Regulace translace REGULACE TRANSLACE PROTEINY A JEJICH POSTTRANSLAČNÍ MODIFIKACE. 1. Translační aparát. 2. Translace

Transkript

1 Regulace translace 1. Translační aparát 2. Translace 3. Proteiny a jejich posttranslační modifikace 4. Lokalizace bílkovin v buňce a jejich degradace 5. Translace v mitochondriích a chloroplastech REGULACE TRANSLACE PROTEINY A JEJICH POSTTRANSLAČNÍ MODIFIKACE Aminokyseliny Aminokyseliny Aminokyseliny = velmi malé biomolekuly, mw. 135 daltonů Ø Jsou stavebními kameny proteinů Ø Kostra aminokyselin určuje primární sekvenci proteinů Ø Vedlejší řetězce určují biochemické vlastnosti proteinů Ø Polární řetězce směřují na povrch proteinu a mohou reagovat s vodným prostředím buňky Základní složení všech aminokyselin 1

2 Proteiny, vytváření polymerních řetězcú Primární struktura proteinů peptidové vazby mezi aminokyselinami Proteiny primární struktura Peptidové vazby: mezi 2 aminokyselinami aminokyselin = peptid vetší počty aminokyselin uspořádaných do vyšších struktur = polypeptid N- a C- terminílní konce jsou ve fyziologickém ph ionizovány R=reaktivní místa = navazování vedlejších řetězců 3. Proteiny - primární struktura Peptidové, pevné kovalentní vazby = řetězení aminokyselin určené geneticky 2

3 3. Proteiny- sekundární struktura Bílkoviny, typy vazeb v polymérech Sekvence aminokyselin samouspořádávání nascentní bílkoviny Vazby mezi aminokyselinami na základě fyzikálně chemických interakcí Voda je polárním roztokem Proteiny - aminokyseliny Proteiny, typy aminokyselin hydrofobní 3

4 Proteiny, typy aminokyselin hydrofilní a ostatní Aminokyseliny Alanin druhá nejjednoduší, nejčastěji zastoupenou (hydrofobní) Arginin často v aktivních místech bílkoviny (basická, hydrofilní) Glutamová kyselina negativně nabitá, na povrchu bílkoviny (kyselá, hydrofilní) Glutation podíl na likvidaci volných radikálů Glycin nejdnodušší aminokyselina Prolin hromadí se za stresu Hydroxyprolin součást stěny buněk Leucin tvoří kostru proteinu (hydrofobní) Methionin iniciace proteosyntézy, nejméně zastoupenou aminokyselinou Fenylalanin nejčastější aromatickou aminokyselinou (velmi hydrofobní) Serin v aktivních místech pro fosforylace Tryptofan velmi málo zastoupena Tyrosin součást stěnových bílkovin Valin drží bílkoviny pohromadě Proteiny, typy vazeb v polymérech Proteiny, typy vazeb v polymérech kovalentní vazba: jednotlivé aminokyseliny mezi sebou do primární struktury bílkovín nekovalentní vazba sekundární uspořádávání bílkovin, vazba reversibilní Reversibilita reakcí: závisí na rychlostních konstantách reakcí poměr konstant=relativní míra produktů, směr reakce Vytváření disulfidických vazeb mezi 2 cysteiny 4

5 Proteiny Bílkoviny aminokyselin = peptid vetší počty aminokyselin uspořádaných do vyšších struktur = polypeptid Bílkoviny = proteiny (z řeckého slova proto = primární důležitost) První popis bílkovin: Berzelius 1838 První důkaz bílkoviny ve funkci enzymu: urea Sumner 1926 První bílkovinná sekvenace: insulin Sanger 1958 První strukturní studie bílkovin: hemoglobin, myoglobin Perutz a Kendrew 1958 Bílkoviny, jejich velikost Bílkoviny jejich lokalizace: Zviditelnění GFP 5

6 Cytochrom - bílkovina není statickou strukturou Bílkoviny, sekundární uspořádávání Alfa + beta šroubovice, beta list sekundární uspořádání dáno sekvencí aminokyselin, tvorba vodíkových můstků Beta list Bílkoviny, sekundární uspořádávání Bílkoviny, sekundární uspořádávání 6

7 Bílkoviny, terciární a quarterní uspořádávání Bílkoviny, terciární a quarterní uspořádávání 2 dvoušroubovice spojené smyčkou Motiv typický pro vápník a DNA vazebné bílkoviny 1 alfa helix spojen s beta šroubovicí Motiv typický pro DNA vazebné bílkoviny 2 alfa šroubovice ovinuté kolem sebe Motiv typický pro transkripční faktory Bílkoviny, terciální a quarterní struktura Bílkoviny, funkční uspořádání Molekula hemaaglutininu Bílkovina složena ze 3 domén, jako membránová bílkovina N- glykosylována kyselinou sialavou a) Myosin je dimer, tvořený 2 identickými těžkými řetězy (bílé) a 4 lehkými řetězy (zelené a modré) b) trojrozměrný model hlavové domény 7

