Metodika detekce čtyř významných virů révy vinné pomocí molekulární hybridizace METODIKA PRO ÚTVARY STÁTNÍ SPRÁVY

Transkript

1 ing. Petr Komínek, Ph.D. ing. Marcela Komínková Metodika detekce čtyř významných virů révy vinné pomocí molekulární hybridizace METODIKA PRO ÚTVARY STÁTNÍ SPRÁVY Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. 2008

2 Metodika pro útvary státní správy Metodiku schválilo Ministerstvo zemědělství ČR a doporučilo její využití v zemědělské praxi, dne , č.j / Autoři: ing. Petr Komínek, Ph.D. ing. Marcela Komínková Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. Drnovská Praha 6 - Ruzyně Název: Metodika detekce čtyř významných virů révy vinné pomocí molekulární hybridizace. I. Cíl metodiky Cílem metodiky je stanovit v rostlinách révy vinné pomocí molekulární hybridizace přítomnost čtyř významných virů napadajících tuto plodinu. II. Vlastní popis metodiky Obsah: strana číslo Úvod 2 1. Vybavení a chemikálie 2 2. Odběr a příprava vzorků 3 3. Nanesení testovaných vzorků na membránu (RNA nebo otisk pletiva) 4 4. Vlastní hybridizace: Inkubace membrány se sondou značenou digoxigeninem Promývání membrány pro odstranění nenavázané sondy Detekce navázané sondy protilátkami značenými alkalickou fosfatázou Chemiluminiscence 6 Příloha 1: Naklonování úseků genomů virů 8 Příloha 2: Příprava sondy 17 Seznam obrázků v metodice hybridizace 20 Dedikace: Metodika vznikla za podpory MZe ČR v rámci řešení projektu NAZV QG50083 Jména oponentů: Ing. Karel Říha, Ústřední kontrolní a zkušební ústav zemědělský Brno Ing. Miloslav Zouhar, Ph.D., Česká zemědělská univerzita Praha ISBN:

3 Úvod: Metodika popisuje postup detekce čtyř významných virů napadajících révu vinnou pomocí molekulární hybridizace. Jde o tyto viry: Virus svinutky révy vinné 1 - Grapevine leafroll-associated virus 1 - GLRaV-1 A virus révy vinné - Grapevine virus A - GVA B virus révy vinné - Grapevine virus B - GVB Virus skvrnitosti révy vinné - Grapevine fleck virus - GFkV Detekce pomocí molekulární hybridizace je realizována pomocí neradioaktivně značené RNA sondy. RNA sonda je úsek RNA, který je komplementární k virové RNA, pro pozitivní RNA viry tedy musí být sonda s negativní orientací. Sondy popsané v této metodice může poskytnout Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. Zájemci, kteří by si chtěli sondy připravit sami, naleznou podrobný popis přípravy RNA sond od získání částí genomu virů až po přípravu sond v přílohách této metodiky. 1. Vybavení a chemikálie Přístrojové zabezpečení Transiluminátor (např. ECX 26MX, dodává Schoeller Pharma Praha) Termocykler (např. PTC200 od MJ Research) Mrazicí box -80 o C Inkubátor (např. Memmert INB200 od Fischer Scientific) Hybridizační pícka (hybridizační inkubátor, např. Binder BFD 53 od Fischer Scientific) Dokumentační systém schopný snímat chemiluminiscenci (např. ChemiGeniusQ od SynGene) Chladnička (+4 o C) Autokláv Vortex (mikrotřepačka) Chlazená centrifuga na mikrozkumavky Eppendorf ( g; 1,5 /2,0 ml) Sada mikropipet (0,1-2 µl, 0,5 10 µl, 2 20 µl, µl, µl) ph-metr Laboratorní váhy Výrobník ledové tříště Materiál 1,5 ml a 2 ml mikrozkumavky Eppendorf Centrifugační kyvety (odolné při vysokých otáčkách) Filtrační papír, papírové ručníky Laboratorní sklo (kádinky, odměrné válce, láhve reagenční s uzávěrem autoklávovatelné) PCR zkumavky (velikost a typ podle použitého přístroje) Permanentní popisovač na sklo a na plast Skalpel s výměnnými čepelkami nebo sterilizovatelný nůž nebo sterilizovatelné nůžky Špičky pro mikropipety + boxy (sterilizovatelné) Špičky s filtrem pro mikropipety ve sterilních boxech Třecí misky a tloučky (cca 10 cm) Váženky Vyšetřovací rukavice 2

4 Chemikálie a kity sterilní redestilovaná voda, nebo komerčně dodávaná voda pro PCR RNeasy Plant Mini Kit (50), katalog Qiagen DIG Northern Starter Kit, katalog Roche DIG-Easy Hyb Granules, katalog Roche DIG Wash and Block Buffer Set, katalog Roche Hybridization Bags, katalog Roche Nylon membrane, positively charged, katalog Roche ApaI, katalog Promega R6361 NsiI, katalog Promega R6531 MinElute PCR Purification Kit (50), katalog Qiagen Příprava roztoků SSC 20x 500 ml (3M NaCl a 300mM sodium citrate) 87,66 g NaCl 44,125 g sodium citrate rozpustit v 400 ml redestilované vody doplnit vodou do 500 ml autoklávovat 2. Odběr a příprava vzorků Odběr vzorků pro testování přítomnosti virů révy vinné pomocí molekulární hybridizace provádíme v zimním období, kdy odebíráme dormantní jednoleté réví. Z jedné rostliny odebíráme tři výhony z různých částí rostliny, z každého výhonu pak odebereme dvě internodia ze spodní části výhonu, kde je vyšší pravděpodobnost přítomnosti testovaných virů ve vyšší koncentraci oproti internodiím z vrchní části výhonu. Z réví sloupneme svrchní vrstvu suché kůry, čímž obnažíme lýkovou část. Z ní naškrábeme ostrým nožem požadované množství vzorku. Ten okamžitě zalijeme extrakčním pufrem a pokračujeme postupem izolace RNA. Pro izolaci RNA doporučujeme kit RNeasy Plant Mini Kit od Qiagenu. Pokud má diagnostická laboratoř dobré zkušenosti s jiným kitem pro izolaci RNA, lze jej samozřejmě použít. Nutnosti izolace RNA se lze vyhnout použitím otisků pletiv testovaných rostlin (tissue printing), čímž dojde k zlevnění celého postupu. Tento postup lze nejsnáze aplikovat na konci vegetace, kdy použijeme řapíky listů jako otiskované pletivo. Při této metodě je však zvýšené riziko nespecifických reakcí rostlinných extraktů se sondami, čímž může docházet k falešným pozitivním reakcím. Postup hybridizace se mírně liší oproti postupu s RNA (teploty hybridizace a přísného mytí), změny jsou popsány v kapitole 4. Tuto metodu, tj. otisk pletiv, proto můžeme doporučit pouze jako předběžnou, za směrodatnou metodu pokládáme pouze použití izolované RNA. Při detekci pomocí molekulární hybridizace je nutno používat pozitivní a negativní kontrola, nejlépe z rostlin révy vinné. Pozitivní kontrola Jako pozitivní kontrolu používáme rostliny révy vinné infikované testovanými viry. Postup přípravy vzorků je stejný jako je uvedeno výše u testovaných rostlin. Kromě rostliny infikované virem můžeme jako druhou kontrolu použít plazmid nesoucí gen, z nějž byla syntetizována sonda. Poskytuje velmi rychlý a silný signál a je to spolehlivý ukazatel správnosti provedení celého detečního postupu. 3

