Využití HPLC pro různé typy analytů

Transkript

1 Využití HPLC pro různé typy analytů Josef Cvačka, Farmaceutické/klinické aplikace Analýza složek životního prostředí Kvalita potravinářských surovin a produktů Průmyslové procesy, kvalita produktů Výzkum

2 HPLC separační systémy dle WOS ( ) Web of Science Přehled analytů peptidy oligonukleotidy sacharidy lipidy steroidy karotenoidy fenolické látky léčiva a drogy vitamíny barviva polycyklické aromáty syntetické polymery

3 PEPTIDY Základní stavební jednotkou peptidů jsou aminokyseliny (< 50), které lze rozdělit podle polarity postranního řetězce R na polární (nenabité, kyselé, bazické) a nepolární (hydrofobní). Peptidy s basickými a kyselými skupinami jsou charakterizovány izoelektrickým bodem, jejich celkový náboj závisí na ph roztoku (mobilní fáze). leucin lysin k. asparagová Retenční chování je výrazně ovlivněno celkovou hydrofobicitou a počtem nabitých skupin. U delších peptidů (> cca 10 aminokyselin) hraje roli i sekundární struktura, případně tvorba disulfidových můstků. Separační systémy: reverzní chromatografie na C18 nebo C8 (separace dle hydrofobicity) a iontově-výměnná chromatografie (separace dle náboje). Separace peptidů v RP systémech Reverzní chromatografie je nejčastěji používaná kvůli možnostem měnit složení a ph mob. fáze v širokém rozmezí. Kolony C18 nebo C8 na silikagelovém nosiči, případně polymerní nebo monolitické fáze, pórovitost Å, gradientové separace nejčastěji v systémech zředěná kyselina (octová, mravenčí, trifluoroctová)/acetonitril.

4 Separace peptidů v iontově-výměnných systémech Iontově-výměnná chromatografie nejčastěji využívá silné katexy (sulfo skupina), které jsou negativně nabité v neutrálním a kyselém prostředí. Při nízkém ph je karboxyl peptidů protonován a při separaci se tak projevují bazické funkční skupiny. Separace peptidů v 2D (RPxIEC) systémech Kombinace separačních mechanismů pro maximální dělení komplexních směsí peptidů. Hlavní využití v proteomice MS detekce.

5 Detekce peptidů Spektrofotometrická detekce v nízké UV oblasti nm (absorbance amidové peptidické vazby) Hmotnostně-spektrometrická detekce elektrospray nebo nanoelektrospray Citlivá detekce, určení molekulové hmotnosti peptidu, případně struktury z MS/MS dat. PROTEINY (BÍLKOVINY) Proteiny jsou vysokomolekulární biomolekuly složené z aminokyselin (>> 50), které mohou být posttranslačně modifikovány. Proteiny v nativním stavu mají charakteristickou 3D strukturu, působením kyselin, bází, solí, org. rozpouštědel apod. denaturují (srážení, ztráta rozpustnosti). Proteiny lze separovat na základě celkové hydrofobicity, velikosti molekul a počtu nabitých skupin. Nejčastěji využívanými separačními systémy jsou: reverzní chromatografie, vylučovací (size-exclusion, gelová) chromatografie a iontově výměnná chromatografie. Separace komplexních proteinových směsí: klasickou metodu (dvourozměrnou gelovou elektroforézu (2D-PAGE)) lze nahradit 2D HPLC separací kombinace SEC-RPHPLC, IEC-RPHPLC, příp. IEF (izoelektrická fokusace)- RPHPLC

6 Separace proteinů v RP systémech Reverzní chromatografie: Kolony C4 C18 na silikagelovém nosiči, případně polymerní nebo monolitické fáze, široké póry 300 Å, gradientové separace nejčastěji v systémech zředěná kyselina (octová, mravenčí, trifluoroctová)/acetonitril. Separace proteinů v SEC systémech Gelová chromatografie: gely různých pórovitostí ( Å) na silikagelovém nosiči, případně polymerní fáze, separace nejčastěji v roztocích pufrů. Adsorpce analytu na stacionární fázi a denaturace proteinů je minimalizována.

7 Separace proteinů v iontově-výměnných systémech Detekce proteinů Spektrofotometrická detekce v UV oblasti nm (absorbance amidové peptidické vazby) nebo při 280 nm (absorbance aromatiky tyrosinu a tryptofanu). Hmotnostně-spektrometrická detekce elektrospray nebo nanoelektrospray Citlivá detekce, určení molekulové hmotnosti proteinu z vícenásobně nabitých iontů (dekonvoluce).