8 Bílkoviny, jejich pohyb Bílkoviny, funkční proměnlivost Calmodulin je bílkovina se 4 šroubovicemi (EF1 EF4) a v každé z nich je Ca 2+ -vazebné místo Při zvýšení koncentrace Ca 2+ nad 5 x 10-7 M, se navazuje Ca 2+ na Calmodulin, mění jeho konformaci a Calmodulin se stává funkční bílkovinou ve fosforylaci Model spojující hydrolýzu ATP s pohybem myosinu podél aktinového vlákna Bílkoviny, funkční proměnlivost Různé podoby struktury Ras, guanin nukleotid-vazebné bílkoviny (bílkovina v inanktivní podobe, s navázaním GDP ( modrá) a)uhlíková kostra bílkoviny b) Lokalizace všech atomů c) Beta listy (azurová) alfa šroubovive (červená) d) Povrch bílkoviny ve vodném prostředí, pozitivně nabité částice (šedá), negativně nabité (červená) Bílkoviny, funkční proměnlivost Model katalytické podjednotky kinázy A v uzavřené funkční konformaci glycin rich sekvence uloví ATP ve štěrbině mezi doménami (b) Schéma otevřené a zavřené konformace v nepřítomnosti substrátu je otevřená, po vazbě substrátu se uzavírá, konformační změny bílkoviny vyvolané vazbou na substrát 8

9 3. Bílkoviny a jejich posttranslační modifikace Uspořádávání nascentních bílkovin Cesta od nascentní podoby k správně modifikované, lokalizované a plně funkční bílkovině Nascentní protein endoplasmatické retikulum Ø prostorové uspořádávání Ø postranslační modifikace Ø oligomerizace Ø třídění translokace lokalizace nezbytný podíl chaperonů buněčné kompartmenty májí své chaperony Nestávají se součástí bílkovinné molekuly Nenesou sterickou informaci Konformují bílkoviny tím, že zabraňují nežádoucím interakcím Uspořádání nascentních bílkovin Proteiny endoplasmatického retikula obsahují chaperony: Ø Ø Ø Ø zvyšují rychlost s jakou proteiny získávají konečnou podobu udržují protein v kompetentním stavu zabraňují nežádoucím interakcím stabilizují proteiny Chaperony = stresové bílkoviny Ø část konstitutivního spektra bílkovin buňky Ø krátkodobě vyšší hladina exprese v určitých fázích ontogenese Ø rychlá a intezivní exprese za stresu (za 1h stresu až 5% podíl stresových bílkovin) Buňka pozná a monitoruje nepořádek (neuspořádané nebo špatně uspořádané bílkoviny) chaperony Chaperony: nomenklatura chaperonů (HSP) podle molekulové hmotnosti na SDS PAGE (Drosophila) : Eukaryota 10-35kDa=sHSP 60kDa 70, 90, 110 kda skupina I HsP70 kda blokování nežádoucích interakcí mezi aminokyselinami bílkovinného řetězce Skupina II HsP60 kda nezbytná doprovodná součást putování a translokace bílkoviny na místo místo určení Chaperoniny pro Prokaryonta = GroEL + GroES: 60 kda GroEL uspořádávání bílkoviny odstraňování špatně uspořádané bílkoviny 9

10 Chaperony a chaperoniny GroEL: komplex 14 identických 60kDa podjednotek GroES: komplex 7 identických 10 kda podjednotek tight = -ATP+ADP = uzavřená struktura s navázanou bílkovinou relax = +ATP=uvolnění bílkoviny GroES/GroEL systém chaperony HSP70 = regulátor množství a aktivity chaperonů v buňce snížená hladina HSP70 = aktivace HSF (heat shock transkription factor) nestresovaná buňka = HSF inaktivován interakcí s HSP Ø GroEL+GroES = funkční interakce = stabilní komplex Ø Sílá a stabilita vazby ovlivněna vazbou substrátu- ADP xx ATP Ø GroES nasedá smyčkou tvořenou 20 aminokyselinami Ø nasednutí mění konformaci GroEL a podpoří tak naskládání bílkoviny do cylindru Ø komplex nasedá jen na nesložené bílkoviny Ø HSP70- stálá ATPázová aktivita (konzervativní oblast molekuly) ovlivnitelná inhibitory enzymů, Ca ionty a je nezbytná pro uvolnění doprovázené molekuly Ø jedna bílkovinná molekula se správnou nativní konfiguraci = až 100 ATP 10