5 Negativní kontrola Jako negativní kontrolu používáme rostliny révy vinné prosté testovaných virů. Postup přípravy vzorků je stejný jako u testovaných rostlin. 3. Nanesení testovaných vzorků na membránu (RNA nebo otisk pletiva) Při použití RNA: Na membránu si vyznačíme tužkou síťku pro náš počet vzorků. Viz obrázek 1. Pracujeme v rukavicích. Nanášíme RNA jednotlivých vzorků, po 2 µl. Jako kontrolu můžeme použít například plazmid nesoucí odpovídající část genomu viru (ten, z něhož byla připravena sonda), ten nanášíme v množství 0,5 µl. Položíme membránu na 5 minut na zapnutý transiluminátor. Obrázek 1: Membrána s vyznačenou síťkou pro nanášení vzorků Při použití otisků pletiv: Na membránu si vyznačíme tužkou síťku pro náš počet vzorků stejně jako v předchozím bodě. Řapíky testovaných listů seřízneme podélně šikmo (viz obrázek 2) a ihned otiskneme na vyznačené místo na membráně. Výsledné otisky na membráně viz obrázek č. 3. Obrázek 2: Šikmo seříznuté řapíky listů révy vinné připravené k otištění na membránu 4

6 Obrázek 3: Otisky řapíků na membráně, pole B1 a B2 Na konec membránu opět položíme na 5 minut na zapnutý transiluminátor. 4. Vlastní hybridizace 4.1. Inkubace membrány se sondou značenou digoxigeninem - do lahvičky s granulemi Dig Easy Hyb přidáme 64 ml sterilní vody a rozmícháme při 37 C. - na jednu membránu použijeme 15 ml Dig Easy Hyb. Ty zahřejeme na 68 C. - pro hybridizaci a všechny následné operace můžeme použít hybridizační sáčky (Hybridization Bags) od Roche, viz obrázek č. 4. Obrázek 4: Membrána v hybridizačním sáčku - předhybridizujeme si membránu - vložíme ji do předehřátého roztoku DIG Easy Hyb a 30 minut necháme jemně třepat v uzavřené sterilní nádobě nebo v hybridizačním sáčku v hybridizační pícce (viz obrázek č. 5) při 68 C. - připravíme si 1 µg sondy, tj. cca 1 µl, dle skutečné koncentrace. Toto množství výchozího roztoku se sondou dáme do 10 µl vody. - denaturujume si RNA sondu povařením 10 minut a rychlým zchlazením na ledu. - připravíme si 15 ml Dig Easy Hyb roztoku, zahřejeme na 50 C. Přidáme sondu, tedy všech 11 µl. Dobře promícháme, dbáme, aby se netvořily bubliny. 5

7 - vylijeme předhybridizační roztok z membrány, nalijeme roztok se sondou (15 ml). - inkubujeme přes noc při 50 C (hodnota pro RNA) za jemného třepání. Pro membránu s otisky pletiv je nutno nastavit teplotu hybridizace 60 C. Obrázek 5: Sáček s membránou v hybridizační pícce 4.2. Promývání membrány pro odstranění nenavázané sondy - promýváme 2x5 minut v 2xSSC obsahujícím 0,1% SDS (40 ml = 4 ml 20x SSC a 0,4 ml 10% SDS) při C za stálého třepání. - promýváme 2x15 minut v 0,1xSSC s 0,1% SDS (předehřátého na 68 C) (40 ml = 0,2 ml 20x SSC a 0,4 ml 10% SDS) při 50 C za stálého třepání - hodnoty pro RNA. U membrány s otisky pletiv provádíme toto přísné mytí při 55 C. - krátce promyjeme (1-5 minut) ve Washing buffer 1x (je 10x, ředíme vodou na pracovní koncentraci) Detekce navázané sondy protilátkami značenými alkalickou fosfatázou - inkubujeme 30 minut ve 100 ml Blocking solution 1x (je 10x, ředíme v Maleic Acid Buffer, ten je také 10x, ředíme vodou). - inkubujeme 30 minut v 20 ml Antibody Solution (Anti-DIG AP je zkumavka 5 v DIG Northern Starter Kitu, ředíme v Blocking solution, připraveném viz výše, 1µl na 10 ml). - promyjeme 2x15 minut ve 100 ml Washing buffer 1x Chemiluminiscence Po aplikaci substrátu pro alkalickou fosfatázu dochází v místech s navázaným enzymem k emisi viditelného světla - membránu nastavíme 2-5 minut ve 100 ml Detection Buffer. - použijeme CDP Star z DIG Northern Starter Kitu. Po ekvilibraci v Detection Buffer nakapeme na membránu kapátkem láhve 7 CDP Star v dávce cca 1 kapka na 4 cm 2 membrány nebo cca 1 ml na membránu velikosti 10x10 cm. - okamžitě rozetřeme tak, aby nevznikly bubliny, necháme inkubovat 5 minut, pak odlijeme 6

