, coţ znamená, ţe kromě vlastní DNA polymerázové reakce enzym provádí i exonuklasovou 3 5 opravnou kontrolu správnosti párování nukleotidů. Tím je dosaţeno poklesu chyb o několik řádů, coţ je významné pro izolaci bezchybné cdna. S 3 5 exonukleázovou aktivitou souvisí i to, zda DNA polymerasa vytváří jako produkt amplifikace dvouvláknovou DNA končící tupě (proofreading polymerasy), nebo s přesahující da na 3 konci (Taq polymerasa). To je rozhodující pro volbu klonovacího plasmidu, do kterého bude PCR produkt vnesen v případě, ţe pouţijeme plasmid pro přímé vnášení PCR produktů. Dostupné jsou obě varianty, ale je nutné ověřit, jakou pro klonování potřebujeme. Druhý významný faktor pouţité DNA polymerasy je její procesivita, tedy 49

50 schopnost číst templátovou DNA určité délky. Čím je větší procesivita polymerasy, tím je moţné amplifikovat delší úseky cdna. Poslední významný faktor je, zda je polymerasa schopná amplifikovat templáty s vysokým obsahem g/c nukleotidů. Jedná se do značné míry o kompatibilitu polymerasy s pufrem modifikovaným pro g/c templáty. Jednotlivé parametry ovšem vylučují jiné, a proto je nutné vţdy volit na základě zvolené priority. Příkladem je nabídka firmy New England Biolabs (Obr. 2.15) Obrázek Souvislost různých parametrů polymeras pro PCR 50

51 Práce s genovými a proteinovými databázemi Současný mohutný rozvoj informačních technologií umoţnil vytvoření genových a proteinových databází, které jsou vzájemně propojeny, takţe vyhledávání a srovnávání popsaných genů a proteinů je relativně velmi snadné. Do databází jsou většinou vkládány výsledky sekvenace genomické DNA nebo cdna získané reverzní transkripcí mrna. Proteinové sekvence jsou naopak velmi často výsledkem nikoliv přímého sekvenování izolovaných proteinů, ale výsledkem přepisu cdna sekvence do aminokyselinové sekvence in silico, tedy pomocí počítače. Dále jsou dostupné databáze fragmentů exprimovaných sekvencí (database of expressed sequence Tags dbest), které usnadňují lokalizaci exonů na genomické DNA úrovni. Propojení různých databází je moţné demonstrovat na schématu sekcí národního centra pro biotechnologické informace (NCBI) Národního institutu zdraví USA (NIH) (Obr. 2.16). Obrázek Schéma vzájemného provázání databází NCBI NIH 51

52 Klonovací a expresní plasmidy Vnášení DNA do plasmidu je moţné několika způsoby. Klasický způsob spočívá v ligaci DNA do plasmidu pomocí DNA ligasy (Obr. 2.17). Jinou moţností je vnášení PCR produktů buď běţnou ligační reakcí, nebo přímým klonováním PCR produktů do linearizovaných plasmidů aktivovaných topoizomerasou I (Obr. 2.18). Jiná moţnost je přenos DNA fragmentu z jednoho plasmidu do druhého místně specifickou rekombinací, jako je tomu například u systému Gateway od firmy Invitrogen (Obr. 2.19). Obrázek Plasmid s MCS pro ligaci DNA insertu DNA ligasovou reakcí 52

53 Obrázek Plasmid pro jednosměrné PCR klonování 53

54 Místně specifická rekombinace u systému Gateway je odvozená od místně specifické rekombinace probíhající u lambda fága. Rekombinace je katalyzována enzymovou směsí označovanou jako klonasa II, která rozlišuje signální sekvence attl1 a attl2 v donorovém plasmidu, vyštípne úsek DNA mezi nimi a liguje jej mezi signální sekvence attr1 a attr2 akceptorového plasmidu. Obrázek Gateway pro místně specifickou rekombinaci (Invitrogen) 54

55 Základní technika klonování (restrikce ligace) Restrikce DNA. Analýza DNA pomocí restrikčních endonukleas. Restrikční endonukleasy byly poprvé popsány u bakterií v souvislosti se schopností bakterií odolávat infekci DNA viry. Restrikční endonukleasy tvoří velmi širokou rodinu proteinů, jeţ svou velikostí variují od 157 aa (PvuII) aţ do 1250 (CjeI) a více. Z hlediska praktického vyuţití, zejména při analýze DNA a rovněţ při klonování, je třeba připomenout několik základních pojmů. Izoschisomery se označují všechny restriktasy, které rozlišují stejnou sekvenci DNA. Rozlišovaná DNA sekvence vykazuje často symetrii. Palindrom je úsek dvouřetězcové DNA, jehoţ pořadí bází je v obou vláknech totoţné při protisměrném čtení. Mnoho restrikčních endonukleas štěpí DNA sekvenci, která má vlastnosti palindromu. Jiné restriktasy naopak štípou sekvenci, která není palindromem. Mnohé z takových restriktas štípou mimo rozlišovanou sekvenci (definovaný počet nukleotidů dále), coţ je moţné s výhodou vyuţít při klonování DNA. Restrikční místo přidáme k izolované sekvenci například prostřednictvím PCR primerů na jejich 5 konec, a tedy vně klonované sekvence. Produkt PCR klonujeme k další DNA po restrikci enzymem (např. BbsI), jeţ rozliší příslušnou sekvenci, ale štípe mimo ni, a to směrem do amplifikované DNA (Tab. 2.11). 55

56 Tabulka Klonování bez vnesení restrikčního místa do cílové sekvence GAAGACTT CGGCGCC TGG TTC CCC CTT TTC GAAGACCC GCC GAG AAG CTG T CTTCTGAAGCCG CGG ACC AAG GGG GAA AAG CTTCTGGGCGGC TC TTC GAC A upstream primer 5 klonované sekvence downstream primer 3 klonované sekvence NNNNNNNNNNNNNNNNGAAAAGGGGGAACCAGGCGCCGAAGTCTTCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNCTTTTCCCCCTTGGTCCGCGGCTTCAGAAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN spojení mezi 5 DNA úsekem a 3 DNA úsekem Sekvence rozlišovaná restriktasou BbsI, sekvence oddělující místo rozlišované BbsI a štípané BbsI, 3 konec DNA fragmentu lokalizovaného směrem k 5 konci (odpovídá například N terminální části fúzního proteinu), sekvence 5 konce DNA fragmentu lokalizovaného směrem k 5 konci (odpovídá například C terminální části fúzního proteinu). Kromě výše uvedených restrikčních endonukleas se vyuţívají specifické exonukleasy a restriktasy, které štípou specificky jednovláknovou DNA, jednovláknovou RNA nebo RNA v hybridu s DNA atd. Minipreparace a maxipreparace DNA Preparace plasmidové DNA. V jednotlivých krocích klonování je nutné získat čistou plasmidovou DNA pro další postupy. Prvním krokem je tedy izolace plasmidové DNA, která můţe být provedena jako mikropreparační metoda (mnoţství získané DNA dosahuje 20 g), například pro následnou PCR analýzu nebo následné PCR klonování, midipreparační metoda (mnoţství získané DNA dosahuje 500 g) pouţitelná pro všechny standardní postupy, zejména ligaci fragmentů DNA získaných restrikcí specifickými endonukleasami. Maxi a mega preparativní postupy (mnoţství získané DNA dosahuje 5 10 mg) umoţňují připravit DNA například pro DNA vakcinaci, kde dávky na jednu experimentální imunizaci dosahují g pro malá laboratorní zvířata a aţ 8 mg pro člověka. Pro izolaci plasmidové DNA je moţné, podobně jako při izolaci genomické DNA, pouţit 1) ultracentrifugační frakcionaci celkové nukleové kyseliny na genomickou DNA, plasmidovou DNA a RNA, 2) purifikaci plasmidové DNA od níţ je genomická DNA odseparována pomocí inotoměniče, nebo 3) separaci plasmidové DNA od genomické 56

57 DNA po precipitaci celkové DNA pomocí rozdílné rozpustnosti plasmidové a genomické DNA. Většina procedur pro purifikaci plasmidové DNA je zaloţena na metodě alkalické hydrolýzy. Spočívá v separaci buněk od kultivačního média, resuspendování buněčné pelety v Tris-Cl pufru s glukózou a EDTA a následné alkalické lýze, kdy je buňka lyzována a proteiny s DNA jsou denaturovány pomocí SDS a NaOH. Následuje vysráţení SDS s vysokomolekulární DNA a denaturovanými proteiny prostřednictvím octanu draselného. Kovalentně uzavřené plasmidy renaturují a zůstávají rozpuštěny v pufru. Precipitát je následně odstraněn centrifugací nebo filtrací a izolovaná plasmidová DNA (rozpuštěná v supernatantu) je precipitována isopropanolem nebo purifikována na iontoměničové koloně. Po eluci je DNA rozpuštěna v pufru s optimálním ph 8 (například Tris-Cl). Do pufru je moţné přidat EDTA, která odebráním iontů kovů inaktivuje DNA. Purifikace pomocí iontově výměnné chromatografie umoţňuje volbou vhodné koncentrace NaCl během promývání a eluce separovat jednotlivé druhy nukleových kyselin (Obr. 2.20). Obrázek Eluce jednotlivých NK podle koncentrace NaCl Restrikční analýza a dělení NK v agarosovém gelu. Agarosový gel umoţňuje separovat nukleové kyseliny o délce od 50 nukleotidů do nukleotidů. Standardní agarosová elektroforéza separuje optimálně fragmenty dvouvláknové DNA o velikosti 50 aţ párů bází. Optimální rozlišení v určitém 57

58 rozsahu velikostí DNA a RNA je moţné dosáhnout volbou koncentrace agarosy v připraveném separačním gelu (Tab. 2.12, Tab. 2.13, Obr. 2.21). Tabulka Optimální dělící podmínky pro agarosovou elektroforézu Délka fragmentů DNA [kb] ,8 12 0,5 10 0,4 7 0,2 3 Optimální koncentrace agarosy [%] 0,5 0,7 1,0 1,2 1,5 Pro separaci se pouţívá acetátový nebo borátový pufr. DNA se v elektrickém poli při ph 8 pohybuje jako záporně nabitá molekula ke kladně nabité elektrodě anodě. Intenzita separačního napětí bývá 1 5 V/cm vzdálenosti připojených elektrod. Rozdíly ve struktuře DNA molekuly ovlivňují významně pohyblivost DNA. Pro vizualizaci DNA se pouţívá interkalační činidlo ethidium bromid (EtBr), který je aktivován pomocí ultrafialového světla a emituje světlo v oblasti oranţové barvy (610 nm). Ethidium bromid je silný mutagen a suspektní karcinogen. Detekční mez při pouţití EtBr je dána velikostí DNA fragmentů a nemá lineární závislost. V průměru dosahuje asi 2 5 ng DNA na jeden diskrétní 5 mm dlouhý prouţek. Při analýze genomické DNA je tedy nutné pouţít mnohonásobně vyšší mnoţství DNA g na 5mm dlouhou jamku. EtBr ovlivňuje i pohyblivost jednotlivých forem DNA šroubovice. Ethidium bromid svou interkalací do DNA ruší negativní suprahelikální strukturu formy I DNA a po překročení kritické hodnoty koncentrace volného EtBr free-dye concentration (0,1 0,5 g/ml) dochází k tvorbě kladné suprahelikální struktury u formy I DNA. Tak pohyblivost od negativního superhelixu přes prostou cirkulární DNA k pozitivnímu superhelixu nejdříve klesá a potom opět roste. U forem II a III interkalace EtBr do struktury způsobuje prodlouţení DNA molekuly a vzrůst rigidity, čímţ můţe pohyblivost pouze klesat, a to aţ o 15 %. Tabulka Morfologie a pohyblivost DNA na agarosovém gelu Forma Morfologie Pohyblivost I Suprahelix. Negativní relaxovaná pozitiv. Nejvyšší nízká nejvyšší II Prostá (zářezy) cirkulární Nízká III Lineární dvojvlákno Vysoká 58

59 Obrázek Závislost pohyblivosti DNA na její morfologii Pro separaci vysokomolekulární DNA je nutné pouţít PFE (elektroforéza v pulsním elektrickém poli) nebo chef (contour clamped homogenous electric field = homogenní elektrické pole zaloţené na řízené rotaci polarit přilehlých elektrod). Malé DNA fragmenty a malé rozdíly délky DNA molekuly je moţné analyzovat v polyakrylamidovém gelu s borátovým pufrem. Tyto gely se pouţívají jednak pro separaci oligonukleotidů, jednak pro sekvenační účely. Na rozdíl od standardního agarosového gelu probíhá separace DNA v akrylamidovém gelu velmi pomalu. Standardní agarosová elektroforéza není vhodná ani pro separaci RNA. Tuto je nutné dělit v agarosovém gelu za denaturačních podmínek, tedy v pufru obsahujícím nejčastěji 7 % formamidu. RNA vzorek v nanášecím pufru obsahujícím ústoj, formaldehyd a formamid je nutné před nasazením do gelu denaturovat 15 min při 55 C. Po separaci RNA je nutné před vizualizací ethidium bromidem odmýt nejdříve 59

60 formaldehyd z agarosového gelu pomocí 0,5M octanu amonného. Typickým znakem kvalitní celkové RNA je přítomnost dvou prouţků odpovídajících ribozomální RNA. Naopak typickým znakem kvalitní izolace mrna z celkové RNA je úbytek intenzity obou prouţků na úkor zvýšeného smíru mrna pokrývajícího oblast 500 aţ nukleotidů. Lokalizace transgenu v buňce - extrachromosomální, rekombinace do genomu Zajištění trvalé přítomnosti plasmidu v hostitelské buňce je většinou realizováno pomocí selekčního tlaku antibiotik. Tato metoda je efektivní a také nejsnadnější. Expresi vneseného genu kódujícího rekombinantní protein či fenotypový znak buňky vázaný na expresi či naopak blokování exprese určitého proteinu je moţné zajistit stabilní integrací do odpovídajícího místa chromozomu hostitelské buňky. Inaktivace určitého buněčného genu je nejlépe realizovatelná homologní rekombinací STOP kazety do oblasti genu. V případě izolace kyseliny hyaluronové z kmene Streptococcus equi subsp. zooepidemicus, pouţité jako modelový problém praktické části kurzu, byla pouţita homologní rekombinace kazety nesoucí gen rezistence k inaktivaci genu pro - glukuronidasu. Vnesení plasmidů do buněk transformace V průběhu buněčného klonování je nutné dopravit DNA konstrukt (plasmid) do buňky, kde je následně replikován a v případě expresního plasmidu dochází k regulované expresi rekombinantního proteinu. Vnesení DNA do prokaryontní buňky se označuje transformace, vnesení DNA do eukaryontní buňky se nazývá transfekce. Pro vnášení DNA do buňky jsou k dispozici různé metody, a to fyzikální, chemické nebo biologické. Chemická transformace principy, příprava kompetentních buněk Chemická transformace E. coli je metoda velmi efektivní, a proto se standardně pouţívá v mnoha laboratořích. Její výhoda mimo jiné spočívá v nízkých nákladech na provedení vlastní transformace, neboť kromě vyhřívané lázně nebo aspoň kádinky s vodou o teplotě 42 C není nutný ţádný zvláštní přístroj. Metody se nazývají podle způsobu přípravy takzvaně kompetentních buněk, tedy bakterií připravených k následné transformaci, která se provádí tak, ţe se přidá DNA k chemicky kompetentím buňkám a po krátké inkubaci, kdy dochází k adhezi DNA na povrch buněk, je proveden tepelný šok (42 C, s), během něhoţ DNA vstupuje do buňky. Následuje preinkubace buněk 60

61 v SOC médiu (37 C, 1 hod.) a vyočkování na tuhé (agarové) selekční půdy. Podobným způsobem probíhá druhý typ chemické transformace, kdy jsou kompetentní buňky připraveny inkubací v roztoku chloridu rubidného. Obě metody umoţňují připravit kompetentní bakterie do zásoby předem a uchovat je dlouhodobě v -80 C. Pro transfekci DNA do savčích buněk je moţno pouţít metody s DEAE dextranem nebo transfekci za tvorby komplexu DNA a fosforečnanu vápenatého. V současnosti se stále více vyuţívají kationické liposomy a kationické polymery, jako například polyethylenimin. Tyto jsou dodávány komerčně pod různými názvy a efektivita transfekce závisí zejména na pouţité buněčné linii a kvalitě kultury v době transfekce (ţivotnost buněk, stáří). Elektroporace princip, příprava kompetentních buněk, podmínky Elektroporace je metodou volby v případech, kdy chemické metody transformace bakterií či transfekce eukaryontních buněk nedosahují dostatečné efektivity. Princip elektroporace spočívá v dočasné destabilizaci buněčné membrány, navozené elektrickým pulsem. V případě bakterií se i zde vyuţívá moţnost připravit kompetentní bakterie předem, a to promýváním bakteriální suspenze ve sterilní vodě při teplotě tání ledu. Uchování kompetentních bakterií se provádí v 10% vodném roztoku glycerolu při 80 C. Podmínky elektroporace jsou optimalizované pro různé bakteriální druhy a spočívají v elektrickém pulsu provedeném přes elektroporační kyvetu, v níţ jsou kompetentní buňky s DNA umístěny. Volitelné podmínky elektroporace jsou: koncentrace buněk, mnoţství DNA, druh elektroporační kyvety, elektrické napětí, kapacita, případně odpor a průběh pulsu. Pro E. coli je moţné pouţít tyto podmínky peleta z 25 ml bakteriální kultury O.D. 600 = 0,3; 10 pg DNA; předchlazené elektroporační kyvety 0,1 cm štěrbina; 25 F; 1800 V; 200 Ω. Transfekční účinnost dosahuje 3,6x10 8 transformovaných E. coli na 1 g DNA. K elektroporaci je nutné pouţít elektroporátor, coţ je zařízení, jehoţ pořizovací náklady jsou ve stovkách tisíců korun. Příklad elektroporátoru od firmy Bio Rrad je uveden na Obr Obrázek Elektroporátor pro vnášení DNA do bakterií i savčích buněk 61

62 Pro elektroporaci eukaryontních buněk jsou rovněţ dostupné protokoly nastavení elektrických vlastností pulsu. Buňky se k elktroporaci připravují těsně před vlastním pulsem. Buňky nejsou promývány vodou jako u E. coli, ale pomocí vhodného pufru nebo kultivačním médiem. Příklady pouţívaných pufrů pro přípravu savčích buněk k elektroporaci jsou následující: RPMI 1640; RPMI 1640, 10 mm dextróza, 0,1 mm dithiothreitol; 1 x PBS; 15 mm HEPES pufr; elektroporační pufr 272 mm sacharóza, 7 mm fosfát sodný, ph 7,4, 1 mm MgCl 2 ; pufr o sloţení 50 mm K 2 HPO 4, 20 mm CH 3 CO 2 K, 20 mm KOH, ph 7,4; hypoosmolární elektroporační pufr (Eppendorf). Elektrické parametry pulsu závisí na pouţité buněčné linii a i pro jednu linii je publikováno poměrně velké rozpětí hodnot, které jednotlivé laboratoře experimentálně ověřily jako optimální. Jako příklad uveďme elektroporaci monocytární linie U937 0,3 ml buněčné suspenze 1,3x10 7 /ml ţivých buněk 10 g DNA; předchlazené elektroporační kyvety 0,4cm štěrbina; elektrické podmínky viz Obr K elektroporaci bylo pouţito 10 g plasmidu psiv LTR/CAT kódujícího bakteriální chloramfenikolacetyltranferázu (CAT) pod kontrolou LTR promotoru (CAT byla pouţita k monitorování transfekční účinnosti) a 15 g psv/tat plasmidu kódujícího Tat protein, který aktivuje transkripci genu kontrolovaných LTR. Aktivita CAT byla měřena radioaktivní metodou stanovující radioaktivitu reakčního produktu po inkubaci s buněčným lyzátem (obsahujícím syntetizovanou CAT). Obrázek Podmínky elektroporace lidské monocytární linie U937 62

