Srovnání účinků různých čiřících prostředků při výrobě vína. Ludmila Vydařilá

Transkript

1 Srovnání účinků různých čiřících prostředků při výrobě vína Ludmila Vydařilá Bakalářská práce 2013

2

3

4

5

6 ABSTRAKT Bakalářská práce se zabývá posuzováním účinností dvou čiřících prostředků u dvou modelových vzorků vín. Účinnost čiřících prostředků byla vyhodnocována za pomocí stanovení obsahů celkových aminokyselin, volných aminokyselin a vázaných aminokyselin. Obsahy aminokyselin byly stanoveny pomocí Automatického analyzátoru aminokyselin. Klíčová slova: víno, čiřící prostředky, čiření. ABSTRACT The bachelor thesis deals with assessing the efficacy of two fining agents in two model wine samples. The effectiveness of fining agents was evaluated using determination of total amino acids, free amino acids and bound amino acids. The contents of amino acids were determined using an Amino Acid Analyzer. Keywords: wine, fining agents, fining

7 Poděkování Ráda bych poděkovala vedoucímu mé bakalářské práce, panu doc. Ing. Františku Buňkovi, Ph.D., za odborné vedení, konzultaci, trpělivost a věnovaný čas, paní Ing. Ludmile Zálešákové za pomoc v laboratoři, Vinařství Trávník a Vinařství Jaroslav Vydařilý za umožnění provedení experimentu a poskytnutí vzorků. Dále bych chtěla poděkovat svým rodičům, bratrovi a příteli za trpělivost a podporu po celou dobu mého studia. Prohlašuji, že odevzdaná verze bakalářské práce a verze elektronická nahraná do IS/STAG jsou totožné.

8 OBSAH ÚVOD...10 I TEORETICKÁ ČÁST VÝROBA VÍNA SKLIZEŇ HROZNŮ ZPRACOVÁNÍ HROZNŮ ÚPRAVA MOŠTU PŘED KVAŠENÍM KVAŠENÍ Způsoby kvašení Vlivy ovlivňující průběh kvašení JABLEČNO-MLÉČNÉ KVAŠENÍ Možnosti realizace jablečno-mléčného kvašení ČIŘENÍ VÍNA FILTRACE ČIŘENÍ VÍNA ČIŘÍCÍ PROSTŘEDKY Čiřící prostředky se záporným nábojem Čiřící prostředky s kladným nábojem Čiřící prostředky s neutrálním nábojem Směsné přípravky VADY VÍNA BÍLKOVINNÉ ZÁKALY VADY PŘI ČIŘENÍ...27 II PRAKTICKÁ ČÁST CÍL PRÁCE METODIKA PRÁCE POPIS VZORKŮ POPIS ČIŘÍCÍCH PROSTŘEDKŮ STANOVENÍ OBSAHU CELKOVÝCH AMINOKYSELIN STANOVENÍ PH VÝSLEDKY A DISKUZE STANOVENÍ AMINOKYSELIN STANOVENÍ PH...46 ZÁVĚR...47 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY...48 SEZNAM POUŽITÝCH SYMBOLŮ A ZKRATEK...51

9 SEZNAM OBRÁZKŮ...52 SEZNAM TABULEK...53 SEZNAM PŘÍLOH...54

10 UTB ve Zlíně, Fakulta technologická 10 ÚVOD Dnešní požadavky na vinaře jsou velmi vysoké. Současný vinař má řadu možností, jak produkovat vína s rozdílným charakterem a stylem přípravy [2]. Základní kroky používané při výrobě vína u drobných výrobců, velkých výrobců i domácích výrobců vína jsou velmi podobné, ale velikost a propracovanost zařízení se mohou lišit [12]. Přesto se nesmí zapomenout na zásadu: Kvalita vzniká na vinici [2]. Víno je alkoholickým nápojem, který se nemusí v žádné fázi své přípravy zahřívat. Tím si uchová přírodní látky prospěšné lidskému organismu [3]. V teoretické části je popisována výroba vína, dále pak procesy čiření vína a vady vína, které jsou zaměřeny na vady související s čiřením vína. V praktické části byl založen experiment s dvěma modelovými vzorky vína, u kterých byly aplikovány dva čiřící prostředky. Jejich účinnost byla posuzována pomocí stanovení před a po aplikaci čiřícího prostředku, a to stanovením celkového obsahu aminokyselin a obsahu volných aminokyselin. Výsledky byly vyhodnoceny a byla porovnána účinnost použitých čiřících prostředků.

11 UTB ve Zlíně, Fakulta technologická 11 I. TEORETICKÁ ČÁST

12 UTB ve Zlíně, Fakulta technologická 12 1 VÝROBA VÍNA 1.1 Sklizeň hroznů Základní surovinou pro výrobu vína jsou čerstvé hrozny révy vinné (Vitis vinifera) [1]. Hrozny se sbírají na vinici v našich podmínkách zhruba v období konec srpna (například: Veltlínské červené rané, Irsay Oliver, Muškát moravský) až v průběhu října (například: Ryzlink vlašský, Veltlínské zelené, Ryzlink rýnský, Frankovka, Rulandské modré) [9]. Výjimkou je sbírání v zimních měsících za mrazu při výrobě ledového vína (sběr při teplotě - 6 C a nižší). Odrůdy pro výrobu vína je možné zjednodušeně rozdělit na bílé (pro výrobu bílých vín) a modré (pro výrobu červených vín) [1]. Již několik týdnů před sklizní je sledováno zrání hroznů a jejich zdravotní stav. Jsou připraveny nádoby pro sklizeň, vynášení hroznů z vinice a odvoz k lisování [4]. Doba sklizně nemá vliv pouze na cukernatost a obsah kyselin v hroznech, ale je jí řízeno i zásobení moštu potřebnými živinami pro kvasinky (aminokyseliny, minerální látky). Předčasný sběr společně s dalšími nepříznivými faktory ve vinici a sklepě by mohl vést k problémům při kvašení [2]. Zpracovávají se pouze vyzrálé hrozny prosté chorob. Úkolem je zachovat pokud možno bez újmy dodanou kvalitu, podpořit odrůdový charakter a dát vínu jeho osobní styl [2]. 1.2 Zpracování hroznů Posbírané hrozny je třeba zpracovat v týž den. Napřed je třeba hrozny odzrnit, což je nepřesný, ale zavedený termín. Hrozny se totiž nezbavují zrníček, ale stopek třapin (semena bývají odstraňovány při lisování). Jejich macerování v moštu by totiž do výchozí suroviny dodalo nežádoucí chuťové vady. Většinou se hrozny pomelou a tím uvolní šťávu z dužiny. Přitom dochází k provzdušnění moštu. U nejmodernějších postupů, kdy se vyrábí jemná, aromatická vína, se hrozny nedrtí, ale rovnou lisují, protože tato technologie vyžaduje maximálně zkrátit čas nutný ke zpracování hroznů [3]. U bílých vín bývá ještě stále doporučováno nechat surovinu nakvasit v rmutových kádích (až několik hodin). Nesprávně odhadnutou dobou nakvašení může nezkušený vinař poškodit výchozí surovinu, protože se mu do ní dostane nadbytek tříslovin, kontaminantů, kde