8 přebytečnou kapalinu - zalepíme sáček a exponujeme v dokumentačním systému (např. ChemiGeniusQ od SynGene). Délka snímání je od 5 minut do několika hodin. Dokumentační systém má chlazenou CCD kameru a je proto vhodný pro takto dlouhé expozice. - membrána nesmí během expozice vyschnout. Chemiluminiscence probíhá ještě dalších 24 hodin, takže není problém nasnímat další záběry. Po skončení expozice získáme snímek membrány, viz obrázek číslo 6. Vyhodnotíme membránu na přítomnost nebo nepřítomnost testovaného viru ve vzorcích. Obrázek 6: Negativ snímku chemiluminiscence na membráně, expozice systémem ChemiGeniusQ po dobu 2 hodiny 23 minut. Sonda GVA F10 zachycuje přítomnost A viru révy vinné - Grapevine virus A - GVA. Sloupce A a B jsou otisky řapíků testovaných rostlin, sloupec C vodné extrakty z těchže řapíků dávkované v objemu 10 µl. Čísla po stranách indikují jednotlivé vzorky rostlin révy vinné, TA a TB jsou kontroly z rostliny révy vinné odrůdy Tramín červený infikované GVA. F10 je plazmid nanesený v objemu 0,5 µl. Pokud potřebujeme tytéž vzorky analyzovat na přítomnost více virů s více sondami, lze po skončení expozice - snímání chemiluminiscence - membránu s navázanými vzorky použít znovu, musíme ale odstranit již navázanou sondu. Membrána nesmí během žádné z těchto operací vyschnout! Membránu nejprve krátce omyjeme ve sterilní dvakrát destilované vodě. Poté promyjeme 2x v roztoku 0,2 N NaOH s 0,1% SDS při 37 stupních. (do 30 ml dáme 0,24 g NaOH a 300 mikrolitrů zásobního roztoku SDS, který je 10%). Po promytí nastavíme membránu krátce v 2x SSC. Prehybridizujeme a hybridizujeme s druhou sondou. 7

9 Příloha 1: Naklonování úseků genomů virů P1.1. Vybavení a chemikálie P1.2.Získání rostlin infikovaných jednotlivými virysa P1.3. Výběr úseku genomu viru a jeho amplifikace z napadené rostliny pomocí RT-PCR P1.4. Naklonování amplifikovaného úseku genomu viru do plazmidu P1.1. Vybavení a chemikálie Přístrojové zabezpečení Termocykler (např. PTC200 od MJ Research) 50 ml kyvety Corning, katalog Sigma C 8296, balení 500 Mrazicí box -80 o C Inkubátor (např. Memmert INB200 od Fischer Scientific) Dokumentační systém (např. ChemiGeniusQ od SynGene) Chladnička (+4 o C) Autokláv Vortex (mikrotřepačka) Chlazená centrifuga na mikrozkumavky Eppendorf ( g; 1,5 /2,0 ml) Sada mikropipet (0,1-2 µl, 0,5 10 µl, 2 20 µl, µl, µl) silně doporučujeme používat několik oddělených sad pipet: jedna sada pro izolaci RNA, druhá sada pro pipetování reakčních směsí, třetí pro pipetování vzorků a čtvrtá pro pipetování PCR produktů ph-metr Laboratorní váhy Horizontální elektroforéza + zdroj Mikrovlnná trouba Výrobník ledové tříště Materiál 1,5 ml a 2 ml mikrozkumavky Eppendorf Centrifugační kyvety (odolné při vysokých otáčkách) Filtrační papír, papírové ručníky Laboratorní sklo (kádinky, odměrné válce, láhve reagenční s uzávěrem autoklávovatelné) PCR zkumavky (velikost a typ podle použitého přístroje) Permanentní popisovač na sklo a na plast Skalpel s výměnnými čepelkami nebo sterilizovatelný nůž nebo sterilizovatelné nůžky Špičky pro mikropipety + boxy (sterilizovatelné) Špičky s filtrem pro mikropipety ve sterilních boxech Třecí misky a tloučky (cca 10 cm) Váženky Vyšetřovací rukavice Primery Nutno si nechat nasyntetizovat primery (na zakázku, např. Sigma nebo Generi Biotech) LR1: 5 CAGGCGTCGTTTGTACTGTG 3 LR2: 5 TCGGACAGCGTTTAAGTTCC 3 GVA2F 5 CTGATCTGCAGTTTGTGGA 3 GVA2R 5 CACCACACTTACACACATTCAT 3 GvbA 5 GTGCTAAGAACGTCTTCACAGC 3 GvbS 5 AGTAGCCCTTCGTTTAGCCGC 3 8

10 Flek1 5 CYCARCAYAARGTVAACGA 3 Flek2 5 CATGCANGTSAGRGGRCCRAA 3 M13fwd 5 GTAAAACGACGGCCAG 3 M13 rev 5 CAGGAAACAGCTATGAC 3 Chemikálie a kity sterilní redestilovaná voda, nebo komerčně dodávaná voda pro PCR RNeasy Plant Mini Kit (50), katalog Qiagen OneStep RT-PCR Kit (100), katalog Qiagen GoTaq DNA Polymerase, 100U, katalog Promega M3171 PCR Nucleotide Mix, 200µl, katalog Promega C1141 SeaKem LE Agarose 1 kg, katalog Lonza 50005, dodavatel East Port Praha Tris Base, katalog Promega H5131 Acetic acid, 1l, katalog Sigma L-F Ethidium bromide 1g, katalog Sigma E8751, pozor - vysoce toxický, možné nebezpečí nevratných účinků GeneRuler 100 bp Plus, katalog Fermentas SM0323 EDTA, 100g, katalog Sigma E g Ficoll PM 400, 10g, katalog Sigma F4375 Bromophenol Blue sodium salt, 5g, katalog Sigma B8026-5G Xylene Cyanol, 10g, katalog Sigma X G Orange G, 25g, katalog Sigma G MinElute Gel Extraction Kit (50), katalog Qiagen pgem -T Easy Vector System II, 20 reactions, katalog Promega A1380 QIAprep Spin Miniprep Kit (50), katalog Qiagen IPTG, 5g, katalog Promega V3951 X-gal, 100 mg, katalog Promega V3941 SOC medium, 10x5ml, katalog Sigma S X5ML FLB (Ficoll Loading Buffer) 10x, 15 ml Ficoll g 0,5M EDTA (ph 8,0) 1,25 ml Bromophenol Blue 10 mg Xylene Cyanol 10 mg Orange G 20 mg doplnit vodou do 15 ml Agarózový gel 1%: na 100 ml gelu 1 g agarózy a 100 ml pufru 1x TAE 1,5%: na 100 ml gelu 1,5 g agarózy a 100 ml pufru 1x TAE 2%: na 100 ml gelu 2 g agarózy a 100 ml pufru 1x TAE Agarózu rozehřejeme v pufru v mikrovlnné troubě nebo na elektrickém míchadle a ještě horkou nalijeme do vaničky. Necháme ztuhnout. 50xTAE - zásobní roztok na 1 litr pufru 1xTAE: 242 g Tris baze 57,1 ml kyseliny octové 100 ml 0,5M EDTA (ph = 8,0) doplnit redestilovanou vodou do 1 l. 9

