FAKULTA BIOMEDICÍNSKÉHO INŽENÝRSTVÍ Katedra biomedicínské techniky. Chemie v medicíně a biomedicínském inženýrství

Transkript

1 FAKULTA BIOMEDICÍNSKÉHO INŽENÝRSTVÍ Katedra biomedicínské techniky Chemie v medicíně a biomedicínském inženýrství 2011 Jana Dobešová ČESKÉ VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V PRAZE Fakulta biomedicínského inženýrství Katedra biomedicínské techniky

2 Významné biochemické látky a laboratorní techniky jejich stanovení v biomedicínských oborech I. Týmový projekt Vedoucí projektu: Ing. Zuzana Fílová Student: Jana Dobešová leden 2011

3 Anotace Cílem projektu je sestavit laboratorní úlohy pro výuku biochemie, zvláště se zaměřit na sacharidy. Sacharidy tvoří velkou skupinu přírodních organických látek. Zabývám se především jejich složením a rozdělením. Hrají podstatnou roli v lidském těle. V našem organismu představují nejpohotovější zdroj energie, ale jsou i důležitou součástí buněčných membrán. Stanovení glukózy v těle se zabývám v kapitolách Glykémie a Glykosurie. Projekt je zaměřen důkazy biochemických látek a na jejich na praktické využití v laboratořích. Annotation The aim of the project is to build laboratory tasks for biochemistry, particulary focused on carbohydrates. Carbohydrates make up a large group of natural organic substances. I deal mainly with the composition and distribution. They play an essential role in the human body. In our body are the carbohydrates the most important energy source, but they are also an important component of cell membranes. Determination of glucose in the body to deal with in chapters Glycemia and Glycosuria. The project focuses on the practical use in laboratories.the project aims evidence of biochemical substances and on their practical use in laboratories.

4 Prohlášení Prohlašuji, že jsem týmový projekt s názvem Chemie v medicíně a biomedicínském inženýrství, vypracoval(a) samostatně a použil(a) k tomu úplný výčet citací použitých pramenů, které uvádím v seznamu přiloženém k závěrečné zprávě. Nemám závažný důvod proti užití tohoto školního díla ve smyslu 60 Zákona č.121/2000 Sb., o právu autorském, o právech souvisejících s právem autorským a o změně některých zákonů (autorský zákon). V Praze dne podpis

5 Obsah Úvod Sacharidy Používané vzorce Fischerovy vzorce Tollensovy vzorce Haworthovy vzorce Rozdělení sacharidů Monosacharidy Oligosacharidy Polysacharidy Stavební polysacharidy (Celulosa, chitin) Polysacharidy zásobní (škrob, glykogen) Polysacharidy se specifickým funkcemi Důkazy sacharidů Barevné reakce sacharidů Chromatografické metody sacharidů Metabolismus sacharidů Glykolýza Glykolitické reakce Fermentace anaerobní odbourávání pyruvátu Poruchy metabolismu cukrů Poruchy metabolismu glukosy Malabsorbace disascharidů Galaktosémie Intolerance fruktózy Biologický význam sacharidů Glykémie Enzymové reakce Kontinuální měření glykémie Glykosurie Příčiny glykosurie Princip průkazu glukózy v moči...16 Závěr Přílohy Sacharidy návod k úloze Sacharidy výuková prezentace DNA návod k úloze DNA výuková prezentace DNA protokol RNA návod k úloze RNA protokol Použitá literatura...24

6 Úvod Biochemie je vědní oblast zabývající se studiem a popisem přírodních látek, tj. látek, které jsou obsaženy v živých organismech. Přírodní látky jsou složeny z tzv. biogenních prvků uhlíku, vodíku, kyslíku, dusíku, síry, fosforu a některých minerálních prvků. Studuje chemickými principy biologické objevy. Moje práce se bude podrobněji zabývat biochemií sacharidů, jejich rozdělením a stanovením glukózy v těle. 1 Sacharidy Sacharidy tvoří velkou skupinu přírodních organických látek. Jsou základními složkami všech živých organismů a zároveň i nejrozsáhlejší třídou biologicky aktivních molekul. Jejich molekuly se skládají z atomů uhlíku, vodíku a kyslíku. Chemicky je řadíme k aldehydickým nebo ketonickým polyalkoholům. Jsou nejrychlejším zdrojem energie. 1.1 Používané vzorce Fischerovy vzorce Pro znázornění izomerie používáme Fischerových projekčních vzorců. To jsou vzorce, ve kterých každé chirální centrum značíme jako průsečík dvou úseček (vazeb), přičemž vazby jdoucí vodorovně směřují před nákresnu, vazby jdoucí svisle směřují za nákresnu. Vodíkové atomy zde často nezobrazujeme. Někdy bývá toto směřování vyznačeno, často se od toho však pro zjednodušení upouští. Podle fischerovy koncepce D-sacharidy mají obr. 1:příklad fischerových vzorců stejnou absolutní konfiguraci asymetrického centra nejvíce vzdáleného od karbonylové skupiny, jako má D-glyceraldehyd. Podle této koncepce představují L-sacharidy zrcadlový obraz příslušných D-forem. Sacharidy, které se liší pouze kofigurací na jediném uhlíkovém atomu se nazývají epimery. L-sacharidy se v biologickém materiálu vyskytují podstatně méně než D-formy Tollensovy vzorce Fischerovy vzorce nevystihují přesně strukturu a vlastnosti sacharidů. Molekuly monosacharidů nejsou ve skutečnosti lineární, ale cyklické. Aldehydová skupina na 6

7 1.uhlíkovém atomu nebo ketonová skupina na 2.uhlíku se aduje na sekundární hydroxylovou skupinu předposledního uhlíku a vzniká vnitřní poloacetal s pěti-, nebo šestičlěnným kruhem Haworthovy vzorce obr. 2: Příklad tollensova vzorce Haworthovými projekčními vzorci se výhodně zobrazuje konfigurace substituentů na každém uhlíku v molekule cyklického sacharidu. Uzavřený heterocyklus monosacharidu leží jakoby v rovině nákresny a jednotlivé skupiny směřují nad něj nebo pod něj. Jde-li o pyranosu, jde-li o D-monosacharid, či o L-monosacharid, rozpoznáme pomocí polohy skupiny -CH 2 OH,v případě D-monosacharidu nahoru, v případě L-monosacharidu dolů. U D-řady tato skupina směřuje nad rovinu cyklu, u L-řady je tomu naopak. K převodu Fischerových vzorců na Haworthovy nám slouží jednoduchá pravidla. Hydroxyskupina, která ve Fischerově vzorci směřuje doprava, bude v Haworthově vzorci směřovat dolů a naopak. Dochází ke vzniku nového typu izomerie - vznikající cyklická forma monosacharidu může existovat ve dvou podobách - α a β. U D-sacharidů se α-forma vyznačuje tím, že její poloacetalová hydroxyskupina směřuje ve Haworthově vzorci nahoru, u β-formy je umístěn dole, u L-sacharidů je tomu naopak. Tyto dva izomery, které se liší pouze orientací poloacetalového hydroxylu, se nazývají anomery (např. α-dglukopyranosa a β-d-glukopyranosa). obr. 3: Příklad Haworthových vzorců Použití Haworthových vzorců může vést k mylné představě, že pyranosový nebo furanosový kruh leží v jedné rovině. To ovšem neodpovídá skutečnosti, neboť všechny atomy těchto kruhů jsou tetraedricky hybridizovány. Pyranosový kruh (cyklohexanu) může nabývat vaničkové nebo židličkové konformace. Stabilita koncentrací závisí na stereochemických interakcích mezi substituent;y na kruhu. 7

8 obr. 4: Židličková a vaničková struktura 2 Rozdělení sacharidů Sacharidy dělíme podle počtu uhlíkových atomů vázaných v jejich molekulách na monosacharidy, oligosacharidy a polysacharidy. 2.1 Monosacharidy Monosacharidy jsou jednoduché cukry, které obsahují ve svých molekulách tři až sedm atomů uhlíku. Jsou charakteristické, že nemohou být hydratovány na jednodušší sacharidy (např. D-glukosa, D-ribulosa). Mnoho sloučenin je syntetizováno z jednodušších látek a jiné jsou produkty fotosyntézy. Metabolický rozklad monosacharidů poskytuje většinu energie potřebné pro průběh biologických pochodů a také jsou základní složkou nukleových kyselin. Monosacharidy se rozlišují podle povahy karbonylových skupin na aldosy, ketosy, triosy. D-glukosa je jedinou aldosou, která se běžně vyskytuje v přírodě jako monosacharid. Všechny monosacharidy s výjimkou dihydroxyacetonu (ketotriosa) mají v molekulách nejméně jedno, častěji více chirálních center. Díky tomu jsou opticky aktivní. Acyklické vzorce monosacharidů nevystihují přesně jejich strukturu a vlastnosti. Sacharidy se šestičlenným kruhem se označují jako pyranosy (podle pyranu) a podobně sacharidy s pětíčlenným kruhem se nazývají furanosy (podle furanu). Cyklické formy glukosy a fruktosy jsou tedy známy jako glukopyranosa a fruktofuranosa. obr. 5: Příklad monosacharidů 8

9 Monosacharidy jsou krystalické látky, které jsou dobře rozpustné ve vodě. Zahříváním tají a při vyšší teplotě karamelizují. Vlastnosti určují hydroxylové a karbonylové funkční skupiny vázané v jednotlivých molekulách. 2.2 Oligosacharidy Oligosacharidy jsou složené ze dvou až deseti monosacharidů vázaných glykosidovou vazbou. Podle počtu monosacharidových jednotek vázaných v jejich molekulách rozlišujeme disacharidy, trisacharidy apod. Monosacharidové jednotky mohou být vázány dvojím způsobem. Disacharid neredukující, vzniká v případě, že poloacetalový hydroxyl jednoho monosacharidu má možnost zreagovat s poloacetalovýmm hydroxylem druhého monosacharidu. Má-li možnost zreagovat s alkoholovým hydroxylem, vznikne disacharid redukující. Disacharidy jsou nejpočetnější skupinou oligosacharidů. Dělí se na redukující a neredukující. Neredukující disacharidy Sacharosa, která vzniká spojením glukosy a fruktosy. Používá se jako hlavní sladidlo v potravinářství. Je to bílá krystalická, ve vodě dobře rozpustná látka, při zahřívání se mění v karamel. Hydrolýzou sacharózy vzniká ekvimolární směs glukózy a fruktózy, tzv. invertní cukr. Tato reakce je doprovázena změnou optické otáčivosti z pravotočivé na levotočivou. Převážná část sacharosy se vyrábí z cukrové třtiny. Redukující disacharidy obr. 6: Sacharosa Maltosa vzniká spojením dvou molekul glukosy. Vzniká hydrolýzou škrobu nebo glykogenu. Je známá pod triviálním názvem cukr sladový. Používá se na výrobu některých cukrovinek. obr. 7: Maltosa Laktosa, mléčný cukr, vzniká spojením molekul glukosy a galaktosy. Vyskytuje se v přírodě pouze v mléce, kde je její koncentrace pohybuje do 7% v závislosti na živočišném druhu. Některé kvasinky zkvašují laktosu na ethanol a kyselinu mléčnou, čehož se využívá při výrobě kefíru. 9

10 2.3 Polysacharidy obr. 8: Laktosa Polysacharidy, neboli glykany, se skládají z více jak 10 monosacharidových jednotek vázaných glykosidovými vazbami. Dělí se na homopolysacharidy nebo na heteropolysacharidy, záleží zda se skládají z jednoho nebo více typů monosacharidů. Polysacharidy vytvářejí jak lineární tak větvené polymery, protože glykosidová vazba může vycházet z kterékoliv hydroxylové skupiny. Díky tomu, nemají polysacharidy redukční vlastnosti. Většina polysacharidů má význam jako stavební materiál nebo se ukládá v podobě zásobních látek Stavební polysacharidy (Celulosa, chitin) Mají funkci stavebního materiálu, jsou nerozpustné ve vodě a málo reaktivní. Celulosa je primární stavební složka stěny rostlinných buněk. Váže více jak polovinu uhlíku přítomného v biosféře. Je to lineární polymer obsahující až D-glukosových zbytků spojených β-glykosidovými vazbami. Každý z nich je ve své poloze udržován vodíkovými můstky. Vzniklé řetězce jsou seřazeny tak, že tvoří list a ty se na sebe skládají. Toto uspořádání, stabilizované intermolekulárními vodíkovými můstky mezi glukosovými zbytky v sousedních řetězcích, dává celulosovým vláknům výjimečnou pevnost a je odpovědná za jejich nerozpustnost ve vodě. Celulosová vlákna jsou uložena ve stěně rostlinných buněk a navzájem propojena hmotou, skládající se z polysacharid; na bázi glukosy a některých dalších monosacharidů. obr. 9: Celulosa Chitin je základní stavební složkou exoskeletu členovců a dalších bezobratlých. Je rovněž přítomen v buněčných stěnách většiny hub a mnoha řas. Chitin je homopolymer β(1 4)-vázaných N-acetyl-D-glukosaminových zbytků. Chemicky se liší od celulosy pouze v tom, že každá hydroxylová skupina na C (2) je nahrazena acetamidovou skupinou. Na základě rentgenové analýzy je patrné, že struktura celulosy a chitinu je obdobná. 10

11 obr. 10: Chitin Polysacharidy zásobní (škrob, glykogen) Zásobní polysacharidy obsahují ve svých strukturách podstatně méně vodíkových můstků než polysacharidy stavební, a v důsledku toho jsou méně odolné vůči vodě. Ve vodném prostředí bobtnají a zčásti přecházejí do roztoku. Škrob je směsí glukanů, syntetizováných rostlinami jako jejich hlavní zásobní látka. V cytoplazmě je uložen v nerozpustných granulích, které se skládají ze dvou složek: z α-amylosy a amylopektinu. α- Amylosa je lineární polymer, obsahující několik tisíc glukosových zbytků, vázaných vazbami α-(1 4). α-glykosidové vazby v α-amylose mají šroubovicovou konfiguraci, v níž na jeden závit připadá šest D-glukosových jednotek. Amylopektin se skládá z D- glukosových zbytků spojených převážně vazbami α-(1 4). Makromolekuly se přibližně po 24 až 30 glukosydových zbytcích větví prostřednictvím vazeb α-(1 6). Molekula amylopektinu obsahuje až 106 glukosových zbytků, což ji řadí mezi největší molekuly vyskytující se v přírodě. obr. 11: Amylopektin Glykogen, zásobní polysacharid živočichů, je přítomen ve všech buňkách, ale nejvíce v buňkách kosterního svalstva a v játrech. Primární struktura glykogenu připomíná amylopektin. Glykogen je více větvený, s větvením na každém osmém až dvanáctém glukosovém zbytku. V buňkách je glykogen rozkládán pro metabolické účely glykogenfosforylasou. Vysoce větvená struktura glykogenu umožňuje rychlou mobilizaci glukosy v případě metabolické potřeby Polysacharidy se specifickým funkcemi Glykosaminoglykany (mukopolysacharidy) jsou nevětvené polysacharidy. Jsou to polysacharidy živočišného původu, které se vyskytují převážně v základní hmotě (gelovitá hmota spojující vlákna kolagenu a elastinu). Heparin vyskytuje se výhradně v intracelulárních granulích žírných buněk, lemujících tepenné stěny, zejména v játrech, plicích a v pokožce. Má antikoagulační účinek. Srážení krve zabraňuje tím, že inhibuje přeměnu trombinu na trombin. Předpokládá se, že při 11

12 poranění dochází k jeho uvolnění, a tím i k zábraně vzniku nežádoucích sraženin. Proto je heparin široce používám v klinické praxi, například u postoperačních pacientů. obr. 12: Heparin 3 Důkazy sacharidů 3.1 Barevné reakce sacharidů Chemické reakce sacharidů jsou založeny na jejich schopnosti tvořit dehydratací minerálními kyselinami furan-2-aldehyd nebo jeho deriváty a dále na reaktivitě hydroxylových a karbonylových skupin sacharidů. Některé polysacharidy tvoří barevné klathráty s jódem. Volbou vhodné kombinace kvalitativních reakcí lze určit základní charakteristiky neznámého vzorku. Barevné reakce sacharidů lze dále využít např. pro jejich kvantitativní fotometrické stanovení, pro jejich chromatografickou detekci, případně pro identifikaci cukerných složek biopolymerů. 3.2 Chromatografické metody sacharidů Základem všech chromatografických metod je distribuce analyzovaných látek mezi stacionární a mobilní fází na základě rozdílné interakce analyzovaných látek se stacionární a s mobilní fází. Při rozdělovací chromatografii se jako stacionární a mobilní fáze používají dvě navzájem nemísitelná nebo omezeně mísitelná rozpouštědla. Aby bylo možno docílit vzájemného pohybu dvou nemísitelných fází, je nutno jednu z nich zakotvit (stacionární fáze). Stacionární fází bývá obvykle voda, zakotvená na hydrofilním nosiči. Mobilní fází je méně polární organické rozpouštědlo, zpravidla směs rozpouštědel s určitým rovnovážným obsahem vody, která je nutná k tomu, aby při eluci nedocházelo k vymývání stacionární vody z nosiče. 4 Metabolismus sacharidů Sacharidy se vstřebávají v tenkém střevě jako monosacharidy, ze kterých je nejdůležitější glukóza. V menší míře se využívají i fruktóza a galaktóza. Všechna polysacharidy, z nichž nejdůležitější je pro člověka škrob, musí být rozštěpeny. Štěpení oligosacharidů a polysacharidů nastává při trávení potravy a při využívání sacharidových rezerv chemické energie. Sacharidy tvoří největší složku přijímané potravy a musí docházet k jejich odbourávání. Nejdůležitějšími enzymy, které je štěpí jsou glykosidázy amylázy, obsažené ve slinách a pankreatu. 12

13 4.1 Glykolýza Glykolýza je hlavní cestou odbourávání glukózy vzniklé štěpením sacharidových složek potravy a rezervních polysacharidů. Je to základní metabolický proces probíhající téměř ve všech buňkách. V buňkách savců se tímto způsobem zpracuje až 80% veškerých přijímaných sacharidů. Hlavní funkcí je uvolnit energii z molekul sacharidů. Glukóza je přeměňována přes fruktosa-1,6-bisfosfát na pyruvát. Glykolýzou se z 1 molu glukózy získají 2 moly ATP. V první fázi glykolýzy se 2 ATP spotřebovávají, ve druhé se 4 ATP vytváří. Glykolýza hraje klíčovou roli v energetickém metabolismu. Glykolýzu lze rozdělit do dvou fází. Fáze I. zahrnuje fosforylaci a štěpení na dvě molekulyglyceraldehyd-3-fosfátu, což vyžaduje dodávku 2 ATP. Ve fázi II. Jsou dvě molekuly molekulyglyceraldehyd-3-fosfátu přeměňovány na pyruvát za současného vzniku 4 ATP. obr. 13: Glykolýza reaktivních látek se syntézou ATP Glykolitické reakce A. Hexokinasa spotřeba prvního ATP Za anaerobních podmínek je vytvořený pyruvát dále oxidován v citrátovém cyklu a oxidační fosforylací na oxid uhličitý a vodu. Naproti za aerobních podmínek je pyruvát přeměňován na redukovaný konečný produkt, kterým je např. laktát ve svalu (mléčné kvašení) nebo u kvasinek na ethanol a oxid uhličitý (alkoholové kvašení). Chemická strategie glykolýzy: 1. Přenesení fosfátové skupiny na glukosu 2. Chemické přenesení fosforylovaných meziproduktů na sloučeniny s vysokým potenciálem přenosu fosfátové skupiny. 3. Chemické spřažení následné hydrolýzy První reakcí glykolýzy je přenos fosfátové skupiny z ATP na glukosu za vzniku glukosa-6-fosfatu. Jako kinasy se označují enzymy, přenášející fosfátové skupiny mezi ATP a metabolitem. Hexokinasa je relativně nespecifický enzym, obsažený ve všech typech buněk, který katalyzuje fosforylazi různých kexos, D-glukosy, D-fruktosy a dalších. Jaterní buňky obsahují také glukokinasu, která je specifická pouze pro glukosu a účastní se udržování hladiny glukosy v krvi. B. Glukosafosfátisomerasa Druhá reakce je konverze glukosa-6-fosfátu na fruktosa-6-fosfát, která je katalyzovaná glukosafosfátisomerasou. Jde o izomeraci aldosy na ketosu. Mechanizmus glukosafosfátisomerasové reakce zahrnuje obecnou enzymovou acidobazickou katalýzu a skládá se ze čtyř kroků. 1. Kyselina, pravděpodobně ε-aminoskupina lysinu, katalyzuje otevření kruhu. 2. Báze, pravděpodobně imidazolový kruh histidinu, odmítá kruhový proton z C (2) za vzniku cis-endiolového meziproduktu. 3. V celkovém protonovém přenosu je nahrazen proton na C (1). Protony odejmuté bázemi jsou labilní a snadno se vyměňují s protony rozpouštědla. 4. Kruh se opět uzavře za vzniku produktu. Glukosafosfátisomerasa, podobně jako většina enzymů, katalyzuje reakci s absolutní stereospecifitou. C. Fosfofruktokinasa spotřeba druhého ATP Třetí reakci glykolýzy je fosforylace fruktosa-6-fosfátu na fruktosa-1,6-bisfosfát katalyzovaná 13

14 fosfofruktokinasou. Fosfofruktokinasa hraje ústřední roli v regulaci glykolýzy, neboť katalyzuje jednu z reakcí, určujících reakční rychlost celé dráhy. D. Aldolasa Aldolasa katalyzuje štěpení fruktosa-1,6-biofátu na dvě triosy glyceraldehyd-3-fosfát a glyceron-fosfát. Takto reakce se označuje jako aldolové štěpení. E. Triosafosfátisomerasa F. Glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenasa tvorba prvního makroenergického produktu Šestá reakce glykolýzy zahrnuje oxidaci a fosforylaci glyceraldehyd-3-fosfátu. Je katalyzována glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenasou. V této reakci pohání exergonická oxidace aldehydu syntézu acylfosfátu 1,3-bisfosfoglycerátu. G. Fosfoglycerátkinasa tvorba prvního ATP V sedmé reakci glykolýzy se tvoří ATP spolu s 3-fosfoglycerátem. Reakce je katalyzovaná fosfoglycerátkinasou. H. Fosfoglycerátmutasa V osmé reakci glykolytické dráhy je 3-fosfoglycerát přeměněn na 2-fosfoglycerát pomocí fosfoglycerátmutasou. Mutasy katalyzují přenos funkční skupiny mezi dvěma polohami uvnitř molekuly. I. Enolasa tvorba druhého makroenegrického produktu V desáté reakci glykolytické dráhy je 2-fosfoglycerát dehydratován fosfoenolpyruvát v reakci, katalyzované enolasou. J. Pyruvátkinasa tvorba druhého ATP Poslední reakci glykolýzy využívá pyruvátkinasa volnou energii hydrolýzy fosfoenolpyruvátu pro syntézu ATP za současného vzniku pyruvátu Fermentace anaerobní odbourávání pyruvátu Anaerobní odbourávání NAD+ může probíhat jako mléčné kvašení nebo jako alkoholové kvašení. A. Mléčné kvašení Ve svalu, zejména v době zvýšené aktivity, kdy je veliký požadavek ATP a současně je spotřebován kyslík, NADH redukuje pyruvát na laktát v reakci katalyzované laktátdehydrogenasou. Tato reakce je často označováná jako jedenáctou reakcí glykolýzy. Většina koncového produktu anaerobní glykolýzy je předávána ze svalové buňky do krve a tou do jatek, kde je laktát znovu přeměněn na glukosu. B. Alkoholové kvašení U kvasinek je za anaerobních podmínek regenerován NAD + přeměnou pyruvátu na ethanol a oxid uhličitý. Ethanol je hlavní součástí kvašených nápojů a lihovin, CO 2 je důležitý při výrobě kynutého těsta. Kvasinky produkují ethanol a oxid uhličitý dvěma reakcemi. 14

15 4.2 Poruchy metabolismu cukrů Poruchy metabolismu glukosy Defekty enzymů glykolýzy, která je jediným zdrojem energie v erytrocytech, se obvykle projeví jako hemolytická anemie. Mohou postihnout kterýkoliv enzym glykolitické dráhy Malabsorbace disascharidů Jedná se o defekt tvorby laktázy, sacharázy či jiných disacharidáz v erytrocytech. Následkem toho nedokáže organismus hydrolyzovat příslušné disacharidy, které se nevstřebávají a pokračují dále do tlustého střeva, kde dochází k jejich přeměně působením bakterií. Hlavním příznakem jsou kolikovité bolesti v břiše a průjmy s objemnou, kysele reagující stolicí. Léčba spočívá v eliminaci příslušných disacharidů ze stravy Galaktosémie Příčinou onemocnění je chybění galaktóza-1-fosfaturidyltransferasy, enzymu nezbytného pro metabolismus galaktózy v dětském věku. Příznaky se projeví průjmy, zástavou růstu, rychlým rozvojem katarakty a mentální retardací. V krvi a moči je vysoká koncentrace galaktózy a galaktóza-1-fosfátu Intolerance fruktózy Toto dědičné onemocnění je způsobenou chyběním aldolázy, štěpící v játrech fruktóza- 1-fosfát. Hromadící se fruktóza vede inhibici fosfoglukomutázy k poruše přeměny glykogenu na glukózu, což se projeví těžkou hypoglykémií po zátěži fruktózou. Onemocnění vede k poškození CNS, jater, poruchám růstu a poškození ledvin. Řešením je vynechání fruktózy a sacharózy ve stravě. 5 Biologický význam sacharidů V těle rostlin mají sacharidy především stavební funkci. Sacharidy jsou pro živočišný organismus hlavním zdrojem energie, která se uvolňuje při oxidaci glukosy. Dále jsou sacharidy využívány jako zásobní látky. 5.1 Glykémie Stanovení koncentrace glukózy v krvi je základní biochemickou informací o sacharidovém metabolismu. Glukóza se určuje v plné krvi, plazmě nebi séru v kapilární nebo venózní krvi. Účelem testu je screening diabetes mellitus (DM), monitorování lékové nebo dietní terapie u pacientů s DM, diagnostika při hypoglykémiích, monitorování energetického stavu a výživy hlavně u intenzivně léčených pacientů. Hladina krevního cukru kolísá u zdravého člověka mezi 3,5 6,5 mmol/l. Vyšetření glykémie se provádí na lačno, náhodně, po jídle nebo jako glykemický profil. Hlavním regulačním orgánem glykémie jsou játra. Při nízké glykémii uvolňují glukózu do krve pomocí hormonů, především inzulinem, glukagonem a pankreatickým polypeptidem. Inzulín umožňuje cestou glukózových transporterů vstup glukózy do buněk, 15

16 kde je využita pro metabolické děje. Protichůdným účinkem disponuje glukagon, který je katabolický a uvolňuje glukózu, tuky i bílkoviny ze zásob do krve. Metody na stanovení glukózy: neenzymové metody, elektrochemické metody, hmotnostní spektrometrie, enzymové metody Enzymové reakce Metoda využívá enzymových reakcí glukózaoxidázy a peroxidázy. V první reakci enzym glukózaoxidáza katalyzuje oxidaci glukózy vzdušným kyslíkem za vzniku kyseliny glukonové, která přechází ve vnitřní ester glukonolakton. Jako vedlejší produkt glukózaoxidázové reakce se vytváří ekvimolární množství peroxidu vodíku. V další reakci katalyzované peroxidázou reaguje vznikající peroxid vodíku s vhodným chromogenem. Jiné metody využívají měření úbytku kyslíku, ke kterému dochází v průběhu reakce katalyzované glukózaoxidázou a který můžeme sledovat elektrochemicky kyslíkovou elektrodou nebo enzymovou elektrodou Kontinuální měření glykémie Kontinuální monitory glykémie jsou přístroje, které v určitém časovém intervalu měří hladinu glukózy v mezibuněčné tekutině, kterou dokáží převést na hladinu krevního cukru. Měření vyžaduje zavedení elektrody do podkoží, kde enzym znehybněný na měřící elektrodě reaguje s přítomnou glukózou. 5.2 Glykosurie Glykosurie je ztráta glukosy močí větší než 0,72 mmol/24 hodin. Je nejčastějším nálezem vedoucím k odhalení diabetes mellitus Příčiny glykosurie Glukóza je volně filtrována glomerulem a její přítomnost v primární moči je stejná jako v plazmě. Prakticky všechna glukóza je reabsorbována buňkami proximálního tubulu. Reabsorbace glukózy je aktivní proces: je-li dosaženo tubulárního maxima, dojdek ke glukosurii. K příčinám glykosurie patří: hyperglykémie, snížený renální práh pro glukózu, těhotenství Princip průkazu glukózy v moči Stanovení pomocí diagnostických proužků je založeno na oxidaci glukózy vzdušným kyslíkem na δ-glukonolakton a peroxid vodíku. Reakce katalyzují enzymy glukózaoxidáza a peroxidáza. Světle žluté zbarvení reakční plošky se při pozitivitě mění na modrozelené. Test je specifický pro D-glukózu, jiné cukry neposkytují pozitivní reakci. 16