8 OLIGONUKLEOTIDY Oligonukleotidy jsou krátké oligomery nukleových kyselin. Mají charakter polyaniotů (kvůli přítomnosti fosfátových skupin). Chromatografické chování je ovlivněno celkovou velikostí molekul a sekvencí nukleových kyselin. Možnosti separace oligonukleotidů: Reverzní chromatografie separace díky různým nukleobázím v řetězcích. Iontově-výměnná chromatografie separace na anexech díky záporně nabitým fosfátům. Gelová chromatografie - separace na základě různých velikostí molekul. RP-HPLC (iontově-párová) oligonukleotidů Pufr slouží jako iont-párové činidlo. TEAA = triethylammonium acetate

9 SACHARIDY Sacharidy jsou aldehydy nebo ketony (příp. hemiacetaly nebo hemiketaly) s množstvím hydroxyskupin. Existují jako nízkomolekulární látky (mono-, disacharidy) až polymery (polysacharidy) Možnosti separace mono, di- a oligosacharidů: Normální chromatografie na amino fázích (HILIC) - separace dle polarity sacharidu Chromatografie na iontově vylučovacích kolonách kombinace separačních mechanismů Gelová chromatografie - separace na základě různých velikostí molekul. Separace mono, disacharidů na amino fázi Kolony s chemicky vázanými aminoskupinami, mobilní fáze acetonitril/voda.

10 Separace sacharidů na iontově vylučovacích kolonách Iontoměniče s navázanými ionty kovů: Ca, Ag, Pb apod. Mobilní fáze - voda LIPIDY Lipidy strukturně odlišné skupiny sloučenin odvozené od mastných kyselin. Jednoduché lipidy mastné kyseliny, estery, acylglyceroly; složené lipidy glykolipidy, fosfolipidy. Možnosti separace lipidů: Normální a HILIC chromatografie separace jednotlivých skupin (tříd) lipidů podle polarity funkčních skupin Reverzní chromatografie separace lipidů v rámci jedné třídy dle hydrofobicity (délky acylových zbytků) Argentační chromatografie - separace podle počtu dvojných vazeb v molekule

11 HILIC celkového lipidového extraktu modelová směs standardů TG: triacylglycerol, Chol: cholesterol, CE: cholesteryl ester, FA: fatty acid, PG: phosphatidylglycerol, 2-LPG: 2-lysophosphatidylglycerol, 1-LPG: 1-lysophosphatidylglycerol, PI: phosphatidylinositol, CA: cardiolipin, LPI: lysophosphatidylinositol, ppe: phosphatidylethanolamine plasmalogen, PE: phosphatidylethanolamine, 2-LPE: 2-lysophosphatidylethanolamine, 1-LPE: 1-lysophosphatidylethanolamine, ppc: phosphatidylcholine plasmalogen, PC: phosphatidylcholine, SM: sphingomyeline, 2-LPC: 2-lysophosphatidylcholine, 1-LPC: 1-lysophosphatidylcholine. HPLC podmínky: kolona Spherisorb Si ( mm, 5 m), průtok 1 ml/min, teplota 40 C, gradient: 0 min 94% A + 6% B, 60 min 77% A + 23% B Rozpouštědlo A: acetonitril, rozpouštědlo B: 5 mm octan amonný. Detekce ESI-MS Lisa et al., Journal of Chromatography A, 1218 (2011) Separace triacylglycerolů v RP-HPLC HPLC podmínky: kolony Nova-Pak C18 (300 x 3,9 a 150 x 3,9 mm, 4 µm, Waters) zapojené do série. Mobilní fáze: acetonitril (A) a 2-propanol (B). Lineární gradient- 0 min 100 % ACN, průtok 1 ml/min, 108 min 70% IPA, průtok 1 ml/min, 122 min 80 % IPA, průtok 0,7 ml/min, 128 min 100 % ACN, průtok 0,7 ml/min, 130min 100% ACN, průtok 1 ml/min. Pokolonový přídavek 100 mm octanu amonného v 2-propanol-vodě (1:1, v/v). APCI MS detekce full scan m/z , 400 C.

12 Argentační chromatografie triacylglycerolů HPLC podmínky: kolona Valco ChromSpher 5 Lipids (250x4.6 mm, 5 mm) fáze: hexan (A), hexan/2-propanol/acetonitril 30:9:1, v/v/v (B). Gradientový program: 100 % A 10 min, lineárně do 18 % B ve 32 min, do 35 % ve 37 min a do 100 % of B ve 40 min. Isokraticky 100 % of B do 41 min. Průtok 1ml/min. Pokolonový přídavek 100 mm octanu amonného v 2-propanol-vodě (9:1, v/v). APCI MS detekce full scan m/z , 400 C. STEROIDNÍ SLOUČENINY Steroidy terpenoidní lipidy, derivátyderiváty cyklopentanperhydrofenanthrenu. Vznikají oxidací terpenů. Z hlediska chemie jde o alkoholy, alkaloidy, hormony, vitaminy, kyseliny. Separace steroidů: Reverzní chromatografie na C8-C18, ACN/voda, MeOH/voda

13 KAROTENOIDY Karotenoidy přírodní organické pigmenty (tetraterpenoidy), které se vyskytují v rostlinách jako fotosyntetická barviva. Mají výrazné antioxidační účinky. Separace karotenoidů: Reverzní chromatografie separace dle hydrofobicity kolony C8-C30, ACN/voda, MeOH/voda FENOLICKÉ LÁTKY a POLYFENOLICKÉ LÁTKY Flavonoidy rostlinné fenoly odvozeny od flavanu. Běžně bývají všechny tři kruhy substituovány hydroxyskupinami nebo ethoxyskupinami a jednotlivé deriváty se liší pouze stupněm substituce a oxidace. Flavonoidy mají antioxidační vlastnosti. Separace flavonoidů: Reverzní chromatografie, kolony C8-C18, ACN/voda, MeOH/voda Kolona: Zorbax SB-C18 column (250mm 4.6mm I.D., 5 um) Mobilní fáze: voda (A), acetonitril (B). Gradient:: 0 15 min, 22 28% B; min, 28 35% B; min, 35 39% B; min, % B; Průtok 1 ml/min. UV detekce 270 nm.

14 LÉČIVA/DROGY Barbituráty deriváty kyseliny barbiturové, tlumící účinek na centrální nervovou soustavu (dříve byly využívány jako léky na spaní; využívány k sebevraždám). V krátké době lze vypěstovat závislost. 1 phenobarbital 2 butalbital 3 pentobarbital 4 amobarbital 5 secobarbital Kinetex 2.6µm EVO C Å, LC Column 50 x 2.1 mm, gradientová eluce, (A:10mM uhličitan amonný ph 10; B:acetonitril; 0.25 ml/min), detekce MS Phenomenex LÉČIVA/DROGY Statiny hypolipidemika, léčí se jimi zvýšená hladina lipidů (cholesterolu) v krvi. lovastatin 1 lovastatin 2 atorvastatin 3 pravastatin 4 simvastatin Kinetex F5 2.6µm 100 Å [pentafluorofenylová fáze], LC Column 50 x 2.1 mm, gradientová eluce (A:0.1% TFA ve vodě; B:acetonitril;0,5 ml/min), detekce UV/Vis 248 nm Phenomenex

15 LÉČIVA/DROGY Léčiva na erektilní dysfunkci sildenafil 1 tadalafil 2 sildenafil 3 vardenafil Kinetex 5µm EVO C Å, LC Column 150 x 4.6 mm, gradientová eluce (A:10mM octan amonný; B:acetonitril; 1.2 ml/min) detekce UV-Vis 230 nm Phenomenex LÉČIVA/DROGY Opiáty 1 Morphine 2 Oxymorphone 3 Hydromorphone 4 Naloxone 5 Codeine 6 6-MAM 7 Oxycodone 8 Naltrexone 9 Hydrocodone 10 Norfentanyl 11 Tramadol 12 Normeperidine 13 Meperidine 14 Norbuprenorphine 15 Fentanyl 16 Buprenorphine 17 Propoxyphene 18 Norpropoxyphene 19 EDDP 20 Methadone morfin Kinetex 2.6 µm Biphenyl 100 Å, LC Column 50 x 3.0 mm, gradientová eluce (0.1% kyselina mravenčí ve vodě; B:0.1% kyselina mravenčí v methanolu, 0.6 ml/min) teplota kolony 40 C, detekce MS Phenomenex

16 VITAMÍNY all-trans-retinol gamma-tocopherol 1 Vitamin A (all-trans-retinol) 2 Vitamin E (gamma-tocopherol) 3 Vitamin E (a-tocopherol) Kinetex 5µm EVO C Å, LC Column 100 x 2.1 mm, gradientová eluce (A:voda; B:50:50 2-propanol:acetonitril;0.6 ml/min), detekce MS - APCI, přepínání polarity Phenomenex BARVIVA Sudan I 1 Sudan I 2 Sudan II 3 Sudan III 4 Sudan Red B 5 Sudan IV Synergi 4 µm Polar-RP 80 Å [ethericky vázaná fenylová fáze], LC Column 150 x 4.6 mm, isokratická eluce voda-acetonitril-methanol ( ), 1 ml/min, detekce UV-Vis 480 nm Phenomenex