63 Stabilita plasmidů v buňkách Po vnesení plasmidu do bakterie je nutno udrţovat selekční tlak, který zabrání bakterii, aby plasmid vyloučila z buňky. Nejvhodnější je pouţití antibiotik, jejichţ eliminace je zajištěna proteinem kódovaným pomocným genem v klonovacím nebo expresním plasmidu. Jinou moţností je integrace plasmidové DNA do genomu hostitelské buňky, a to buď náhodně (pouţíváno při selekci stabilně transferovaných klonů savčích buněčných linií), nebo homologní rekombinací (pouţíváno i u prokaryot). Homologní rekombinace vţdy nahradí určitý, přesně vymezený úsek genomické DNA. Vnesený gen můţe kódovat buď jen selekční marker (rezistence na antibiotikum), nebo jiný protein zajišťující novou fenotypovou vlastnost buňky, nebo můţe být cílem pouze inaktivace nahrazeného úseku genomické DNA, coţ bude v praktické části projektu pouţito k inaktivaci genu kódujícího -glukuronidasu v linii Streptococcus equi subsp. zooepidemicus. Episomální DNA Episomální DNA se pouţívá zejména pro zajištění nového fenotypového znaku hostitelské bakteriální linie. Detaily byly diskutovány výše. Antibiotická selekce Antibiotika jsou stále nejčastěji pouţívaným selekčním markerem při molekulárním klonování. Některé obecné aspekty byly jiţ zmíněny v předcházejících kapitolách. Zde jen několik praktických poznámek. Pouţití antibiotika jako ampicilin je 63

64 spojeno s fenoménem satelitních kolonií. Jedná se o to, ţe po naočkování bakterií na pevné selekční půdy s ampicilinem začnou nejdříve růst pouze bakterie, které nesou plasmid zajišťující rezistenci na ampicilin (Obr. 2.24). Obrázek Satelitní kolonie při kultivaci na tuhých půdách s ampicilinem Po několika hodinách se však v okolí kolonií objeví další malé satelitní kolonie bakterií, které však nenesou plasmid zajišťující rezistenci na ampicilin. Na obrázku jsou šipkami označeny centrální kolonie, kolem kterých se satelitní kolonie vytvářejí. Ampicilin je totiţ v okolí velké kolonie rychle hydrolyzován, a satelitní kolonie jsou tedy projevem růstu bakterií na neselekční půdě. Proto je třeba klást důraz na pouţití čerstvých antibiotik. V případě ampicilinu je moţno redukovat kontaminaci vybraného klonu satelitně rostoucími bakteriemi rozočkováním klonu kličkou na čerstvou selekční půdu. 64

65 Homologní rekombinace Homologní rekombinace je postup cíleného nahrazení úseku genomické DNA nejlépe pomocí lineární DNA, jejíţ okrajové části mají vysokou sekvenční homologii s okrajem nahrazeného úseku. Pomocí homologní rekombinace lze gen cíleně inaktivovat či odstranit (gene knock-out), nebo lze vnést do genu předem připravenou mutaci (gene knock-in). U bakterií dochází k homologní rekombinaci v důsledku aktivity RecA systému. V savčích buňkách a u kvasinek dochází k homologní rekombinaci v důsledku aktivity mis-match repair systému. U savčích buněk se však většina vloţené DNA začlení náhodně (nikoliv sekvenčně specificky). Homologní rekombinace nastává v 1 0,01 % případů z celkového počtu prokázaných rekombinací. Tím je vyuţití homologní rekombinace u savčích buněk značně omezeno. Uţitečným pomocníkem můţe být například reporterový gen, který správnou rekombinací umoţní detekovat a klon následně izolovat. Pomocí homologní rekombinace lze gen cíleně inaktivovat či odstranit (gene knock-out), nebo lze vnést do genu předem připravenou mutaci (gene knock-in). Ověření exprese genů na laboratorní úrovni Fenotypová analýza, PCR analýza Přípravou rekombinovaného expresního plasmidu a jeho vnesením do hostitelské buňky začíná další významný krok přípravy rekombinantního proteinu, ověření produkce a optimalizace podmínek exprese a purifikace. První skríning je moţné provést analýzou buněčného lyzátu, například pomocí western blot analýzy. Zde je moţné s výhodou pouţít protilátky proti různým tagům neboli krátkým peptidům, s nimiţ je rekombinantní protein fúzován po vnesení do expresního plasmidu. Tyto krátké sekvence jsou součástí většiny komerčně dodávaných plasmidů a nacházejí se bezprostředně před nebo za klonovacím místem (MCS) nebo místem pro vnášení cdna fragmentu získaného PCR amplifikací. Aby byla tato krátká sekvence přepisována do sekvence aminokyselin, musí být, cdna inzert vnesen do MCS nebo odpovídajícího PCR klonovacího místa se zachováním čtecího rámce (viz výše). Pokud se jedná o sekretované proteiny, je moţné provádět skríning přímo ze supernatantu kultury. Bliţší popis biochemických analytických metod je uveden v poslední kapitole. V některých situacích, zejména u eukaryontních expresních systémů se můţeme setkat s problémem nízké míry exprese rekombinantního proteinu, coţ znesnadňuje detekci. Zde je moţné skrínovat přítomnost rekombinantního expresního plasmidu pomocí PCR. Tato metoda je dále vhodná pro mapování průběhu homologní rekombinace. Pokud se jedná o náhodnou integraci do genomu hostitelské buňky, je moţné pouţít PCR k průkazu integrace rekombinované DNA například selektivní izolací 65

66 genomické DNA, která pak slouţí jako templát pro PCR amplifikaci. Zde však je nutné zahrnout kontrolu, která prokáţe, ţe templátem nebyl zbytkový plasmid, který genomickou DNA kontaminuje. Skríning produkce rekombinantních proteinů Pro skríning produkce rekombinantního proteinu byl uveden jako vhodný nástroj western blot. Jelikoţ však většinou chceme docílit maximální dosaţitelné exprese, snaţíme se izolovat buněčný klon s maximální mírou exprese. To je významné zejména u eukaryontních expresních systémů kvasinkových a savčích. Navíc buňky, které exprimují rekombinantní protein, jsou oproti ostatním buňkám v nevýhodě, protoţe mají delší buněčný cyklus a ostatní buňky se dělí rychleji a postupně dochází k přerůstání stabilních transfektantů ostatními buňkami. Pro skríning exprese rekombinantního proteinu jsou vhodné metody jako dot blot či ELISA. Dot blot metoda je zaloţená na vazbě proteinu na nitrocelulózovou nebo polyvinyliden fluoridovou membránu na zařízení dot blotter (Obr. 2.25). Výhoda metody spočívá v jejím snadném aplikování na velké mnoţství vzorků současně tedy pro skrínování. Po nanesení proteinu na membránu se dále postupuje identicky jako při imunodetekci na western blotu proteinů. Jediná nevýhoda spočívá v tom, ţe dot blot neposkytuje ţádné informace o velikosti proteinu. Tedy pokud by došlo k tomu, ţe vybraný klon exprimuje daný rekombinantní protein, na který se váţe protilátka, budeme na dot blotu pozorovat pozitivní reakci, coţ je kolečko odpovídající nanesenému proteinu. Pokud však skrínováním vybereme několik kandidátních klonů, snadno můţeme provést následující analýzu, např. SDS-PAGE s následným western blotem, čím získáme základní informace o proteinu. Někdy se na wester blot analýze ukáţe více prouţků, které reagují se specifickou protilátkou. Můţe to být zapříčiněno rozpadem proteinu, který můţe probíhat intracelulárně i extracelulárně. To uţ ale spadá do oblasti optimalizace expresních podmínek a někdy vede k nutnosti provést modifikaci struktury proteinu tak, aby byla zabezpečena vyšší stabilita bez ztráty potřebné funkce. Obrázek Zařízení pro dot blot firmy BioRad 66

67 67

68 3. BIOTECHNOLOGICKÉ KULTIVACE MIKROORGANISMŮ Principy pilotní a průmyslové kultivace mikroorganismů Základem pilotních a průmyslových biotechnologických procesů jsou kultivace a biotransformace v bioreaktorech. Jednoduchým bioreaktorem je jakýkoli uměle vymezený prostor, kde bioprocesy mohou probíhat. Například třepaná baňka je jednoduchým bioreaktorem. Bioreaktor Bioreaktor je zařízení, kde probíhá růst buněk a tvorba produktů nebo konverze substrátu na jeden či více produktů. V moderním a širším slova smyslu není vţdy nutné, aby se procesu zúčastnily buňky, i např. Enzymové biotransformační reaktory můţeme nazvat bioreaktory. Bioreaktory můţeme klasifikovat podle různých hledisek, ale výše zmíněná třepaná baňka zůstává prototypem transportních procesů, které jsou pro bioproces nezbytné (Obr. 3.1). Obrázek 3.1. Transport živin a metabolitů. Sj - substráty, Pj - produkty, Hv - tepelná bilance, 1. mezifázové rozhraní plyn-kapalina, 2. transport v kapalině, 3. kapalina-pevná fáze, 4. transport aglomerátem, 5. transport přes biologické membrány. 68

69 Klasifikace typů bioreaktorů Bioreaktory rozdělujeme podle různých hledisek, základní dělení je podle fáze: Submerzní nositelé bioprocesu (buňky, enzymy, agregáty, imobilizáty) se volně vznášejí v kapalné fázi ţivného média, Na pevné fázi médium v tomto uspořádání tvoří pevný povrch a nositelé bioprocesu tvoří povlak čí nárůst; i tady se zpravidla tvoří mezistrukturní vrstvičky kapaliny, Imobilizované nositelé procesu jsou nějakým způsobem ukotveni v pevné struktuře. Obrázek 3.2. Některé typy submerzních bioreaktorů 1. mechanicky míchaný tank, 2. průtočný s nepohyblivou náplní, 3. kombinovaný pro bioplyn, 4. enzymový membránový, 5. pneumatický, 6. s pevnou fází 69

70 Měřítko: Jiné dělení můţe být podle objemu procesu: Laboratorní (do 30 l) Čtvrtprovozní (do 100 l) Poloprovozní (do 5000 l) Provozní (nad 5000 l) Charakter pohybu média i nositelů procesů zakládá dělení podle operačního módu: Vsádkový (batch) - všechny ţiviny jsou vloţeny do procesu jiţ na počátku, metabolity se hromadí (vyjma plynů), nejjednodušší typ procesu, Přítokovaný (fed-batch) k základnímu objemu v bioreaktoru přitéká další médium s novými ţivinami, metabolity se opět hromadí, Kontinuální existuje přítok i odtok, nositelé procesu jsou zadrţováni, nebo odtékají. Další základní dělení je na aerobní (za přístupu kyslíku), mikroaerobní (minimální přístup kyslíku, zpravidla mnoţství, které se rozpustilo a absorbovalo před uzavřením reaktoru) a anearobní (přístup kyslíku je zamezen). Neméně důležité dělení je podle konstrukce bioreaktorů, pro ilustraci Obr. 3.2: Míchání Mechanické, pneumatické nebo hydraulické Fluidní vrstva Náplňové Speciální Membránové, fotobioreaktory, reaktory pro kultivace na pevném substrátu, atd. Kultivace SSC a SLC Tyto podivné zkratky znamenají dva základní typy kultivací v klasifikaci podle provedení, které mají zásadní vliv na typ pouţitého bioreaktoru. Jsou to kultivace na pevném substrátu (SSC solid-solid-cultivation) a submerzní kultivace v kapalině (SLC solid-liquid-cultivation). Toto pojmenování označuje pevnou fázi buňky versus pevnou nebo kapalnou fázi substrátu. Mezi rozdíly mezi SSC a SLC patří: 70

71 Gradient ţivin U SSC přístup k povrchu buňky je omezen, ţiviny v bezprostředním okolí jsou vyčerpávány a další musí k buňkám difundovat. SLC v ideálně míchaném reaktoru gradient neexistuje. Vrstva substrátu SSC - pro omezený transport ve vlhkém, ale pevném prostředí nemá smysl pouţívat silnou vrstvu substrátu. Kapalného média bývá přebytek. Limitace transportu tepla a ţivin SSC - je dána omezenou difuzí, u SLC je přístup k buňkám dokonalý (pokud se jedná o volné buňky) a je dána transportními procesy přes buněčné stěny a membrány. Fáze SSC - třífázový systém pevná kapalina plyn, SLC pouze dvoufázová systém kapalina plyn. Dodávka kyslíku SSC - kyslík je dodáván hlavně z plynné fáze, coţ je problematičtější, SLC rozpuštěný kyslík z kapaliny a zároveň mezifázový přechod kyslíku z plynu do kapaliny. Teplo SSC teplo se odvádí plynou fází, SLC kapalina je chlazena externím médiem nákladnější, ale mnohem účinnější. Sledování (monitoring) a řízení procesů SSC velmi obtíţné aţ nemoţné, SLC standardní postupy. Charakter růstu SSC povrchový, SLC submerzní. Koncentrace produktu Zde významná výhoda SSC zpravidla vyšší koncentrace produktu ve srovnání se SLC. Zvětšování měřítka procesu (scale-up) U SSC špatně definovatelné, u SLC standardní metodika. Celkově spočívají výhody SSC pouze v jednoduchosti a nenáročnosti na strojní vybavení, ve vyšší objemové koncentraci produktů a tím efektivnější izolaci, jednodušší inokulaci a menším objemu odpadů. Dále v tom, ţe některé organismy se v submerzním prostředí kultivují obtíţně, nebo netvoří ţádané produkty (např. Některé vláknité mikroorganismy). Ideální bioreaktor Ideální bioreaktor má rychlý přestup tepla, kyslíku a hmoty, rychlá homogenizace, nízké provozní náklady. Zpravidla se jedná o submerzní bioreaktor, ale to závisí na 71

72 charakteru nositele procesu a procesu samém. Bioreaktor je proto nutné vybírat, případně konstruovat, s přihlédnutím k těmto parametrům procesu: Přestup kyslíku Přestup tepla Přestup hmoty Poţadavky na míchání Nároky na energie Citlivost kultury ke střiţným silám Reologie kapaliny - viskozita média (míchání, přestup hmoty, přestup tepla, střiţné síly) Minimalizace odparu kapaliny Tlaková odolnost Sterilita operace Čištění bioreaktoru Bezpečnost Účelová flexibilita a kompatibilita Cena zařízení a jeho provozu Přestup kyslíku a tepla jsou limitující faktory pro provoz bioreaktoru a scale-up Submerzní kultivace v kapalném médiu Nadále se budeme věnovat submerzní kultivaci v kapalném médiu s volně pohyblivou pevnou fází, jakoţto typickému příkladu bioreaktorových aplikací. Tyto kultivace se vyznačují několika charakteristickými parametry. Míchání zajišťuje homogenitu vsádky, ideální přístup ţivin a odvod metabolitů, odvod tepla. Regulace teploty, ph a v případě aerobních procesů průtoku vzduchu nebo obohaceného vzduchu představují další základní parametry, které musí aerobní míchaný bioreaktor zajišťovat. Poslední parametr, ne vţdy vyuţitý, je přítokovací systém. Speciální bioreaktory Mezi speciální bioreaktory řadíme například fotobioreaktory, zařízení různé konstrukce umoţňující přístup světla k rostoucím fotosyntetizujícím kulturám, např. Jednobuněčným řasám, cyanobakteriím. Další velkou skupinou jsou bioreaktory pro kultivaci na pevné fázi, o které bylo stručně pojednáno výše. Konstrukce jsou opět různé, podle charakteru organismu a jeho růstu. K těmto reaktorům se řadí i zařízení pro povrchový nárůst na kapalných médiích. Bioreaktory pro kultivaci ţivočišných či rostlinných buněk tkáňových kultur 72

73 přesahují rovněţ rozsah tohoto textu. Míchání bioreaktorů Nejčastějšími způsoby míchání bioreaktorů jsou pneumatické, s fluidním loţem a zejména mechanické. Pneumatické míchání bioreaktorů Nejznámějšími zástupci jsou bublané kolony a air-lift reaktory. Charakterizovat je lze takto: Probublávané reaktory (kolony) Cylindrická nádoba, poměr průměru k výšce 1:2 (kolona) Rozdělovač plynu obvykle naspodu reaktoru Nepřítomnost speciálních difuzorů a vestaveb Přestup kyslíku a míchání dáno rychlostí proudění vzduchu a rheologií kapaliny Maximální rychlost míchání obvykle 0,1 m/s Nevýhoda obvykle malý přestup kyslíku Relativně malé mezifázové rozhraní Bubliny postupem vzhůru koaleskují (spojují se) Air-lift reaktory (s vestavbami) Vestavby zaráţka, cirkulační trubka Funkce vestaveb: Dostatečná dispergace plynu umoţňuje obnovování mezifázového povrchu zvyšuje přestup kyslíku Organizování toku fází Zvýšení doby prodlení plynu Zvýšení mikroturbulence Air-lift reaktory lze vybavit cirkulační trubkou nebo vnější cirkulací. Princip bublané kolony a air-lift reaktoru s centrální cirkulační trubkou je patrný na Obr Obrázek 3.3. Pneumaticky míchané bioreaktory 73

74 a) bublaná kolona, b) air-lift reaktor s cirkulační trubkou. Bioreaktory s fluidním ložem V reaktorech s fluidním loţem proudí kapalina směrem vzhůru a nadnáší suspenduje částice pevné fáze. Jsou vhodné pro imobilizované či flokulované mikroorganismy nebo enzymy. V horní rozšířené části se sniţuje rychlost proudění a tím i suspendace dochází k separaci částic od kapaliny, která můţe opustit reaktor. Tyto reaktory mohou být i aerované, většinou probubláváním. Jsou vhodné pro imobilizované či flokulované mikroorganismy nebo enzymy. Samotné buňky jsou příliš lehké, špatně sedimentují a jsou nevhodné pro cirkulaci ve fluidním loţi. Uspořádání je kontinuální, ţiviny proudí přes náplň, metabolity a produkty odváděny. Prostředí je nehomogenní, koncentrace ţivin se mění s výškou náplně, gradient ph, špatné promíchávání. Tyto reaktory se vyuţívají např. Při inhibice produktem (rozdílná koncentrace produktu podél náplně). Mechanicky míchané bioreaktory V mechanicky míchaných submerzních bioreaktorech se procesu opět účastní třífázový systém, plyn-kapalina-pevná fáze, kde plynem je zpravidla vzduch, kapalinou médium a pevnou fází nositelé procesu, buňky, flokuláty, aglutináty atd. Účelem míchání je opět homogenizace, transport ţivin a tepla a v aerobních procesech dispergace bublin aeračního plynu. Při míchání mechanickými míchadly vzniká střihové napětí, které způsobuje rozbíjení bublin a tím zvětšuje mezifázovou plochu. Střihové napětí však rovněţ působí negativně na pevnou fázi, zvláště na nepevné struktury, například vláknité mikroorganismy. 74