17 Závěr Cílem týmového projektu bylo podrobněji se zabývat biochemickými látkami, především sacharidů. V teoretické části jsou informace o strukturách sacharidů a o metodách jakýma se zkoumají. Tyto znalosti jsou potřeba na práci s biochemickými látkami. V praktické části jsme se zabývali vytvořením laboratorních úloh pro výuku biochemie. Úlohy jsou zaměřeny na důkazy sacharidů, bílkovin a dalších přírodních látek. Vytvořily jsme návody k úlohám, které obsahují veškeré potřebné vybavení a podrobný popis úloh. Dále jsme vytvořily vzorové protokoly a výukové prezentace, které k popisům úloh obsahují fotodokumentaci z laboratoře, která nám ukazuje výsledek úlohy. 17

18 6 Přílohy 6.1 Sacharidy návod k úloze Úvod: VLASTNOSTI SACHARIDŮ Sacharidy tvoří velkou skupinu přírodních organických látek. Jsou základními složkami všech živých organismů a zároveň i nejrozsáhlejší třídou biologicky aktivních molekul. Jejich molekuly se skládají z atomů uhlíku, vodíku a kyslíku. Sacharidy dělíme podle počtu uhlíkových atomů vázaných v jejich molekulách na monosacharidy, oligosacharidy a polysacharidy. Chemikálie: 1%roztoky škrobu, glukosy,, fruktosy, sacharosy 2%roztoky laktosy, galaktosy, maltosy 3%thymol v ethanolu,10% 1-naftol ethanolu Lugolův roztok 5 g jodu + 10 g KI v 100 ml vodného roztoku činidlo Selivanovo 0,05 roztok resorcinu v 20 % HCl činidlo Rothenfusserovo 20 ml 10 % roztoku difenylaminu v 96 % ethanolu s 80 ml ledové kys. octoové a 100 ml koncentrované HCl činidlo Fehlingovo I.-40 g CuSO 4.5H 2 O v rozpustit ve vodě a doplnit na 1 l; II.-200 g Seignettovy soly g NaOH rozpustit v destilované vodě a doplnit na 1 l činidlo Tollensovo I.-10 % dusičnan stříbrný II.-20 g NaOH rozpustit ve vodě, doplnit na 250 ml. škrobový maz (převařený roztok škrobu) koncentrovaná HCl Pomůcky: zkumavky kádinky pipeta skleněná tyčinka odměrný válec (5 ml, 20 ml) lžička vodní lázeň el. vařič kapátko Postup: a) Skupinová reakce na sacharidy Thymolová reakce: K 0,5 ml roztoku sacharidu přidejte 3 kapky 3 %alkoholického roztoku thymolu a 3 ml koncentrované HCl. Opatrným provařením (1-5 min.) vzniká karmínové zbarvení. Reakci proveďte se škrobem, sacharosou a neznámým vzorkem. 18

19 Molischova reakce: K 0,5 ml roztoku sacharidu přidejte kapku 10 % roztoku 1-naftolu a po promíchání opatrně podvrstvěte stejným objemem koncentrované kyseliny sírové (nechte kyselinu stékat po stěně zkumavky). Na rozhraní se vytvoří červenofialové zbarvení. Reakci proveďte s laktosou, glukosou a neznámým vzorkem. b) Skupinová reakce na mono- a oligosacharidy Nitrochromová reakce: K 1 ml roztoku sacharidu přidejte 3 ml koncentrované kyseliny dusičné a po stěně zkumavky 5 kapek 5 % chromanu draselného. Po promíchání a odstátí zvniká modré zbarvení. Proveďte se škrobem, sacharosou a neznámým vzorkem. c) Reakce na polysacharidy Reakce s jodem: K 1 ml roztoku sacharidu přidejte kapku Lugolova roztoku. Je-li přítomen škrob, vzniká modré zbarvení. Červené zbarvení svědčí o přítomnosti glykogenu nebo kratších polysacharidových řetězců vzniklých částečným štěpením škrobu. Proveďte se škrobem a neznámým vzorkem. d) Reakce na redukující sacharidy Felingova reakce: Smíchejte 0,5 ml roztoku sacharidu s 0,5 ml Fehlingova činidla I. A 0,5 ml Fehlingova činidla II. Po provaření vzniká v pozitivním případě červená sraženina Cu 2 O. Proveďte se sacharosou,maltosou a neznámým vzorkem. Tollensova reakce: K 1 ml roztoku sacharidu přidejte 1 ml čerstvě připraveného Tollensova činidla. Provařením vzniká u redukujících sacharidů na stěnách zkumavky stříbrné zrcátko. Po provedení okamžitě vylijte obsah zkumavky do odpadu. Delším stáním může dojít ke vzniku Bertholetova třaskavého stříbra, jenž může být příčinou samovolných explozí. Proveďte s neznámým vzorkem. e) Reakce na ketosy Selivanova reakce: 0,5 ml roztoku sacharidu s 2 ml Selivanova činidla zahřívejte ve vodní lázni. Červeným zbarvením se projeví asi po minutě přítomnost ketos, aldosy reagují slabě až po delší době. Reakci proveďte s fruktosou, glukosou a neznámým vzorkem. Rothenfusserova reakce: K 1 ml roztoku sacharidu přidejte 2 ml činidla. Po deseti minutách zahřívání na vroucí vodní lázni vzniká zejména u ketos modré zbarvení. Reakci proveďte s fruktosou, galaktosou a neznámým vzorkem. 2)Kyselá hydrolýza škrobu Zřeďte si Lugolův roztok...do připravených 10 zkumavek dejte 1 ml zředěného Lugolova roztoku. Odměřte si 10 ml škrobového mazu a promíchejte v Erlenmeyerově baňce s 1 ml koncentrované HCl. Pomocí plastové Pasteurovy pipetky (kapátka) odeberte do první zkumavky 0,5 ml vzorku. Dále Erlenmeyerovu baňku, přikrytou hliníkovou fólií, zahřejte a udržujte v mírném varu. Vždy po minutě odeberte z baňky 0,5 ml vzorku do připravených zkumavek a pozorujte vzniklé zbarvení. 6.2 Sacharidy výuková prezentace 19