11 1 x TAE - pracovní roztok: 20 ml 50xTAE doplnit redestilovanou vodou do 1 l. 0,5 M EDTA 200 ml 37,22 g EDTA prášek doplnit vodou do 200 ml upravit ph pomocí NaOH na hodnotu 8,0 LB médium: 1% trypton, 0,5 yeast extract, 1% NaCl, ph 7,0 Na 1 litr: rozpustit 10 g tryptonu, 5 g yeast extract, 10 g NaCl v 950 ml deionizované vody. Upravit ph na 7,0 pomocí NaOH a doplnit objem do 1 litru. Autoklávovat 20 minut při 15 psi. Nechat roztok zchladnout na 55 o C a přidat ampicilin (100 mg/l). Skladovat při +4 o C. Selektivní misky - LB agar + ampicilin, 0.5mM IPTG, X-gal (80µg/ml) Na 100 ml: rozpustit 1 g tryptonu, 0,5 g yeast extract, 1 g NaCl a 1,5 g agaru v 95 ml deionizované vody. Upravit ph na 7,0 pomocí NaOH a doplnit objem do 100 ml. Autoklávovat 20 minut při 15 psi. Nechat roztok zchladnout na 55 o C. Přidat ampicilin (10 mg), IPTG (0,0119 g) a X-gal (0,16 ml). Rozlít na 10 cm misky. Nechat ztuhnout, po zchladnutí přelepit parafilmem, otočit a skladovat v temnotě při +4 o C. Ethidium bromid zásobní roztok: 2,5 mg/1 ml vody dávkování 2 µl na 50 ml agarózového gelu Ethidium bromid je látka, která se váže na šroubovici nukleových kyselin, kde pak pod UVlampou (312 nm) intenzívně růžově fluoreskuje. Ethidium bromid je mutagen, proto se veškerá manipulace provádí v rukavicích. Pro snížení rizika kontaminace laboratoře je možné ethidium bromid do gelu nepřidávat a gel po elektroforéze barvit v roztoku ethidium bromidu a odbarvovat ho v destilované vodě nebo v 1x TAE pufru. Veškerou manipulaci s ethidium bromidem lze přesunout do zvláštní místnosti s dokumentačním zařízením. Agarózové gely, vyšetřovací rukavice a plasty kontaminované ethidium bromidem se skladují odděleně v silných PE pytlích. Likvidaci provádějí speciální firmy zabezpečující likvidaci nebezpečného odpadu. Roztoky a pufry se dekontaminují přímo v laboratoři pomocí specifických adsorpčních kolon, jejichž likvidaci opět zajišťují speciální firmy na likvidaci nebezpečného odpadu. P1.2. Získání rostlin infikovaných jednotlivými viry, případně získání sbírkových kmenů virů Pro získání úseků genomů testovaných virů je nejprve nutno nalézt rostliny révy vinné infikované dotyčnými viry. Pro předběžné otestování zdravotního stavu rostlin révy vinné se používá imunoenzymatický test ELISA, s případnými modifikacemi dle návodů výrobce. Hlavními dodavateli jsou firmy Bioreba (Švýcarsko), Loewe (Německo), případně Agritest (Itálie). Odběr vzorků: Z virů testovaných touto metodikou jsou tři viry velmi běžné - GLRaV-1, GVA a GFkV. Pro jejich nalezení stačí namátkou odebrat vzorky z cca 20 rostlin révy vinné z běžného vinohradu kdekoliv v ČR. 10

12 GVB je naproti tomu v ČR dosti vzácný virus, pro jeho získání je nejjednodušší se obrátit na vhodnou sbírku fytopatogenních mikroorganismů - má jej ve své sbírce například Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. v Praze - Ruzyni. Vzorky pro předběžné testování přítomnosti virů ELISA i pro vlastní amplifikaci viru pro molekulární metody jsou shodné, odebíráme dormantní jednoleté réví v zimním období. Z jedné rostliny odebíráme tři výhony z různých částí rostliny, z každého výhonu pak odebereme dvě internodia ze spodní části výhonu, kde je vyšší pravděpodobnost přítomnosti testovaných virů ve vyšší koncentraci oproti internodiím z vrchní části výhonu. Z réví sloupneme svrchní vrstvu suché kůry, čímž obnažíme lýkovou část. Z ní naškrábeme ostrým nožem požadované množství vzorku. Ten okamžitě zalijeme extrakčním pufrem a pokračujeme postupem ELISA nebo PCR. P1.3. Výběr úseku genomu viru a jeho amplifikace z napadené rostliny pomocí RT-PCR Část genomu viru pro sondu vybíráme obvykle z dobře známé části genomu viru, z často zkoumaného genu nebo jeho části, u něhož je známo větší množství sekvencí a tím podchycena variabilita tohoto viru. Upřednostňujeme pokud možno konzervativní části genu, které jsou shodné i u izolátů pocházejících z různých částí světa. Takto konzervativní úseky jsou většinou ty, které virus nezbytně potřebuje pro základní funkce produkovaných proteinů, jako je například polymeráza. Dobře známé jsou u většiny virů obvykle jejich geny pro obalový protein. U GLRaV-1 jsme použili gen pro HSP-70, u GVA a GVB gen pro obalový protein a u GFkV gen pro virovou polymerázu. P Amplifikace úseku genomu GLRaV-1 Použité primery (Komínek and Bryxiová, 2005): Primer LR1: 5 CAGGCGTCGTTTGTACTGTG 3 je amplifikační primer. Primer LR2: 5 TCGGACAGCGTTTAAGTTCC 3 je reverzní primer. Amplifikovaný fragment má délku 540 bp, je na pozicích v kompletní sekvenci GLRaV-1 AF (Fazeli and Rezaian, 2000). Tento úsek se nachází v rámci genu pro HSP70. Jako zdroj GLRaV-1 byla použita rostlina révy vinné z VSV Karlštejn odrůdy Rulandské bílé, klon RB34/30, T4, keř 11. RNA byla izolována kitem RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen). Smícháme v mikrozkumavce objemu 500 µl následující složky reakční směsi: RNA 4 µl primer LR1 1 µl primer LR2 1 µl voda 4 µl celkem 10 µl Inkubujeme při 100 C po dobu 10 minut a následně ochladíme na ledu po dobu 5 minut, pak necháme 25 minut stát při pokojové teplotě. Přidáme následující složky, používáme OneStep RT-PCR Kit (Qiagen): 5x Qiagen Buffer 5 µl dntp mix 1 µl Q roztok 5 µl Qiagen Enzyme Mix 1 µl voda 3 µl celkem 25 µl 11