13 UTB ve Zlíně, Fakulta technologická 13 jednou z možností jsou octové bakterie (například rody Acetobacter, Gluconobacter), či nežádoucí zbarvení [3]. U malopěstitele jsou hrozny obvykle mlety na mlýnku nebo odzrňovány na odzrňovači s ručním pohonem. Ve velkovýrobě se pro tuto práci používají velmi výkonné stroje s čerpadly na dopravu rmutů do lisů nebo kvasných jímek [4]. Drť je co nejrychleji, pokud možno ihned po naležení, vylisována. Lisováním je oddělován mošt od tuhých částí rmutu [4]. Při lisování není vhodné ponechávat matoliny dlouho v lisu, protože začnou kvasit, zvyšuje se v nich teplota, mohou se zapařit a mohou být kontaminovány bakteriemi octového kvašení, při kterém vzniká nežádoucí kyselina octová. Matoliny vybrané z lisu by měli být ihned z místnosti vyvezeny [4]. Po skončení lisování by měl být nejen lis, ale i všechny použité nádoby řádně opláchnuty nejlépe teplou a potom studenou vodou [4]. Výlisnost v malovýrobě se pohybuje od l moštu ze 100 kg hroznů. Je závislá na odrůdě, zralosti hroznů, ročníku a lisovací technice [4]. 1.3 Úprava moštu před kvašením Během krátkého období mezi sklizní a kvašením se používají postupy, rozhodující o budoucím charakteru a kvalitě vína. Důležitou částí je přitom úprava moštu. Tyto úpravy moštu budou dále charakterizovány a patří mezi ně: odkalování moštů, provzdušnění, síření, zvyšování cukernatosti, odkyselování a úprava tříslovin. [2]. V ochraně révy vinné proti chorobám a škůdcům se používají různé chemické přípravky, zejména fungicidy a pesticidy, které mohou zanechávat na hroznech, a tím i v moštech četné nežádoucí látky. U některé z nich se projevuje nepříznivý vliv i na kvašení moštů. Proto bývá vhodné mošty před kvašením odkalovat. Odkalováním jsou odstraňovány z moštů také mechanické nečistoty (zbytky slupek, třapin, pecičky i půdní částice), které by mohli nepříznivě ovlivnit kvalitu budoucího vína. Mošty jsou odkalovány hned po lisování, dokud nekvasí, čímž jsou vytvořeny vhodné podmínky pro průběh kvašení po aplikaci zákvasu. Odkalení probíhá tak, že jsou ponechány nečistoty usazovat se na dno nádoby během jednoho až dvou dnů, poté je kal oddělen od čistého moštu [4]. Odkalení patří k nejdůležitějším postupům, jak získat čisté víno bez postranních tónů ve vůni a chuti [2].

14 UTB ve Zlíně, Fakulta technologická 14 Provzdušnění moštu podporuje množení kvasinek, a tím kvašení, ale zvyšuje i vliv nežádoucích mikroorganismů (např. octových bakterií), čímž se zvyšuje nebezpečí vad vína. Zdravý mošt se zpravidla neprovzdušňuje [2]. V zásadě by měl být rmut, případně již hrozny sířeny tak, aby v moštu byl obsah volného SO 2 přibližně 2 2,5 g/hl [2]. Další síření moštu dávkou g/hl disiřičitanu draselného je nutné pouze v případě: delšího stání moštu, velmi vysokých teplot při sklizni, značně nahnilých hroznů [2]. V nepříznivých letech hrozny některých odrůd nedozrají, takže obsahují málo cukru a hodně kyselin. Proto je nedostatek cukernatosti napravován zvýšením obsahu sacharózy rafinovaným řepným cukrem nebo zahuštěným moštem a příliš kyselé mošty jsou odkyselovány pomocí jablečno-mléčného kvašení, které bude probíráno dále (Kapitola 1.5). Úpravě moštu předchází přesné stanovení jeho cukernatosti a vypočítání potřeby sacharózy [4]. Révové mošty pro výrobu stolních je dovoleno dosladit, jestliže celkový obsah alkoholu v objemových % dotyčného stolního vína nebude zvýšen o více než 2 objemové % (pro výrobu bílých vín nad 21 stupňů cukernatosti, nejvýše však o 7 stupňů cukernatosti). Doslazování je u jakostních vín s přívlastkem zakázáno [14]. Obsah cukru se nejčastěji zjišťuje normalizovaným moštoměrem, který udává koncentraci zkvasitelných cukrů révových moštů v kg na 1 hl [4]. Pro vytvoření harmonického poměru mezi cukrem a kyselinami v moštu nestačí jen mošty s vysokým obsahem kyselin přisladit, ale musí se rovněž snížit obsah kyselin [4]. Odkyselování moštu je v kyselých ročnících velmi důležité opatření k ovlivnění kvality vína. I když kyselejší mošt zaručuje mikrobiologicky čistší prokvašení, je vhodné snížit kyseliny v moštu s obsahem vyšším než cca 12 g/l. K odkyselování může být použit uhličitan vápenatý, hydrogenuhličitan draselný nebo uhličitan vápenatý s malým množstvím vinanu vápenatého a jablečnanu vápenatého. U moštů by měla být snižována kyselost maximálně na 9 10 g/l. Odkyselování moštů je řízeno zákonem č. 321/2004 Sb., o vinohradnictví a vinařství a o změně některých souvisejících zákonů (zákon o vinohradnictví a vinařství) [2].

15 UTB ve Zlíně, Fakulta technologická 15 Při velmi dlouhém naležení rmutu a také při méně šetrném zpracování hroznů se do moštu dostává vysoký podíl tříslovin. To později vede k hrubým, neelegantním vínům, která rychle získávají vyšší barvu, oxidují a stárnou. V takových případech si lze pomoci použitím adsorpčních látek a prostředků snižujících třísloviny, jako želatiny, kaseinu, polyvinylpolypyrrolidonu, které jsou někdy nabízeny i jako směsné přípravky [2]. 1.4 Kvašení Alkoholové kvašení je způsobeno činností mnoha druhů kvasinek. Základem při výrobě vína jsou vinné kvasinky (Saccharomyces cerevisiae), které jsou považované za zkvašující glukózu [6]. Obr. 1: Zjednodušené schéma alkoholového kvašení [15]. Mošt z hroznů révy vinné obsahuje dva nejvýznamnější cukry, glukózu a fruktózu, nejčastěji v poměru 1:1, přičemž vinné kvasinky tyto dva cukry velmi dobře zpracovávají. Při doslazování bývá v moštu obsažena také sacharóza, která je štěpena na glukózu a fruktózu,

16 UTB ve Zlíně, Fakulta technologická 16 které jsou zpracovávány kvasinkami. V průběhu kvašení potom rychleji využívají glukózu a pomaleji fruktózu. Případný zbytkový cukr ve víně je častěji představován právě fruktózou, která rovněž působí chuťově sladším dojmem (sladivost glukózy 74,3, sladivost fruktózy 173 v porovnání se sacharózou, sladivost standardu sacharózy 100) [6]. Během tohoto procesu nepřeměňují kvasinky jen cukr na alkohol a jiné vedlejší produkty, ale uvolňuje se i aroma a vytvářejí se nové sloučeniny vzniká kvasný buket [2] Způsoby kvašení Kvašení začíná, jakmile jsou hrozny rozdrceny [11]. Pro zahájení kvašení je zapotřebí asi 10 6 buněk/ml. Lisy a jiná zařízení jsou nejdůležitějšími zdroji kontaminace, zde se zvyšuje přirozený počet kvasinek v moštu z 10 až 100 jedinců/ml deseti- až stonásobně. Aby se dosáhlo počtu kvasinek potřebného k zahájení kvašení, existují dvě možnosti, a to spontánní kvašení a kvašení pomocí čistých kultur kvasinek. V případě spontánního kvašení se čeká, až se kvasinky s využitím kyslíku namnoží na potřebný počet buněk. Občas je argumentováno, že odrůdový charakter vína je nejlépe zajištěn původními kvasinkami z bobulí (Saccharomyces cerevisiae subsp. cerevisiae, Saccharomyces cerevisiae subsp. uvarum, Saccharomyces cerevisiae subsp. bayanus, Saccharomyces chevalieri, Torulaspora delbrueckii, Zygosaccharomyces florentinus, Zygosaccharomyces rouxii, Kluyveromyces thermotolerans, Kloeckera apiculata, Metschnikowia pulcherrima, Candida stellata, Kloeckera corticis, Candida krusei, Candida vini, Hansenula anomala, Hansenula subpelliculosa, Pichia fermentans, Pichia membranaefacien). Podle podmínek (SO 2, teplota, výchozí počet zárodků, rezidua přípravků na ochranu rostlin) se může prosadit jiný druh kvasinek, než je požadován. Divoké kvasinky často zakvášejí rychleji, vytvářejí hodně glycerolu, ale hůře snášejí alkohol, a některé odumírají již při 4 % obj. alkoholu [2]. V případě kvašení pomocí čistých kultur kvasinek je přídavkem selektovaných sušených čistých kultur od počátku dosaženo dostatečného množství buněk, a minimalizuje se riziko vzniku kvašení nežádoucím směrem [2]. Čistá kultura kvasinek se může prodávat v kapalné formě, ta se však v současné době používá méně z důvodu špatné manipulace a možné kontaminace jinými kvasinkami z prostředí. Technologií hojně užívanou a vhodnou zejména pro malovinaře jsou sušené