75 Pro mechanicky míchané systémy je charakteristická vysoká turbulence a rychlý přestup látky a tepla. U kyslíkově nenáročných, pomalých procesů a střihově citlivých organismů se ale naopak pouţívají nízké rychlosti otáčení, větší plochy míchadel a jejich speciální tvary omezující střiţné síly. Mechanické míchání je vţdy kompromis mezi maximální dodávkou kyslíku a homogenizací a velikostí střihových sil. Obrázek 3.4. Aerovaný míchaný bioreaktor 1 - nádoba bioreaktoru 2 - plášť 3,4 - izolace 5 přívod inokula 6 porty pro ph elektrody 7 - míchadlo 8 aerační věnec 9 ucpávka 10 - převodovka 11 motor 12 vypouštěcí otvor 13 chlazení pláště 14 vzorkovací otvor s připojením páry 15 prosklená plocha (pozorování obsahu) 16 přívod roztoků na úpravu ph a odpěňovadla 17 vstup vzduchu 18 víko 19 přívod média 20 odvod vzduchu 21 porty pro senzory 22 rozbíječ pěny 23 přívod páry 24 tryska Základním systémem pro malé rigidní buňky s vysokou spotřebou kyslíku (bakterie, kvasinky) je však mechanické míchadlo typu disková turbína, 4-6 listů, d (průměr míchadla) asi 0.3 dt (průměr nádoby). Aby docházelo k co největší dispergaci, je aerační věnec umístěn pod nejspodnějším míchadlem. Naopak, aby nedocházelo ke vzniku středového víru a zvýšila se turbulence, je nádoba bioreaktoru vybavena 75

76 míchacími naráţkami, coţ jsou podélné obdélníkové vestavby, zpravidla umístěné pravidelných vzdálenostech po vnitřním obvodu nádoby. Naráţky (zaráţky) pro optimální promíchávání se umisťují v počtu 4-8, d (šířka naráţky) asi 0.1 dt. Typická konstrukce aerovaného míchaného bioreaktoru (CSTR continuous stirred tank reactor) je na Obr Základní typy míchadel Základní typy míchadel jsou vrtulové, vyznačující se vysokou čerpací kapacitou, menšími střiţnými sílami, axiálním tokem čerpané suspense a turbínové, kde vysoké střiţné síly způsobují dispergaci vzduchových bublin a dělicí kotouč zabraňuje zkratovému toku vzduchu kolem hřídele. Čerpací kapacita je omezená. Na Obr. 3.5 a 3.6 jsou základní tvary míchadel. Obrázek 3.5. Turbínová míchadla s různým tvarem a sklonem lopatek. Obrázek 3.6: Míchadla a) vrtulové, b) diskové turbínové s naráţkami, c) diskové turbínové bez naráţek. 76

77 CSTR standardního tvaru je vybaven obvykle více míchadly na společném hřídeli, coţ výrazně zlepšuje homogenizace tanku, vzdálenost míchadel D (průměr nádoby), nejčastější počet je tři. Rychlost míchání je často omezena pouze konstrukčním a materiálovým provedením bioreaktoru, avšak maximalizace otáček není efektivní ani pro homogenizaci a provzdušnění. Velikost míchadla se volí D/DT = (průměr míchadla/průměr tanku), počet naráţek je čtyři a jejich šíře 0.1 DT. Vzdušnění (aerace) podporuje míchání a sniţuje míchací příkon. Poměr mezi příkonem aerovaného tanku (P G ) a neaerovaného tanku (P) vyjadřuje vztah: V G je průtok aeračního plynu, n otáčky míchadla a d jeho průměr. Příkon míchadel (P) je moţno počítat pro newtonské kapaliny podle vztahů: kde P 0 příkonové číslo, ρ hustota, n otáčky, d průměr míchadla, μ dynamická viskozita. Přestup tepla V aerobních míchaných bioreaktorech vzniká teplo exotermickou činností mikroorganismů nebo exotermickými reakcemi, dále třením při míchání a aeraci. Mnoţství uvolněného tepla u aerobních procesů je proporcionální spotřebovanému kyslíku, Q (kj/m 3.s) = Ocr (mmol o 2 /m 3.s) kde Q rychlost produkce tepla, OCR rychlost spotřeby kyslíku 450 kj tepla/mol utilizovaného O2. U submerzních kultur to bývá 3-15 kj/m3.s. Odvod tepla je realizován prostřednictvím aktivního chlazení přes externí plášť či interní vestavby. Při zvětšování měřítka (scale-up) si přestup kyslíku a tepla zaslouţí zvláštní pozornost - větší objem znamená menší chladicí plochu. 77

78 Aerace a přestup kyslíku Aktivní přísun vzduchu do bioreaktoru za současné účinné dispergace vyváří relativně velké mezifázové rozhraní. Hodnotí se pomocí tzv. Stupně dispergace a: kde D b průměr bublin (ideálně 2-3 mm), ε plynová zádrţ. Celkový průtok vzduchu bioreaktorem se nejčastěji klasifikuje jako hodnota vvm volume/volume/minute: Kde v g průtok vzduchu (aeračního plynu), v r objem reaktoru. Přestup kyslíku je základní parametr, který charakterizuje aerobní bioreaktor. Je obvykle vyjádřen koeficientem přestupu hmoty k l a, který je konstantou úměrnosti mezi rychlostí přestupu kyslíku z plynné fáze do kapalné (OTR oxygen transfer rate) a gradientem koncentrací: kde C*,C rovnováţná a aktuální koncentrace kyslíku. Rychlost spotřeby kyslíku mikroorganismy nebo biotransformační reakcí je charakterizována vztahem: kde X koncentrace biomasy, q o2 specifická respirační rychlost, μ specifická růstová rychlost, Y x/o výtěţnost biomasy na kyslík. Rovnováţnou koncentraci kyslíku ovlivňují především fyzikální vlastnosti média - teplota, tlak a charakter kapaliny (koncentrace solí, viskozita). Aktuální koncentraci pak geometrie nádoby - průměr, kapacita, konfigurace a velikost míchadla, příkon, zaráţky, aerace - velikost a umístění distributorů vzduchu, způsob operace, vlastnosti kapaliny (morfologie a koncentrace mikroorganismů, odpěňovací činidla). Ve velkých fermentorech (>5000 L) bývá OTR < 300 mmol/l.h. Zvyšování přestupu kyslíku (OTR) se provádí zvýšením průtoku vzduchu, zvýšením otáček míchadla, zvýšením tlaku v bioreaktoru, zvýšením obsahu kyslíku ve vzduchu. Je však třeba upozornit, ţe vzájemné závislosti jsou nelineární a jsou popisovány poměrně sloţitými modely. 78

79 Kultivační půdy média Kultivační média jsou nezbytná pro kultivaci - růst a metabolismus mikroorganismů. Dále tvoří vnější prostředí, které ovlivňuje fyziologii a chování mikroorganismů a tím ovlivňují výtěţnost, rychlost tvorby produktu a sloţení produktu. Ţiviny obsaţené v médiu jsou potřebné pro růst buněk, získávání energie pro syntézu produktů a zachování buněčné integrity. Pro technologické účely dělíme média na KOMPLEXNÍ a DEFINOVANÁ. Komplexní média obsahují zpravidla všechny potřebné ţiviny v ne zcela přesně definovaném sloţení, coţ je dáno jejich původem. Bývá to organický zdroj ţivin, např. Hydrolyzáty proteinů (peptony), extrakty masa, kvasnic, mléka, různé směsi rostlinných ţivin apod. Definovaná média mají přesně známé sloţení, obvykle roztoky minerálních solí, čisté esenciální ţivných komponent a jeden nebo více zdrojů uhlíku a energie. Médium představuje zdroj stavebního materiálu nebo prekurzorů pro syntézu nových buněčných součástí sloučeniny, které se stanou součástí biomasy, dále zdroj energie - sloučeniny, které se nestávají přímo součástí biomasy, ale slouţí k výrobě energie (jako donory nebo akceptory elektronů). Elementární sloţení všech mikrobiálních buněk je relativně podobné moţnost odhadu obecných poţadavků mikroorganismů na ţiviny a návrh média obsah hlavních prvků (C, H, N, O, S, P). Při návrhu sloţení média je nutno znát biochemii kultivace, jeho případný vliv na metabolismus a fyziologii buněčné populace, dále účel kultivace a průběh DSP. Cena média tvoří přes 50% ceny konečného produktu, je tedy třeba ji zohlednit. Důleţitá je také stálost jeho sloţení. Formulace média je vţdy kompromis mezi nutričními poţadavky, cenou a dostupností sloţek. Elementární chemické sloţení média se určí ze sloţení biomasy a produktu, výtěţnostních koeficientů a doplňkových experimentů. Uhlíkatý substrát - část je oxidována na CO 2 (disimilace), vyuţití takto získané energie je na syntézu biomasy ze zbylé části (asimilace). Poměr asimilované a disimilované části je závislý na stupni redukce C-zdroje. Maximální výtěţnost substrátu - čím více oxidovaný zdroj uhlíku, tím více je ho disimilováno a méně asimilováno odrazí se to v Y X/S. Hlavní elementární sloţky médií jsou obvyklé biogenní prvky. Dalšími sloţkami jsou stopové prvky Na, Mn, Co, Ni, Cu, růstové faktory - esenciální org. sloučeniny, které si buňka neumí sama syntetizovat, vitamíny často kofaktory enzymů, L- aminokyseliny především glutamová, puriny a pyrimidiny - syntéza nukleových kyselin, VODA pitná, deionizovaná, destilovaná, odpěňovadla povrchové napětí, oleje, polyglykoly polymery (PPG). Při přípravě médií je nutno dbát na ph a iontovou rovnováhu. Ke stabilizaci ph se 79

80 uţívají pufry (organické kyseliny, fosfáty, peptony, TRIS, HEPES). Regulace ph se provádí během kultivací, většinou pomocí NaOH, NH 3, H 3 PO 4, H 2 SO 4. Iontová síla i redox potenciál také ovlivňují růst, produkci a produkty. Příprava inokula Průmyslové kultivační procesy začínají stejně jako laboratorní, z čisté kultury produkčního kmene. Kmeny se uchovávají standardním způsobem, lyofilizované, hluboko zmrazené, nebo klasicky přeočkováváním na pevných, mnohdy selektivních půdách. Revitalizace se obvykle provádí v kapalném médiu. Abychom dosáhli potřebného kultivačního objemu, je zpravidla zapotřebí několika stupňů. Všem stupňům před produkčním se říká inokulační, objemový poměr pro převod je 1:10 aţ 1:20, můţe však být i mnohem vyšší; pak je třeba počítat s delší lag fází. V inokulačních stupních je důraz na růst, nikoli produkci, často se pouţívají komplexní média. Stupňů by mělo být co nejméně, mohou způsobit změnu chování nebo charakteru kultury. Sterilizace u bioreaktorů Řada produkčních procesů je aseptických. Sterilita znamená nepřítomnost ţivých organismů, tedy vyjma těch produkčních. Kultivačnímu procesu tedy předchází odstranění veškerých ţivých mikroorganismů ze zařízení a je nutné zabránit vstupu kontaminace po sterilaci. Provádí se tedy sterilizace bioreaktoru a veškerého dalšího zařízení a portů (potrubí, ventily, filtry, příchozí i odcházející vzduch, vzorkovací zařízení, senzory atd.). Kontaminace způsobuje například: Produkci toxinů (bezpečnost produktu, inhibice produkčního kmene) Produkci enzymů (degradace produktu) Sníţení výtěţnosti (spotřeba substrátu) Produkci metabolitů (polysacharidy) Spotřebu části substrátu (výtěţnost). Vlastní sterilizace média a bioreaktoru se provádí: 80

81 ostrou párou min 121ºC, 0.2 MPa horkým vzduchem ºC chemicky ethanol, chlornan sodný, fenol, formaldehyd... UV, X-rays většinou povrchy, prostory ultrafiltrace plyny, roztoky velké bioreaktory in situ (SIP), malé v autoklávu Hodnocení sterility Pouţívá se tzv. D-hodnota sníţení počtu zárodků na 1/10, která závisí na odolnosti mikroorganismu. kde n počet ţivých zárodků, t čas sterilizace, k - konstanta MO pro mokré/suché teplo. Sterilizace vzduchu a odplynů Nutnost sterilizace velkých objemů: Vzdušnění obvykle 1 VVM 10 m 3 reaktor za 48 h m 3 vzduchu Koncentrace MO ve vzduchu 1-10/L vzduchu Ultrafiltrace splňuje všechny poţadavky, pouţívá se ke sterilizaci vzduchu, hydrofobní membránové filtry v patroně, póry 0.1 μm Inokulace Inokulace je aseptické převedení inokula do bioreaktoru vyššího stupně. Je vhodné ji provádět pomocí sterilizovatelného potrubního spojení tanků a čerpat tlakem sterilního vzduchu. Také se pouţívají sterilní inokulační jehly a septa v aperturách ve víku bioreaktoru. V tom případě se pouţívají sterilní hadice a čerpání peristaltickými čerpadly - inokulum tak nepřichází do styku s čerpadlem. 81

82 Základní typy kultivačních procesů Vsádková (batch) Uzavřený systém, není průběţný přítok ţivin ani odvod metabolitů Přítokovaná (fed-batch) Přítok média ano, odvod média ne objem reaktoru není konstantní Kontinuální (continuous cultivation) Otevřený systém, plynulý přítok a odtok média, konstantní objem reaktoru Vsádková kultivace (batch) Jedná se o uzavřený systém, všechny ţiviny i inokulum jsou přivedeny na počátku kultivace a postupně spotřebovávány, dochází k akumulaci biomasy a metabolitů. Objem bioreaktoru je konstantní, zanedbává se změna objemu při úpravě ph, odpěňování, vzdušnění. Fáze vsádkové kultivace: Lag fáze Exponenciální fáze Stacionární fáze Fáze odumírání Mezi jednotlivými fázemi jsou tranzientní stavy Snaţíme se obvykle o minimalizaci lag fáze, prodlouţení a exponenciální fáze. Při produkci ve stacionární fázi se prodluţuje tato. V exponenciální fázi probíhá intenzivní a pravidelný růst lze ho sledovat jako koncentraci buněk nebo biomasy. kde x je koncentrace biomasy, μ růstová rychlost, t čas, x 0 počáteční koncentrace biomasy. Chceme-li proces urychlit (produkt je přímo spojen s růstem), maximalizujeme růstovou rychlost: Sloţení média, teplota, ph, DOT, koncentrace substrátů atd. Mnoţství vytvořené biomasy přímo úměrné mnoţství spotřebované ţiviny výtěţnost (yield): 82

83 Rychlost růstu úměrná rychlosti spotřeby ţiviny a naopak Hodnota y x/s je za různých podmínek různá. Typický průběh vsádkového procesu v exponenciální fázi ukazuje Obr Obrázek 3.7. Vsádkový proces s - substrát, O - rozpuštěný kyslík, P - produkt, X biomasa, μ růstová rychlost. Řízením vsádkového procesu se pokoušíme: Produkce biomasy maximální délka exponenciální fáze růstu Produkce primárního metabolitu prodlouţení exponenciální fáze růstu za současné produkce metabolitu Produkce sekundárního metabolitu krátká exponenciální fáze, prodlouţená stacionární fáze. 83

84 Přítokovaná kultivace (fed-batch) Jedna nebo více ţivin dávkováno do bioreaktoru během kultivace, produkt zůstává v bioreaktoru, V r není konstantní. Řízením rychlosti přítokování limitujícího substrátu lze ovlivnit rychlosti spotřeby substrátu řízení reakčních rychlostí a metabolismu. Výhodou je, ţe řízenou změnou koncentrace ţivin lze ovlivnit výtěţek nebo produktivitu. Ţiviny jsou dodávány během kultivace, neodvádí se médium - objem bioreaktoru roste. Fed-batch kultivace se pouţívá kdyţ nastává nebo je třeba: Substrátová inhibice (methanol, ethanol, kyselina octová, atd.) Hustá kultura vysoká koncentrace buněk Glukosový efekt (over-flow metabolismus) Katabolická represe snadno metabolizovatelný zdroj (glukosa) Optimalizace tvorby metabolitu produkce ak, řízené udrţování nízké koncentrace s Prodlouţení produkční fáze (oddělení produkční a růstové fáze) sekundární metabolity Strategie řízení přítokování Strategie řízení přítoků při fed-batch kultivacích jsou různé, např. Koncentrace substrátu se udrţuje konstantní nebo se mění podle předem připraveného, či adaptivního algoritmu. Pomalý konstantní přítok média vede zpravidla k lineárnímu růstu celkové biomasy, exponenciální přítok média (a v něm limitujícího substrátu) by měl způsobit exponenciální růst. Moţné je i přítokování média podle zvoleného parametru spojeného s růstem biomasy nebo produkcí (zpětnovazebná regulace). Přítokování podle předem daného schématu lze realizovat jako přerušovaný nástřik nebo kontinuálně dle vypočtené funkce. Pokud má přítokování reagovat na stav kultivace pak se vyuţívá zpětná vazba je přímá, podle měření koncentrace substrátu v bioreaktoru, podle toho upraven nástřik nebo nepřímá měření jiných parametrů, které jsou spjaté s metabolismem buňky DOT, ph, CO 2 a O 2 v odplynech atd. Kontinuální kultivace Kontinuální kultivace je otevřený systém, kde dochází k plynulému (nepřetrţitému) dodávání ţivin (média) a zároveň k plynulému odběru média pozměněného metabolickou činností mikroorganismů i s částí biomasy. Rychlost přítoku je rovna rychlosti odtoku, objem bioreaktoru je konstantní. K rozmnoţování 84

85 mikroorganismů dochází za podmínek blíţících se optimu. Základním a nejméně náročným typem kontinuální kultivace je chemostat: V chemostatu je konstantní rychlost přítoku média f a konstantní zřeďovací rychlost d, rychlost přítoku substrátu je tedy rovna rychlosti spotřeby substrátu a mikroorganismy si podle podmínek nastaví konstantní μ a konstantní X. Dalšími typy kontinuálních kultivací jsou např. Turbidistat, kde je konstantní turbidita (koncentrace biomasy) a mění se D (automatická regulace), nebo auxostat, kde je konstantní parametr spjatý s růstem mění se D (nutristat: S=konst, oxistat: DOT=konst, CO 2 stat: CO 2 =konst). Optimalizace bioprocesu Hlavní faktory, které určují kvalitativní i kvantitativní výsledky bioprocesů jsou: Konstrukce a/nebo selekce produkčního kmene Optimalizace sloţení média Výběr typu kultivace Podle optimalizovaného parametru, technických moţností a dalších kritérií Optimalizace kultivačních parametrů (ph, teplota, aerace, míchání...) Optimalizace složení média Prvním krokem je určení kvalitativního a semikvantitativního sloţení média. Za tím účelem se provádějí baňkové pokusy a ke sníţení počtu experimentů se vyuţívají optimalizační metody, např. Experimentální design odvozený od response surface methodology, optimal či central composition design. Velmi důleţitá je ekonomika sloţení média, zvláště v produkčních stupních. Dalším krokem je určení kvantitativního sloţení média, kde se vychází z experimentů v laboratorním fermentoru a vhodného strukturovaného modelu s bilancí procesu. Matematický model procesu nebo zařízení zahrnuje vztahy popisující jeho chování v čase, je tvořen diferenciálními a nelineárními rovnicemi. Základem bývá bilance: VSTUP + ZDROJ = VÝSTUP + AKUMULACE 85