13 Ihned po přidání enzymatické směsi vložíme mikrozkumavky do cykleru (PTC200 od MJ Research) předehřátého na 45 C. Dále probíhá následující program: 45 C 50 minut 95 C 15 minut 94 C 1 min. 55 C 1 min. 40 x 72 C 1 min. 72 C 10 minut 10 C stále Po skončení reakce přidáme k reakční směsi 2 µl FLB (Ficoll Loading Buffer) a nanášíme na 1% agarózový gel spolu s vhodným markerem (např. GeneRuler 100 bp Plus firmy Fermentas). U pozitivních vzorků obdržíme produkt délky 540 bp. Tento produkt následně izolujeme z gelu za použití kitu MinElute Gel Extraction Kit (Qiagen). P Amplifikace úseku genomu GVA Použité primery (Komínek et al., 2008): GVA2F 5 CTGATCTGCAGTTTGTGGA 3 je amplifikační primer. GVA2R 5 CACCACACTTACACACATTCAT 3 je reverzní primer. Amplifikovaný fragment má délku 931 bp, je na pozicích v kompletní sekvenci GVA X75433 (Minafra et al., 1994). Tento úsek zahrnuje 3 konec genu pro transportní protein, kompletní gen pro obalový protein a 5 začátek genu pro 10 kda protein pro vazbu nukleové kyseliny. Jako zdroj GVA byla použita rostlina révy vinné z VSV Karlštejn odrůdy Müller-Thurgau, klon MT43/25, T3, keř 2. RNA byla izolována kitem RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen). Smícháme v mikrozkumavce objemu 500 µl následující složky reakční směsi: RNA 4 µl primer GVA1F 0,6 µl primer GVA1R 0,6 µl voda 4,8 µl celkem 10 µl Inkubujeme při 100 C po dobu 10 minut a následně ochladíme na ledu po dobu 5 minut, pak necháme 25 minut stát při pokojové teplotě. Přidáme následující složky, používáme OneStep RT-PCR Kit (Qiagen): 5x Qiagen Buffer 5 µl dntp mix 1 µl Q roztok 5 µl Qiagen Enzyme Mix 1 µl voda 3 µl celkem 25 µl Ihned po přidání enzymatické směsi vložíme mikrozkumavky do cykleru (PTC200 od MJ Research) předehřátého na 45 C. Dále probíhá následující program: 12

14 45 C 90 minut 95 C 15 minut 94 C 1 min. 50 C 1,5 min. 40 x 72 C 2,5 min. 72 C 10 minut 10 C stále Po skončení reakce přidáme k reakční směsi 2 µl FLB (Ficoll Loading Buffer) a nanášíme na 1% agarózový gel spolu s vhodným markerem (např. GeneRuler 100 bp Plus firmy Fermentas). U pozitivních vzorků obdržíme produkt délky 931 bp. Tento produkt následně izolujeme z gelu za použití kitu MinElute Gel Extraction Kit (Qiagen). P Amplifikace úseku genomu GVB Použité primery (Minafra and Hadidi, 1994): GvbA 5 GTGCTAAGAACGTCTTCACAGC 3 je amplifikační primer. GvbS 5 AGTAGCCCTTCGTTTAGCCGC 3 je reverzní primer. Amplifikovaný fragment má délku 151 bp, je na pozicích v kompletní sekvenci GVB EF (Moskovitz et al., 2008). Tento úsek zahrnuje 3 konec genu pro obalový protein, krátký nekódující úsek a 5 začátek genu pro 13 kda protein pro vazbu nukleové kyseliny. Jako zdroj GVB byla použita rostlina révy vinné odrůdy Tramín červený ze soukromé zahrady v Modřicích u Brna. RNA byla izolována kitem RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen). Smícháme v mikrozkumavce objemu 500 µl následující složky reakční směsi: RNA 4 µl primer GvbS 0,6 µl primer GvbA 0,6 µl voda 4,8 µl celkem 10 µl Inkubujeme při 100 C po dobu 10 minut a následně ochladíme na ledu po dobu 5 minut, pak necháme 25 minut stát při pokojové teplotě. Přidáme následující složky, používáme OneStep RT-PCR Kit (Qiagen): 5x Qiagen Buffer 5 µl dntp mix 1 µl Q roztok 5 µl Qiagen Enzyme Mix 1 µl voda 3 µl celkem 25 µl Ihned po přidání enzymatické směsi vložíme mikrozkumavky do cykleru (PTC200 od MJ Research) předehřátého na 50 C. Dále probíhá následující program: 50 C 45 minut 95 C 15 minut 94 C 45 sec. 50 C 45 sec. 40 x 72 C 45 sec. 72 C 10 minut 10 C stále 13

