Možnosti diagnostiky chorob u kanců a v inseminačních dávkách MVDr. Petr Václavek, Ph.D. Státní veterinární ústav Jihlava

Transkript

1 Možnosti diagnostiky chorob u kanců a v inseminačních dávkách MVDr. Petr Václavek, Ph.D. Státní veterinární ústav Jihlava MEVET / Topigs Norsvinseminář, Michalovice, 10. března 2015

2 Možnosti diagnostiky chorob u kanců a v inseminačních dávkách OBSAH: 1) Laboratorní diagnostika u kanců obecně 2) Diagnostické metody chorob prasat/kanců a interpretace výsledků 3) Standardní a alternativní postupy odběrů vzorků pro lab. diagnostiku 4) Porcinní epidemická diarhoea (PED)

3 Laboratorní diagnostika u kanců obecně povinné vyšetřování SZ viz Metodika kontroly zdraví povinné úkony hrazené ze státního rozpočtu brucelóza, KMP, ACH, VCHP dobrovolné vyšetřování monitoring PRRS apod. cílené diagnostické testy kontrola semene bakteriologická/virologická

4 Laboratorní diagnostika u plemenných kanců obecně povinné vyšetřování Metodika kontroly zdraví - povinné úkony hrazené ze státního rozpočtu EpB130BRUCELÓZA VyLa- sérologické vyšetření (RBT+ RVK) Plemenní kanci vhospodářství původu před přijetím do izolační stáje vsouladu s přílohou č. 5 kvyhlášce č. 380/2003 Sb. EpB131BRUCELÓZA VyLa- sérologické vyšetření (RBT + RVK) Plemenní kanci vestřediscích pro odběr spermatu 1x ročně - vsouladu spřílohou č. 5 kvyhlášce č. 380/2003 Sb. EpB132BRUCELÓZA VyLa- sérologické vyšetření (RBT + RVK) Plemenní kanci vizolační stáji před přijetím do střediska pro odběr spermatu nejdříve za 15 dnů po zahájení izolace - vsouladu spřílohou č. 5 k vyhlášce č. 380/2003 Sb.

5 Laboratorní diagnostika u plemenných kanců obecně povinné vyšetřování Metodika kontroly zdraví - povinné úkony hrazené ze státního rozpočtu EpB303 KLASICKÝ MOR PRASAT VyLa - sérologické vyšetření (ELISA) Plemenní kanci vhospodářství původu před přijetím do střediska pro odběr spermatu vsouladu spřílohou č. 5 kvyhlášce č. 380/2003 Sb. EpB304 KLASICKÝ MOR PRASAT VyLa- sérologické vyšetření (ELISA) Plemenní kanci ve střediscích pro odběr spermatu 1x ročně -vsouladu spřílohou č. 5 kvyhlášce č. 380/2003 Sb. EpB403 AUJESZKYHOCHOROBA VyLa- sérologické vyšetření (ELISA) Plemenní kanci vhospodářství původu před přijetím do izolační stáje vsouladu spřílohou č. 5 kvyhlášce č. 380/2003 Sb. EpB404 AUJESZKYHO CHOROBA VyLa-sérologické vyšetření (ELISA) Plemenní kanci ve střediscích pro odběr spermatu 1x ročně -vsouladu spřílohou č. 5 kvyhlášce č. 380/2003 Sb. EpB405 AUJESZKYHO CHOROBA VyLa-sérologické vyšetření (ELISA) Plemenní kanci v izolační stáji před přijetím dostřediska pro odběr spermatu nejdříve za 15 dnů od zahájení izolace -vsouladu s přílohou č. 5 kvyhlášce č. 380/2003 Sb.

6 Státní veterinární ústav Jihlava Komplexní diagnostika chorob prasat ODDĚLENÍ bakteriologie virologie patologie chemie parazitologie krmiva bakteriologická vyšetření virologická a sérologická vyšetření molekulárně-biologická vyšetření histologická a imunohist. vyšetření patologicko anatomická vyšetření biochemická, toxikologická a hematologická vyšetření parazitologická vyšetření mikrobiologická, mykologická a chemická vyšetření Výsledek vyšetření + interpretace, konzultace a návrh řešení.