17 UTB ve Zlíně, Fakulta technologická 17 preparáty, aktivní suché vinné kvasinky [6]. V případě výroby bílého vína jsou kultury přidávány do moštu po lisování, u červených vín bývají kultury přidávány na počátku macerace. Množství, koncentrace a forma kultury závisí na složení hroznů, typu vína, které je vyráběno a dalším [11]. Velmi vhodný je přídavek čistých kvasinek v případě: moštu o vysoké cukernatosti (vína s přívlastkem), moštu z hroznů s vadami, opětovného překvášení a druhotného kvašení, které je využíváno při výrobě sektů, velmi nízkých teplot [2]. Při použití čistých kvasinek dostávají vína typickou chuť, doba kvašení je kratší než u spontánního kvašení, u některých je možné použití i při nižších teplotách (10 15 C), a také některé druhy čistých kvasinek produkují specifické aromatické látky, které ovlivňují vůni i chuť vína [17] Vlivy ovlivňující průběh kvašení Teplota je naprosto nejdůležitějším faktorem, ovlivňujícím kvašení. Většinu problémů s kvašením je ve skutečnosti způsobováno nevhodnou teplotou [2]. Pro rozmnožování kvasinek a počátek kvašení je optimální teplota C. Teplota je ovlivňována přihříváním moštů nebo naopak jejich chlazením [6]. Dalším vlivem je cukernatost moštů. U moštů o nízké cukernatosti probíhá kvašení bez problémů. Vysoké obsahy cukrů prokvášejí v důsledku vysokého osmotického tlaku špatně. Kvasinky se dostávají do osmotického stresu a dochází ke snížení intenzity jejich množení [2]. Na kvašení má vliv také obsah alkoholu. Silně kvasící kvasinky rodu Saccharomyces jsou značně tolerantní vůči alkoholu. Ještě při 12 až 13 % obj. alkoholu se mohou množit, jejich možnosti množení končí při 15 až 16 % obj. etanolu. Při vysokém obsahu alkoholu bývá prováděno závěrečné dokvašování nejčastěji kvasinky Saccharomyces cerevisiae subsp. bayanus, které bývají ještě více rezistentní vůči alkoholu než většina kmenů Saccharomyces cerevisiae. [2].

18 UTB ve Zlíně, Fakulta technologická 18 Při aplikaci většího množství kyseliny siřičité, při ošetřování moštů sířením, bývá snižována rychlost množení kvasinek. Jsou tím potlačovány především divoké kvasinky a bakterie, kvasinky rodu Saccharomyces méně [2]. Kalové částice podporují uvolňování CO 2, to vede k výraznému promísení a k další stimulaci prudkého kvašení. Má-li být kvašení klidné a řízené, měly by být kaly z moštu odstraněny. Po odkalení kvasí mošt pomaleji, rovnoměrněji, neohřívá se tak značně a vznikají z něj mladá vína bez postraních tónů [2]. Vysoký obsah kovů, který se dostává do moštu jeho přímým stykem s těmito kovy (měď, zinek), zpravidla nijak neovlivňuje kvašení, ale může bránit druhotnému kvašení (u šumivých vín) [2]. Rezidua pesticidů mohou způsobovat problémy s počátkem kvašení, především pokud byly použity vyšší než předepsané dávky nebo nebyla dodržena stanovená ochranná lhůta. Důkladným odkalením se lze zbavit většiny reziduí pesticidů [2]. Bakterie octového kvašení se mohou dostat do moštu z narušených bobulí (hniloby) nebo také z kontaminovaných kádí, lisů apod. Při pomalém nástupu kvašení mají dostatek času k namnožení a pak brzdí množení kvasinek [2]. 1.5 Jablečno-mléčné kvašení Kyselina jablečná může představovat zhruba polovinu celkové kyselosti hroznů a vína. Její koncentrace v plodu má tendenci klesat, když hrozny zrají, a to zejména v horkém období na konci sezóny. To může vést k produkci vín s plochou chutí, které jsou citlivé na mikrobiální kažení. Naopak, v chladu, může hladina kyseliny jablečné zůstávat vysoká a výsledné víno může mít kyselou chuť. Proto bývá obsah kyseliny jablečné jedním z hlavních ukazatelů používaných při určování doby sklizně [10]. Malé množství kyseliny mléčné je produkováno kvasinkami v průběhu kvašení. Pokud se kyselina mléčná vyskytuje ve víně jako hlavní složka, pochází z metabolické aktivity bakterií, nejčastěji bakterií mléčného kvašení. Syntetizují jablečno-mléčný enzym, který přeměňuje kyselinu jablečnou na kyselinu mléčnou. Proces, nazývaný jablečno-mléčné kvašení, je obyčejně podporován v červených a některých bílých vínech. Hlavní výhodou jablečno-mléčného kvašení je přeměna tvrději chutnající kyseliny jablečné na jemněji chutnající kyselinu mléčnou [10].

19 UTB ve Zlíně, Fakulta technologická 19 HO O OH O OH Mn 2+ NAD + O CH 3 H O + CO 2 OH kyselina jablečná kyselina mléčná Obr. 2: Zjednodušené schéma přeměna kyseliny jablečné na kyselinu mléčnou [10]. Spontánní jablečno-mléčné kvašení probíhá v našich klimatických podmínkách s kontaminující mikroflórou a vede k syntetizování dalších metabolitů nežádoucích bakterií (těkavé kyseliny, těkavé sirnaté látky a negativní mléčné aromata), které mohou vést k tvorbě negativních senzorických projevů. Vývoj spontánní mikroflóry je určený vývojem počasí v době zrání hroznů. Spontánní rozvoj jablečno-mléčného kvašení bývá podporován teplotou vyšší než 22 C, kontaktem s jemnými kvasničnými kaly a nízkým obsah volného oxidu siřičitého [6]. Základní výhodou inokulace selektovaného kmene mléčných bakterií je možnost kontroly průběhu jablečno-mléčného kvašení, a tím pozitivní vliv na senzorické vlastnosti vína. Úplný průběh jablečno-mléčného kvašení je důležitý z pohledu senzorických vlastností vína a jeho mikrobiální stability. Využití selektovaných preparátů mléčných bakterií umožňuje realizaci jablečno-mléčného kvašení také v obtížnějších podmínkách, např. při nízké teplotě nebo nízké hodnotě ph. Bakterie používané k inokulaci bývají například Oenococcus oeni a Lactobacillus plantarum [6] Možnosti realizace jablečno-mléčného kvašení Obvyklým způsobem provedení jablečno-mléčného kvašení je inokulace mléčných bakterií až po ukončení alkoholového kvašení. Aplikací mléčných bakterií do vína po ukončení alkoholového kvašení je zamezeno nadměrné produkci kyseliny octové a kyseliny mléčné, ty mohou negativně ovlivňovat aroma a chuť vína. [6]. Doba zahájení inokulace může být velmi významná pro senzorickou kvalitu vína. V součastné vinařské praxi bývají doporučovány 2 termíny inokulace bakterií: společná inokulace s kvasinkami před začátkem alkoholového kvašení;

20 UTB ve Zlíně, Fakulta technologická 20 inokulace ihned po ukončení alkoholového kvašení [6]. U většiny výrobců vín bývá prováděna inokulace selektovaných mléčných bakterií až po ukončení alkoholového kvašení. Až nejsou ve víně senzoricky patrné stopy po proběhnutém jablečno-mléčném kvašení, bývá aplikován oxid siřičitý [6]. 1.6 Čiření vína Čiření je proces, kdy se do vína přidají látky, které budou vázány na částice ve víně (např. bílkoviny, apod.) Po navázání dochází k sedimentaci čiřící látky a na ní navázané částice na dno nádoby. Částice a čiřící látky jsou z vína odstraňovány dekantací. Mezi čiřící prostředky je řazena například želatina, bentonit, kasein nebo vaječný bílek detailněji popsáno v kapitole 2 [13]. 1.7 Filtrace Filtrace je jeden ze základních procesů používaných téměř ve všech potravinářských technologiích. Smyslem procesu je oddělování dispergovaných pevných částic z kapaliny pomocí vhodné filtrační přepážky. Při filtraci je přiváděna suspenze částic na filtrační překážku, kde je vlivem tlakového rozdílu před a za přepážkou filtrována. Tímto způsobem dochází k zachycení částic na přepážce, kde se tvoří tzv. filtrační koláč. Tekutina prochází kapilárami a mezerami ve filtračním koláči a póry filtrační přepážky a odchází jako filtrát [16]. Kvalifikace filtrace závisí na druhu filtračního materiálu a na velikosti jeho pórů [6]. Ve vinařské malovýrobě lze používat následující filtrační postupy: filtrace s použitím křemeliny, filtrace s použitím deskových (vložkových) filtrů a filtračních desek, membránová filtrace (velikost pórů 0,2 µm, 0,45 µm, 0,65 µm a 0,8 µm) [6]. Úplné čistoty a mikrobiální stability hotového vína obvykle není dosáhnuto hned po první filtraci. Zakalená vína není vhodné okamžitě filtrovat přes póry nejmenší velikosti, protože pak dochází k velmi rychlému ucpání filtračního materiálu. Aby byla zabezpečena odpovídající kvalita vína pro lahvování, je tedy třeba počítat s více filtracemi. Účinnost filtrace může být zhodnocena na základě parametrů, které je možné jednoduše určit. Hodnota zákalu neboli zakalenosti vína je určena například turbidimetrem [6].

21 UTB ve Zlíně, Fakulta technologická 21 2 ČIŘENÍ VÍNA Čiřícími prostředky se ošetřuje víno hned z několika důvodů. Na jednu stranu mají pomoci uchovat víno, předané spotřebiteli, stabilní i po skladování v různých podmínkách a při různých teplotách. Mají-li vína vady, lze využít čiřící prostředky také ke snížení či v některých případech i odstranění nežádoucích chuťových a pachových látek [2]. Čiřením vína se urychluje sedimentace kalicích látek přidáváním různých zdraví neškodných čiřidel [4]. Zákaly vína způsobují tuhé kalicí částice (bílkoviny, Fe 2+, Fe 3+, Cu 2+ ) a různé chemické reakce probíhající v době zrání vína. Na tvorbu zákalů má vliv srážení bílkovin, pektinových a slizových látek, dále přebytek některých kovů, zejména železa, mědi a zinku a rovněž změna koloidních stavů vína. Koloidy mají kladný nebo záporný náboj, čehož se využívá při čiření vína k vysrážení látek způsobující zákaly. Do vína se přidává látka s opačným elektrickým nábojem, čímž se náboje navzájem vyrovnají a vytvářejí se koloidní shluky, které při sedání ke dnu strhávají s sebou mikroorganismy a nečistoty. Jsou přidávány také látky, které nemají elektrický náboj a působí ve víně například svými adsorpčními schopnostmi (například aktivní uhlí) [4]. Každému čiření musí předcházet předběžné zkoušky pro stanovení správné dávky čiřidla. Víno, které se má čiřit, musí být dokvašené a nesmí v něm probíhat odbourávání kyselin. Nejlépe probíhá při stálé, nižší teplotě. Sraženina má mít větší hmotnost než víno, aby sedimentovala. Čiření je prováděno obvykle jednou, v případě potřeby může být opakováno. Opakované čiření ale způsobuje například větší ztrátu barevných, anebo chuťových složek vína [4]. 2.1 Čiřící prostředky Čiřidla jsou rozdělovány podle toho, zda mají kladný nebo záporný elektrický náboj. Můžou se vyskytovat čiřidla i bez náboje. Kladný náboj mají bílkovinná čiřidla jako vyzina, želatina, vaječný bílek a kasein. Záporným nábojem působí tanin, agar, bentonit, kyselina křemičitá, křemelina, kaolin a španělská hlinka. Čiřící prostředky bez náboje působící například svými adsorpčními schopnostmi jsou aktivní uhlí nebo vinné kvasnice [4]. Čiření je úspěšné, když ve víně již neprobíhají intenzivní biochemické pochody, jako je alkoholové kvašení, biologické odbourávání kyselin apod. Viskózní vína, jako jsou vína

22 UTB ve Zlíně, Fakulta technologická 22 s vyšším zbytkovým obsahem sacharidů, dále pak dezertní kořeněná vína apod., jsou čiřena méně snadno než tichá vína s menším obsahem zbytkového cukru [5]. Čiřidlo musí mít opačný elektrický náboj než kaly vína a musí být ve víně řádně rozptýlené dokonalým rozmícháním. Z vyčeřeného vína je nutno odstranit kaly a přefiltrovat [4] Čiřící prostředky se záporným nábojem Mezi čiřící prostředky se záporným nábojem patří bentonit, kyselina křemičitá, tanin, agar, křemelina, kaolin a síran měďnatý [4]. Za účelem odstranění termolabilních bílkovin se používají bentonity. Jsou to zeminy, obsahující silikáty vápníku, sodíku a hliníku, které se vyznačují adsorpční schopností vůči rozpuštěným bílkovinným látkám ve víně. Bentonit se používá k tomu, aby víno bylo stabilní i při změnách teploty. Obvyklé dávky jsou v rozmezí g/hl [2]. Velmi účinné jsou granulované sodno-vápenaté bentonity pod obchodním označením NaCalit 2000 a Aktivit 2000 [4]. Kyselina křemičitá je přidávána do vína ve formě 10% koloidního roztoku. Množství přidávané kyseliny se pohybuje v rozmezí ml/hl. Chuť vína neovlivňuje. Může se používat při čiření želatinou jako náhrada za tanin. Je vhodná pro čiření červených vín s malým obsahem tříslovin [4]. Postup při čiření je opačný než při použití tatinu: nejdříve je dávána do vína želatina, potom teprve kyselina křemičitá [4]. Tanin je tříslovina se záporným povrchovým nábojem [2]. Je používána k čiření vín společně se želatinou. Je používán v množství 2-15 g/hl. Vyznačuje se schopností vysrážet bílkoviny. Nejčastěji je používána k urychlení čištění bílých vín chudých na třísloviny [4]. Agar je glycid připravený z mořských řas. Jeho částice jsou nabity záporným elektrickým nábojem. Dávky agaru se pohybují v rozmezí 5-30 g/hl [4]. Křemelina má velmi dobrou schopnost vázat na sebe bílkoviny. Může být používána i k čiření nejjemnějších vín, protože neovlivňuje ani buket, ani chuť vína. Přídavek křemeliny bývá g/hl. Vhodnější je k filtraci mladých vín než k čiření [4]. Kaolin je křemičitan hlinitý, který má rovněž schopnost vázat bílkovinu. Používá se zejména k čiření vín velké specifické hmotnosti (sladkých) nebo k přečiření přírodních vín, v nichž bílkovinné čiřidlo z jakýchkoliv příčin zůstalo viset. Je to jemný prášek s velkou