15 Po skončení reakce přidáme k reakční směsi 2 µl FLB (Ficoll Loading Buffer) a nanášíme na 2% agarózový gel spolu s vhodným markerem (např. GeneRuler 100 bp Plus firmy Fermentas). U pozitivních vzorků obdržíme produkt délky 151 bp. Tento produkt následně izolujeme z gelu za použití kitu MinElute Gel Extraction Kit (Qiagen). P Amplifikace úseku genomu GFkV Použité primery (Sabanadzovic et al., 2000) jsou schopny detekovat všechny viry čeledi Tymoviridae (rody Tymovirus, Marafivirus, Maculavirus). Z virů infikujících révu vinnou detekují GFkV a GRGV z rodu Maculavirus a GAMaV z rodu Marafivirus. Přítomnost všech tří virů již byla prokázána v ČR (Komínek a Komínková, dosud nepublikováno). Flek1 5 CYCARCAYAARGTVAACGA 3 je amplifikační primer. Flek2 5 CATGCANGTSAGRGGRCCRAA 3 je reverzní primer. Amplifikovaný fragment má délku 386 bp, je na pozicích v kompletní sekvenci GFkV AJ (Sabanadzovic et al., 2001). Tento úsek se nachází v rámci genu pro virovou polymerázu. Jako zdroj GFkV byla použita rostlina révy vinné z VSV Karlštejn odrůdy Müller-Thurgau, klon MT30/34, T3, keř 6. RNA byla izolována kitem RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen). Smícháme v mikrozkumavce objemu 500 µl následující složky reakční směsi: RNA 4 µl primer Flek1 0,8 µl primer Flek2 0,8 µl voda 4,4 µl celkem 10 µl Inkubujeme při 100 C po dobu 10 minut a následně ochladíme na ledu po dobu 5 minut, pak necháme 25 minut stát při pokojové teplotě. Přidáme následující složky, používáme OneStep RT-PCR Kit (Qiagen): 5x Qiagen Buffer 5 µl dntp mix 1 µl Q roztok 5 µl Qiagen Enzyme Mix 1 µl voda 3 µl celkem 25 µl Ihned po přidání enzymatické směsi vložíme mikrozkumavky do cykleru (PTC200 od MJ Research) předehřátého na 45 C. Dále probíhá následující program: 45 C 45 minut 95 C 15 minut 94 C 1 min. 55 C 1 min. 40 x 72 C 1 min. 72 C 10 minut 10 C stále Po skončení reakce přidáme k reakční směsi 2 µl FLB (Ficoll Loading Buffer) a nanášíme na 1,5% agarózový gel spolu s vhodným markerem (např. GeneRuler 100 bp Plus firmy Fermentas). U pozitivních vzorků obdržíme produkt délky 386 bp. Tento produkt následně izolujeme z gelu za použití kitu MinElute Gel Extraction Kit (Qiagen). 14

16 P1.4. Naklonování amplifikovaného úseku genomu viru do plazmidu Úseky genomu virů amplifikované pomocí PCR je následně nutno naklonovat do plazmidu. K tomuto účelu používáme plazmid pgem-t Easy od firmy Promega. První den V mikrozkumavce smícháme: 2x Rapid Ligation Buffer 6 µl pgem -T Easy Vector 1 µl fragment po PCR 4 µl T4 DNA Ligase (3U/µl) 1 µl celkem 12 µl Promícháme pipetou, necháme inkubovat přes noc při +4 o C. Připravíme si selektivní misky, LB agar obsahující 100 µg/ml ampicilinu, NBT a BCIP. Druhý den Misky se selektivním médiem zahřejeme na pokojovou teplotu. SOC necháme zahřát na pokojovou teplotu, 1 ml na reakci, tedy cca 4 ml. Z klonovací reakce z prvního dne odebereme 6 µl do 2 ml mikrozkumavky. Zkumavku s kompetentními buňkami JM 109 (200 µl, jsou uchovávány v - 80 o C) necháme roztát na ledu (cca 5 minut). Směs buněk promícháme jemným cvrnknutím do zkumavky. Ke klonovací reakci přidáme á 50 µl buněk. Nabíráme opatrně 1ml pipetou s modrou špičkou s uříznutým koncem. Směs buněk a plazmidu promícháme jemným cvrnknutím do zkumavky. Umístíme na led na 25 minut. Následuje teplotní šok 42 C 45 s na vodní lázni. Okamžitě dáme na led na 2 minuty. Přidáme 950 µl SOC média předehřátého na pokojovou teplotu. Necháme jemně překlápět 2 hodiny při 37 C, nesmí se s tím razantně třepat, nesmí se to promíchávat pipetováním, kompetentní buňky jsou křehké a při razantnější manipulaci bychom je zničili!!! Tuto inkubaci provádíme v hybridizační pícce, nastavíme si 10 rev/min. Z každé reakce rozetřeme po cca 100 µl směsi na dvě až čtyři misky se selektivním médiem (ampicilin, IPTG a X-gal). Misky inkubujeme přes noc při 37 o C. Třetí den Na selektivních miskách od včerejška vyrostly kolonie E. coli. Pozorujeme modré a bílé kolonie. Správné kolonie jsou bílé, což signalizuje úspěšné vložení insertu do plazmidu. Modré kolonie jsou s čistým plazmidem bez insertu. Z bílých kolonií vyloučíme ty, které mají modrý nebo namodralý střed. Vybereme tedy od každého vzorku 5 bílých kolonií, přeočkujeme každou zvlášť na 5 ml selektivního LB média v kyvetách Corning. Necháme intenzívně třepat přes noc při 37 C v třepačce na vodní lázni. Čtvrtý den U narostlých bakteriálních kultur provedeme kontrolní PCR pro zjištění insertu v plazmidu. Z každé kultury odeberme 50 µl, přidáme 50 µl vody, inkubujeme 10 minut při 100 o C, potom na 5 minut zchladíme při 5 o C. Z této směsi bereme 2 µl do PCR. Použité primery: M13fwd 5 GTAAAACGACGGCCAG 3 M13 rev 5 CAGGAAACAGCTATGAC 3 15

17 Smícháme v mikrozkumavce objemu 500 µl následující složky reakční směsi: směs z buněčné kultury 4 µl H 2 O 16 µl 5x Taq pufr 2,5 µl MgCl 2 1,5 µl dntp mix Promega 0,2 µl primer M 13 fwd 0,3 µl primer M 13 rev 0,3 µl Taq polymeráza Promega 0,2 µl 25 µl Program pro cykler: 94 C 10 minut 94 C 1 min. 55 C 50 sec. 30 x 72 C 2 min. 72 C 10 minut 10 C stále Po skončení reakce přidáme k reakční směsi 2 µl FLB (Ficoll Loading Buffer) a nanášíme na 1,5% agarózový gel spolu s vhodným markerem (např. GeneRuler 100 bp Plus firmy Fermentas). U úspěšně naklonovaných plazmidů vidíme produkt délky našeho vloženého insertu bp. U neúspěšně naklonovaných dostaneme produkt délky 264 bp (jenom úsek plazmidu) nebo jinou délku (při naklonování např. fragmentů produktu PCR). Všechny kultury s neúspěšně naklonovanými plazmidy vyloučíme z dalšího postupu! Ze všech buněčných kultur uložíme alikvoty do - 80 o C: smícháme v kryoampulce vždy 0,85 ml kultury a 0,15 ml sterilního glycerolu a uskladníme při - 80 o C. Zbytky kultur a vyřazené kultury dáme autoklávovat. Z vybraných kultur následuje ihned izolace plazmidů. Pro izolaci plazmidů použijeme QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen. Vyizolované plazmidy skladujeme při -20 o C. Je nutno stanovit koncentraci vyizolovaných plazmidů pomocí elektroforézy s markerem GeneRuler 100 bp Plus firmy Fermentas, kdy podle intenzity proužku pozorovaného při UV světle odhadneme výslednou koncentraci plazmidu. 16