86 Model procesu či zařízení je pro reálné pouţití třeba identifikovat, určit hodnotu konstant a parametrů. Pouţívají se metody shody experimentu s předpovědí modelu, např. Aproximace empirických dat metodou nejmenších čtverců. Optimalizačními kritérii jsou pak extrémy funkcí, kritérium optimalizace nazýváme účelovou funkcí. Optimalizované proměnné jsou obvykle μ, π, Y P/X, Y P/S. Optimalizace kultivačních parametrů Základními kultivačními parametry jsou: Teplota ph Optimální růstová teplota kmene, lze vyuţít pro změny rychlosti růstu a produkce Optimální růstové ph kmene, lze omezit kontaminaci, vliv sloţení média, indikátor metabolismu Aerace (řízení DOT) Podle metabolismu produkce, limitace kyslíkem v různých fázích, řízení dostupnosti energie, změny metabolismu Monitoring a automatizace Prvky zajišťující monitoring a automatizační hardware a software jsou v dnešní době jiţ konstrukčními součástmi bioreaktorů. Reaktory jsou vybaveny senzory a zařízeními pro měření základních stavových veličin, jako jsou ph, teplota, do, redox, dco2, odplyny, x, s, p a pro měření a řízení základních procesních parametrů, jako jsou otáčky míchadla, průtok vzduchu, tlak, přítoky. Ještě v nedávné době to bylo realizováno prostřednictvím analogových měřících a řídících jednotek, dnes je standardem ddc (direct digital control) realizované plc (procesními počítači. S nimi spolupracují nadřazené monitorovací, archivační a řídící systémy. Základní regulace chodu bioreaktoru se dotýká: ph automatizované dávkování H + a OH - Teplota dvojitý plášť, pára, tepelná média DO (koncentrace rozpuštěného kyslíku Otáčky míchadla asynchronní elektromotory, frekvenční měniče Průtok vzduchu - kompresory, turbodmychadla, škrtící regulace podle MS 86

87 (hmotová spektrometrie) měření Tlak tenzometrická čidla, regulace na výstupu podle SP (set-point, ţádaná hodnota) Přítokování - Tlakové nebo peristaltické pumpy, měření nejpřesněji váţením reaktoru nebo zásobníku. Kultivace rekombinantních mikroorganismů Prokaryotní expresní systém E. coli Dosud nejvíce vyuţívaný prokaryotní expresní systém, zejména pro enzymy a proteiny je prokaryotní expresní systém E. coli. Produkce proteinů probíhá v cytoplasmě a periplasmatický prostor, k dispozici je mnoho expresních vektorů a promotorů. Nevýhodami jsou nestabilita vektorů, poruchy v iniciaci translace a elongace, nestabilita mrna a toxicita produktů pro hostitelskou buňku. Kultivace rekombinantní E. coli má ale řadu výhod, lze kultivovat do vysoké hustoty (HCDC) (fed-batch), lze vyuţít konstitutivní i regulované exprese (regulace promotoru negativně represí nebo pozitivně indukcí). Obvyklou kultivační strategií je v první fázi nárůst biomasy, v další indukce exprese. Rizikem je moţná špatná konformace proteinů (folding), agregace za vzniku inkluzních částic. Obvykle se to řeší sníţením kultivační teploty redukce rychlosti syntézy proteinů, správné sbalení. Doba kultivace je závislá na kmeni a médiu, indukuje se často ve vrcholící exponenciální fázi, vetšinou se tak získá maximum biomasy. Jako strategie se uţívá batch i fed-batch. Doba exprese je závislá na kmeni a médiu, v produkční fázi dochází ke zpomalení růstu vliv niţší teploty a a probíhající exprese. Bývá nutné experimetální stanovení optimálního lineárního přítokování. Samovolné zvýšení růstové rychlosti často znamená ztrátu plasmidu. Kultivaci je třeba ukončit před přechodem k degradaci produktu. Obvyklá doba hodin. Eukaryotní expresní systém - Pichia pastoris Eukaryotní expresní systém je mladší generace, velmi populární, pracuje v methylotrofní kvasince pichia pastoris. Disponuje silným promoterem pro alkoholoxidasu AOX, výhodou je snadná indukce a regulace. Kvasinka má silně respirativní růst, kultivace se daří v hustých kulturách. Pouţívá se pro expresi velkých proteinů (>50 kd). Výhodou je rovněţ posttranslační modifikace glykozylace, odstranění signálních peptidů, tvorba disulfidových můstků. 87

88 Kultivace rekombinantní P. pastoris je třístupňový proces, proto je zde nutnost optimalizace vyšší neţ jinde. První fází je batch na glycerolu, kdy se vyprodukuje biomasa za současné represe genové exprese. Následuje adaptační fáze první fed-batch, kdy je glycerol přítokován rychlostí limitující růst a poslední je produkční fáze druhý fed-batch, kdy je methanol (směs methanol+glycerol) přítokován v závislosti na fenotypu, dochází k indukce exprese. Použité zdroje Kultivační techniky, sylabus ÚKCHB VŠCHT Bioinţenýrství kvasných procesů (Mojmír Rychtera a Jan Páca, VŠCHT Praha 1987) Fyziologie bakterií (František Kaprálek, SPN 1986) Bioinţenýrství (František Kaštánek, Academia 2001) 88

89 4. SEPARACE BIOMASY A HRUBÁ IZOLACE CÍLOVÝCH MOLEKUL Separace biomasy od kultivačního média Ssedimentace Filtrace Tangenciální filtrace Průtoková centrifugace Spůsoby dezintegrace biomasy a izolace produktu z ní Fyzikální metody dezintegrace Chemické metody dezintegrace 89

90 5. METODY PURIFIKACE PRODUKTŮ Selektivní precipitace Rozpustnost biomakromolekul ve vodném roztoku je ovlivněna jejich solvatací molekulami vody, která můţe být ovlivněna změnou hodnoty ph, teploty, iontové síly, přídavkem solí či organických látek rozpustných ve vodě. Kombinací různých sráţecích činidel tak byly vytvořeny postupy pro sráţení, precipitaci různých skupin makromolekul. Pro úspěšnost precipitace je důleţité zvolit nejen vhodné činidlo, ale i vhodnou výslednou koncentraci činidla v precipitovaném vzorku. Změnou koncentrace precipitačního činidla v roztoku se totiţ změní specifičnost procesu precipitace. Globulární proteiny, které jsou rozpustné ve vodných roztocích, jsou ve své nativní formě uspořádány tak, ţe rezidua polárních aminokyselin jsou orientována vně molekuly proteinu, zatímco nepolární vedlejší řetězce směřují do nitra molekuly, a tak nejsou ve styku s vysoce polárním vodným prostředím. Stabilita nativní konformace je dána jednak hydrofobními interakcemi uvnitř molekuly, jednak inter- i intramolekulárními vodíkovými vazbami vně molekuly. Dojde-li k narušení rovnováhy mezi jednotlivými interakcemi, je molekula proteinu denaturována a dochází k precipitaci tohoto proteinu. Tato precipitace můţe být jak vratná reverzibilní, tak nevratná ireverzibilní. Jedna z reverzibilních metod precipitace proteinů je zaloţena na skutečnosti, ţe nejniţší rozpustnost vykazuje protein ve svém izoelektrickém bodu. Voda je vysoce polární rozpouštědlo, a tudíţ se v ní velmi dobře rozpouští látky s elektrickým nábojem. V izoelektrickém bodu jsou kladné i záporné náboje vyrovnány, takţe molekula jako celek je bez náboje, coţ sniţuje její rozpustnost ve vodě. Opětovnou změnou ph lze protein opět denaturovat a převést tak zpět do roztoku. Patrně nejpouţívanější metoda sráţení proteinů vyuţívá síranu amonného. Velkou výhodou (NH 4 ) 2 SO 4 je moţnost jej připravit v dostatečně velkých koncentracích pro sráţení takřka všech proteinů, takřka nepatrná produkce tepla při přídavku jeho roztoku, niţší hustota jeho roztoku umoţňující odstranění precipitátu centrifugací a v neposlední řadě i skutečnost, ţe jeho koncentrovaný roztok je bakteriostatický. Vzhledem ke skutečnosti, ţe je nutné jej pouţít pro sráţení proteinů, které nejsou příliš zředěné, zařazuje se precipitace pomocí (NH 4 ) 2 SO 4 obvykle mezi počáteční kroky při izolaci proteinů. Precipitát lze od roztoku oddělit centrifugací, následně rozpustit ve vhodném pufru a poté oddělit (nh 4 ) 2 so 4 gelovou filtrací či ultrafiltrací. Specifičtější precipitace lze dosáhnou postupným zvyšováním koncentrace (NH 4 ) 2 SO 4, rozdílné proteiny jsou totiţ precipitovány při rozdílných koncentracích (NH 4 ) 2 SO 4. 90

91 Tepelná denaturace naproti tomu představuje ireverzibilní metodu precipitace. Tímto způsobem lze vysráţet poměrně širokou skupinu neţádoucích proteinů, které se následně oddělí centrifugací. Obvykle spočívá zmíněná metoda v zahřívání míchaného roztoku proteinu na vodní lázni na teplotu 90 C. Nukleové kyseliny jsou vůči ireverzibilní precipitaci odolnější neţ proteiny. Stejně jako proteiny jsou i nukleové kyseliny polární makromolekuly, které tak lze vysráţet změnou ph či přídavkem méně polárních organických rozpouštědel. Nejpouţívanější precipitační metodou pouţívanou pro sráţení nukleových kyselin je precipitace alkoholem. Pouţívá se zejména etanol či isopropanol v přítomnosti 0,1 aţ 0,5 m octanu sodného či draselného o hodnotě ph 5,0. Následkem konformačních změn nukleových kyselin dochází k jejich precipitaci. Při vyšších koncentracích probíhá precipitace kvantitativně i při 25 c, zatímco při niţších koncentracích nukleových kyselin je pro jejich kvantitativní precipitaci nutná inkubace v mrazu. Pro velmi zředěné roztoky nukleových kyselin lze pouţít precipitaci pomocí 10% polyethylenglykolu Jedná se o časově náročnější metodu, která však podobně jako sráţení proteinů síranem amonným umoţňuje frakční precipitaci. Nukleové kyseliny vyšších molekulových hmotností se totiţ sráţí jiţ při niţších koncentracích polyethylenglykolu, zatímco nukleové kyseliny s niţší molekulovou hmotností se stále nachází v roztoku. Chromatografické metody Velmi účinnou separační metodou, která našla široké uplatnění jak při izolaci látek ze směsí, tak při stanovení rozličných látek v široké škále vzorků, je chromatografie. Ta je zaloţena na rozdělení látky mezi dvě nemísitelná prostředí, stacionární fázi ukotvenou na pevném nosiči-matrici a mobilní fázi protékající kolem stacionární fáze. Bylo vyvinuto mnoho chromatografických metod, které se od sebe mnohdy výrazně liší. Mohou být vhodné pro separaci látek nízkomolekulárních i makromolekul. Separaci lze provádět podle rozdílné molekulové hmotnosti, polarity, izoelektrického bodu či dle přítomnosti funkční skupiny či značky, která specificky interaguje se stacionární fází. Podle prostorového uspořádání stacionární fáze dělíme chromatografii na plošnou a sloupcovou. Plošná chromatografie má stacionární fázi uspořádanou v ploše, jedná se buď o tenkovrstvou chromatografii (TLC), u níţ je stacionární fáze umístěna na tenké vrstvě, např. Na hliníkové folii, nebo o papírovou chromatografii (PC), kde je stacionární fáze voda adsorbovaná v pórech papíru. Plošná chromatografie je nenáročná na laboratorní provedení, papírovou chromatografii lze provést i s obyčejným savým papírem, ovšem v současné době ztrácí na svém významu. Slouţí zejména pro relativně rychlou detekci kontaminantů či drog, např. V moči, a některých reakčních produktů v organické chemii. 91

92 U sloupcové chromatografie tvoří stacionární fáze náplň kolony nebo tenké kapiláry. Mobilní fáze protéká kolonou nebo kapilárou a unáší s sebou vzorek aţ na konec kolony. Za kolonou či kapilárou se stacionární fází se nachází detektor, který zaznamená průchod vzorku. Svým významem sloupcová chromatografie výrazně převyšuje chromatografii plošnou. Mobilní fází můţe být u sloupcové chromatografie plyn, pak hovoříme o plynové chromatografii (GC), nebo kapalina v případě kapalinové chromatografie (LC). V případě plošné chromatografie je mobilní fází kapalina. GC má velký význam zejména v analytické chemii pro separaci plynných a těkavých nízkomolekulárních látek. Příkladem jejího vyuţití je stanovení obsahu alkoholu v krvi. Pro GC se jako nosiče stacionární fáze vyuţívají tenké kapiláry, jejichţ délka dosahuje i několika desítek metrů. Naproti tomu LC lze pouţít pro separaci vysokomolekulárních i nízkomolekulárních látek. Stacionární fáze můţe být rovněţ v tenké kapiláře, ale i v koloně, jejíţ vnitřní průměr můţe dosáhnout i několika cm. Kapalina tvořící mobilní fázi se můţe pohybovat kolonou buď vlivem gravitace, nebo pomocí pumpy. Pouţitím pumpy se zvyšuje zpětný tlak stacionární fáze a rychlost průtoku mobilní fáze. Sloţení mobilní fáze můţe být při celé separaci konstantní, nebo se můţe v průběhu separace měnit. V závislosti na tom hovoříme o isokratické, krokové (jednorázová změna) či gradientové (postupná změna mobilní fáze) eluci. Po ukončení eluce je třeba promýt kolonu původní mobilní fází, aby byla připravena pro další pouţití. Kapalinovou chromatografii je moţné rozdělit na mnoho rozmanitých metod. Tabulka 5.1. Nejběžnější typy kapalinové chromatografie Typ LC Adsorpční chromatografie Afinitní chromatografie Gelová chromatografie Hydrofobní chromatografie Iontově výměnná chromatografie Reverzní chromatografie Princip Adsorpce na povrchu pevné stacionární fáze Selektivní interakce analytu se stacionární fází (např. antigen protilátka) Zadrţování malých molekul jejich vstupem do pórů gelu Hydrofobní interakce makromolekul se stacionární fází ve vodném prostředí Interakce iontů s opačně nabitými skupinami stacionární fáze (zvlášť pro anionty a kationty) Záchyt nepolárních látek nepolárními řetězci stacionární fáze v polárním organickém prostředí Důleţitou součástí sloupcové chromatografie je detektor. Ten se umisťuje za kolonu a umoţňuje detekovat a stanovit látky opouštějící kolonu a určit čas potřebný k jejich průchodu kolonou eluční čas. V chromatografii se pouţívá mnoho typů 92

93 detektorů. Nejčastěji se pouţívá spektrofotometr, hmotnostní spektrometr, voltmetr, ampérmetr, vodivostní detektor, fluorescenční detektor a další. Volba správného detektoru je takřka stejně důleţitá jako volba správné chromatografické metody. K detektoru bývá připojeno záznamové zařízení, obvykle počítač nebo posuvný zapisovač, které ukládá naměřená data. Jejich grafickým vyjádřením je chromatogram zobrazující závislost signálu detektoru na čase. Afinitní purifikace Afinitní chromatografie je nejefektivnější chromatografická metoda, přestoţe není moţné ji aplikovat na všechny problémy. V praxi se při purifikacích obvykle jedná o poslední (ne-li jediný) purifikační krok. Vyuţívá biochemicky specifickou interakci mezi dvěma druhy látek. Jedná se např. O dvojici antigen protilátka, enzym substrát, enzym koenzym či protein specifický ligand. Lze vyuţít i tak vysoce specifickou interakci, jako je interakce komplementárních řetězců nukleových kyselin. Základním předpokladem afinitní chromatografie je schopnost matrice kovalentně navázat ligandy, které se specificky váţí na purifikovanou látku. Při purifikaci polymerních produktů z geneticky modifikovaných organismů se často vyuţívá specifická značka určená pouze pro usnadnění purifikace. Příkladem jsou proteiny obsahující na c-konci řetězce šestkrát his, které jsou specificky zachyceny kyselinou nitrilotrioctovou koordinačně spojenou s Ni 2+ nebo Co 2+. Mnoho postupů je natolik specifických, ţe lze z buněčného extraktu získat v jediném kroku pomocí afinitní chromatografie poţadovanou látku. Některé ligandy a jimi zachycované molekuly jsou uvedeny v Tab Při afinitní chromatografii se vyuţívají dvě mobilní fáze. Jedná se o ekvilibrační a eluční pufr. Ekvilibračním pufrem je kolona promývána před nanesením vzorku, který by měl být rozpuštěn ve stejném či podobném pufru. Po nanesení vzorku je dále na kolonu čerpán ekvilibrační pufr do doby, neţ dojde k eluci nezachycených látek. Po eluci nezachycených látek dojde k zapojení elučního pufru, slouţí k vymytí látek specificky zachycených na koloně. Jeho eluční síla je oproti ekvilibračnímu pufru výrazně vyšší díky obsahu stejného ligandu, který zachycuje purifikovanu látku či jeho analogu. Tento volný ligand kompetuje (soutěţí) s ligandem vázaným k matrici o vazbu do vazebného místa zachycené molekuly, a tak ji uvolňuje z vazby s ukotveným ligandem. Jinou moţností zvýšení eluční síly bývá změna ph, pouţití chaotropních solí či organických látek narušujících vazbu ligandu s purifikovanou molekulou. Např. Proteiny s histidinovou značkou lze z kolony s obsahem Ni 2+ či Co 2+ vymýt pomocí pufru s imidazolem. Změna ph či pouţití chaotropních solí můţe vézt k poškození purifikovaných komponent. Existují i protokoly, v nichţ se nepouţívá kroková, ale gradientová eluce. 93

94 Je-li purifikovaná látka vázána na kotvený ligand příliš pevně, bývá prospěšné po aplikaci elučního činidla na kolonu zastavit jeho tok a nechat je chvíli působit. Obvykle se tok zastavuje na 10 minut aţ 2 hodiny. Afinitní chromatografii lze rovněţ pouţít pro selektivní odstranění vybraných kontaminantů. V tomto případě se vybírá stacionární fáze tak, aby zachytila tuto nečistotu, která je po získání frakce se vzorkem vymyta elučním pufrem dle výše zmíněného principu. Tabulka 5.2. Některé ligandy používané při afinitní chromatografii Ligand Arginin Kyselina nitriloctová v komplexu Co 2+ či Ni 2+ Polymyxin Heparin Protein A, protein G 5 -AMP Nukleové kyseliny Lektin 2,5 -ADP Zachycované molekuly Prothrombin, plasminogen Proteiny s histidinovou značkou Endotoxin Proteiny vázající nukleové kyseliny Imunoglobin G ATP dependentní kinasy, NADP + dependentní enzymy Komplementární řetězce nukleových kyselin, histony Polysacharidy, glykoproteiny NADP + dependentní enzymy Iontově výměnná chromatografie Iontově výměnná chromatografie, nazývaná často téţ iontoměničovou chromatografií, je zaloţena na interakci iontů vzorku a mobilní fáze s opačně nabitými skupinami ve stacionární fázi. Podle náboje zadrţovaných iontů dělíme iontoměniče na anexy a katexy. Anexy zachycují anionty a jejich stacionární fáze tudíţ obsahuje kladně nabité skupiny, zatímco katexy zachycují kationty. Díky skutečnosti, ţe mnoho biomakromolekul nese v nativním stavu náboj, jehoţ hodnota i znaménko se při změně ph postupně mění, je iontoměničová chromatografie významnou purifikační metodou pro separaci proteinů, polysacharidů a dalších biopolymerů. Tyto polymery totiţ obsahují mnoho protonizovatelných skupin, přičemţ jejich míra protonizace je závislá na hodnotě ph. Jako nosiče stacionární fáze se vyuţívá mnoho rozličných polymerů. Z přírodních polymerů se jedná o celulosu, dextran či agarosu, mezi syntetické nosiče patří polystyren, polyakrylamid a mnoho dalších. Tyto nosiče jsou derivatizovány nabitými skupinami. Slabé anexy obsahují obvykle primární či sekundární aminoskupinu, silné anexy kvartérní aminoskupinu. Záporný náboj slabých katexů je tvořen karboxylovými 94