11 Nascentní bílkovina Ko-translační modifikace bílkovin Získání translokační kompetence kompetence udělena: Ø ko-translační N-glykosylací Ø skládáním polypeptidu Ø tvorbou disulfidických vazeb Ø vytvářením oligomerů Ø odstraněním signální sekvence Získání funkčnosti po translokaci 3. Bílkoviny a jejich posttranslační modifikace modifikace bílkovin ko-translační nebo post-translační adice nebo delece Ø stabilizují strukturu Ø regulují enzymatické aktivity Ø modifikují strukturu a tím i schopnost translokace Ø slouží pro transport a lokalizaci proteinu v buňce Ø Ø ( pozor na možnost nežádoucích modifikací rekombinantních proteinů v heterologní buňce) nelze je odvodit z DNA sekvence modifikace typu deaminace, acetylace, fosforylace, glykosylace a oxidace mění molekulovou hmotnost proteinu a jsou detekovatelné na elektroforéze (možnost srovnání s nascentním nebo de-modifikovaným proteinem) 3. Bílkoviny a jejich posttranslační modifikace 3. Bílkoviny a jejich posttranslační modifikace N- a C- terminální modifikace = acylace, methylace, amidace Acylace (acetyl-, formyl-, pyroglutamyl-, myristyl-) ochrana proti aminopeptidázám Ø Acetylace: Ser, Ala, Met na N-konci charakterizuje většinu rozpustných proteinů Ø Formylace: Met, typická pro prokaryota Ø Myristylace: modifikace N-terminálního Gly nezbytnou součástí funkčnosti většiny signálních proteinů + membránových proteinů Nejčastější příčinou zablokování N-konce při charakterizaci proteinů N-terminální mikrosekvenací (postupným odbouráváním jednotlivých AMI z N- konce degradací podle Edmana, kdy je třeba volit metodu hmotnostní spektrometrie) 11

12 3. Bílkoviny a jejich posttranslační modifikace 3. Bílkoviny a jejich posttranslační modifikace N- a C- terminální modifikace = methylace, amidace Methylace Ø charakteristické pro histony, DNA-vazebné a ribosomální bílkoviny Ø metylovány jsou alfa-amino skupiny Ala, Met, Lys Ø často metylace omezeny jen na část proteinové molekuly Ø specifické metyltransferázy pro jednotlivé bílkoviny Amidace Ø modifikace AMI na C-terminálním konci 3. Bílkoviny a jejich posttranslační modifikace 3. Bílkoviny a jejich posttranslační modifikace modifikace jednotlivých AMI v celém řetězci prenylace, adenylace, hydroxylace, oxidace, fosforylace, glykosylace Hydroxylace významná u stěnových proteinů hydroxyproliny (hydroxylace až v stěně) Fosforylace a glykosylace mají největší podíl na funkčnosti proteinu Ø Fosforylace Ø nejvíce zastoupeny O-fosforylace serinu, threoninu, tyrosinu Ø až 1/3 cytosolických bílkovin fosforylována Ø řada klíčových enzymů je funkčních ve formě fosforylované a neaktivní po obsazení téhož tripletu AMI O-glykosylací 12

13 3. Bílkoviny a jejich posttranslační modifikace Glykosylace glykoprotein = polypeptid + glykan N- a O-glykosylace, obě rozhodují o funkčnosti proteinů N-glykosylace glykan připojen na amid kyseliny asparagové: Asn X Ser/Thr Ø ko-translačně = začíná na nascentním proteinu v ER přesně regulovaným procesem Ø významnou regulační funkci u rostlin, jejich exprese se podílí na nástupu jednotlivých etap ontogenese Ø N-glykoproteiny nedílnou součástí strukturálních bílkovin stěny buňky 0-glykosylace glykan připojen na hydroxyl serinu / treoninu Ø post-translační glykosylace až v Golgi a je reversibilní, cukerným zbytkem glukosaminem N-glykosylace Polyglykanový komplex = glykosid dolicholdifosfátu dolicholy: polyisoprenoly s řetězcem (n=14-24), tvořené nasycenými jednotkami alfa isoprenolu po navázání dolicholu do membrány je fosfátovým můstkem navázán první glykan tato makroergická vazba umožní vazby s asparaginem nascentní bílkoviny Ø C-glykosylace, S-glykosylace velice řídké 3. Posttranslační modifikace - N-glykosylace I dolichol je dlouhý řetězec isoprenů = polyisoprenoid, výrazně hydrofobní a víc jak jednou smyčkou je zanořen do membrány UDP-aktivované cukry přiváděny do membránového systému pomocí lipidového nosiče dolicholu 3. Posttranslační modifikace bílkovin N-glykosylace N-glykosylace mnohostupňový proces: Ø probíhá ko-translačně a UDP-aktivované cukry přiváděny do membránového systému pomocí lipidového nosiče dolicholu Ø dolichol je dlouhý řetězec isoprenů = polyisoprenoid, výrazně hydrofobní a víc jak jednou smyčkou je zanořen do membrány Ø po navázání dolicholu do membrány je fosfátovým můstkem navázán první glykan Ø tato makroergická vazba umožní vazby s asparaginem nascentní bílkoviny Syntéza oligosacharidu začíná na cytosolické straně a pokračuje na straně hrubého ER 13

14 3. Postranslační modifikace- N-glykosylace II N-glykosylace úloha dolicholu Asn X Ser/Thr N-glykosylace proměnlivost glykanové struktury 14

15 3. Postranslační modifikace - N-glykosylace 3. Postranslační modifikace - N-glykosylace manozové typy glykoproteinů: man5-9(glcnac)2 také u živočišnýcu buněk a u kvasinek komplexní typy glykoproteinů odlišné u rostlin: Ø neobsahují kyselinu sialovou Ø vazba xylozy a fukozy na manozovou kostru jen u rostlin a bezobratlých Ø vazba fukozy je poslední úpravou a neexistuje bez xylozy Ø vazba xylozy může být jedinou konečnou úpravou Asn X Ser/Thr: napojení oligosacharidového řetězce na nascentní bílkovinu Ø 1. stupeň glykosylace na ER, 2. stupeň v Golgi Ø 2. stupeň = konečná podoba: manozové nebo komplexní typy Ø Komplexní typy: fukozy, xylozy, (ne kyselinu sialovou) Konečná podoba = anténové glykany 3. Postranslační modifikace - N-glykosylace 3. Postranslační modifikace - N-glykosylace výskyt a funkce napojení glykanu má: nepřímý účinek Ø stabilita proteinu Ø přesnost prostorové orientace Ø ochrana před agregací Ø ochrana před proteolyzou Ø transport buňkou přímý účinek Ø syntéza biologicky aktivní molekuly = syntéza biologicky Ø aktivních glykanových anten Výskyt: glykoproteiny buněčné stěny sekreční proteiny Funkce: rozpoznávací, receptorová, signální? stěnové bílkoviny exprese regulována vývojově, kódovány mnohočetnými genovými rodinami Ø jejich relativní množství tkáňově a druhově specifické Ø jsou kotranslačně N-glykosylovány, mají signální peptid Ø 4 hlavní typy: glykoproteiny bohaté na hydroxyprolin (HRPG) glykoproteiny bohaté na prolin (PRPG) 15

16 3. Postranslační modifikace typy n-glykoproteinů 3. Postranslační modifikace typy n-glykoproteinů stěnové bílkoviny - arabinogalaktany (AGP) molekuly obsahují až 95% glykanových zbytků druhově specifická vysoká rozdílnost v relativním obsahu i složení repetice Pro(Hyp), Ala, Ser(Tyr) funkce nejasná, jeví se jako nespecifická, prostředník mnoha vzájemných vazeb polymerů Lektiny glykoprotyeiny bez glykanu Ø Lokalizovány ve vakuole v lipidových raftech na Golgi Ø Mají schopnost se vázat na glykany jiných glykoproteinů Ø Komplex glykoprotein-lektin- glykolipid = důležitá složka v procesu cell-cell-recognition 3. Postranslační modifikace - N-glykosylace 3. Postranslační modifikace - N-glykosylace Účinek inhibitoru tunicamycinu = postupná deglykosylace castasnosperminu = přeglykosylováno inhibitory syntézy N-glykoproteinů: inhibice napojení primárního oligosacgaridu TUNICAMYCIN (antibiotikum) DEOXYJIRIMYCIN (alkaloid) inhibice glukozidázy I a II CASTANOSPERMIN (alkaloid) inhibice manozidáz SWAINSONIN (alkaloid) 16

17 3. Posttranslační modifikace reversilní: O-glykosylace - fosforylace O-glykosylace a fosforylace: Ø Ser/Tre/Tyr Ø Vratné, rychlé, funkční modifikace 3. Posttranslační modifikace O-glykosylace - fosforylace 1. nejčastěji zjištěny 2 molekuly GLcNAc navázány na Ser/Thr 2. polypeptid mnohem stabilnější než glykan 3. O- glykosylace je dynamickým procesem 4. O a N glykosylace probíhají zřejmě na stejném místě v cis-golgi 5. nejznámější příklady: arabinogalaktany proteiny bohaté hydroxyprolinem RNA-polymeráza II (O-glykosylovaná --- fosforylovaná) extensiny: obsahují repetice Ser-(HYP)4 a Tyr-Lys-Tyr lektiny Glykanové řetězce určují krevní skupiny 17