17 POLYCYKLICKÉ AROMÁTY benzo[a]pyren 1 Naphthalene 2 Acenaphthylene 3 Acenaphthene 4 Fluorene 5 Phenanthrene 6 Anthracene 7 Fluoranthene 8 Pyrene 9 benzo(a)anthracene 10 Chrysene 11 benzo(b)fluoranthene 12 benzo(k)fluoranthene 13 benzo(a)pyrene 14 Dibenz[a,h]anthracene 15 benzo(g,h,i)perylene 16 Indeno[1,2,3-cd]pyrene Synergi 4 µm Max-RP 80 Å, LC Column 250 x 4.6 mm, gradientová eluce (A:voda; B:acetonitril; 1.5 ml/min) UV-Vis 254 nm Phenomenex SYNTETICKÉ POLYMERY Možnosti separace synt. polymerů: Reverzní chromatografie separace dle hydrofobicity Vylučovací chromatografie - separace na základě různých velikostí molekul. RP-HPLC

18 SYNTETICKÉ POLYMERY SEC-LC Na základě kalibrace lze z elučních objemů v SEC určit molární hmotnost polymerů. Vybrané aplikace podrobněji

19 Forenzní analýza: benzodiazepiny ve vlasech Příprava vzorku - dekontaminace vzorku v isooktanu - sušení, mletí -přídavek vnitřního standardu - sonikace, inkubace v pufru 12 hodin - extrakce org. rozpouštědly delorazepam HPLC/MS: - kolona Luna C18 (150 1 mm, 5 μm), 40 C - gradientová eluce, průtok 100 μl/min. A: 0.1% kyselina mravenčí ve vodě B: 0.1% kyselina mravenčí v acetonitrilu - detekce HRMS ESI, orbitrap nordiazepam Vogliardi et al., Anal Bioanal Chem (2011) 400:51 67 Forenzní analýza: benzodiazepiny ve vlasech -současná identifikace a kvantifikace 28 benzodiazepinů - 50 mg vzorku koncentrace ve vlasech: - kvantifikační limity 1-10 pg/mg až pg/mg - linearita do pg/mg Vogliardi et al., Anal Bioanal Chem (2011) 400:51 67

20 Analýza potravin: mykotoxiny v potravinách Příprava vzorku -přídavek vnitřního standardu - extrakce v acetonitrilu/vodě/k. octové - centrifugace, naředění mobilní fází Aflatoxin B1 HPLC/MS: - kolona Gemini C mm, 5-μm částice, 25 C -předkolona C m. - gradientová eluce, 1 ml/min A: methanol/voda/k. octová 10:89:1, 5 mm octan amonný B: methanol/voda/k. octová 97:2:1, 5 mm octan amonný - detekce ESI-MS/MS (MRM) na Q-trap 4000 Aflatoxin G1 Sulyok et al., Anal Bioanal Chem (2007) 389: Analýza potravin: mykotoxiny v potravinách - metoda pro 87 analytů v plesnivých potravinách - limity detekce μg/kg - nalezeno 37 fungálních metabolitů koncentrace: až 33 mg/kg potraviny Sulyok et al., Anal Bioanal Chem (2007) 389:

21 Environmentální analýza: hormonálně aktivní látky ve vodách Příprava vzorku - filtrace vody - ředění v případě vody z ČOV Estron HPLC/MS: - kolona Acclaim PA2, 3 um, 3x150 mm (stabilní ve 100% vodě) - gradientová eluce, 0.2 ml/min A: acetonitril B: 1 amoniak ve vodě - detekce ESI-MS/MS (QqQ) Estradiol Guo, et al., Journal of Chromatography A, 1281 (2013) 9 18 Environmentální analýza: hormonálně aktivní látky ve vodách - prekoncentrace analytů na SPE koloně IonPac NG1, 4x35 mm, 2.5 ml vzorku - odstranění nečistot (30% acetonitril ve vodě) - vypláchnutí mobilní fází, separace na analytické koloně - regenerace SPE kolony (90% acetonitril ve vodě) Guo, et al., Journal of Chromatography A, 1281 (2013) 9 18

22 Environmentální analýza: hormonálně aktivní látky ve vodách -plně automatická metoda pro on-line SPE prekoncentraci - kvantifikace 5 estrogenů a 4 androgenů ve vodách - MRM v negativním módu pro estrogeny, v positivním pro androgeny - limity detekce ng/l. The - poměrně nízké výtěžnosti pro androgeny 32% - 60% Guo, et al., Journal of Chromatography A, 1281 (2013) 9 18