95 skupinami, zatímco u silných katexů se vyuţívá síranová skupina. Slabé katexy potřebují mobilní fázi s ph kolem 4, zatímco slabé anexy s ph kolem 11. Přiblíţí-li se ph k neutrální hodnotě, ztrácí tyto katexy i anexy svůj náboj. Naproti tomu silné katexy i anexy je moţné pouţít při širším rozsahu ph. Dostupné jsou ionexy s pracovním rozsahem jedné jednotky i deseti jednotek ph. Před nanesením vzorku je nutno promýt kolonu mobilní fází, která bude pouţita pro nanášení vzorku a promývání kolony. Hodnota ph mobilní fáze vytékající z kolony musí odpovídat hodnotě mobilní fáze vstupující do kolony. V opačném případě nelze nanést vzorek na kolonu. Eluční síla mobilní fáze závisí na jejím ph a na její iontové síle. V případě změny ph je změna iontové síly způsobena změnou v ionizaci separovaných látek. Slabé kyseliny se v bazickém prostředí vyskytují ve formě aniontu a v kyselém ve formě neutrálních molekul. Podobně je tomu u slabých bází. Při zvýšení iontové síly mobilní fáze se k nabitým skupinám stacionární fáze dostává větší mnoţství iontů, které vzájemně soutěţí (kompetují) o moţnost iontové vazby s touto skupinou. Mobilní fáze je u iontově výměnné chromatografie buď gradientová, či se skokovým zvýšením eluční síly, jak je tomu u afinitní chromatografie. Gradientová mobilní fáze s postupně rostoucí či klesající hodnotou ph je vyuţívána při dělení látek dle izoelektrického bodu. Sbíráním frakcí mobilní fáze tak můţeme získat separované látky vzorku tak, jak postupně s měnícím se ph ztrácí svůj náboj díky vyrovnání počtu kladně a záporně nabitých skupin. Při volbě podmínek iontově výměnné chromatografie je nutné uváţit mnoho faktorů, které úţí moţný výběr experimentu. Jedná se o náboj separovaných molekul a jeho velikost. Molekula s jedním záporným nábojem je eluována při niţší koncentraci chloridů v mobilní fázi neţ molekula se dvěma či třemi náboji. Dále je nutno vzít v úvahu izoelektrický bod hodnotu ph, při které je celkový náboj molekuly, obsahující kladně i záporně nabité skupiny, nulový. Kladně nabitá molekula s vyšší hodnotou isoelektrického bodu je tudíţ eluována při vyšší hodnotě ph. Gelová filtrace Gelová filtrace umoţňuje separovat od sebe látky na základě jejich rozdílné molekulové hmotnosti a je zaloţena na existenci přesně definovaných či různě velkých pórů v částicích gelu. Malé molekuly při průchodu kolem částic gelu vstupují difuzí do zmíněných pórů a jsou tak zadrţovány, zatímco velké molekuly se do těchto pórů nedostanou a jsou vylučovány z kolony. Proto se pro gelovou filtraci pouţívá i označení gelová permeační (zadrţovací) či exlusní (vylučovací) chromatografie. 95

96 Gelová filtrace je pouţitelná zejména pro oddělení nízkomolekulárních látek od látek vysokomolekulárních, např. Pro odsolení roztoků proteinů, separaci makromolekul podle jejich molekulové hmotnosti a určení molekulové hmotnosti makromolekul. V poslední zmiňované funkci ji však stále častěji nahrazuje hmotnostní spektrometrie. Stacionární fází u gelové filtrace je kapalina uvnitř pórů gelu. Ideální nosič stacionární fáze, který vytváří gelové částice, by měl být hydrofilní polymer bez náboje, maximálně inertní a pevný. V praxi se pouţívají především přírodní polymery na bázi agarosy či dextranu. Komerčně dostupné jsou gely s různým stupněm zesíťování polymeru, které zvyšuje jeho pevnost a rovněţ určuje velikost pórů gelu. Velikost těchto pórů určuje rozsah velikosti částic, které lze daným gelem od sebe oddělit. Gely se prodávají pod různými komerčními názvy. Jedním z nejpopulárnějších materiálů je Sephadex, dextran zesíťovaný pomocí epichlorhydrinu. Sepharosa je vyráběna z agarosy, polymeru D-galaktosy a 3,6-anhydro-L-galaktosy. Oproti Sephadexu je Sepharosa vhodná i pro dělení větších makromolekul aţ do molekulové hmotnosti 40,000 kda, u Sephadexu je to maximálně 750 kda. Krom materiálu a velikosti pórů se dodávané nosiče liší i velikostí částic, která se pohybuje od 10 do 300 μm. Superdex a Superosa odpovídají svým materiálovým sloţením Sephadexu, resp. Sepharose. Oproti nim poskytují lepší výsledky, avšak jsou výrazně draţší. Pouţívají se tedy jen v případech, kdy je kladen velký důraz na kvalitu separace. Vzhledem k tomu, ţe zde nedochází ke specifickým interakcím, ani není potřeba měnit náboj separovaných molekul, pouţívá se isokratická mobilní fáze. Důleţité však je, aby mobilní viskozita mobilní fáze nebyla výrazně niţší neţ viskozita vzorku; doporučuje se, aby byla minimálně poloviční. To vytváří problémy zejména při obsahu glycerolu ve vzorku, a nikoliv v mobilní fázi či při vysoké koncentraci biopolymerů. Gelová filtrace je často pouţívaná analyticky, zejména pro stanovení molekulové hmotnosti nativních proteinů. V tomto případě se experiment provádí nejméně dvakrát. Jednou pro kalibraci, kdy se jako vzorek pouţije směs standardních proteinů známé molekulové hmotnosti, a minimálně jednou při samotném měření molekulové hmotnosti vzorku. Do grafu se pak zanáší dekadický logaritmus molekulové hmotnosti polymeru na osu x a poměr elučního objemu k mrtvému objemu na osu y. Z regresní přímky se pomocí rovnice V e /V 0 = - a.log M r + b, ve které jsou a a b jsou empirické konstanty, vypočítá molekulová hmotnost polymeru. Hydrofobní chromatografie Mnohé molekuly obsahují na svém povrchu nepolární hydrofobní oblasti. Rozdílů mezi nepolárním charakterem molekul se vyuţívá i pro jejich separaci. Nízkomolekulární 96

97 látky jsou na základě toho separovány adsorpční chromatografií, zatímco pro makromolekuly se pouţívá hydrofobní chromatografie (HIC). Tento typ chromatografie vyuţívá jako nosiče stacionární fáze hydrofilní gely, na nichţ jsou navázány nepolární alkylové či arylové skupiny. Jedná se často o methyl, oktyl, oktadecyl či fenyl. Tím je hydrofobní chromatografie shodná s chromatografií na reverzní fázi. Obě metody se však liší stupněm substituce hydrofilního gelu. V případě hydrofilní chromatografie je koncentrace substituovaných skupin v rozmezí od 10 do 50 μmol.ml -1 gelu, u chromatografie na reverzní fázi je substituce přibliţně o řád vyšší. Rovněţ eluční roztok se u obou chromatografií liší. Pro hydrofobní chromatografii je pouţíván roztok niţší iontové síly a bez organických rozpouštědel typických pro chromatografii na reverzní fázi. Vazba proteinu k matrici závisí na mnoha faktorech. Z vlastností matrice se jedná především o její funkční skupiny a stupeň derivatizace, z vlastností polymerů pak zejména o velikost a charakter hydrofobní části povrchu. Proteiny s větší hydrofobní částí povrchu jsou vázány těsněji neţ proteiny s menším hydrofobním regionem. Těsnější vazbu k hydrofobním regionům vykazují alkylové substituenty, u kterých se těsnost vazby zvyšuje s délkou řetězce. Těsnější vazby se docílí i pouţitím matrice s vyšším stupněm derivatizace. Matrice pro hydrofobní chromatografii dosahují velké kapacity záchytu polymerů. Podle typu matrice, mobilní fáze a polymeru se můţe na 1 g gelu zachytit aţ 50 mg polymeru. Vznik a pevnost hydrofobních vazeb polymerů k matrici velmi závisí na pouţité mobilní fázi. Vyšší koncentrace soli zvyšuje pevnost vazby polymerů k matrici. Mimo koncentraci je důleţitá i volba konkrétní soli v mobilní fázi. Pro kationty i anionty byla vypracována Hofmeisterova řada iontů: NH 4 + > K + > Na + > Li + > Mg 2+ > Ca 2+ PO 4 3 > F ~ SO 4 2 > HPO 4 2 > CH 3 COO > Cl > Br > NO 3 > I > SCN. Tato řada srovnává ionty podle jejich podpory vazby polymeru k matrici. Obě uvedené řady obsahují jen několik významnějších iontů, ačkoliv byl studován vliv mnoha jiných, které byly rovněţ zařazeny do Hofmeisterovy řady. Ionty v levé části řady navíc zvyšují stabilitu proteinů. Obojí je dáno zvýšením organizovanosti molekul vody v okolí iontu, kdy voda obaluje jednotlivé ionty v několika vrstvách. Na průběh hydrofobní chromatografie má vliv i hodnota ph mobilní fáze, avšak vliv změny ph je často nepředvídatelný. Mobilní fází je obvykle pufr s obsahem vhodné soli, často se jedná o fosforečnanový pufr nastavený na ph 7,0 s 1M (NH 4 ) 2 SO 4. Eluce se zajišťuje 97

98 postupným sniţováním koncentrace soli. Často je navíc usnadňována přídavkem organických látek, zejména glycerolu či neionogenních detergentů. Ultrafiltrace a dialýza nízkomolekulárních kontaminant Pro odstranění nízkomolekulárních komponentů, např. Síranu amonného z precipitace proteinů, se pouţívají dvě podobné metody, dialýza a ultrafiltrace. Obě metody jsou zaloţeny na stejném principu. Jedná se o průchod malých molekul přes membránu s póry s přesně definovanou velikostí. Ta určuje, jak velké molekuly jsou membránou zachyceny a jak velké molekuly jsou schopny projít přes membránu. Tato hranice je důleţitou charakteristikou membrány, kterou je nutné vzít při volbě membrány v úvahu a je označována jako cut-off value. Její hodnota se udává v kda a je míněna pro globulární proteiny, které při vyšší molekulové hmotnosti prochází přes membránu jen velmi pomalu, nebo neprochází vůbec. Základní rozdíl mezi oběma metodami spočívá v síle, která pohání transport molekul přes membránu. V případě dialýzy se jedná o prostou difuzi přes membránu, zatímco v případě ultrafiltrace je průchod roztoku přes membránu poháněn vnějším tlakem. Ultrafiltrace je proto rychlejší neţ dialýza. Dialýza. Nejjednodušším provedením dialýzy je pouţití dialyzačního střívka naplněného dialyzovaným roztokem, které se vloţí do nádoby s dialyzačním roztokem, do kterého se difuzí přesouvají nízkomolekulární komponenty. Vzhledem k vyšší koncentraci rozpuštěných látek v dialyzovaném roztoku uvnitř střívka můţe zároveň dojít ke vstupu rozpouštědla do střívka a následnému nárůstu jeho objemu. Proto je nutné plnit střívko jen částečně. Dialyzační roztok by měl obsahovat pufr, který stabilizuje jeho ph na poţadované hodnotě. Rychlost difuze lze určit pomocí Fickova zákona. Podle něj záleţí na ploše, přes kterou difuze probíhá, koncentračním gradientu a difuzní konstantě závislé na velikosti a tvaru částice. Dialýza je poměrně zdlouhavá metoda, která probíhá obvykle 12 aţ 24 hodin. Ukončení dialýzy lze detekovat měřením konduktivity dialyzačního roztoku. Dialýzu lze urychlit výměnou dialyzačního roztoku za čistý. Membrány a střívka pro dialýzu se obvykle vyrábí z celulosy a jejich hodnota cutoff se pohybuje v rozmezí 1 aţ 50 kda. Pro dialýzu malých objemů do 1 ml lze pouţít buď komerčně vyráběné mikrodialyzační komůrky, nebo je moţné je vyrobit přímo v laboratoři z ependorfových trubiček odstraněním víčka a překrytím jejich konců dialyzační membránou, kterou je nutné dobře upevnit. 98

99 Dialýzu lze pouţít i pro zakoncentrování roztoku makromolekul. V tomto případě se vyuţije polyetylen glykol přidaný do dialyzačního pufru, který postupně nasává vodu a zvětšuje svůj objem. Pro odstranění nízkomolekulárních látek lze kromě dialýzy pouţít i obdobnou metodu, ultrafiltraci či gelovou filtraci. Ty jsou sice rychlejší, ale rovněţ náročnější na laboratorní vybavení a zručnost. Ultrafiltrace. Ultrafiltrace se ve svém principu podobá dialýze do té míry, ţe je moţné pro ni pouţít dialyzační střívko umístěné v nádobě připojené k vakuové pumpě. Přesto je výhodnější pouţít membránu určenou přímo pro ultrafiltraci. Membrána pro ultrafiltraci se skládá ze dvou vrstev. První, obrácená směrem k ultrafiltrovanému roztoku, je tenká a obsahuje póry s přesně definovanou velikostí. Druhá vrstva je širší a obsahuje větší póry, jejichţ velikost jiţ nemusí být přesně určena. Při sestavování ultrafiltrační komůrky je důleţité dbát na správnou orientaci membrány; strana přivrácená směrem k roztoku bývá obvykle hladší a při pohledu proti světlu se více leskne. V současnosti se vyrábí různé druhy membrán pro ultrafiltraci. Jejich hodnota cutoff se pohybuje v rozmezí od 0,5 kda po 1000 kda (membrána Millipore PCXK). Jednotlivé membrány se od sebe liší i materiálem, ze kterého jsou vyráběny. Je moţné zakoupit membránu z acetátu celulosy, regenerované celulosy, hydrofilních polymerů, syntetických polymerů či inertních polymerů. Do pórů membrány jsou samozřejmě tlačeny i molekuly, jejichţ hmotnost přesahuje hodnotu cut-off. Menší z nich mohou velmi pomalu projít přes membránu, jiné se však v pórech zapříčí a ucpou je. Aby k tomu nedocházelo, je při kaţdé ultrafiltraci pouţito magnetické míchadlo. Jedná se o oblý tyčový magnet, který se vlivem otáčení magnetu v míchačce, na kterou je ultrafiltrační komůrka poloţena, otáčí a zajišťuje tak míchání kapaliny v ultrafiltrační komůrce. Elektromagnetické míchadlo se samozřejmě spolu s míchačkou nevyuţívá jen při ultrafiltraci, ale všude tam, kde je třeba zajistit míchání roztoku. Na rozdíl od dialýzy je při ultrafiltraci pro urychlení procesu rozpouštědlo hnáno přes membránu tlakem. Tento tlak můţe být vytvořen přetlakem inertního plynu, nejčastěji dusíku, v ultrafiltrační komůrce, vakuem v nádobě pro zfiltrovaný roztok či centrifugací. Je-li makromolekulární látka, kterou chceme zahustit či odsolit, odolná vůči oxidaci vzdušným kyslíkem, je moţné pouţít k vytvoření tlaku v komůrce namísto dusíku vzduch. Pro ultrafiltraci prováděnou při centrifugaci se vyrábí zvláštní kyvety pro pouţití v rotorech s fixním úhlem. Tyto kyvety umoţňují v relativně krátké době zahuštění z několika ml i na méně neţ 100 μl. 99

100 Je-li účelem ultrafiltrace sníţení koncentrace nízkomolekulárních látek v roztoku, přidává se k tomuto roztoku další roztok, který tyto kontaminanty neobsahuje, a tento roztok se zahustí na poţadovaný objem. Tím dojde ke sníţení koncentrace kontaminantu v koncentrátu. Je-li potřeba výrazné sníţení koncentrace kontaminantů, je výhodnější pouţít opakovanou ultrafiltraci menším objemem neţ jednu ultrafiltraci menším objemem. Chceme-li například sníţit koncentraci kontaminantu v 5 ml roztoku na 1 % původní koncentrace, potřebujeme při jedné ultrafiltraci přidat 495 ml čistého roztoku, zatímco při 2 ultrafiltracích pouţijeme vţdy jen 45 ml čistého roztoku a při čtyřech ultrafiltracích jen po 11 ml roztoku. Spotřeba roztoku tak při dosaţení stejného výsledku činí jen 18, resp. 9 % spotřeby při jednorázové ultrafiltraci. Výhodnost opakované ultrafiltrace stoupá s rostoucím poměrem mezi původní a poţadovanou koncentrací ultrafiltrovaného roztoku. Bude-li třeba sníţit koncentraci nízkomolekulárních kontaminant na setinu procenta, bude spotřeba promývacího roztoku při 2, resp. 4 ultrafiltracích činit jen 2, resp. 0,4 % spotřeby při jednorázové ultrafiltraci. Uvolnění cílové podjednotky z fúzního proteinu Štěpení fúzního proteinu specifickou endoproteázou Získání rekombinantního proteinu v aktivní a vysoce čisté formě je jedním ze základních metodik biotechnologického výzkumu. Při přípravě těchto proteinů se vyuţívá fúzních proteinů, jejichţ součástí je sekvence aminokyselin, která umoţňuje jejich purifikaci. Tyto sekvence však mohou omezovat biologickou aktivitu sledovaného proteinu. Odštěpení těchto sekvencí pomocí specifických endoproteáz, enzymů štěpících určitou aminokyselinovou sekvenci, je často nezbytné pro další vyuţití cílového proteinu. Specifické endoproteasy minimalizují nechtěné nespecifické štěpení, které se vyskytuje při štěpení fúzních proteinů chemickými látkami (bromkyan, hydroxylamin, ph). Příkladem specifických endoproteas je enterokinasa rozpoznávající aminosekvenci Asp-Asp-Asp-Asp-Lys X-, dále pak prolin, specifické endoproteasu hydrolyzující peptidy, endoproteáza AspN selektivně štěpící peptidové vazby mezi N-koncem a kyselinou aspartámovou, faktor Xa štěpící sekvenci Ile-Glu(nebo Asp)-Gly-Arg nebo trombin štěpící sekvenci Leu-Val-Pro-Arg Gly-Ser. Autokatalitická technika odštěpení fúzní kotvy od rekombinantního proteinu Purifikace fúzních a následně rekombinantních proteinů je proces zahrnující několik na sebe navazujících chromatografických purifikací, které musí být vţdy optimalizovány. Pro zjednodušení tohoto procesu byla vyvinuta jednokroková afinitní purifikace fúzního proteinu, tedy cílového proteinu značeného afinitní koncovkou připojenou na n- nebo c- konec rekombinantního proteinu. Jako afinitní koncovka jsou 100