18 Příloha 2: Příprava sondy P2.1. Vybavení a chemikálie P2.2. Syntéza RNA sondy z plazmidu P2.2. Kontrola kvality sondy P2.1. Vybavení a chemikálie Přístrojové zabezpečení Termocykler (např. PTC200 od MJ Research) Mrazicí box -80 o C Inkubátor (např. Memmert INB200 od Fischer Scientific) Hybridizační inkubátor (např. Binder BFD 53 od Fischer Scientific) Dokumentační systém schopný snímat chemiluminiscenci (např. ChemiGeniusQ od SynGene) Chladnička (+4 o C) Autokláv Vortex (mikrotřepačka) Chlazená centrifuga na mikrozkumavky Eppendorf ( g; 1,5 /2,0 ml) Sada mikropipet (0,1-2 µl, 0,5 10 µl, 2 20 µl, µl, µl) ph-metr Laboratorní váhy Výrobník ledové tříště Materiál 1,5 ml a 2 ml mikrozkumavky Eppendorf Filtrační papír, papírové ručníky Laboratorní sklo (kádinky, odměrné válce, láhve reagenční s uzávěrem autoklávovatelné) PCR zkumavky (velikost a typ podle použitého přístroje) Permanentní popisovač na sklo a na plast Špičky pro mikropipety + boxy (sterilizovatelné) Špičky s filtrem pro mikropipety ve sterilních boxech Vyšetřovací rukavice Hybridization Bags, katalog Roche Nylon membrane, positively charged, katalog Roche Chemikálie a kity sterilní redestilovaná voda, nebo komerčně dodávaná voda pro PCR DIG Northern Starter Kit, katalog Roche DIG Wash and Block Buffer Set, katalog Roche ApaI, katalog Promega R6361 NsiI, katalog Promega R6531 MinElute PCR Purification Kit (50), katalog Qiagen Příprava roztoků SSC 20x 500 ml (3M NaCl a 300mM sodium citrate) 87,66 g NaCl 44,125 g sodium citrate rozpustit v 400 ml redestilované vody doplnit vodou do 500 ml autoklávovat 17

19 P2.2. Syntéza RNA sondy z plazmidu Pro syntézu RNA sondy potřebujeme plazmid ve vysoké koncentraci, alespoň 100 ng/µl. Dále potřebujme analyzovat virový insert z hlediska jeho orientace v plazmidu, zda je v "sense" orientaci nebo otočený - nejjednodušší cesta je dát si dotyčný plazmid komerčně osekvenovat alespoň z jedné strany. Před štěpením plazmidu jakýmkoliv enzymem je nutno nejdříve zkontrolovat, zda náš insert neobsahuje restrikční místo pro tento enzym, sonda by pak byla velmi krátká a mohlo by to ovlivnit její afinitu k virové RNA. U správně orientovaného insertu potom pro syntézu komplementární sondy štěpíme plazmid restrikční endonukleázou ApaI (gggccc), RNA sondu pak syntetizujeme RNA polymerázou SP6 (DIG Northern Starter Kit od Roche). U insertu orientovaného opačně štěpíme plasmid štěpíme restrikční endonukleázou NsiI (atgcat), RNA sondu pak syntetizujeme T7 RNA polymerázou. Snažíme se vyhnout této polymeráze, dává dle našich zkušeností o řád nižší výtěžnost sondy! P Štěpení plazmidu P Štěpení Apa I Složení reakce - smícháme v mikrozkumavce: 14 µl plazmidu, při koncentraci alespoň 100 ng/µl se tak dostane do reakce minimálně 1,4 µg 2 µl endonukleáza (Apa I, 20U) 2 µl BSA ze zásobního roztoku zředěného 1:10 2 µl pufr A 10x Štěpíme při 37 C 4 hodiny. Reakci ukončíme 15 minut při 72 C, například v termocykleru. Po skončení štěpení přečistíme vzorky kitem MinElute PCR purification kit (Qiagen). P Štěpení Nsi I Složení reakce - smícháme v mikrozkumavce: 14 µl plazmidu, při koncentraci alespoň 100 ng/µl se tak dostane do reakce minimálně 1,4 µg 2 µl endonukleáza (Nsi I, 20U) 2 µl BSA ředěného ze zásobního roztoku 1:10 2 µl pufr D 10x Štěpíme při 37 C 4 hodiny. Reakci ukončíme 15 minut při 72 C, například v termocykleru. Po skončení štěpení přečistíme vzorky kitem MinElute PCR purification kit (Qiagen). P Syntéza sondy Sondu syntetizujeme ze štěpeného plazmidu kitem DIG Northern Starter Kit. Objem plazmidu pro reakci je maximálně 10 µl. Pokud do štěpení restrikční endonukleázou šel plazmid v koncentraci 100 ng/µl, je výsledná koncentrace plazmidu 70 ng/µl. Do reakce lze dát nejvýše 10 µl, což činí 0,7 µg. Výrobce kitu doporučuje pro reakci koncentraci 1 µg plazmidu, je proto vhodné mít výchozí koncentraci plazmidu vyšší než 100 ng/µl. Smícháme v mikrozkumavce na ledu: štěpený plazmid 10 µl labeling mix 5x, zkumavka 1a 4 µl pufr 5x, zkumavka 1b 4 µl RNA polymeráza pokud jsme štěpili enzymem ApaI (správně orientovaný insert), použijeme polymerázu SP6, zkumavka 2 2 µl (40U) pokud jsme štěpili enzymem NsiI (obrácený insert), použijeme polymerázu T7, zkumavka 3 2 µl (40U) 18