20 6.3 DNA návod k úloze Úvod: IZOLACE ROSTLINNÉ DNA Deoxyribonukleové kyseliny (DNA) představují základní genetický materiál většiny živých organismů -uchovávají a předávají základní genetickou informaci. DNA se nejčastěji vyskytuje ve formě pravotočivé dvojšroubovice (DNA-B), kde jsou 2 řetězce tvořené zbytky deoxyribosy a kyseliny fosforečné zatočeny ve spirálách kolem centrální osy a dovnitř šroubovice potom směřují jednotlivé báze. DNA se v jádře buňky vyskytuje jakožto vysoce strukturně uspořádaný nukleoproteinový komplex zvaný chromatin. Dvojšroubovice DNA je omotána kolem 8 molekul histonů (bazické proteiny) za vzniku útvarů zvaných nukleosomy. Chemikálie: kyselina EDTA(ethylendiamintetraacetát) extrakční roztok 90 ml H 2 O + 5 ml kys.edta+ lžička NaCl NaCl ledový ethanol/isopropylalkohol 0,5 % NaOH difenylaminové činidlo 50 ml CH 3 COOH + 2 x 37,5 H 2 SO 4 Pomůcky: třecí miska kádinky nálevka, filtrační papír skleněná tyčinka odměrný válec (5 ml, 20 ml) zkumavky lžička vodní lázeň Postup: a) Vysrážení DNA Do třecí misky vložte 1-2 jahody (banán, kiwi). Třete do doby až se vytvoří homogenát, tím mechanicky narušíte buňky. Poté přidejte 15 ml extrakčního roztoku. Kyselina EDTA rozpustí tuky v buněčné membráně, sůl zadrží bílkoviny v roztoku, aby se nesrážely společně s DNA. Homogenát pomocí filtrační aparatury přefiltrujete. Do zkumavky přelijte 2 ml filtrátu a opatrně, pod mírným úhlem po stěně zkumavky, nalijte stejný objem (2 ml) ledového alkoholu. Alkohol je lehčí než filtrát, a proto vzniknou dvě oddělené vrstvy. Alkohol váže další molekuly vody a konečně způsobí precipitaci DNA, jež ztratila svůj hydratační obal. Čím studenější alkohol, tím lépe se DNA vysráží. DNA přeneste skleněnou tyčinkou(špejlí) do zkumavky. b) Důkaz DNA DNA a RNA od sebe lze rozlišit na základě barevných reakcích. Difenylamin poskytuje s RNA zelené zbarvení a s DNA modré zbarvení. Do zkumavky s izolovanou DNA přidejte 1 ml 0,5 % NaOH. Po promíchání a rozpouštění přidejte 1 ml difenylaminového činidla. Ve vroucí vodní lázni zahřívejte minut. 6.4 DNA výuková prezentace 20

21 6.5 DNA protokol Téma:Izolace rostlinné DNA Jméno: Jana Dobešová Skupina Datum měření: Chemikálie: Pomůcky: - kyselina EDTA(ethylendiamintetraacetát) - extrakční roztok 90 ml H 2 O + 5 ml kys.edta+ lžička NaCl - NaCl - ledový ethanol/isopropylalkohol - 0,5 % NaOH - difenylaminové činidlo 50 ml CH 3 COOH + 2 x 37,5 H 2 SO 4 - třecí miska - kádinky - nálevka, filtrační papír - skleněná tyčinka - odměrný válec (5 ml, 20 ml) - zkumavky - lžička - vodní lázeň Postup: a) Vysrážení DNA - Do třecí misky jsem vložila 1-2 jahody (banán, kiwi). Třela do doby až se vytvořil homogenát, tím jsem mechanicky narušila buňky. Poté jsem přidala 15 ml extrakčního roztoku. Kyselina EDTA rozpustila tuky v buněčné membráně, sůl zadržela bílkoviny v roztoku, aby se nesrážely společně s DNA. Homogenát jsem přefiltrovala pomocí filtrační aparatury. Do zkumavky jsem přelila 2 ml filtrátu a opatrně, pod mírným úhlem po stěně zkumavky, nalila stejný objem (2 ml) ledového alkoholu. Vznikly dvě oddělené vrstvy, protože alkohol je lehčí než filtrát. DNA jsem přenesla skleněnou tyčinkou(špejlí) do zkumavky. b) Důkaz RNA - Do zkumavky s izolovanou DNA jsem přidala 1 ml 0,5 % NaOH. Po promíchání a rozpouštění jsem přidala 1 ml difenylaminového činidla a ve vroucí vodní lázni zahřívala minut. Poté se nám roztok zbarvil do modra, což nám dokázalo DNA. 21