101 úspěšně pouţívány malé peptidy, např. Poly-His, poly-arg, c.myc, Flag, nebo velké peptidy, např. Glutation s transferasa, doména váţící chitin. Abychom zajistili biologickou aktivitu rekombinantního proteinu, musíme tuto koncovku odstranit před jeho samotným vyuţitím. Z tohoto důvodu je mezi rekombinantní protein a koncovku umístěna krátká aminokyselinová sekvence, která je rozpoznávána specifickou endoproteázou. Tento způsob přípravy rekombinantního proteinu má několik omezení: 1. Odseparování proteinu od fúzní koncovky a pouţité endoproteasy vyţaduje další purifikační krok. 2. Pouţité proteasy nejsou zcela specifické a mohou částečně štěpit cílový protein. 3. Štěpené místo můţe být nepřístupné pro endoproteasu. 4. Štěpení vyţaduje dlouhý reakční čas a je drahé. K překonání uvedených omezení byl vyvinut samoštěpící systém, kdy je tzv. Self processing modul umístěn mezi cílový protein a afinitní kotvou. Po navázání fúzního proteinu na kolonu a odmytí všech kontaminujících nečistot je štěpící aktivita samoštěpícího modulu aktivována malou molekulou a vyúsťuje v uvolnění rekombinantního proteinu s tím, ţe afinitní koncovka včetně samoštěpící modulu zůstává na koloně. Vhodný samoštěpící modul splňuje následující podmínky: 1. Štěpí pouze vazbu mezi cílovým proteinem a tímto modulem. 2. Není aktivován in vivo, pouze po cílené indukci in vitro. Izolace proteinu z inkluzních tělísek a jejich refoldování Přirozeně produkované proteiny jsou v buňce bezprostředně po translaci skládány do své nativní struktury. Ta je však v mnoha případech heterologní exprese (například eukaryontní proteiny exprimované v mikroorganismech) či po denaturační purifikaci narušena. Nesprávně sloţené proteiny vytváří v bakterii (pro nás nejdůleţitější je E. coli) nerozpustné agregáty, tzv. Inkluzní tělíska. Ve formě inkluzních tělísek se tak vyskytují aţ tři čtvrtiny proteinů biotechnologicky exprimovaných v E. coli. Za stabilitu nativní konformace i za vznik inkluzních tělísek z nesprávně sloţených proteinů a jejich agregátů jsou odpovědny stejné typy interakcí. Jedná se o hydrofobní interakce mezi nepolárními vedlejšími řetězci aminokyselin uvnitř proteinu či inkluzního tělíska, iontové interakce a kovalentní či vodíkové vazby. Důvod vzniku inkluzních tělísek dosud není plně objasněn, ale předpokládá se, ţe proteiny jsou exprimovány ve větším mnoţství, neţ je kapacita bakteriální buňky pro jejich správné skládání. Z toho vyplývají moţnosti, jak se tvorbě inkluzních tělísek vyhnout. Často je účinné sníţení teploty pro kultivaci exprimujících buněk z 37ºC na pokojovou teplotu a patřičné prodlouţení doby exprese či pouţití lowcopy expresního plasmidu. Náročnější metodou je koexprese chaperonů potřebných pro skládání proteinu do správné konformace (u E. coli hlavně molekuly GroEl a GroEs). V některých případech se osvědčil krátký tepelný šok (42 C), po kterém dochází v exprimujících buňkách k přechodnému zvýšení exprese proteinů tepelného šoku zvyšujících stabilitu nascentních proteinů. Příznivý vliv na rozpustnost proteinů můţe mít 101

102 také typ připojené značky (Tagu). Fúze s doménovými nebo proteinovými značkami (celulose binding domains, glutathione s-transferase tag (GST), maltose-binding protein (MBP), thioredoxin (TRXA), transcription termination anti-termination factor (NUSA), protein disulfide isomerase i) často zvyšuje rozpustnost a stabilitu rekombinantních proteinů. Navíc některé značky jsou s výhodou pouţitelné pro afinitní purifikaci. Kvůli své velikosti ale pro většinu aplikací musejí být z proteinu po purifikaci odstraněny. V současné době je také moţno pouţít speciální kmeny E. coli geneticky upravené pro expresi eukaryotických proteinů jako je kmen Rosseta TM nesoucí geny pro trna rozeznávající kodony vzácné v E. coli, kmen Origami TM mutovaný v genech pro thioredoxin reduktasu a glutathion reduktasu umoţňující tak tvorbu disulfidických můstků v cytoplasmě nebo kmen Rrosseta-Gami TM kombinující obě tyto vlastnosti. Obrázek 5.1. Inkluzní tělíska v elektronové mikroskopii Inkluzní tělíska (označená šipkami) u kultury E. coli. (převzato z www stránek Working group downstream processing at the Department of biotechnology, University of Natural Resources and Applied Life Sciences Vienna, Vienna, Austria). Z inkluzních tělísek je moţné získat funkční a správně sloţený protein a to často ve vyšší čistotě a koncentraci, neţ jakou můţeme dosáhnout při expresi proteinu za podmínek, kdy se inkluzní tělíska netvoří. Postup, který umoţňuje převést protein 102

103 z inkluzních tělísek do nativní plně funkční podoby se nazývá refoldování. Jelikoţ není k dispozici univerzální refoldovací pufr a výsledek refoldování je poměrně nejistý, vyuţívá se při produkci proteinů jen omezeně. Ačkoliv je refoldování poměrně levné a rychlé, mnoho pracovníků při expresi proteinu v nerozpustné formě volí změnu expresního systému. V současnosti je moţno z inkluzních tělísek refoldovat více neţ polovinu proteinů. Pro ověření správné konformace získaného proteinu je třeba mít k dispozici nástroj potvrzující, ţe produkt je refoldování převeden do nativní formy. Je moţno vyuţít: - stanovení enzymové aktivity - ověření imunogenity experimentální vakcinací - stanovením reaktivity s protilátkami proti konformačním epitopům - ověření vazby na receptor nebo ligand - pouţití spektroskopických metod Obrázek 5.2. Schéma purifikace proteinu z inkluzních tělísek Inkluzní tělíska Denaturace a solubilizace (8M Urea, 6M Guanidin hydrochlorid, Mercaptoethanol, detergenty) Purifikace za denaturačních podmínek (afinitní chromatografie) Čistý denaturovaný solubilní protein Renaturace 103

104 Čím více je o daném proteinu známo, tím větší je pravděpodobnost úspěchu. Postup pro refoldování některých proteinů lze nalézt v databázích refoldování, jako je např. Refold, který je k dispozici na internetových stránkách melbournské univerzity monash ( Inkluzní tělíska lze získat z buněk jejich lyzováním, centrifugací a promytím pelety roztokem tritonu x-100 nebo deoxycholátu. Rozpuštění (solubilizace) inkluzních tělísek vyţaduje narušení interakcí, které se podílejí na jejich vzniku a stabilitě. Toho je moţné dosáhnout přídavkem chaotropních činidel (8M močovina, 8M hydrochlorid guanidinu apod.) Či detergentů (sarkosyl, SDS apod.) A redukčních činidel (2- merkatoethanol nebo dithiotreitol). Rychlejší a účinnější solubilizace se dosáhne pouţitím hydrochloridu guanidia, zatímco močovina je výhodnější při nanášení na gel pro SDS- PAGE elektroforézu. Proto se v mnoha protokolech v průběhu purifikace přechází z hydrochloridu guanidinu na močovinu, coţ můţe být provedeno např. při chromatografické purifikaci, kdy je na kolonu nanesen vzorek v roztoku hydrochloridu guanidinu, ale eluční pufr obsahuje močovinu. Samotné renaturaci často předchází purifikace denaturovaného proteinu. Nejvýhodnější je pouţití afinitní chromatografie v případě, ţe obsahuje polyhistidinovou značku, naopak problematické můţe být pouţití hydrofobní či iontoměničové chromatografie. Při renaturaci jsou solubilizační činidla odstraněna a nahrazena pufrem, jenţ podporuje správné sloţení proteinu do aktivní formy a umoţňuje následné pouţití proteinu, tj. Má pokud moţno fyziologické ph a osmotický tlak. Je-li protein jednou správně sloţen, můţe být obvykle pro další pouţití rozpuštěn v různých pufrech. Jedna z prvních metod refoldování v roztoku vyuţívala dialýzu. Protein v dialyzačním střívku je ve více krocích dialyzován za pouţití pufrů, které se svým sloţením postupně přibliţují finálnímu refoldovacímu pufru. Při průtokové metodě se sloţení pufru nemění skokově, ale plynulým gradientem. Tato metoda vyţaduje desítky hodin a řádově litry pufrů. Nejdynamičtěji se rozvíjející metodou refoldování je rychlá diluční metoda, která je při nulových či nízkých zkušenostech s refoldováním nejvýhodnější. Protein se postupně po malých dávkách přidává do nadbytku nativního pufru za stálého míchání.. Jsou-li podmínky ideální, protein se po zředění v průběhu několika sekund správně sloţí do nativní konformace. Odstranění solubilizačních činidel a jejich nahrazení nativním pufrem můţe být také provedeno přímo na koloně při afinitní purifikaci, kdy eluován je jiţ refoldovaný protein. 104

105 Do renaturačních pufrů se často přidávají aditiva, sniţující agregaci proteinů a/nebo usnadňující tvorbu disulfidických vazeb. Patři mezi ně hlavně arginin (0,5 1m), glycerol, oxidovaný a redukovaný glutathion, dithiotreitol, polyethylen glykol, detergenty, edta atd. Efektivita aditiv je jen obtíţně predikovatelná a jejich účinnost je nutno ověřovat empiricky. Je také moţno zakoupit komerční refoldovací kity obsahující různé koncentrace a poměry aditiv, které mohou poskytnout za spotřeby minima vzorku cenné informace pro refolding ve větším měřítku. Metody sušení produktů Stabilizace biopolymerů a rekombinantních proteinů Proteiny jsou amfifilní molekuly, tedy molekuly mající jak hydrofobní, tak hydrofilní skupiny. Rozpustnost proteinu ve vodných roztocích úzce souvisí s jejich aminokyselinovým sloţením a jejich solvatačním obalem, tj. Vrstvou molekul vody a iontů, které obalují jejich molekuly. Příčinnou solvatačního obalu jsou elektrostatické síly mezi polárními strukturami proteinů a dipóly vody. Rozpustnost proteinů se s rostoucí koncentrací solí zpravidla nejprve zvyšuje (vsolovací efekt), prochází maximem a posléze klesá (vysolovací efekt). Vsolování je způsobeno vytvořením iontového oblaku kolem ionizovaných skupin biopolymeru dochází ke sníţení interakce nabitých skupin biopolymeru mezi sebou a zvýšení interakcí s rozpouštědlem. Dalším přídavkem neutrální soli se sniţuje tloušťka solvatačního obalu a efektivní koncentrace vody, a tím se sniţuje i rozpustnost proteinu. Charakter závislosti rozpustnosti na koncentraci soli je určen nejen typem biopolymeru, ale i typem soli a hodnotou ph, nejniţší je rozpustnost v izoelektrickém bodě. Při frakcionaci organickými rozpouštědly mísitelnými s vodou (methanol, ethanol, aceton) se vyuţívá rozdílná rozpustnost proteinu v těchto rozpouštědlech a ve vodě. Zvyšováním koncentrace organického rozpouštědla se zmenšuje i solvatační obal kolem molekul proteinu, coţ nakonec vede k jejich vysráţení. Frakcionace organickými rozpouštědly se můţe kombinovat se změnami koncentrace solí, ph a teploty. Proteiny i nukleové kyseliny jsou vysoce senzitivní, nepatrná změna některé z podmínek můţe způsobit jejich denaturaci, degradaci nebo změnu vlastností, které jsou nutné pro úspěšnou krystalizaci. Z tohoto důvodu musí být proteiny v hydratované formě udrţovány při konstantním ph a teplotě. Krystaly makromolekul Obsahují průměrně 50 % rozpouštědla, většinou mají charakter gelu s mnoha intersticiálními prostory, kterými můţe proudit rozpouštědlo nebo difundovat malé 105

106 molekuly. Mříţkové interakce (solné můstky, vodíkové vazby, hydrofobní interakce) udrţují integritu krystalu a vysvětlují rozdíly mezi vlastnostmi a schopností krystalizace u malých molekul a biomakromolekul. Vysoká neuspořádanost, gelový charakter, vysoká senzitivita na změny teploty, ph, druh rozpouštědla či iontovou sílu jsou hlavní příčinou slabých difrakčních vlastností krystalů makromolekul. Krystaly jsou křehké, slabým tlakem se rozpadají, na vzduchu hydratují, vykazují slabé optické vlastnosti. V průběhu expozice radiačního záření dochází k silnému poškození krystalů, proto je nutné provádět měření na difraktometrech s plošným detektorem, resp. Na vysokofrekvenčných zdrojích rentegenového záření, tzv. synchrotronech. Krystaly biologických makromolekul jsou při laboratorní teplotě vysoce citlivé k rentgenovým paprskům a často podléhají radiačnímu poškození, zejména při pouţití synchrotronového záření s vysokou intenzitou. Většinou je toto poškození tak rychlé, ţe k nasnímání nezbytného mnoţství difrakčních dat je potřeba několika různých krystalů a někdy dokonce není moţné měření provést. V současné době se pouţívá metoda kryokrystalografie, tedy měření difrakce za velmi nízkých teplot (100 K). Sušení za zvýšené teploty sušárny, sprejové sušení Sušení za snížené teploty evaporační centrifugace, lyofilizace Speciální část frakcionace biopolymerů HA Redukce molekulové hmotnosti biopolymerů kyselou hydrolýzou Biomakromolekuly jsou sloţeny z menších molekul, které se v organismech vyskytují i samostatně. Mezi těmito molekulami se odštěpením vytváří vazba, coţ umoţňuje tvorbu dlouhých řetězců těchto molekul a tvorbu makromolekulárních látek. Jedná se např. O peptidovou vazbu mezi aminokyselinami v peptidech a proteinech či glykosidovou vazbu mezi monosacharidovými jednotkami v oligosacharidech a polysacharidech. Za určitých podmínek lze tuto vazbu dodáním molekuly vody opětovně rozštěpit. Tato hydrolytická reakce můţe být specifická, kdyţ dochází ke štěpení pouze konkrétních vazeb mezi podjednotkami např. za konkrétní aminokyselinou v proteinu, nebo nespecifická, kdyţ je štěpena vazba mezi libovolnými monomerními jednotkami. Polysacharidy je moţné štěpit více metodami. Velmi často je vyuţívána enzymatická hydrolýza. Ta je katalyzována enzymy označovanými glykosidasy (EC 3.2.x.x) ze třídy hydrolas. Patrně nejznámější glykosidasou je ptyalin ze slinných ţláz α-amylasa (EC ), která štěpí škrob. 106

107 Další moţností štěpení polysacharidů je vyuţití kyselé hydrolýzy. Její postup se pro různé polysacharidy liší, v závislosti na rozpustnosti polysacharidu můţe být heterogenní nebo homogenní. Základním principem je vazba protonu na kyslík glykosidové vazby. Ta je následována nukleofilním atakem molekuly vody na sousední uhlík a substitucí původního kyslíku. Kyselinu hyaluronovou lze hydrolyzovat např. V 0,4 m HCl, ke které byl pro stabilizaci ph na hodnotě 1,44 přidán ekvimolární roztok KCl, KH 2 PO 4, tetraboritanu sodného, tris-(hydroxyl-methyl)-aminoethanu a kyseliny citronové. Reakce probíhá při teplotě 60 C několik dní. Molekula obsahuje dva uhlíky náchylné k hydrolýze, jedná se o uhlíky C1 a C4. V případě uhlíku hydrolýzy u uhlíku C1 existují dva rozdílné mechanismy. Proton můţe atakovat nejen glykosidovou vazbu, ale i heterocyklický kyslík cukerné kostry. Kyselina alginová je podobně jako celulosa hydrolyzována v 85% H 3 PO 4 v poměru 18,8 ml kyseliny na 1 g polysacharidu. Jedná se o heterogenní reakci, probíhající za laboratorní teploty po dobu několika dnů. Produkt se získá filtrací, přičemţ polysacharidy o vyšší molekulové hmotnosti jsou zachyceny filtrem, produkty niţší molekulové hmotnosti je moţné vysráţet vodou či methanolem a opět oddělit filtrací. Pro hydrolýzu síranových polysacharidů (karagenany, heparin, síranové estery dextranu) při teplotě 55 c je moţné pouţít pufr sestávající z 12 mm HCl a 8 mm LiCl o hodnotě ph 2,0. Příprava oligosacharidů enzymatickým štěpením Výchozí sloţkou pro přípravu oligosacharidů jsou polysacharidy. Přípravu je moţné provádět kyselou hydrolýzou (ph 4), kdy účinnost hydrolýzy je sledována pomocí metody SEC-MALS. Po skončení kyselé hydrolýzy roztok zneutralizujeme NaOH a následně zbavíme připravené oligosacharidy nízkomolekulárních nečistot pomocí ultrafiltrace. Tuto metodu lze modifikovat pouţitím enzymů endoglykosidas, které štěpí pouţitý polysacharid v kyselém prostředí. Příkladem endoglykosidasy je například Endoβ-N-acetylhexosaminidasa, která štěpí GalNAc-Glc vazby v polysacharidech. Dalším příkladem je Endo-β-glukuronidasa, která štěpí Glc GalNAc vazby. 107

108 6. OVĚŘENÍ ČISTOTY A CHARAKTERIZACE BIOMOLEKUL Ověření čistoty proteinů, peptidů a polysacharidů a jejich charakterizace HPLC Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) je nezbytný nástroj pro purifikaci a charakterizaci makromolekul. Výběr chromatografické metody je spojen s typem sledované molekuly a také s cílem výzkumu. Všechny uvedené chromatografické metody mohou být prováděny jako izokratická nebo gradientová eluce v kvalitativních nebo kvantitativních analýzách. V současné době je pouţíváno 8 základních modelů HPLC pro analýzu a purifikaci peptidů a proteinů. Tyto metody zahrnují gelovou permeační chromatografii téţ nazývanou vylučovací chromatografie (HP-SEC), iontově výměnnou chromatografii (HP-IEX), chromatografii na normálních fázích (HP-NPC), chromatografii na reverzních fázích (RP-HPLC), hydrofobní interakční chromatografie (HP-HIC), hydrofilní interakční chromatografii (HP-HILIC), chelatační afinitní chromatografii (HP-IMAC), a bioafinitní chromatografii (HP-BAC). Vlastnosti peptidů a proteinů a jejich implikace pro vývoj HPLC metod Chemická organizace a sloţená struktura aminokyselinového řetězce jsou základní vlastnosti, které určují způsob a typ chromatografické separace. Chromatografická separace úzce souvisí se strukturou a chemickými vlastnostmi postraních řetězců jednotlivých aminokyselin. Chemická diversita proteinů je navíc zvětšována posttranslačními modifikacemi s karbohydráty a lipidy. Polární postranní řetězce aminokyselin jsou rozděleny do tří skupin bez náboje, s pozitivním nábojem nebo téţ bazické a s negativním nábojem neboli kyselé. Peptidy a proteiny obsahují různé mnoţství ionizovatelných bazických a kyselých skupin. V závislosti na těchto vlastnostech má kaţdý peptid a protein charakteristický izoelektrický bod, jehoţ hodnota se odvíjí od typu pouţitého rozpouštědla (jeho ph, sloţení a teploty). Zvláštní skupinu tvoří cyklické peptidy bez ionizovatelných postraních řetězců, které mají nulový náboj. Mnoţství a rozloţení nabitých skupin bude ovlivňovat polarizaci a ionizaci peptidů a proteinů. Tyto faktory určují výběr optimálních separačních podmínek pro rozdělení peptidů a proteinových směsí. Tyto informace jsou přímým vodítkem pro zvolení typu eluentu a uspořádání HPLC. Parametry mobilní a stacionární fáze Parametry mobilní a stacionární fáze přímo ovlivňují vlastnosti polypeptidů nebo proteinů v průběhu kapalinových chromatografických separací. Ve vodných roztocích 108