23 UTB ve Zlíně, Fakulta technologická 23 absorpční schopností. Ve víně se jemně rozptyluje. Usazování probíhá pomaleji, proto čištění trvá 4 5 týdnů. Je vhodné ho současně podpořit želatinou. Používá se dávkování g/hl vína [4]. Síran měďnatý bývá používán k odstranění zápachů vína, např. při zápachu po sirovodíku. Používá se dávka 0,2-1 g/hl. Sirovodík a jiné sirnaté sloučeniny, způsobující sirkový zápach, se chemicky váží na síran měďnatý. Vzniká sulfid měďnatý, který je nerozpustný a vysráží se. Tím je víno zbavováno zápachu po zkažených vejcích a česneku [2] Čiřící prostředky s kladným nábojem Mezi čiřící prostředky s kladným nábojem patří želatina, vyzina, kasein, vaječný bílek a polyvinylpolypyrrolidon [4]. Želatina je bílkovinný preparát, vyráběný z kostí a chrupavek. Je uváděn na trh v pevné formě nebo jako tekutina [2]. Dobře vločkuje zejména ve vínech s větším obsahem taninu. Vločky s sebou strhávají nečistoty a usazují se na dně nádob [4]. Potřeba želatiny se řídí druhem vína, dávkuje se v rozmezí 2-20 g/hl. Želatina se ve víně sráží taninem, proto je třeba vždy při jejím použití přidat do vína potřebné množství taninu, kvůli dostatečnému obsahu tříslovin, které jsou potřebné při srážení. Rozpuštěný tanin je dáván do vína před želatinou. U červených vín bývá někdy tatinu dostatek, proto není v tomto případě přídavek taninu nutný [4]. Při čiření želatinou se víno slabě odbarvuje. Želatina se používá i k odstranění menších chuťových vad vína a k urychlení sedimentace při čiření jinými čiřícími látkami [4]. Vyzina je vhodná zejména pro čiření kvalitních bílých vín. Je vyráběna z plovacích blan některých ryb, zejména vyzy a jesetera. Tato čistá bílkovina patří mezi nejjemnější čiřidla, protože vínu neodnímá žádnou z jeho cenných látek. Ve víně tvoří velmi jemnou sraženinu [4]. Toto čiření zabírá i při nižších teplotách a používalo se dříve především ke zlepšení filtrovatelnosti vína před plněním do láhví. Vyzina je na trhu v tenkých plátcích, ve formě prášku nebo pasty. Do vína se přidává v množství 1-2 g/hl. V současnosti se používají přípravky s přídavkem dalších čiřidel, které pak lépe působí [2]. Kasein je to bílkovinný přípravek, který je získáván z odstředěného mléka. Reaguje s tříslovinami, ale značně silně i s barvivy. Lze jim snížit tmavší odstín barvy bílého vína a hnědý tón červeného vína. Podle stavu vína se používá dávka 5-60 g/hl [2].

24 UTB ve Zlíně, Fakulta technologická 24 Vaječný bílek je nejstarším čiřidlem. Účinnou látkou je albumin [4]. Zjemňuje tvrdá vína a obrušuje drsné látky vína [2]. Používají se buď bílky v čerstvém stavu, nebo sušené. Hodí se k čiření jemných červených vín. Vhodnější jsou bílky z čerstvých vajec [4]. K čiření jsou používány bílky z 1-3 vajec na 1 hl vína [2]. Polyvinylpolypyrrolidon (např. Polyclar AT) účinkuje jako specifický bílkovinný přípravek. Je to práškovitá smáčivá substance, vykazující velkou adsorpční schopnost vůči tříslovinám a vysoké barvě. V závislosti na dávce jsou vína hladší, světlejší a vytáhnou se. PVPP snižuje náchylnost k oxidaci vína, a tím stabilizuje jeho barvu. Při správné dávce působí víno čerstvějším dojmem než před aplikací. Dávka pro jemnou úpravu tříslovin a barvy se pohybuje kolem g/hl, u vín s příliš tmavým odstínem barvy a stařinou až do 80 g/hl [2] Čiřící prostředky s neutrálním nábojem Mezi čiřící prostředky s neutrálním nábojem patří aktivní uhlí a vinné kvasnice [4]. Působení aktivního uhlí ve víně nebo moštu je mnohostranné. Může snižovat vysokou barvu, ale také odstraňovat nežádoucí pachuť. Uhlí je čiřidlem s velmi velkou aktivitou povrchu, 1 g aktivního uhlí vykazuje až 600 m 2 adsorpční plochy, takže tím jsou vysvětleny i značné účinky v odstraňování pachutí a barvy [2]. Bývá používáno v dávkách g/hl [4]. V ČR není maximální dávka stanovena, ale uhlí lze používat pouze pro ošetřování bílých vín a vyšší dávky nejsou v zájmu výrobce vína, protože víno značně ochuzují o chuťové látky a barvu [2]. Vinné kvasnice jsou vhodné k čiření hlavně v malovýrobě. Nejvhodnější jsou po prvním stáčení vína. Kvasnice odstraní slabší barevné nežádoucí odstíny vína, zvětralou chuť a osvěží starší vína [4]. Jsou používány čerstvé kvasnice ihned po ukončení kvašení [2]. Bývají používány v množství 5 20 l/hl vína [4] Směsné přípravky V posledních letech bývají často používány hotové směsi jednotlivých čiřidel. Velmi dobře se osvědčila v oblasti preventivního čiření moštu kombinace želatina/kasein (Mostgelatine). Bývá používána především při větší mechanické zátěži rmutu (například filtrace a přečerpávání vína) [2].

25 UTB ve Zlíně, Fakulta technologická 25 V posledních letech bývají směsné přípravky používány i k čiření vína před lahvováním. Zvláště suchá, zcela prokvašená vína mívají často po pár měsících mírně nahořklou dochuť, takže bývá prováděno čiření. Těsně před stáčením do láhví by se z důvodu nebezpečí zavlečení termolabilních bílkovin neměla želatina používat. Proto se úspěšně používají kombinované přípravky jako Sensovin nebo Gerbinol super [2]. Sensovin: Kombinovaný přípravek kasein/pvpp [2]. Gerbinol super: Kombinovaný přípravek želatina, vyzina, mléčná bílkovina [2].

26 UTB ve Zlíně, Fakulta technologická 26 3 VADY VÍNA Pokrok ve vinařství vedl k výraznému zlepšení kvality vína a umožnil zdůraznit individuální charakter vinných hroznů. Vážné vady vína, které byly v minulosti běžné, nacházíme stále méně [7]. Vady a nedostatky vína jsou nežádoucí změny způsobené technologickými, fyzikálními a chemickými zásahy. Nemoci vína jsou stavy vyvolané mikroorganismy [18]. Vinaři z celého světa nyní ví, jak vyrábět vysoce kvalitní, zdravé a čisté vína, jejichž chuť plně vyjadřuje kvalitu hroznů [7]. Už během školení vína nebo až po provedení čiření a stabilizaci se někdy ukáže, že víno nemá kvalitu, jakou by mělo mít. Nedostatky kvality, které se dají rozpoznat senzoricky, se projevují například nepříznivými změnami vzhledu, barvy, vůně a chuti. Jelikož se během přípravy vína odehrávají nebo mohou odehrávat nejrůznější chemické, fyzikální a mikrobiologické procesy, existuje stále nebezpečí, že se produkt může poškodit nebo bude zcela nepoživatelný. Tyto negativní změny se podle druhu jejich vzniku označují jako nedostatky, vady nebo nemoci [8]. 3.1 Bílkovinné zákaly I s pomocí odpovídajícího vybavení je často obtížné nebo nemožné jednoznačně posoudit, jestli původem zákalu je bílkovina. To je způsobeno především tím, že bílkovinné zákaly obvykle obsahují i třísloviny, malé množství železa, mědi a jiných látek [8]. Bílkoviny jsou vysoce molekulární sloučeniny složené z aminokyselin. Aminokyseliny projevují na základě současné přítomnosti zásaditých NH 2 - skupin, kyselé karboxylové skupiny (-COOH) a postraních řetězců tzv. amfoterní charakter, to znamená, že se chovají v závislosti na hodnotě ph jako kyseliny nebo zásady. Při určité hodnotě ph, jež se označuje jako izoelektrický bod, a která je charakteristická pro každou aminokyselinu, jsou aminokyseliny jako vnitřní soli ve formě obojetných iontů. U těchto iontů se tedy odehrává intramolekulární neutralizace (přechod protonů uvnitř molekuly a tvorba soli). Tyto neutrální molekuly mohou tedy bez problémů sedimentovat, a tak tvořit velké a viditelné agregáty [8]. Tendence vína vytvářet kal tedy není závislá jen na celkovém množství přítomných bílkovin, nýbrž i na složení vína. Každé víno, které ještě obsahuje zbytkové bílkoviny, může i při minimálním posunu ph projevovat tendence k zákalu [8].

27 UTB ve Zlíně, Fakulta technologická 27 Velmi významným parametrem ovlivňující tvorbu zákalů bývá ph vína, které dává podnět k výskytu bílkovinných zákalů. Změny ph mohou být způsobeny: mikrobiologickou činností (např. bakterie octového kvašení, dokvašení) odkyselením scelením (např. dvou vín) změnou teploty přidáním prostředků pro ošetření vína (např. čiření) [6]. Dalším možným faktorem způsobujícím zákal je přítomnost záporných iontů jako např. tříslovin [8]. Prevence použití bentonitu Tradiční metodou odstranění bílkovin je aplikace materiálů, které mají schopnost poutat bílkoviny ve víně. Vhodným materiálem je zejména už výše zmíněný bentonit, který dokáže odstranit bílkoviny z moštu nebo vína [6]. 3.2 Vady při čiření Vady při čiření mohou mít dvě příčiny: poškozený (degradovaný) prostředek, kterým je víno ošetřeno nesprávné použití prostředku [8]. Mnoho prostředků pro ošetření vína, jako např. bentonit nebo aktivní uhlí, má velmi vysokou adsorpční sílu. Jsou-li prostředky skladovány v zatuchlých místnostech vedle jiných materiálů vydávajících silné pachy, adsorbují nezadržitelně pach tohoto okolí. Pokud jsou pak tyto prostředky pro ošetření vína bez předchozí kontroly použity, dostane se nežádoucí pach do vína. Prostředky obsahující protein (např. želatina, vyzina, kaseináty) mohou někdy poléhat kažení. Tyto zkažené prostředky mohou vínu předat vadné tóny, které bývají senzoricky často klasifikovány jako zkažení nebo rozklad [8]. Nesprávně použité množství prostředku může mít za následek, že prostředek zůstane bez účinku, jelikož svoji aktivitu nemůže vínu předávat nebo mohou vznikat vadné tóny [8].

28 UTB ve Zlíně, Fakulta technologická 28 II. PRAKTICKÁ ČÁST

29 UTB ve Zlíně, Fakulta technologická 29 4 CÍL PRÁCE Cílem práce bylo: Založit experiment s modelovými vzorky vína, kde byly aplikovány dva čiřící prostředky a posoudit jejich účinnost. V modelových vzorcích před a po čiření stanovit celkový obsah aminokyselin. V modelových vzorcích před a po čiření stanovit obsah volných aminokyselin. Vyhodnotit výsledky a stanovit závěr.

30 UTB ve Zlíně, Fakulta technologická 30 5 METODIKA PRÁCE Experiment byl založen s dvěma modelovými vzorky Veltlínského zeleného. Každý modelový vzorek byl poskytnut jiným vinařstvím (Vinařství Trávník, Vinařství Jaroslav Vydařilý). U obou modelových vzorků byl proveden sběr hroznů révy vinné, hrozny byly následně pomlety přímo do pneumatických lisů, kde došlo k vylisování (oddělení moštu od tuhých částí rozemletých hroznů), a u vylisovaných moštů byla změřena cukernatost. Po změření cukernatosti byly mošty odkaleny (sedimentace kalů ke dnu nádoby, ve které byl mošt umístěn), do odkalených moštů byly přidány sušené čisté kvasinky a bylo zahájeno kvašení. Po prokvašení moštů na víno bylo víno stočeno z kalů, a byl přidán SO 2 (40-50 mg/l). Poté byly vína promíchány a byly odebrány z obou vín vzorky v množství 200 ml (vzorek č. 1 a vzorek č. 4). Po odebrání vzorku byly obě vína (modelové vzorky) rozděleny na poloviny a do jedné poloviny byl přidán čiřící prostředek Optibent (sodný bentonit) a do druhé poloviny byl aplikován čiřící prostředek Granula (vápenatý bentonit). U všech vzorků bylo provedeno důkladné promíchání čiřícího prostředku s vínem. Čiřící prostředky byly nechány působit při teplotě C až do vymizení zakalení (1-2 týdny), které se objevilo po přidání čiřícího prostředku. Následně byly odděleny vyčeřené vína od sedimentů vzniklých při čiření a z každého takto vyčeřeného vína byly odebrány vzorky o objemu 200 ml (Optibent vzorek č. 2 a vzorek č. 5, Granula vzorek č. 3 a vzorek č. 6). Po odebrání těchto dílčích vzorků byly vína dále zpracovávány vinaři dle jejich uvážení.

31 UTB ve Zlíně, Fakulta technologická 31 Obr. 3: Schéma průběhu experimentu. Po provedení experimentu a odebrání dílčích vzorků bylo cílem posoudit účinnost použitých čiřících prostředků. Účinnost prostředků byla posuzována stanovením obsahů celkových aminokyselin, volných aminokyselin a vázaných aminokyselin. Tyto obsahy byly porovnávány u jednotlivých vzorků a byla tak porovnána účinnost čiřících prostředků. Pro orientaci bylo u vzorků stanoveno také ph. Byly stanoveny celkové obsahy aminokyselin, kde celkový obsah aminokyselin je dán součtem obsahů aminokyselin zjištěných při kyselé i oxidativně-kyselé hydrolýze a dále byly stanoveny obsahy volných aminokyselin. Diferenčně byly zjištěny obsahy vázaných aminokyselin.