7 Diagnostické metody A) Nepřímý průkaz = sérologický průkaz specifických protilátek MATERIÁL: sérum, plasma, sliny B) Přímý průkaz = průkaz patogena/antigenu / nukleové kyseliny MATERIÁL: krev, sliny, sperma, výtěry, trus, sekční materiál, seškraby 7

8 Diagnostické metody - nepřímý průkaz = sérologický průkaz specifických protilátek MATERIÁL: sérum, plasma, sliny ELISA APP, PRRS, M. hyop, PCV2, H. parasuis, P. multocida, SIV, VGP, KMP, AMP, VCHP, ACH, Salmonella sp., brucelóza, chlam., PED, Lawsoniaintracellularis, atd. hemaglutinačně-inhibiční test (HIT) PPV rychlá a pomalá aglutinace (RA) brucelóza reakce vazby komplementu (RVK) brucelóza, chlamydióza MAT Leptospira sp. VNT, NPLA, IPMA KMP, AMP, ACH, apod. 8

9 Diagnostické metody - přímý průkaz = průkaz patogena /antigenu / nukleové kyseliny MATERIÁL: krev, sliny, sperma, výtěry, trus, sekční mat. (realtime) RT PCR PRRS, SIV, KMP VGP, PRCoV, PED (realtime) PCR PCV2, AMP, PPV, PMT, HP, APP, M. hyop., B. hyodysenteriae, L. intracellularis, Mycoplasmasuis imunochromatografickýtest rotaviry, VGP, PED imunohistochemie PCV2 izolace virologická / bakteriologická 9

10 Interpretace výsledků není pouze problém diagnostických metod limity diagnostické metody -specifita, sensitivita, robustnost, atd. reprezentativní počet vzorků /frekvence vzorkování stádium onemocnění -virémie/bakteriémie/ sérokonverze prevalence onemocnění klinické symptomy - při klinice je nejpravděpodobnější záchyt patogena (ale virus může být vylučován i před klinickými příznaky i po odeznění) materiál/vzorek - vylučování viru do spermatu apod., správný odběr, uchování a transport vzorků

11 Interpretace výsledků není pouze problém diagnostických metod Příklad - PRRSV aneb co vše ovlivňuje výsledek diagnostiky a jeho následnou interpretaci PCR diagnostika viru PRRS: RT PCR and nested PCR (diferenciace EU a AM kmene) Real-time RT PCR PCR detekuje NK (nemusí být infekční) k infekci je třeba určité dávky mírná klinika u kanců s infekcí PRRS virus kanci vylučují již 1-2 týdny před sérokonverzí (2.-9. den pravidelně, den variabilně) v krvi je virus detekován dříve a ve větší kvantitě než v semeni (rozdíl cca 2 dny) striktní používání pouze ELISA testů bez PCR není doporučováno v momentě potvrzení sérologické pozitivity už může být viru sířen spermatem dále dlouhodobé/intermitentní vylučování viru PRRS u kanců virus perzistuje v tonsilách a m.u. ( dnů) RNA PRRS virus je citlivý k degradaci transport vzorků, uchování,!!

12 Příklad PRRSV aneb co vše ovlivňuje výsledek diagnostiky a následnou interpretaci IDEXX PRRS X3 Ab Test ELISA Oral Fluid IDEXX AniGen PRRS Ab ELISA 4.0 (Bionote) INGEZIM PRRS 2.0 (Ingenasa) imunoperoxidázovýtest -IPMA (AM/EU kmeny) specifita ELISA testů = téměř 100%, ALE falešně pozitivní výsledky mohou být - nutnost konfirmačních testů či nutný opakovaný odběr k potvrzení diagnostiky SVÚ Jihlava -nové ceny ELISA testů (od ): IDEXX ELISA = 230,- Kč / 1 vzorek (zvýšeno pravděpodobně pouze dočasně) ostatní ELISA = 150,- Kč / 1 vzorek ELISA vmezinárodních kruhových testech ověřena kvalita a srovnatelné výsledky testů AniGen a Ingezim