20 Zamícháme, stočíme, inkubujeme 1 hodinu při 42 o C v termocykleru. Přidáme DNázu I (zkumavka 6) 2 µl Inkubujeme 15 minut při 37 o C Ukončíme reakci přidáním 2 µl 0,2 M EDTA (ph 8.0) P2.3. Kontrola kvality sondy Připravíme si ředicí roztok pro RNA (SSC 2x): Každou sondu zředíme v tomto ředicím roztoku - 10x, 100x, 1000x a 10000x. Kontrolní sondu z kitu DIG Northern Starter Kit, zkumavka č. 8, zředíme takto: ředění č. 1 neředěná kontrola 10 ng/µl ředění č. 2 ředicí roztok 18 µl + 2 µl z ředění č.1 1 ng/µl ředění č. 3 řed. rozt. 198 µl + 2 µl z ředění č.2 10 pg/µl ředění č. 4 řed. rozt. 35 µl + 15 µl z ředění č.3 3 pg/µl ředění č. 5 řed. rozt. 45 µl + 5 µl z ředění č.3 1 pg/µl ředění č. 6 řed. rozt. 45 µl + 5 µl z ředění č.4 0,3 pg/µl ředění č. 7 řed. rozt. 45 µl + 5 µl z ředění č.5 0,1 pg/µl ředění č. 8 řed. rozt. 45 µl + 5 µl z ředění č.6 0,03 pg/µl - ustřihneme malý kousek nylonové membrány, stačí 3x1 cm a naznačíme si na ní tužkou 4 řady po 4 vzorcích. - nakapeme z každé zkumavky 1 µl na membránu. - položíme membránu na 5 minut na zapnutý transiluminátor. - vložíme membránu do misky s 20 ml Washing Buffer (je 10x, ředíme vodou na pracovní koncentraci). - zlehka třepeme 2 minuty při pokojové teplotě. - inkubujeme 30 minut v 10 ml Blocking Solution (je 10x, ředíme v Maleic Acid Buffer, ten je také 10x, ředíme vodou). - inkubujeme 30 minut v 10 ml Antibody Solution (Anti-DIG AP je zkumavka 5, ředíme v Blocking solution, připraveném viz výše, 1µl na 10 ml) - vložíme membránu do misky s 20 ml Washing Buffer. - zlehka třepeme 15 minut při pokojové teplotě. - vyměníme pufr a znovu třepeme 15 minut. - vložíme membránu do misky s 10ml Detection Buffer (je 10x, ředíme vodou). - po ekvilibraci v Detection Buffer nakapeme na membránu kapátkem láhve 7 CDP Star v dávce cca 1 kapka na 4 cm 2 membrány. - CDP Star okamžitě rozetřeme, necháme inkubovat 5 minut, pak zalepíme sáček a exponujeme v dokumentačním systému 5-30 minut, ne více. Membrána nesmí během expozice vyschnout. - porovnáme intenzitu signálu s kontrolou a stanovíme tak koncentraci naší sondy. Výtěžnost reakce má být dle výrobce kitu cca 20 µg sondy, koncentrace 1 µg/µl. Tuto výtěžnost běžně dosahujeme při použití RNA polymerázy SP6, zatímco polymeráza T7 dává o řád nižší výtěžnost, tedy cca 0,1 µg/µl. Postup popsaný v přílohách není nutno absolvovat, pokud získáme sondu z laboratoře, která se zabývá jejím výzkumem a vývojem. Popsané sondy pro detekci GLRaV-1, GVA, GVB a GFkV jsou k dispozici na oddělení virologie Výzkumného ústavu rostlinné výroby, v.v.i. v Praze - Ruzyni u Ing. Petra Komínka, Ph.D. 19

21 III) Srovnání novosti postupů Metodika molekulární hybridizace pro viry révy vinné nebyla dosud v ČR publikována. Problematika detekce dvou virů (GLRaV-1 a GVA) byla již autory metodiky publikována jako původní vědecké sdělení, u dalších dvou virů (GVB a GFKV) jde podle našich poznatků o světové prvenství v použité metodě detekce. IV) Popis uplatnění metodiky, pro koho je určena, jakým způsobem bude uplatněna. Metodika je určena pro státní správu v oboru rostlinolékařství, je zaměřena na detekci významných patogenů révy vinné - jejími uživateli proto budou primárně Státní rostlinolékařská správa a Ústřední kontrolní a zkušební ústav zemědělský. Uplatněna bude při použití v laboratořích těchto institucí při diagnostice virů révy vinné. V) Seznam použité související literatury Benson DA, Karsch-Mizrachi I, Lipman DJ, Ostell J, Wheeler DL (2007): GenBank. Nucleic Acids Research, 35: Database issue D21-D25. Fazeli FC, Rezaian MA (2000): Nucleotide sequence and organization of ten open reading frames of the grapevine leafroll-associated virus 1 genome and identification of three subgenomic RNAs. Journal of General Virology 81: Minafra A, Hadidi A (1994): Sensitive detection of grapevine virus A, B, or leafrollassociated III from viruliferous mealybugs and infected tissue by cdna amplification. Journal of Virological Methods 47: Minafra A, Saldarelli P, Grieco F, Martelli GP (1994): Nucleotide sequence of the 3 terminal region of the RNA of two filamentous grapevine viruses. Archives of Virology 137: Moskovitz Y, Goszczynski DE, Bir L, Fingstein A, Czosnek H, Mawassi M (2008): Sequencing and assembly of a full-length infectious clone of grapevine virus B and its infectivity on herbaceous plants. Archives of Virology 153: Sabanadzovic S, Abou-Ghanem N, Castellano MA, Digiaro M, Martelli GP (2000): Grapevine fleck virus-like viruses in Vitis. Archives of Virology 145: Sabanadzovic S, Abou-Ghanem-Sabanadzovic N, Saldarelli P, Martelli GP (2001): Complete nucleotide sequence and genome organization of Grapevine fleck virus. Journal of General Virology 82 (PT 8): VI) Seznam publikací, které předcházely metodice Komínek P., Bryxiová M. Comparison of three techniques for the detection of Grapevine leafroll-associated virus 1. Acta Virologica, 49, 2005: Komínek P., Komínková-Bryxiová M., Jandurová O.M., Holleinová V. An RNA probe for the detection of Grapevine virus A. Journal of Phytopathology, 156, 2008:

22 Seznam obrázků v metodice hybridizace Titulní strana: Muskat donskoj, VSV Karlštejn, foto RNDr. Olga Jandurová, CSc. Obrázek 1: Membrána s vyznačenou síťkou pro nanášení vzorků Obrázek 2: Šikmo seříznuté řapíky listů révy vinné Obrázek 3: Otisky řapíků na membráně, pole B1 a B2 Obrázek 4: Membrána v hybridizačním sáčku Obrázek 5: Sáček s membránou v hybridizační pícce Obrázek 6: Výsledek chemiluminiscence na membráně, detekce GVA Obrázky 1-6, foto autoři metodiky Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., 2008 ISBN: