Vznik NMR signálu a jeho další osud.

Transkript

1 Vznik NMR signálu a jeho další osud.

2 NMR ecitace ce Zdrojem energie pro ecitaci jader je oscilující elektromagnetické záření s frekvencí ω o generované střídavým proudem : B = C * cos (ω o t) z z β M o β M o B B i i B o Vsílač () Je-li frekvence RF pole B a precesního pohbu magnetizace M o stejná, je dosaženo tzv. rezonanční podmínk a sstém absorbuje energii. Vzájemnou interakcí RF pole B a magnetizace M o dojde k jejímu překlopení kolem tohoto pole B o úhel β, který odpovídá velikosti dodané energie a době jejího působení.

3 Návrat magnetizace M o zpět do rovnováh (detekce NMR signálu) Při absenci eterního mag. pole B se M bude snažit přejít zpět nam o (rovnováha) obnovením původní distribuce populací N α / N β. Tento jev se nazývá relaace. z z M rovnováha... M o ω Oscilace vektoru M vtváří fluktující magnetické pole, které generuje elektrický proud v přijímací cívce: z M ω Přijímací cívka (-) NMR signál

4 Průběh signálu v přijímací cívce (-)( ): I = C * cos (ω o t) I t

5 Free Induction Deca (FID) Z důvodu relaace NMR odezv jednotlivých jader zanikají. Tento zánik probíhá eponenciálně a získáme tak signál, který je superpozicí cosinové a eponenciální funkce. M ω = ω o čas čas M ω ω - ω o <> 0 čas

6 FID (pokračování( pokračování) V reálném vzorku eistuje mnoho spinových sstémů o různých frekvencí, většinou rozdílných od nosné frekvence B. Z tohoto důvodu získáme mnoho odezev, které mají různou periodu a rozdílnou rchlost zániku. Takováto kombinace signálů vzorku se nazývá Free Induction Deca (FID): I = f (t) t sec Abchom získali NMR spektrum, musíme provést tzv. Fourierovu transformaci: I = f (ν)

7 Algoritmus zpracování FIDu a získání NMR spekter Nasnímání dat Vnásobení FIDu vhodnou matematickou funkcí (apodizace) Doplnění FIDu nulami(zero filling) Fourierova transformace Fázování spektra Referencování spektra

8 Zpracování dat digitální filtrování Nní máme signál v počítači. První operací při zpracování je tzv. digitální filtrování, nebo-li násobení FIDu vhodnou matematickou funkcí. Jak M zaniká, obsahuje čím dál více šumu: Kvalitní signál Většinou šum t sec Jednoduše vnásobíme FID funkcí, která potlačí šum:

9 Digitální filtrování (pokračování) V takovémto případě se jedná o eponenciální funkci: F(t) = * e -( LB * t ) nebo F(t) = * e -( t / τ ) Parametr LB se nazývá umělé rozšíření čár (line broadening). LB Použijeme-li parametr LB s opačným znaménkem, eponenciála roste, šum je zvýrazněn a dojde k zúžení signálu (zlepší se rozlišení). Eistuje celá řada dalších funkcí pro různé účel.

10 Zlepšení citlivosti nebo rozlišení Na následující FID bla aplikována eponenciální funkce s LB kladným a potom záporným a bl sledován efekt jak na FID, tak po FT na spektrum: t sec LB = 5.0 Hz LB = -.0 Hz t sec t sec FT FT

11 Velikost dat d a doplnění FIDu nulami Důležitý parametr je velikost dat (v datových bodech). Platí jednoduchý vztah, čím více datových bodů, tím je umožněno lepší digitální rozlišení (pokud to umožňuje povaha vzorku). Digitální rozlišení je definováno jako počet Hz na jeden datový bod: DR = SW / SI SW šířka spektra (Hz) SI velikost dat (bodech) Takže pro šířku spektra 5 KHz a FID snímaný do 6K, máme digitální rozlišení Hz/bod. Pokud je spektrální šířka (SW) velká a počet bodů paměti (SI) malý, digitální rozlišení bude také malé a dojde ke ztrátě informace. Jedním z řešení je zvětšit SI, což znamená větší objem dat a delší eperimentální čas. Druhým řešením je doplnění eperimentálních bodů nulami, tzv. zero filling na konci FIDu.

12 Zero-filling (pokračování( pokračování) Touto operací zvýšíme počet bodů paměti a tím i digitální rozlišení výsledného spektra. Nelze použít pokud máme špatně vzorkovaná data na začátku! 8K data 8K zero-fill t sec 8K FID 6K FID

13 Fourierova ova transformace ace a tvar signálu Matematická operace pomocí níž lze převést informaci ze závislosti na čase na závislost na frekvenci. f(ν) = f(t) e -i2πνt dt - f πtr i2πνt e e dt = ( πr ( ν ) = + i2πν ) e ( t R 2 ) FT ν 0 ν Tvar signálu je charakterizován tzv. Lorentzovou křivkou, kde ν je šířka signálu v polovině jeho maimální intenzit a nazývá se pološířka signálu.

14 R ν = = π 2 π T 2 Další příklad FT některých funkcí. cos( 2πν * t ) FT 2πν 2πν sin( 2πν * t ) FT 2πν 2πν

15 Fázování spekter offset nezfázované Rozdílná fázová korekce.řádu offset správně zfázované

16 Fázování NMR spekter Jedna z velmi důležitých operací při zpracování NMR spekter je nastavit správné fáze všech signálů. Co je příčinou toho, že různé odezv v jednom spektru mají tzv. rozdílnou fázi? Fázový posun 0. řádu: Je způsoben rozdílnou fází mezi vsílačem a přijímačem. z M o M B ω Přijímací cívka (-) ω

17 Fázování NMR spekter z M o M B ω Přijímací cívka (-) ω Fáze signálu je směsí reálné (cosinové)) a imaginární složk. I = C * cos (ω o t) I= C * sin(ω o t)

18 Fázování NMR spekter Fázový posun. řádu: K tomuto fázovému posunu dochází vlivem tzv. mrtvého času měřící sond, kd různé signál mají různou úhlovou rchlost (frekvenci), čímž dojde k různému posunu snímání jejich odezv. Jejich cosinové signál jsou navzájem z fázově posunuté. t ω I ν t

19 Fázování NMR spekter Rozdíl mezi fázovým posunem 0. a. řádu je v jejich závislosti na frekvenci příslušného signálu. Zatímco fázový posun 0. řádu je stejný pro všechn bod ve spektru, (nezávisí na frekvenci signálu), fázový posun. řádu lineárně vzrůstá se vzdáleností od nosné frekvence (závisí na frekvenci signálu). Chceme, ab výsledek blo spektrum se signál v čistě absorpčním tvaru. Provedeme fázovou korekci 0. řádu (stejnou pro všechn bod spektra) a poté korekci. řádu (korekce lineárně roste se vzdáleností od nosné frekvence). S(ω) = S(ω) + [ φ o + φ (ω) ] * S(ω) φ o fázová korekce 0. řádu φ fázová korekce. řádu

20 Radiofrekvenční puls. Radiofrekvenční puls je kombinací cosinové (frekvence ω o ) a krokové funkce. * = Toto je časový průběh. Chceme-li vidět, jaké frekvence puls pokrývá provedeme FT: t p FT ω o Výsledkem je signál se středem ω o, který pokrývá široký rozsah frekvencí oběma směr, tzv. šířku pásma (band width). Šířka pásma je nepřímo úměrná délce pulsu f / t.

21 Délka pulsp ulsu a sklápěcí úhel Sklápěcí úhel θ t je úhel vchýlení makroskopické magnetizace z rovnovážného stavu do rovin <>. Závisí na velikosti RF pole B, době jeho působení t p a gromagnetické konstantě γ měřeného jádra. z z M o t p θ t B M θ t = γ * t p * B Takto definujeme tzv. šířku (délku) pulsu, což je doba, za kterou dosáhneme otočení vektoru magnetizace o π / 4, π / 2, π...