13 Interpretace výsledků není pouze problém diagnostických metod Příklad PRRSV aneb co vše ovlivňuje výsledek diagnostiky a následnou interpretaci IDEXX PRRS X3 Ab Test

14 PRRS ELISA akvalitativní/kvantitativní výsledek IDEXX PRRS ELISA nám dává jednoduchý kvalitativní výsledek = pozitivní/negativní. Pozitivní kontrola je standardizována a reprezentuje signifikantní hladinu specifických protilátek proti viru PRRS. Relativní hladina protilátek je pak determinována kalkulací tzv. S/P hodnoty. Hodnota S/P (vzorek/pozitivní kontrola) je porovnáním výsledku OD vzorku svýsledkem OD známého standardu. Hraniční hodnota(cut-off) mezi poz.aneg. jestanovena na S/P =0,4. S/P poměr je rekalkulovánna titer-like value = ne pravý titr protilátek! 14

15 PRRS monitoring u plemenných kanců SPRÁVNÝ POČET VZORKŮ / FREKVENCE Obecná pravidla: doporučován sérologický monitoring v kombinaci s PCR testy ze stejných vzorků krve různá schémata pro monitoring PRRS: např. 1 x týdně test spermatu metodou PCR a měsíční sérologické testování séra četnost vyšetření a počet vzorků? STATISTIKA x EKOMOMIKA někdy povoleno směsování vzorků na PCR test (3-5 vz.) odůvodněné v negativních chovech, kde se testuje často ID by neměly být pouštěny bez negativního výsledku striktní používání pouze ELISA testů bez PCR není doporučováno v momentě potvrzení sérologické pozitivity už může být viru sířen spermatem dále

16 PRRS monitoring u plemenných kanců SPRÁVNÝ POČET VZORKŮ Počet vzorků k potvrzení nákazy Excel tabulka (včetně vlivu sensitivity použitého testu) Velikost populace (ks) 50 Požadovaná spolehlivost (95%) 95% Citlivost metody (%) 100% Předpokládaná prevalence (%) 5% Počet vzorků (ks) n 32 n = potřebný počet vzorků α = požadovaná jistota detekce infekce (většinou 0,95) D = počet infikovaných zvířat (odhad prevalence) N = velikost (četnost) populace

17 Počet vzorků pro 95% jistotu detekce infekce (1 nebo více) s testem se 100% senzitivitou Velikost populace SPRÁVNÝ POČET VZORKŮ Prevalence (%)

18 Správný počet vzorků Používáme malé množství vzorků, abychomzískaliinformace o velkém množství zvířat. Výsledek má zajistit relevantní informaciaplikovatelnounaceloupopulaci(halu,farmu). statistika určuje ideální počet vzorků praxe bere v úvahu také ekonomickou stránku Chovatel/majitel tlačí počet vzorků a frekvenci vzorkování dolů.potom přichází klíčové otázky: Kolik informací ztrácím? Jaká rizika vznikají snížením počtu vzorků (popř. frekvence)?

19 Standardní a alternativní postupy odběru diagnostických vzorků u kanců Matrice: KREV VÝTĚRY SEKČNÍ MATERIÁL SLINY SEŠKRABY Z MANDLÍ SPERMA

20 SPERMA a jeho specifika jako diagnostického vzorku Možnostilaboratorníhovyšetření: konvenční bakteriologické vyšetření - ne vždy optimální výsledky (přerůstání, interpretace, apod.) konvenční virologické vyšetření ne vždy optimální výsledky z různých důvodů nízká sensitivita, délka analýzy/izolace, interpretace, kontaminace TK,cytotoxicita na TK biologický pokus na prasnicích byl používán, citlivější než izolace na TK nelze systematicky používat zwelfare důvodů izpraktického hlediska molekulární diagnostika -PCR vysoká sensitivita, rychlé, vysoká kapacita (poč. vz.),ale