32 UTB ve Zlíně, Fakulta technologická Popis vzorků Ke stanovení byly vybrány dva modelové vzorky odrůdy Veltlínského zeleného. První modelový vzorek (Modelový vzorek 1) pochází z Vinařství Jaroslav Vydařilý. Byly z něho odebrány dílčí vzorky: Vzorek č. 1: před aplikací čiřidel Vzorek č. 2: po vyčeření čiřícím prostředkem Optibent Vzorek č. 3: po vyčeření čiřícím prostředkem Granula Druhý modelový vzorek (Modelový vzorek 2) pochází z Vinařství Trávník. Byly z něho odebrány dílčí vzorky: Vzorek č. 4: před aplikací čiřidel Vzorek č. 5: po vyčeření čiřícím prostředkem Optibent Vzorek č. 6: po vyčeření čiřícím prostředkem Granula Tab. 1: Tabulka s údaji k modelovým vzorkům o průběhu experimentu. Modelový vzorek 1 Modelový vzorek 2 Doba sklizně Oblast Morava Morava Podoblast Slovácká Slovácká Obec Mutěnice Hovorany Trať Vyšicko Díly za vinohrady Cukernatost 21,5 NM 23 NM Množství moštu 400 l 600 l Použité kvasinky VITILEVURE 58W3 AR2 (BioPro) Zahájení kvašení Množství SO 2 před kvašením 50 mg/l 50 mg/l Konec kvašení Přídavek SO 2 po kvašení 50 mg/l 40 mg/l Stáčení z kalů po kvašení Odběr vzorku (č.1/č.4) Přídavek čiřidla Optibent Množství vína s čiřidlem Optibent 200 l 300l Množství přidaného čiřidla Optibent 100 g/hl 100 g/hl Konec čiření (Optibent) Odběr vzorku (č.2/č.5) Přídavek čiřidla Granula Množství vína s čiřidlem Granula 200 l 300l Množství přidaného čiřidla Granula 80 g/hl 80 g/hl Konec čiření (Granula) Odběr vzorku (č.3/č.6) Pozn.: VITILEVURE 58W3 druh kvasinek, AR2 druh kvasinek.

33 UTB ve Zlíně, Fakulta technologická Popis čiřících prostředků K čiření byly použity dva čiřící prostředky, a to bentonity Optibent a Granula. Optibent je získáván speciálním procesem, má vysokou aktivitu a tvoří velmi nízké množství kalu. Patří mezi sodné bentonity. Je používán na všech stupních výroby vína, od moštu až po stabilizaci před lahvováním. Doporučená dávka g/hl [19]. Granula je aktivní vápenatý bentonit, velmi dobře adsorbuje bílkoviny a tvoří běžné množství kalu. Může být používán na všech stupních výroby vína, od moštu až po lahvování. Doporučené dávkování g/hl [19]. Bentonity se před použitím ponechávají nabobtnat ve studené vodě. Po 2 hodinách by mělo dojít k zamíchání nabobtnaných bentonitů a k vlití do vína. Bentonity je třeba nechat působit 3 až 10 dnů (závislost na bentonitu, teplotě, apod.) [19]. 5.3 Stanovení obsahu celkových aminokyselin Kyselá hydrolýza Vzorky byly postupně pipetovány do vialek v množství 7 ml. Každý takto připravený vzorek byl zvážen na analytických vahách. Ke vzorkům bylo přidáno po 8 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové. Připravené směsi vzorků a kyseliny chlorovodíkové byly probublávány 30 sekund argonem. Následně byly vialky uzavřeny a ponechány hydrolyzovat. Kyselá hydrolýza probíhá v termobloku při teplotě 115 C 23 hodin. Po hydrolýze byly vialky vytáhnuty z termobloku, byly umístěny do lednice a nechány do druhého dne vychladnout. Dále byly postupně převedeny všechny vzorky kvantitativně pomocí 0,1 mol/l kyseliny chlorovodíkové přes filtrační papír do odpařovací baňky a odpařeny na rotační vakuové odparce (při maximální teplotě 50 C) do sirupové konzistence. Odparek byl následně zředěn s několika mililitry redestilované vody a znovu odpařen. Tento krok byl zopakován třikrát. Nakonec byl odparek kvantitativně převeden pufrem o ph 2,2 do 25 ml odměrné baňky. Z odměrné baňky byly vzorky filtrovány do mikrozkumavek přes 0,45 µm filtr a umístěny na stanovení do Automatického analyzátoru aminokyselin AAA 400 (Ignos, Praha, Česká republika) [20]. Tento přístroj pracuje na principu středotlaké kapalinové chromatografie s ionexovou kolonou, ninhydrinovou derivatizací a spektrofotometrickou detekcí [21]. Kyselou hydrolýzou byly stanoveny obsahy aminokyselin (kyselina asparagová,

34 UTB ve Zlíně, Fakulta technologická 34 kyselina glutamová, threonin, serin, prolin, glycin, alanin, valin, isoleucin, leucin, tyrosin, fenylalanin, histidin, lysin, arginin, cystein, methionin). Oxidativně-kyselá hydrolýza Oxidativně-kyselou hydrolýzou byly stanoveny sirné aminokyseliny (cystein, methionin). Sirné aminokyseliny byly před kyselou hydrolýzou oxidovány oxidační směsí peroxidu vodíku a kyseliny mravenčí, jinak by docházelo při kyselé hydrolýze k rozkladu těchto sirných aminokyselin. Pro tuto metodu byla nejprve připravena oxidační směs: 30% peroxid vodíku a 85% kyselina mravenčí v poměru 1:9. Takto připravená směs byla ponechána stát 2 hodiny v digestoři při laboratorní teplotě a následně 15 minut v chladničce. Do baněk bylo napipetováno po 5 ml vzorku a každá baňka se vzorkem byla zvážena na analytických vahách. K těmto 5 ml vzorku bylo do baňky přidáno 15 ml oxidační směsi peroxidu vodíku a kyseliny mravenčí. Takto připravené vzorky byly umístěny na asi 16 hodin do chladničky. K takto oxidovaným vzorkům z chladničky bylo přidáno 50 ml 6 mol/l kyseliny chlorovodíkové. Baňky byly postupně umisťovány do olejové lázně a byly nechány hydrolyzovat. Oxidativní hydrolýza probíhá při teplotě 118 C 23 hodin. Po hydrolýze byly baňky sundány z lázně a byly ponechány vychladnout i spolu s chladičem. Po vychladnutí byl chladič propláchnut 0,1 mol/l kyselinou chlorovodíkovou a obsahy baněk byly kvantitativně převedeny 0,1 mol/l kyselinou chlorovodíkovou přes filtrační papír do 250 ml odměrných baněk. Odměrné baňky byly vytemperovány na teplotu 20 C a poté byly doplněny 0,1 mol/l kyselinou chlorovodíkovou. Takto doplněné odměrné baňky byly asi 15 hodin ponechány odležet v chladničce. Po odležení bylo z odměrných baněk odebráno 25 ml, které byly dány do odpařovacích baněk a byly odpařovány na rotační vakuové odparce (maximálně do 50 C) do sirupovité konzistence. Odparky byly poté zředěny s několika mililitry redestilované vody a znovu byly odpařovány do sirupovité konzistence. Tento krok byl opakován dvakrát. Odparky byly kvantitativně převedeny pufrem ph 2,2 do 25 ml odměrných baněk. Takto připravené vzorky byly filtrovány do mikrozkumavek přes 0,45 µm filtr a umístěny do Automatického analyzátoru aminokyselin AAA 400 (Ignos, Praha, Česká republika) [20]. Stanovení obsahu volných aminokyselin (FAA) Stanovení volných aminokyselin bylo zaměřeno na přítomnost volných aminokyselin a jejich derivátů (kyselina asparagová, asparagin, kyselina glutamová, glutamin, threonin,

35 UTB ve Zlíně, Fakulta technologická 35 serin, prolin, glycin, alanin, valin, isoleucin, leucin, tyrosin, fenylalanin, histidin, lysin, arginin, cystein, methionin). Ke stanovení volných aminokyselin bylo do ependorfek napipetováno 750 µl vzorku a 750 µl lithno-citrátového pufru. V dalším kroku byl vzorek centrifugován na odstředivce, kde byly odděleny nečistoty, usazeniny a extrakt. Takto připravené vzorky byly filtrovány do mikrozkumavek přes 0,45 µm filtr a umístěny do Automatického analyzátoru aminokyselin AAA 400 (Ignos, Praha, Česká republika) [22]. 5.4 Stanovení ph U vzorků bylo také stanovováno ph. Bylo měřeno ph-metrem, který byl opakovaně (každý vzorek byl měřen dvakrát, hodnoty byly následně zprůměrovány) nořen do vzorků a bylo vždy vyčkáno do ustálení hodnoty.