109 dochází k internalizaci hydrofobních reziduí, a tím k stabilizaci struktury, coţ je základní předpoklad pro chromatografické separace. Určení proteinových struktur včetně autoagregací je nezbytné pro správnou interpretaci výsledků získaných HPLC. Kritickým faktorem pro selekci HPLC je výběr experimentálních podmínek, které ovlivní konformační stav biomakromolekul. Konformační stabilita proteinů můţe být ovlivněna mnoha způsoby (mobilní a stacionární fází, teplotou), v mnoha případech pak integrovanou experimentální a detekční strategií. Nejčastěji jsou pouţívány: 1 H 2- dimensionální NMR, infračervená spektrometrie s Fourierovou transformací (FTIR), hmotnostní spektrometrie s elektrosprejem (ESI-MS), cirkulární dischroismus, optická rotační disperze které jsou nutné k určení nadstruktur polypeptidového řetězce v roztoku nebo v přítomnosti specifických ligandů. Detekce peptidů a proteinů HPLC UV detekce je nejpouţívanější metodou pro detekci peptidů a proteinů v HPLC, jelikoţ peptidové vazby absorbují v ultrafialové (UV) oblasti spektra (205 to 215 nm). Aromatické aminokyseliny absorbují v daleké UV oblasti nad 250 nm. Znalost uv spektra a částečně extinkčních koeficientů nepřekrývajících se absorpčních minim těchto aminokyselin umoţňuje UV -diodová detekce (DAD). Znalost relativní UV/VIS absorbance peptidů a proteinů je nezbytná pro výběr správné detekční vlnové délky v RP- HPLC a v dalších HPLC módech. Společné pouţití 215 nm jako preferované vlnové délky pro většinu analytických reverzních fází s peptidy nebo proteiny je dobrým kompromisem mezi detekcí senzitivity a potenciální detekcí interference způsobené absorpcí pufru. Nicméně vlnové délky mezi 230 a 280 nm jsou často pouţívané v preparativních aplikacích, kde pouţití více senzitivní detekce můţe vyústit v přehlcení detektoru. Afinitní kapalinová chromatografie (bioafinitní chromatografie) Podstatou metod zaloţených na afinitní interakci je tvorba stabilního, specifického komplexu mezi ligandem a bílkovinou (biologicky aktivní látkou a protilátkou). Ligandem můţe být látka vysokomolekulární i nízkomolekulární povahy. Afinitní interakci představuje soubor různých interakcí polárních, elektrostatických, hydrofobních i Van der Waalsových. Intenzita afinitní interakce mezi bílkovinou a ligandem můţe být vyjádřena pomocí disociační konstanty K D. Hodnota disociační konstanty by se měla pohybovat zhruba v rozmezí 10-8 aţ 10-4 mol.l -1. Nejčastěji vyuţívané afinitní páry protein-ligand uvádí následující přehled: Enzym substrát Enzym inhibitor 109

110 Protilátka antigen Lektin sacharid Avidin biotin Lecithin glykoprotein Vazebný protein hormon Afinitní chromatografie je zaloţena na interakci mezi bílkovinou a ligandem imobilizovaným na chromatografickém sorbentu. Experimenty lze provádět v reţimu HPLC i klasické sloupcové chromatografie. Pouţívaný sorbent bývá umístěn v chromatografické koloně nebo je přímo přidán do roztoku vzorku. Při chromatografické analýze se obvykle nejprve vymyjí balastní bílkoviny a následovně je eluována poţadovaná purifikovaná bílkovina. Afinitní chromatografie je vysoce selektivní metodou, umoţňuje separovat velice sloţité směsi bílkovin. Nevýhodou afinitní chromatografie bývá nízká kapacita a vysoká cena afinitních sorbentů Gelová permeační chromatografie (SEC) Metoda je zaloţena na nerovnováţném ději na sítovém efektu. Separace je zde závislá na velikosti a tvaru částic analyzované látky a stacionární fáze. Mobilní fáze pouze unáší analyty kolonou, separačního procesu se přímo neúčastní. Velké molekuly (makromolekuly) nepronikají do pórů gelu a elují se jako první (t M ). Malé molekuly pronikají do pórů gelu, jejich pohyb kolonou se zpomaluje. Experimenty lze provádět v reţimu HPLC i klasické sloupcové chromatografie. Vylučovací kolony mají omezenou kapacitu, pouţívají se dlouhé kolony. Vylučovací limit = velikost částic, které jiţ nebudou pronikat do pórů a nebudou separovány na vylučovací koloně. Agarosové a dextranové gely se nehodí pro HPLC, neboť nevydrţí vysoké tlaky. Většinou se jako gel pouţívají organické polymery (kopolymer styren + divinylbenzen). Vhodné je téţ pouţití porézních rigidních skel a silikagelu. Mobilní fáze musí rozpouštět analyty, nesmí reagovat se soluty ani se stacionární fází, musí smáčet povrch stacionární fáze a být kompatibilní s detektorem. Často pouţívanou mobilní fází je voda a vodné roztoky pufrů. Iontově výměnná chromatografie Iontově výměnná chromatografie probíhá na iontoměničích. Je zaloţena na silných elektrostatických silách mezi ionizovanými funkčními skupinami měniče a ionty v mobilní fázi. Při technice iontové výměny jde o separaci iontů, proto je vţdy pouţívána vodná mobilní fáze. Stacionární fáze (iontoměnič, ionex) je zpravidla makromolekulární matrice obsahující kyselou nebo bazickou funkční skupinu. Katexy jsou iontoměniče s 110

111 kyselou funkční skupinou (sulfo-kyselina, karboxylová kyselina) nesoucí záporný náboj, anex obsahuje bazickou funkční skupinu (aminoskupinu) a je nositelem kladného náboje. Ion obsaţený v ionexu bývá vyměněn za ion obsaţený v mobilní fázi nebo ve vzorku a na principu soutěţení ionexu o tyto ionty dochází k separaci. Podobně probíhá také ligandová výměna, kdy na iontoměniči, obvykle katexu, je zachycen iontovou výměnou vhodný kov. Na takto upravenou kolonu se přivádí mobilní fáze obsahující látku schopnou vytvářet s vázaným kovem iontovou vazbu. Hydrofobní interakční chromatografie HIC Na hydrofobní interakční chromatografii můţe být pohlíţeno jako na nástavbu reverzní chromatografie s vodnými mobilními fázemi bez přídavků organických rozpouštědel. Retence solutů je ovlivňována přídavkem organických nebo anorganických solí do vody. Chromatografie HIC byla primárně pouţita pro separaci proteinů, protoţe v přítomnosti organických rozpouštědel v mobilní fázi vede často k denaturaci proteinů a navíc zůstává zachována biologická aktivita proteinů. K separaci proteinů se namísto isokratické eluce pouţívá eluce gradientová, a to gradientová eluce se sniţující se iontovou sílou mobilní fáze (opak iontové chromatografie). HIC se pouţívá především k separaci proteinů a velkých peptidů. Kapacita HIC je srovnatelná s kapacitou chromatografie GPC, ale mnoţství dávkovaného vzorku je příliš komplikované. Je to dáno tzv. vysolovacím efektem, kdy je rozpustnost proteinů ve vysoce koncentrovaných solích omezena. Objem nástřiku není příliš velký a vzorek se rozpouští přímo v primárním pufru, který se nastřikuje na kolonu. Je-li vzorek rozpustný ve vodě nebo slabém pufru, pak se mohou na kolonu dávkovat pouze velmi malé objemy vzorku, protoţe voda je v HIC velmi silnou mobilní fází. Na druhé straně však můţe mít přídavek soli do solventu vliv na rozpustnost proteinu a můţe docházet k jeho vysráţení. Koncentrace soli ve vzorku musí být proto optimalizována a má za následek omezení HIC k rozšíření v preparativní chromatografii. Dalším problémem aplikace HIC je pouţití právě vysoce koncentrovaných pufrovaných mobilních fází, coţ má za následek vysoké nároky na pouţitou instrumentaci HPLC (čerpadla, nástřiková zařízení). Stanovení molekulových hmotností pomocí SEC-MALS HPLC (size-exclusion chromatography plus multi-angle light scattering) 111

112 Charakterizace proteinů a polypeptidů pomocí elektroforézy Jednorozměrná denaturační elektroforéza Je pouţívána k separaci směsi proteinů (např. z buněk, subcelulárních extraktů, frakcí izolovaných na koloně, imunoprecipitátů), k výzkumu podjednotkových sloţení a k verifikaci homogenity proteinových vzorků. V polyakrylamidové gelové elektroforéze (PAGE) migrují proteiny v elektrickém poli přes póry v matrici polyakrylamidového gelu. Velikost pórů gelového síta vzrůstá s klesající koncentrací akrylamidu. Kombinace velikosti pórů a proteinového náboje, velikosti a tvaru determinuje migraci daného proteinu. Za standardní elektroforézu je povaţována denaturační elektroforéza v přítomnosti lauryl síranu sodného (SDS). Tato elektroforéza je prováděna na vertikálních gelech o různých rozměrech. Nejčastěji jsou pouţívány minigely (6x8 cm). Však díky své malé velikosti mají nízké rozlišení. Pouţívání minigelů je však levnější a rychlejší. Jednorozměrová gelová elektroforéza nám poskytuje informace o proteinech, jejich molekulové velikosti a čistotě, taktéţ o podjednotkovém sloţení glykozylaci. Separované proteiny mohou být z gelu získány pomocí elektroeluce a dále pouţity pro další studie. Dalším typem gelu jsou gely ultratenké nebo gradientové. Proteiny separované na gelech mohou být následně analyzovány imunoblotováním, přímým barvením proteinů atd.. Velikost proteinů je posuzována podle komerčně dostupných proteinových markerů. Typy elektroforéz závisí na typu vzorku. Protokol na separaci malých proteinů a peptidů poţaduje modifikaci standardních pufrů: buď Tris-tricinový pufr, nebo Tris pufr bez urey. SDS-PAGE vyuţívá negativního náboje SDS který obaluje proteiny. Proteiny se pak chovají jako negativně nabité molekuly, které putují k pozitivně nabité elektrodě. Výjimečně jsou proteiny separovány v kationtovém uspořádání elektroforéz, typickým příkladem je separace histonů v prostředí pufru kys. octové a urey. SDS-PAGE je obvykle prováděna za konstantního proudu. Odpor gelu vzrůstá v průběhu separace, a s tím vzrůstá i napětí. Pokud elektroforetická nádobka obsahuje více neţ jeden gel, pak stejný proud prochází oběma gely, ale napětí je aditivní. Tedy pokud jeden gel má konstantních 10 ma při 100 V, pak dva identické gely mají 200 V (100 v kaţdý). Napětí tedy limituje mnoţství gelů, které jsme schopni rozdělit na jednom nízkonapěťovém zdroji. Pouţitý proud téţ souvisí s tloušťkou gelu. 1.5 mm tlustý gel je obdobou dvou 0.75 mm tlustých gelů. Tím, ţe tlustší gely potřebují více proudu a tím se i více zahřívají. Po proběhnutí SDS-PAGE je třeba proteiny vizualizovat. Pro obarvení se pouţívá barvivo Coomassie brilliant blue. Toto barvení je navíc kvantitativní a gel je moţné 112

113 pouţít pro analýzu hmotnostní spektrometrií. Dalším způsobem je barvení stříbrem. Toto barvení je sice x citlivější, ale jelikoţ se stříbrné ionty váţou jen na některé aminokyselinové zbytky (Asp, Glu, His, Cys, Met, Lys), nelze tuto metodu povaţovat za plně kvantitativní. Nejnovější metodou je fluorescenční barvení, které je kvantitativní a také slučitelné s hmotnostní spektroskopií jako Coomassie a svou citlivostí je srovnatelné s barvením stříbrem, ale nevýhodou je jeho vysoká cena. Nezachycené barvivo se vymyje a výsledkem je tzv. Proteinová mapa. Jednorozměrná elektroforéza za nativních podmínek Nedenaturující nebo téţ nativní elektroforéza je elektroforézou, která neprobíhá v přítomnosti denaturačních činidel, jako např. Urey nebo SDS. Je technikou pouţívanou pro určení velikosti a podjednotkového sloţení a optimálních separačních podmínek pro daný protein. Tato elektroforéza je vysoce flexibilní umoţňující pracovat v celém rozsahu ph. Dvourozměrná gelová elektroforéza Dvourozměrná gelová elektroforéza je kombinací dvou separačních technik, izoelektrické fokusace a SDS-PAGE. V prvním gelu dochází k separaci proteinů podle jejich isoelektrického bodu. Dále pak proteiny z prvního gelu migrují do druhého gelu, kde jsou rozděleny pomocí SDS elektroforézy v závislosti na jejich velikosti. Výsledné dvourozměrné gely obsahují mnoţství bodů dobře od sebe rozpoznatelných. Při pouţití citlivé detekce, např. Barvení stříbrem nebo autoradiografie, obsahují tyto gely aţ 1500 bodů. Pro srovnání jednorozměrná separace umoţňuje rozlišení pouhých 100 prouţků a kaţdý tento prouţek obsahuje několik proteinů. Proto je dvourozměrná elektroforéza metodou s maximálním rozlišením. V případě imunoprecipitátů nám tato metoda umoţňuje monitorovat změny v náboji nebo molekulové hmotnosti cílových proteinů. Toto je velmi důleţité při studiu rekombinantních proteinů, jejichţ vlastnosti mohou být pouze mírně odlišné od přirozených intracelulárních proteinů. Nevýhodou dvourozměrné elektroforézy je časová a manuální náročnost. Dalším problémem je nedostatečné rozlišení v případě, ţe jsou si dva proteiny tak podobné, ţe se zobrazí pouze jako jedna skvrna v gelu. Tento problém však můţe vyřešit pouţití úzkého rozsahu ph při isoelektrické fokusaci, které zvýší rozlišení. Posledním krokem minipreparativní SDS-PAGE je vyřezání části gelu s cílovým proteinem a následná eluce. Sloţení elučního pufru úzce souvisí s typem SDS-PAGE, která byla pouţita k separaci proteinů. 113

114 Izoelektrická fokusace (IEF) Izoelektrická fokusace je další metoda, která se realizuje elektroforetickou technikou a lze ji řadit mezi preparativní elektromigrační techniky. Zatímco elektroforéza na nosičích se provádí za konstantního ph, k separaci při izoelektrické fokusaci dochází v gradientu ph, který se ustaví mezi dvěma elektrodami. Separovaná látka se pohybuje vlivem el. proudu v gradientu ph aţ do okamţiku, kdy se dostane do oblasti ph shodné s jeho izoelektrickým bodem. Tam ztratí náboj, zastaví se a bude se v tomto bodě koncentrovat. IEF je tedy rovnováţná technika a současně elektroforetická technika s pravděpodobně nejvyšším stupněm rozlišení. Tímto způsobem je moţno od sebe oddělit (a tak identifikovat) sloučeniny, jejichţ izoelektrické body se od sebe liší o 0,001 ph jednotky. Kapilární elektroforéza Zvláštním způsobem elektroforézy je tzv. Kapilární elektroforéza, která vyuţívá elektrokinetických principů elektroforézy a elektroosmózy k separaci látek uvnitř křemenné kapiláry. Tomuto způsobu elektroforézy se říká vysokoúčinná kapilární elektroforéza (HPCE) a provádí se několika způsoby jako volná elektroforéza, gelová elektroforéza, ale i jako izoelektrická fokusace. Volná kapilární elektroforéza Provádí se v otevřené kapiláře naplněné elektrolytem. K separaci dochází kombinací vlivu elektroforetické migrace a elektroosmotického toku. Elektroforetickou migrací rozumíme pohyb nabitých molekul v elektrickém poli. Elektroosmotický tok je tok elektrolytu způsobený nábojem vnitřní stěny kapiláry a aplikovaným potenciálem. Ve styku s elektrolytem mají silanové skupiny podél vnitřní stěny kapiláry tendenci ionizovat a vytvářet tak na rozhraní stěny kapiláry a elektrolytu elektrickou dvojvrstvu. Kdyţ se do systému zavede stejnosměrný proud, kationty v elektrolytu v blízkosti stěny kapiláry se pohybují směrem ke katodě a strhávají elektrolyt s sebou. Tak se vytváří elektroosmotický tok směrem ke katodě. Různě nabité molekuly v separovaném vzorku se pohybují různými směry podle náboje, ale všechny jsou neseny ve směru katody díky elektroosmóze. Kladně nabité molekuly dosáhnou katody jako první, neboť elektroforetická migrace i elektroosmotický tok mají stejný směr. Jestliţe se za podmínek volné kapilární elektroforézy separují anionty, pak elektroosmotický tok elektrolytu a elektroforetická migrace mají opačný směr. Směr elektroosmotického toku však můţe být změněn přidáním povrchově aktivních chemických aditiv do elektrolytu. 114

115 Stanovení molekulových hmotností proteinů a peptidů pomocí SDS-PAGE Nejjednodušší způsob stanovení molekulové hmotnosti purifikovaných proteinů nebo peptidů je spojen s jednorozměrnou denaturační elektroforézou, provedenou na gradientovém gelu. Nabarvením tohoto gelu Coomassie brilliant blue modří a srovnáním velikosti sledovaného proteinu s pouţitým proteinovým standardem, který je komerčně dostupný, určíme velikost sledovaného proteinu. Pro určení molekulové hmotnosti a izoelektrického bodu se pouţívá dvourozměrná denaturační elektroforéza. Pokud chceme sledovat změny molekulových hmotností v souvislosti s posttranslačními modifikacemi (např. glykozylacemi), známe-li tedy hmotnost sledovaného proteinu, zvolíme hustotu polyakrylamidového gelu tak, aby umoţňoval maximální rozlišení v oblasti sledovaných molekulových hmotností (pod 40 kda na 12% gelech, kda na 10% gelech, kda na 8% gelech, nad 200 kda na 6% gelech). Pouţijeme vhodný proteinový marker a hmotnost proteinu odečítáme od tohoto markeru. V současné době je dostupná celá řada proteinových markerů, která zahrnuje markery vhodné pro různé způsoby detekce, mající různou škálu hmotnostních markerů. Sledované proteiny můţeme detekovat buď barvením gelu bromfenolovou modří, nebo immunodetekcí. Zvolený způsob detekce zvolíme v závislosti na mnoţství sledovaného proteinu a typu experimentu, který provádíme. Flow field flow frakcionace (FFFF) Flow field flow frakcionace je velmi účinná metoda pro separaci makromolekul, proteinů, koloidů a nanočástic s obrovským dynamickým rozsahem (tj. všechny tyto analyty mohou být separovány společně v jednom separačním běhu a s vysokým rozlišením). V kombinaci s MALS detektorem (rozptyl světla) poskytuje FFFF spolehlivou a absolutní (tj. bez potřeby kalibrace pomocí standardních částic) velikostní charakterizaci vzorku, čímţ nahrazuje mnohem draţší, pracnější a časově náročnější techniky, jako je analytická ultracentrifugace, elektronová mikroskopie a AFM (atomic force microscopy, mikroskopie atomárních sil). Field flow frakcionace (FFF) je zaloţena na spolupůsobení laminárního toku a transverzálního (kolmého) silového pole. Separace probíhá v kanálu tvořeném dvěma plochými skleněnými, kovovými, nebo plastovými deskami oddělenými folií spacerem. Tento spacer udává výšku separačního prostoru, která se pohybuje mezi 80 aţ 500 μm. Nejjednodušším a historicky prvním provedením FFF je gravitační FFF. Představme si, ţe do separačního kanálu nastříkneme směs částic a (o průměru 10 μm) a b (o průměru 0.5 μm). Zatímco všechny částice a pro svoji větší hmotnost sedimentují aţ na dno (akumulační stěnu) kanálu, menší částice b kromě sedimentace vykonávají i Brownův pohyb, a tudíţ vytvoří rovnováţnou zónu o určité výšce nad akumulační stěnou kanálu. K vlastní separaci pak dojde spuštěním průtoku a vytvořením parabolického profilu toku: 115