21 SPERMA a jeho specifika jako dg. vzorku na PCR pozitivní výsledek molekulární diagnostiky (PCR) nemusí znamenat, že sperma obsahuje infekční patogen detekujeme genom (NK) ne infekční organismus kinfekci je navít třeba jistá infekční dávka množství virových partikulí např. test RT-nPCR na PRRSV detekuje 100 TCID 50 /ins. dávku =20x méně viru než jetřeba na exp. infekci 1z5prasniček (Benfieldetal. 2000) ALE byla zaznamenána vysoká korelace (94%) mezi PCR aexp. infekcí, tzn. je vysoká pravděpodobnost, že vzorek spozitivním výsledkem vpcr obsahuje infekční dávku (Christopher-Henningsetal. 1995) sperma je ideální spíše pro pozitivní chov, kde se snažím limitovat šíření viru směrem dolů u PRRS pozitivního kance totiž nemohu dle séra předpokládat vylučování viru ve spermatu směsování vz. spermatu se nedoporučuje (kvůli nižší sensitivitě) virus PRRS v semeni intermitentní vylučování, nemusí korelovat s protilátkami a virem v krvi

22 SPERMA a jeho specifika jako diagnostického vzorku na PCR NATIVNÍ SPERMA vysoká koncentrace balastní DNA oproti hledanému targetu řešení úprava metodiky zpracování vzorku INSEMINAČNÍ DÁVKA problém naředění = snížení citlivosti testu potencionální inhibiční vlivy protektiv/ředidel, která by mohla způsobovat inhibici při PCR testu množství spermatu optimum 2 ks pejet/kapilár /1 zvíře - potřeba min. 200 uldo testu na izolaci NK (+ případná rezerva)

23 SÉRUM a jeho specifika jako diagnostického vzorku ideální vzorek virus PRRS vylučován dříve než v krvi a ve větší kvantitě preferovaný vzorek pro negativní stáj (sperma je ideální spíše pro pozitivní chov, kde se snažím limitovat šíření viru směrem dolů) možno směsování pro PCR diagnostiku (3-5 vz.) zpracování na PCR (PRRS) rychleji než standard na sérologii chlazené do 24 hodin do lab. krev 24 h/pokojová t. 3 dny/2-8 C sérum 7-14 dní/2-8 C déle při -20

24 Standardní a alternativní postupy odběrů vzorků krve Odběr vzorků krve u kanců: standardní odběr do HEMOS zkumavek v. jugularis, v. cavaanterior alternativní odběry ušní žíly -v. auricularis ocasní žíla v. caudalis mediana, perineal tarzální žíla v. tarsalis (v. saphenalateralis ne vždy vidět) na /do: filtrační papír (TEGO) tampon + PBS plast. kapilára mikrozkumavka KDY? na fantomu při ejakuaci!

25 Standardní a alternativní postupy odběrů vzorků krve Bloodswabmetod : krevní stěr komprese ušní žíly narušení jehlou (20G) stěr tamponem tyčinka s polyesterovým tamponem umístit do zkumavky s PBS (0,5-1 ml) odběr během ejakulace flinch rate = 10% (ne všichni kanci reagují pozitivně) naředění (7-20x ředící efekt) = nižší sensitivita testu směsování vzorků se nedoporučuje

26 Standardní a alternativní postupy odběrů vzorků krve Blood-swabmetod shoda s ostatními vzorky citlivější než testování spermatu! Reickset al. 2006

27 Standardní a alternativní postupy odběrů vzorků krve Blood-swabmetod : V séru je mnohonásobně vyšší koncentrace viru než ve vzorku krevního stěru = rizika Reicks et al NAVÍC brát v potaz: ideální podmínky experimentu krátká doba mezi odběrem a testováním neřeší se uchování a transport vzorku ELISA test na detekci protilátek použitelný jen při výrazném posunu cut off (Pattersonet al. 2007)