22 D Pulsní sekvence Nejjednodušší pulsní sekvence, kterou se měří běžné H spektrum, obecněji jakékoliv jádro. Vektorově: z z M o 90 M puls Schématick: detekce n Tzv. fáze pulsu udává směr odkud je aplikováno RF pole. Vektor makroskopické magnetizace se okolo této os otáčí. Puls se označují 90 nebo 90, což znamená 90 o z os () v rotující soustavě souřadnic.

23 3 C spektra ( H dekaplink) H pravděpodobnost výsktu H - H ~00% pravděpodobnost výsktu H 3 C~ % 3 C pravděpodobnost výsktu 3 C 3 C ~ 0,0% pravděpodobnost výsktu 3 C H ~ 00% 3 C spektrum dominantní nepřímá spin-spinová interakce J HC ~ Hz 3 C spektrum s širikopásmovým protonovým dekaplinkem

24 3 C spektra ( H dekaplink) bez H dekaplinku αβ 3 C ββ H J (Hz) H αα 3 C βα I s H dekaplinkem αβ 3 C ββ H H βα αα 3 C I Schematick: 3 C: H: { H}

25 Spinové echo Mějme následující pulsní sekvenci: (or ) Analýzu začneme po 90 pulsu: z rozfázování 80 refokusace

26 Spinové echo (pokračování( pokračování) z detekce Zanedbáme-li vliv T 2 relaace dostaneme na konci stejný signál (pouze s opačným znaménkem) jako na začátku. Protože dojde k sfázování všech signálů ve spektru, tato sekvence umožňuje získat signál v absorpčním tvaru bez nutnosti aplikovat fázovou korekci. řádu. Spinové echo se vužívá pro měření spin-spinového relaačního času T 2 Spinové echo je stavebním kamenem mnoha důležitých NMR eperimentů.

27 Spinové echo a heteronukleární interakce Nní modifikujme trochu naší pulsní sekvenci pro měření spinového echa tak, že obsahuje H dekapling: (or ) 3 C: H: { H} Uvažujme nejprve CH sstém. Po π / 2 pulsu se bude 3 C M vvíjet pod vlivem J-interakce. Jinými slov, každý vektor bude označen jedním ze stavů H, a to α a β: z - 2πJ / 2 (α) φ (β) φ = π * * J. + 2πJ / 2

28 Spinové echo a heteronukleární interakce π puls z os převrátí jednotlivé vektor a ihned poté začneme dekaplovat H. Dojde k jejich zastavení (nevvíjejí se) a ke kolapsu v jeden: Pro různé hodnot bude signál vpadat následovně: = / 2J = / J

29 Spinové echo a heteronukleární interakce Signál se mění s cosinem, je nulový pro / 2J násobk a maimální/minimální pro / J násobk. Pro skupinu CH 2 je to následovně: = / 2J = / J Analogick pro CH 3 : = / 2J = / J

30 Attached Proton Test (APT) Za předpokladu, že CH interakční konstant jsou podobné a hodnota je nastavena na / J, získáme následující výsledek: OH HO ppm 2,3 5 7 Eperiment se jmenuje attached proton test (APT) a lze jej vužít pro rozlišení C, CH, CH 2, a CH 3.

31 Přenos polarizace Uvažujme dva proton, které jsou v interakci a mají velmi rozdílný chemický posun δ. Označíme je I a S, abchom dodrželi konvenci a označíme přebtek populace jednoho stavu nad druhým: αβ 2 I S 4 ββ S I αα 3 βα,3 2,4 I,2 3,4 S Nní ozáříme selektivně (měkký puls ) jen jednu čáru (jeden přechod). Dojde k vrovnání populací obou stavů a příslušná čára zmizí ze spektra. αβ 2 I S 4 ββ S I αα 3 βα,3 I 2,4,2 S 3,4

32 Přenos polariza rizace.. SPT and SPI Protože jsme změnili populace jednotlivých spinových stavů, dojde ke změně intenzit příslušných čar ve spektru. Přenesli jsme polarizaci (magnetizaci) z jednoho spinu na druhý. Toto se nazývá selektivní přenos polarizace (selective polarization transfer, SPT). Eistuje varianta tohoto eperimentu: s První puls je selektivní π puls. Invertuje populace pouze jednoho spinu: 3,4 αβ 2 I S 4 ββ S I αα 3 βα 2,4,2,3 Takovýto eperiment se nazývá selektivní inverze populace (selective population inversion, SPI).