36 UTB ve Zlíně, Fakulta technologická 36 6 VÝSLEDKY A DISKUZE 6.1 Stanovení aminokyselin Ve vzorcích byly stanoveny obsahy jednotlivých aminokyselin, a to obsahy celkových aminokyselin a volných aminokyselin. Diferenčně byly zjištěny obsahy vázaných aminokyselin. Posuzováno bylo 17 stanovených aminokyselin, a to jak samostatně tak i v celkovém součtu. V tabulce číslo 10 (Tab. 10) jsou uvedeny součty obsahů aminokyselin u jednotlivých vzorků. Byly sčítány obsahy aminokyselin u celkových aminokyselin, volných aminokyselin a vázaných aminokyselin. Na obrázcích 4-6 jsou zpracovány grafy, na kterých jsou srovnávány součty aminokyselin u jednotlivých vzorků. Celkový obsah aminokyselin [g/kg] 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 Vzorek č.1 Vzorek č.2 Vzorek č.3 Vzorek č.4 Vzorek č.5 Vzorek č.6 Jednotlivé vzorky vína Obr. 4: Graf s celkovými obsahy aminokyselin v jednotlivých vzorcích vína. Pozn.: Vzorek č. 1 před aplikací čiřícího prostředku (Vinařství Jaroslav Vydařilý), vzorek č. 2 po vyčeření čiřícím prostředkem Optibent (Vinařství Jaroslav Vydařilý), vzorek č. 3 po vyčeření čiřícím prostředkem Granula (Vinařství Jaroslav Vydařilý), vzorek č. 4 před aplikací čiřícího prostředku (Vinařství Trávník), vzorek č. 5 po vyčeření čiřícím prostředkem Optibent (Vinařství Trávník), vzorek č. 6 po vyčeření čiřícím prostředkem Granula (Vinařství Trávník). Na obrázku 4 (Obr. 4) jsou v grafu znázorněny součty celkových aminokyselin v jednotlivých vzorcích. Z grafu můžeme posoudit rozdílný obsah celkových aminokyselin u vzorku

37 UTB ve Zlíně, Fakulta technologická 37 č. 1 a u vzorku č. 4, což jsou vzorky odebrané před aplikací čiřících prostředků. U vzorku č. 4, který pochází z Vinařství Trávník je značně větší obsah celkových aminokyselin (3,1 g/kg) než u vzorku č. 1 (1,3 g/kg), který pochází z Vinařství Jaroslav Vydařilý. Rozdíl v obsahu celkových aminokyselin může být ovlivněn vnějšími faktory (přidané kvasinky, doba kvašení, teplota kvašení, apod.). Z obsahů celkových aminokyselin před aplikací čiřícího prostředku tedy vyplívá, že budou rozdílné obsahy celkových aminokyselin i v porovnání vzorku č. 2 s vzorkem č. 5, a také v porovnání vzorku č. 3 a vzorku č. 6. Je-li sledována rozdílná účinnost čiřících prostředků u vzorku č. 2 a vzorku č. 3, kde byl použit stejný výchozí vzorek (vzorek č. 1) před přidáním čiřících prostředků, zjistíme, že méně celkových aminokyselin obsahuje vzorek č. 2 (0,8 g/kg), kde byl použit čiřící prostředek Optibent. Vzorek č. 3 obsahoval o něco více celkových aminokyselin (0,9 g/kg), zde byl použit čiřící prostředek Granula. Z výsledků tedy vyplývá, že účinnějším prostředkem je Optibent, protože odstranil větší množství aminokyselin. Rozdíl celkových aminokyselin u vzorku č. 2 a vzorku č. 3 činil 0,1 g/kg. Při porovnání účinků čířících prostředků u vzorku č. 4 a vzorku č. 5, které pochází z výchozího vzorku č. 4, bylo zjištěno, že více celkových aminokyselin obsahuje vzorek, u kterého byl použit čiřící prostředek Granula, tedy u vzorku č. 6 (2,4 g/kg). Vzorek č. 5, u kterého byl použit čiřící prostředek Optibent, obsahoval méně celkových aminokyselin (2,2 g/kg), a je tedy více účinným prostředkem. U těchto dvou vzorků je rozdíl obsahů celkových aminokyselin větší a činí 0,2 g/kg. 700,0 Obsah volných aminokyselin [mg/kg] 600,0 500,0 400,0 300,0 200,0 100,0 0,0 Vzorek č.1 Vzorek č.2 Vzorek č.3 Vzorek č.4 Vzorek č.5 Vzorek č.6 Jednotlivé vzorky vína Obr. 5: Graf s obsahy volných aminokyselin v jednotlivých vzorcích vína.

38 UTB ve Zlíně, Fakulta technologická 38 Pozn.: Vzorek č. 1 před aplikací čiřícího prostředku (Vinařství Jaroslav Vydařilý), vzorek č. 2 po vyčeření čiřícím prostředkem Optibent (Vinařství Jaroslav Vydařilý), vzorek č. 3 po vyčeření čiřícím prostředkem Granula (Vinařství Jaroslav Vydařilý), vzorek č. 4 před aplikací čiřícího prostředku (Vinařství Trávník), vzorek č. 5 po vyčeření čiřícím prostředkem Optibent (Vinařství Trávník), vzorek č. 6 po vyčeření čiřícím prostředkem Granula (Vinařství Trávník). Na obrázku 5 (Obr. 5) jsou v grafu znázorněny součty obsahů volných aminokyselin u jednotlivých vzorků. Stejně tak jako tomu bylo u obsahu celkových aminokyselin ve vzorcích před aplikací čířícího prostředku (vzorek č. 1, vzorek č. 4), i v tomto případě je obsah volných aminokyselin značně vyšší u vzorku č. 4 (Vinařství Trávník) než u vzorku č. 1 (Vinařství Jaroslav Vydařilý). U vzorku č. 1 je množství volných aminokyselin 313,8 mg/kg. U vzorku č. 4 je množství volných aminokyselin téměř dvojnásobné, a to 618,7 mg/kg. Při porovnání čiřících prostředků u vzorku č. 2 (Optibent) a vzorku č. 3 (Granula), bylo zjištěno, že vzorek č. 2 obsahuje větší množství volných aminokyselin (328,2 mg/kg) než vzorek č. 3 (314,4 mg/kg), z čehož vyplývá, že lepší čiřící účinek by měl mít prostředek Granula. Rozdíl obsahů volných aminokyselin u těchto vzorků je malý a činí 13,8 mg/kg. Ale při porovnání obsahů volných aminokyselin u vzorků č. 1 3, došlo zřejmě k chybě při stanovení, protože obsahy volných aminokyselin u vzorku č. 2 a 3 (po čiření) převyšují obsah volných aminokyselin u vzorku č. 1 (před přídavkem čiřícího prostředku). Obsahy volných aminokyselin vzorku č. 2 a 3 by měly být nižší než obsah volných aminokyselin vzorku č. 1. Při porovnání účinnosti čiřících prostředků u vzorku č. 5 (Optibent) a vzorku č. 6 (Granula) bylo zjištěno, že vzorek č. 6 obsahuje více volných aminokyselin (573,8 mg/kg) než vzorek č. 5 (498,9 mg/kg), z čehož vyplývá, že lepší čiřící účinek má čiřidlo Optibent. Rozdíl obsahů u těchto vzorků je patrnější a činí 74,9 mg/kg.