28 Standardní a alternativní postupy odběrů vzorků krve Plastiková kapilára s mikrocenrifugačnízkumavkou

29 Standardní a alternativní postupy odběrů vzorků krve Plastiková kapilára s mikrocenrifugačnízkumavkou : SAFE-T-FILL Serum Gel CapillaryCollection (RAM Scientific, USA) může obsahovat separační gel nebo antikoagulant výsledný vzorek je neředěné sérum cca 300 ulkrve může být málo pro dg zvíře musí být klidné jinak vznik bublin v kapiláře alternativa: Bio-Tubes, Biovetinc, Kanada 600 ulkrve Postup: narušení žíly jehlou často nestačí potřeba malého skalpelu ucho před zákrokem očistit alkoholem (ethanol nebo xylol) nebo lze kapiláru vsunout do jehly (18G)

30 Standardní a alternativní postupy odběrů vzorků krve Plastiková kapilární kapilárnízkumavka : Pattersonet etal. 2007

31 Standardní a alternativní postupy odběrů vzorků krve Mikrozkumavky : komprese ušní žíly narušení jehlou (20G) odběr do mikrozkumavky odběr během ejakulace na závěr opět komprese ušní žíly aby nevznikl hematom Deweyet al. 2006

32 Standardní a alternativní postupy odběrů vzorků krve TEGO swine blood collection kit

33 Standardní a alternativní postupy odběrů vzorků krve TEGO swine blood collection kit Detekce viru testem PCR porovnání: sérum x TEGO Detekce protilátek ELISA testem porovnání: sérum x TEGO

34 Standardní a alternativní postupy odběrů vzorků krve VÝHODY alternativních odběrů z periferních žil: jednodušší a méně invazivní odběry bez fixace = méně stresu = welfare bez rizik spojených s odběrem z v. jugularis potencionální poranění štítné žlázy, n. vagus, ductus thoracicus při pravidelném odběru méně nebezpečné pro kance i pro lékaře odběr do kapiláry a mikrozkumavkysrovnatelné se standardním odběrem z v. jugularis

35 Standardní a alternativní postupy odběrů vzorků krve NEVÝHODY alternativních odběrů z periferních žil: vněkterých případech nižší sensitivita naředění (stěry krve, filtrační papír) nevhodné na směsování (stěry, papír) v některých případech vyšší náklady? (TEGO, kapiláry) nutnost další validace postupů testování v praxi Copyright The Norwegian School of Veterinary Science

36 Porcinní epidemická diarhoea (PED) Epidemický průjem prasat AlphacoronavirusI. -VGP, PRCV AlphacoronavirusII. - PED Betcoronavirus-SARS Deltacoronavirus SwDCV HongKong, USA (Swine deltacoronavirus) Aktuální situace: USA genetická variabilita, kmeny s různou patogenitou Německo 2014 výkrmny a dva chovy prasnic - kmen úzce příbuzný s kmeny INDEL v USA - nízká patogenita Rakousko 2014 výkrmna s běhouny importovanými z Německa Nizozemsko 2014 Ukrajina 2014 podobný virulentním kmenům z Číny a USA Slovensko 2015 (detekováno na SVÚ Jihlava) nízce patogenní (5-6 dní průjem, do 10 dní úmrtnost 20-30% selat + prasnice 3-4 dny nežraly a nedávaly selatům mléko)

37 Porcinní epidemická diarhoea (PED) DIAGNOSTIKA na SVÚ Jihlava Průkaz viru/nk RT PCR nebo Real-time PCR 1000,-Kč imunochromatografickýtest - AnigenRapid TGE/PED Ag Test 200,-Kč (resp. 400 Kč s TGE) ICH -pouze rychlý orientační (spíše stájový) test s nízkou sensitivitou nutnost odběru vyššího počtu vz. PCR o několik řádů vyšší sensitivita i specifita Sérologický screening ELISA Ab

38 Děkuji za pozornost!

39 STÁTNÍ VETERINÁRNÍ ÚSTAV JIHLAVA Oddělení virologie