116 částice a jsou eluovány proudnicí, která je nejblíţe ke dnu, a je tudíţ nejpomalejší. Zóna částic b zasahuje do vyšších, a tudíţ rychlejších proudnic, proto je eluována dříve. Záměnou gravitačního pole za jiné transverzální silové pole (např. termální gradient, elektrické pole, příčný tok) vznikla celá rodina FFF technik. Asymetrická flow field flow frakcionace (AF4) vyuţívá síly příčného toku, který unáší vzorek k akumulační stěně kanálu (Obr. 6.1). Zatímco horní stěna kanálu pro AF4 je nepropustná, akumulační stěna je vyrobena z porézní frity, takţe je propustná a při vhodném tlaku uvnitř kanálu umoţňuje příčný tok. Frita je pokryta ultrafiltrační membránou o velikosti pórů 10 kda, aby nedocházelo k úniku vzorku akumulační stěnou. Aby byl zajištěn konstantní tlak po celé délce kanálu, profil kanálu se zuţuje. Jak uţ bylo zmíněno výše, menší analyty jsou eluovány rychleji, protoţe vytvářejí rovnováţné Brownovské zóny v oblasti vyšších (rychlejších) proudnic, takţe na výstupu z kanálu jsou analyty separovány podle velikosti. Závislost elučního objemu na molekulové hmotnosti nebo velikosti částic je u FFF opačná ve srovnání s gelovou permeační chromatografií (GPC), kde jsou větší molekuly eluovány dříve neţ molekuly s menší velikostí (Obr. 6.2). Obrázek 6.1: separační princip AF4 Kromě velkého dynamického rozsahu nabízí AF4 další velkou výhodu uvnitř kanálu není ţádné medium, které by mohlo se vzorkem nějak reagovat, takţe ani v případě velkých polymerů se nemusíme obávat střiţných sil. Střiţné síly působí např. U GPC, kdy se větší komplexy, např. Viry nebo nekovalentně vázané proteinové komplexy, mohou rozpadat vlivem střiţných sil při penetraci porézní chromatografickou matricí. Celá separace je velmi jemná, rychlá, není destruktivní a nehrozí zde interakce se stacionární fází, která by mohla vést ke změně elučního chování (opět případ GPC, kdy 116

117 se některé proteiny mohou kvůli interakci s matricí eluovat anomálně), k degradaci nebo ke změně vzorku. Obrázek 6.2. AF4 kanály AF4 má své nezastupitelné místo v molekulární biologii, v nanotechnologiích, environmentálních analýzách, při separacích a charakterizacích proteinů a jejich agregátů, při separaci liposomů, emulzí, virových částic, polysacharidů, nanočástic, polymerních latexů, koloidů, huminových kyselin atd. ve spojení s moderními detektory (UV-VIS, fluorescenční detektor, mikroviskozimetrický detektor, refraktometrický detektor, MALS - multi-angle light stattering detektor) a případně GPC umoţňuje tento systém jedinečnou separaci polydispersních vzorků s vysokým dynamickým rozsahem velikostí částic a jejich fyzikálně-chemickou charakterizaci, zahrnující i absolutní molekulovou hmotnost a případně tvar molekuly (např. Větvení polymerů). 117

118 Obrázek 6.3. Charakteristika solubilizovaných pšeničných gluteninů AF4 MALS Červená - odezva MALS detektoru (rozptyl světla) při 90 ; modrá - odezva UV detektoru; černá - průběh velikosti molekulární hmotnosti ve frakcích. Obr. 6.3 ukazuje vyuţití AF4 ve spojení s MALS detektorem pro identifikaci rozdílů ve velikostní distribuci a konformaci nízkomolekulárních a vysokomolekulárních podjednotek gluteninu z pšeničné mouky. Komerční usopořádání FFF je zobrazeno na Obr Obrázek 6.4. Přístroj Eclipsea FFF od firmy Wyatt 118

119 Stanovení hydrodynamického poloměru pomocí DLS (Dynamic light scattering) Metoda DLS je známa také pod názvy kvazielastický rozptyl světla (QELS quasi elastic light scattering) a foton korelační spektroskopie (PCS photon correlation spectroscopy). Je vhodná zejména pro stanovení hydrodynamického poloměru nanočástic a také jeho změn v důsledku různých interakcí nanočástic. Lze ji také pouţít k charakterizaci vzorků s bimodální nebo oligomodální distribucí částic v roztoku. Základem metody DLS je měření fluktuace intenzity rozptýleného světla z laserového zdroje okolo její průměrné hodnoty. Tyto fluktuace souvisí s interferenčním zeslabováním a zesilováním světla rozptýleného na nestacionárních částicích dispersní fáze, podléhajících Brownovu pohybu. Rozptyl světla Rozptyl je obecný fyzikální proces, v němţ jsou některé druhy záření, jako je světlo, zvuk nebo pohybující se částice, přinuceny se odchýlit od přímé trajektorie. Kdyţ paprsek světla prochází koloidní dispersí částic, jeho paprsek se rozptyluje ve všech směrech. V případě, ţe částice jsou velmi malé ve srovnání s vlnovou délkou světla, je intenzita rozptýleného světla izotropní, tj. stejná ve všech směrech (Rayleighův rozptyl). Pro větší částice (nad průměr přibliţně 250 nm) existuje úhlová závislost intenzity rozptýleného světla (Mieho rozptyl). Tuto úhlovou závislost popisuje teorie, kterou vytvořil Mie. DLS vyuţívá Reyleighův rozptyl světla (Rayleigh scattering). V případě proteinů se jedná o částice, které jsou výrazně menší (do 30 nm), neţ je pouţitá vlnová délka světla laseru (obvykle he-ne laser s λ 633 nm). V případě, ţe velikost částice je daleko menší neţ vlnová délka pouţitého světla d λ / 10, dochází k izotropickému rozptylu, coţ znamená, ţe intenzita rozptýleného světla vertikálně polarizovaného laserového paprsku je stejná ve všech směrech. Tím, ţe úhlové rozloţení intenzity rozptýleného světla je konstantní, lze v případě proteinů částic provádět měření při jednom úhlu pro stanovení jejich hmotnosti (jak uvidíme níţe). Obvykle se pouţívá snímání světla v úhlu 90 a nebo nověji při zpětném úhlu 173 (back scattering). Toto uspořádání umoţňuje měření i koncentrovaných vzorků, neboť je potlačen vliv vícenásobného rozptylu světla. Rayleighova aproximace udává, ţe intenzita rozptýleného světla je úměrná šesté mocnině průměru částice a nepřímo úměrná čtvrté mocnině vlnové délky světla pouţitého laseru. Ι d 6 ; ι 1 / λ 4 119

120 Ι = intenzita rozptýleného světla; D = průměr částice; λ = vlnová délka světla laseru Přítomnost velkých částic (např. Agregáty proteinů, fragmenty buněk, prach a nečistoty) překrývá signál malých částic. Např. Intenzita rozptýleného světla na částicích s průměrem 50 nm je milionkrát větší neţ intenzita světla rozptýlená na částicích s průměrem 5 nm. Jinými slovy, intenzita rozptýleného světla jednou takovou částicí je ekvivalentní intenzitě světla rozptýleného milionem částic s desetkrát menším poloměrem. Inverzní vtah mezi intenzitou rozptýleného světla a vlnovou délkou laseru nám napovídá, ţe pro měření malých částic v nízké koncentraci můţe být výhodné pouţití laserů s kratší vlnovou délkou. Prakticky je však He-Ne laser 633 výkonem 10 mw dostačující pro většinu měření. Brownův pohyb Brownův pohyb je náhodný pohyb malých částic, který je způsobován nárazy molekul rozpouštědla (voda, ionty solí). Čím větší je částice, tím menší je vliv nárazů molekul rozpouštědla a tím pomalejší Brownův pohyb tato částice vykonává. Naproti tomu na malé částice, které mají také menší hmotnost, má náraz molekul rozpouštědla daleko silnější účinek a změna rychlosti a směru pohybu je výraznější. Technika DLS měří Brownův pohyb částic a dává jej do vztahu s jejich hmotností. Velikost Brownova pohybu je určena parametrem zvaným difuzní koeficient a je označována jako D (m 2 /s). n = viskozita rozpouštědla (voda = 8,94 x 10-4 kg/ms); T = teplota ( K); D = difuzní koeficient (m 2 /s); k B = boltzmannova konstanta (1,3807 x J/K); d = průměr koule (m). Z rovnice je patrné, ţe difuzní koeficient D pro danou částici je nepřímo úměrný jejímu průměru a je závislý na teplotě (kinetická energie částic rozpouštědla) a viskozitě (odpor kladený pohybu částice v rozpouštědle). Je tedy jasné, ţe pro měření pomocí DLS je nezbytná přesná znalost teploty a viskozity rozpouštědla. Je vhodné připomenout, ţe hodnota viskozity je závislá na teplotě. Jakýkoliv ne-brownovský pohyb (např. Sedimentace částic, konvexní proudění kapaliny vlivem nehomogenity teploty v cele, 120

121 koncentrační nehomogenita vzorku) vnáší velikou chybu do stanovení d, a tím i hydrodynamického poloměru částic R h. Na základě Stokes-Eeinsteinovy rovnice můţeme vyjádřit hydrodynamický poloměr částice R h jako: R(h) = kt / 3πεd Pro proteiny pak můţeme vypočítat molekulovou hmotnost na základě znalosti R(h) ze vztahu: mw = (d x α) β d = průměr koule v nm α = korekční faktor = 1,68 korekční faktor = 2,3398 hmotnost v kda Hydrodynamický poloměr proteinu (R h ) Skutečný tvar molekuly většiny proteinů se liší od kulového tvaru (např. Elipsoid, tyčka, disk). Hydrodynamický poloměr je tedy aproximací skutečného tvaru proteinu na tvar koule o takovém poloměru, pro který by tato koule vykazovala stejný difuzní koeficient d jako daný protein. Obrázek 6.5. Srovnání pohybu malé a velké částice vlivem Brownova pohybu 121

122 Princip metody DLS Pouţijeme-li koherentní a monochromatický paprsek laseru, je moţné s pomocí vhodného detektoru, jako např. Fotonásobiče, stanovit v krátkých časových intervalech mnoţství rozptýlených fotonů, a tak přesně měřit intenzitu světla rozptýleného částicemi ve vzorku. Vzhledem k Brownovu pohybu částic fluktuuje hodnota intenzity rozptýleného světla kolem střední hodnoty, dané velikostí a koncentrací částic ve vzorku. Fluktuace intenzity rozptýleného světla jsou způsobeny Brownovým pohybem částic, který způsobuje, ţe vzdálenost mezi částicemi se neustále mění, coţ ovlivňuje konstruktivní a destruktivní interferenci světelných vln emitovaných sousedními částicemi rozptýlenými v osvětlené oblasti vzorku. Kolísání intenzity rozptýleného světla, které je zaznamenáno detektorem, obsahuje informaci o pohybu částic, tedy o jejich difuzním koeficientu, a tedy o jejich hydrodynamickém poloměru. Obrázek 6.6. Fluktuace signálu intenzity rozptýleného světla 122

123 Časová závislost intenzity fluktuace je nejčastěji analyzována pomocí digitálního korelátoru, který provádí srovnání okamţité hodnoty intenzity světla v čase t a srovnává ji s hodnotou naměřenou v čase t + δt; t + 2δt; t + 3δt; t + nδt. Řešením vztahu závislosti změny intenzity rozptýleného světla na čase je autokorelační funkce, která má tvar exponenciálního poklesu korelačního koeficientu. Čím větší je pohyb částic, tím rychleji klesá korelační koeficient. Analýza autokorelační funkce vede k získání translačního difuzního koeficientu d a výpočtu hydrodynamického poloměru R(h). Autokorelační funkce g I t I t I t 2 A Be 2 2q D q 4 n sin 2 I = intenzita rozptýleného světla v čase t Konstanty přístroje: A = základní hladina B = faktor související s optikou přístroje q = vektor rozptylu D = translační difuzní koeficient τ = časová změna, n = index lomu vzorku λ = vlnová délka světla laseru, α = úhel rozptylu Získání informace o velikosti částic z autokorelační funkce 123

124 Pro tento účel byla vyvinuta řada algoritmů, které lze rozdělit do dvou skupin. První skupinu tvoří algoritmy, které autokorelační funkci vyjádří jako jednoduchou exponenciální funkci a výsledkem je průměrná velikost označovaná jako δ-průměr (zetaaverage diameter) a šíře distribuce velikosti, která je označována jako index polydispersity (PDI, polydispersity index). Druhý přístup je zaloţen na vyjádření autokorelační funkce multiexponenciální funkcí, která umoţní charakterizovat distribuci velikosti částic v heterogenních vzorcích s bimodální nebo polymodální distribucí velikosti částic. Nejčastěji se setkáme s algoritmy označovanými zkratkou NNLS (nonnegative least squares) nebo CONTIN. Pro monodispersní systémy má autokorelační funkce jednoduchý tvar, zobrazený na Obr Obrázek 6.7a. Průběh jednoduché autokorelační funkce pro standardní 96 nm polystyrenové částice Obrázek 6.7b. Srovnání tvaru autokorelační funkce (rychlost poklesu korelačního koeficientu) pro malé částice (ovalbumin) a velké částice (nanočástice oxidu křemičitého) 124

125 V případě polydispersních vzorků je tvar autokorelační funkce vlivem příspěvků od různě velikých částic podstatně komplikovanější, ale rovněţ řešitelný. Tvar autokorelační funkce pro bimodální distribuci je Obr Obrázek 6.8. Tvar korelační křivky pro bimodální distribuci 125

126 Analýza autokorelační křivky v monomodálním modu poskytne kumulativní velikost 12,4 nm (z-average diameter), zatímco pouţití analýzy multimodální distribuce ukazuje na existenci částic o velikosti 3,5 nm a 388 nm. Vyjádření výsledků distribuce velikosti Distribuci velikosti částic lze vyjádřit jako 1) distribuci podle intenzity rozptýleného světla; 2) distribuci podle objemu částic; 3) distribuci podle počtu částic. 1. Distribuce velikosti je vynesení relativní intenzity světla rozptýleného částicemi v určité velikostní škále (třídě). Toto vynesení je nazýváno distribuce podle intenzity. Pro monodispersní vzorky s nízkou polydispersitou není třeba převádět distribuci podle intenzity na distribuci podle objemu částic. V případě polydispersního vzorku nebo vzorku s multimodálním rozdělením velikosti je nezbytné provést převedení výsledků na distribuce podle objemu částic, které dává daleko realističtější pohled na takový vzorek. Ze vztahu velikosti částice a intenzity rozptýleného světla (viz odstavec rozptyl světla) vyplývá, ţe veliké částice v důsledku větší intenzity rozptylu světla silně nadhodnocují svůj příspěvek k celkové distribuci, která je vyjádřena jako distribuce podle intenzity. 2. Příspěvek částic z hlediska jejich objemu je vyjádřen distribucí podle objemu částic. Prakticky to znamená, ţe příspěvek jedné velké částice je zhruba ekvivalentní příspěvku tisíce částic s desetkrát menším průměrem. 3. Distribuce podle počtu částic pak charakterizuje systém z hlediska počtu částic v jednotlivých velikostních třídách. Obecně lze říci, ţe příspěvek větších částic je zvýrazněn v následujícím pořadí vynesení distribuce d: d (intenzita) > d (objem) > d (počet). Názorně pochopíme příspěvek jednotlivých vynesení z Obr. 6.9, kde je ukázán vliv velikosti částic na jednotlivá vynesení podle intenzity, objemu a počtu částic. Pokud analyzujeme vzorek připravený ze stejného počtu částic s průměrem 5 a 50 nm, pak vynesení podle počtu částic ukazuje poměr 1 : 1. Pokud převedeme data na distribuci podle objemu, pak poměr malých a velkých částic bude v poměru 1 : (objem kulovitých částic je roven to 4 / 3π(d / 2) 3, a tedy je v poměru třetích mocnin průměru). Další konverze dat na vyjádření podle intenzity pak dává poměr 1 : (intenzita rozptylu světla je podle rayleighovy aproximace úměrná šesté mocnině průměru částice). 126

127 Obrázek 6.9. Srovnání vyjádření distribuce částic podle množství, objemu a intenzity pro vzorek 5 a 50 nm částic smíchaných v poměru 1 : 1 Vliv prostředí na difuzní koeficient a tvar nanočástic V případě velmi malých částic, jako jsou proteiny, má na jejich difuzní koeficient vliv několik faktorů. Mezi hlavní můţeme zařadit změnu tvaru vlivem ph, iontové síly prostředí, teploty a interakce s dalšími molekulami (např. Dimerizace, interakce s lidgandy, deglykozylace ap.). Ionty v mediu a jejich koncentrace mohou ovlivnit difuzní koeficient ovlivněním tloušťky elektrické dvojvrstvy (debyeova dvojvrstva) a tím i δ-potenciálu. Tato dvojvrstva je větší v mediu s niţší vodivostí. Také povrchové struktury nanočástic jsou ovlivněny vlastnostmi media a tyto struktury mohou výrazně měnit jak tvar, tak difuzní koeficient částic. Zejména jsou tyto efekty silné u částic s povrchem modifikovaným polymery (v případě proteinů se jedná o glykoproteiny nebo proteiny modifikované syntetickými polymery jako polyethylen glykol, které zvyšují jejich stabilitu v séru). Díky své citlivosti je DLS je velmi vhodnou metodou pro sledování těchto jemných změn makromolekul a nanočástic v jejich přirozeném vodném prostředí. Přístroje pro měření pomocí DLS Existuje celá řada renomovaných firem, které nabízejí přístroje pro DLS. Jsou to např. Malvern, Nicomb, Coulter, Wyatt, Horiba, Brookhaeven. Zde se zmíníme o principu přístroje Nanosizer ZS od firmy Malvern, který patří k absolutní špičce. Tento přístroj se vyznačuje měřením signálu rozptýleného světla při zpětném úhlu 173 (backscattering angle). Toto uspořádání umoţňuje měření velmi hustých vzorků (aţ 40%), neboť eliminuje vliv vícenásobného rozptylu, který nastává při vysoké koncentraci 127

128 částic v roztoku. Tento přístroj také umoţňuje měření δ-potenciálu nanočástic, lze měřit v teplotním rozsahu 2 90 C, a tak studovat např. denaturační křivky proteinů, DNA a teplotně závislé strukturální změny nanočástic. Unikátní je také rozsah měření v rozmezí 0,6 nm aţ 6 µm. Tato citlivost je co do velikosti a koncentrace jedinečná a důleţitá pro studium proteinů, jejichţ velikost se pohybuje v jednotkách aţ desítkách nanometrů, a koncentrace lze pouţít jiţ v desítkách mikrogramů proteinu na mililitr. Zejména u vzácných vzorků je významná moţnost pouţití mikrocely s objemem 12 µl. Obrázek Optické uspořádání přístroje Nanosizer ZS Některé aplikace DLS při studiu proteinů: - Stanovení hydrodynamického poloměru Rh. - Stanovení absolutní molekulové hmotnosti a interakce s rozpouštědlem (optimalizace podmínek pro krystalizaci proteinů). - Studium čistoty preparátů a agregace proteinů. - Studium teplotní stability proteinů a proteinových preparátů. - Studium interakce proteinů (dimerizace, oligomerizace, interakce s ligandy, štěpení a degradace proteinů např. Účinek proteáz, glykozyláz, kináz, štěpení disulfidových S-S vazeb). - Vazba proteinů na nanočástice liposomy. - Solubilizace membránových proteinů a jejich rekonstituce do lipidních membrán. - Studium změny konformace proteinu na základě změny Rh a stanovení tvaru proteinu na základě vztahu mezi Rh a Rg. 128