33 Heteronukle leární přenos polarizace Z praktického hlediska má heteronukleární přenos polarizace mnohem větší význam než homonukleární varianta. Vužití pro navýšení intenzit málo citlivých jader! αβ 2 3 C 4 ββ H,2 3,4 H αα 3 C 3 βα,3 2,4 3 C H Pracujeme-li s kombinací jader 3 C a H, musíme brát v úvahu jejich vzájemný poměr gromagnetických konstant γ ku 4.

34 Heteronukle leární přenos polarizace - SPT Nní ozáříme selektivně přechod,2 a získáme následující rozdělení populací: αβ 2 3 C 4 ββ H 2,4 3,4 H αα 3 C 3 βα,3,2 3 C H Došlo k trojnásobnému navýšení intenzit jednoho z 3 C přechodů. V absolutní hodnotě (sečteme-li příspěvk obou čar) se jedná o dvojnásobné navýšení intenzit 3 C signálu. celkové navýšení =

35 Heteronukle leární přenos polarizace - SPI Nní proveďme stejnou analýzu pro SPI. Jestliže selektivně vměníme (obrátíme) populace stavů a 2, dostaneme: αβ 2 3 C 4 ββ H 2,4 3,4 H αα 3 C 3 βα,2 Pro pořádek. Začínali jsme s 3 C signálem takovéto intenzit: 3 C H,3 2,4,3 3 C Manipulací polarizace protonů jsme dospěli k čtřnásobnému navýšení 3 C signálu. Pochopitelně uvažujeme opět obě čár jak kladnou, tak i zápornou: celkové navýšení =

36 Heteronukle leární přenos polarizace Nní máme 3 C signál kladné a záporné a spektrum je zkaplované s H. Není ted možné začít s protonovým dekaplingem!!! Provedeme tzv. J-modulaci: 90 3 C: H: 80 s { H} Nastavíme na hodnotu / 2J. To znamená, že po π / 2 pulsu na a periodě dojde k tzv, refokusaci obou signálů 3 C.

37 Heteronukle leární přenos polarizace ( ) Budeme uvažovat pouze 3 C magnetizaci, protože pro H dojde pouze k převrácení populací na jednotlivých hladinách. Po π / 2 pulsu na 3 C máme +5 and 3 komponent magnetizace v rovině <>: J / 2 = / 2J J / 2 {H} {H} BEZ REFOKUSACE PŘED DEKAPLINGEM REFOKUSOVÁNO PŘED DEKAPLINGEM

38 Přenos polarizace s neselektivními puls Použijeme-li dva π / 2 puls vzájemně fázově posunuté o 90 o a oddělené periodou = / 2J CH, dosáhneme převrácení vektoru α = / 2J CH z z β α = / 2J β α J CH / 2 z z β β α 90 - α

39 Neselektivní přenos polarizace - INEPT Pokud rozšíříme sekvenci o heteronukleární spinové echo (odstranění rozdílu chemických posunů jednotlivých H) dostaneme pulsní sekvenci, která se nazýva INEPT (Insensitive Nuclei Enhancement b Polarization Transfer). Je to důležitý stavební blok mnoha pulsních sekvencí. Je používána pro navýšení citlivosti jader s nízkým γ jako např. 3 C a 5 N. Vpadá následovně: H: X: Velikost zvýšení citlivosti je úměrná poměru gromagnetických konstant spinu ecitovaného a spinu snímaného γ E / γ A. Pro 3 C ~ 4, pro 5 N ~ 0.