22 6.6 RNA návod k úloze Úvod: IZOLACE ROSTLINNÉ RNA Ribonukleové kyseliny (RNA) se bezprostředně podílejí na různých fázích biosyntézy bílkovin. Základem molekuly nukleových kyselin je nerozvětvený polynukleotidový řetězec, sestavený ze základních stavebních článků nukleotidů. Každý nukleotid se skládá ze tří složek heterocyklické dusíkaté báze, pentosy (ribosy/deoxyribosy) a kyseliny fosforečné. Chemikálie: diethylether ledový ethanol mořský písek 5 % CH 3 COOH a 50 % CH 3 COOH 0,1 N HCl 0,1 N NaOH 0,5 % NaOH difenylaminové činidlo 50 ml CH 3 COOH + 2 x 37,5 H 2 SO 4 Pomůcky: třecí miska kádinky centrifuga skleněná tyčinka odměrný válec (5 ml, 20 ml) zkumavky lžička vodní lázeň kapátko Postup: a) Vysrážení RNA Do třecí misky vložte směs 20 g kvasnic, 3 ml destilované vody a 3 ml diethyletheru a 5 g mořského písku. Do homogenátu přidejte 25 ml 0,5 % NaOH a roztírejte přibližně 15 minut. Mechanicky se naruší buňky a louh pomůže narušit buněčnou stěnu kvasinek. Směs zahřívejte ve vodní lázni 15 minut při 70 C. Pomocí 5 % kyseliny octové upravte ph preparátu na ph 6. Směs centrifugujte při 3000x g po dobu 15 minut. Tím se odstraní zbytky buněčných obalů, větší organely. Supernatant odlijte do kádinky a upravte na ph 3,5 pomocí 50 % kyseliny octové. Poté k roztoku v kádince přidejte stejné množství vychlazeného ethanolu. Vyloučená sraženina představuje ribonukleoprotein, kterou dále centrifugujte (10 minut, 2000 g). Sraženinu v malých zkumavkách rozpusťte v malém množství 0,1 N NaOH. Roztok zřeďte stejným objemem ledové destilované vody a zcentrifugujte. Supernatant okyselte 1 N HCl na ph 6 a za stálého mícháni přidejte dvojnásobné množství chlazeného ethanolu. Nechte v lednici 1 h. RNA se znovu vysráží, již bez bílkovin. Zcentifugujte, sraženinu promyjte methanolem a vysušte v exsikátoru. b) Důkaz RNA DNA a RNA od sebe lze rozlišit na základě barevných reakcích. Difenylamin poskytuje s RNA zelené zbarvení a s DNA modré zbarvení. Do zkumavky s izolované RNA přidejte 1 ml 0,5 % NaOH. Po promíchání a rozpouštění přidejte 1 ml difenylaminového činidla. Ve vroucí vodní lázni zahřívejte minut. 22

23 6.7 RNA protokol Téma:Izolace rostlinné DNA Jméno: Jana Dobešová Skupina Datum měření: Chemikálie: Pomůcky: - kyselina EDTA(ethylendiamintetraacetát) - extrakční roztok 90 ml H 2 O + 5 ml kys.edta+ lžička NaCl - NaCl - ledový ethanol/isopropylalkohol - 0,5 % NaOH - difenylaminové činidlo 50 ml CH 3 COOH + 2 x 37,5 H 2 SO 4 - třecí miska - kádinky - nálevka, filtrační papír - skleněná tyčinka - odměrný válec (5 ml, 20 ml) - zkumavky - lžička - vodní lázeň Postup: a) Vysrážení DNA - Do třecí misky jsem vložila 1-2 jahody (banán, kiwi). Třela do doby až se vytvořil homogenát, tím jsem mechanicky narušila buňky. Poté jsem přidala 15 ml extrakčního roztoku. Kyselina EDTA rozpustila tuky v buněčné membráně, sůl zadržela bílkoviny v roztoku, aby se nesrážely společně s DNA. Homogenát jsem přefiltrovala pomocí filtrační aparatury. Do zkumavky jsem přelila 2 ml filtrátu a opatrně, pod mírným úhlem po stěně zkumavky, nalila stejný objem (2 ml) ledového alkoholu. Vznikly dvě oddělené vrstvy, protože alkohol je lehčí než filtrát. DNA jsem přenesla skleněnou tyčinkou(špejlí) do zkumavky. b) Důkaz RNA - Do zkumavky s izolovanou DNA jsem přidala 1 ml 0,5 % NaOH. Po promíchání a rozpouštění jsem přidala 1 ml difenylaminového činidla a ve vroucí vodní lázni zahřívala minut. Poté se nám roztok zbarvil do modra, což nám dokázalo DNA. 23

24 7 Použitá literatura [1] Donald Voet, Judith G. Voet, Biochemie, ed. 1.vydání, Praha: Victoria Publishing, 1995, ISBN [2] Racek, J. et al: Klinická biochemie, 1. vydání. Galén, Praha, ISBN Karolinum, Praha, ISBN [3] Laboratorní cvičení z biochemie I - kvalitativní stanovení glukózy v základním praktiku. Cukrovka očima biochemie [online] [cit ]. Dostupné z: [4] JOSEPH, Wang. Electrochemical glucose biosensors. Chemical reviews [online]. 2008, vol. 108, no. 2, s , dostupné také z < ISSN [5] HELLER, Adam FELDMAN, Ben. Electrochemical glucose sensors and their applications in diabetes management. Chemical reviews [online]. 2008, vol. 108, no. 7, s , dostupné také z < ISSN [6] Kontinuální měření glykémie přes kůži Moje cukrovka. Moje cukrovka [online] [cit ]. Dostupné z: [7] Čím vším je ovlivňována glykémie. DIAinfo: informace pro diabetiky [online] [cit ]. Dostupné z: [8] - Biochemie - SACHARIDY. [online] [cit ]. Dostupné z : 24