Výzkumný ústav rostlinné výroby Praha Ruzyně

Transkript

1 Výzkumný ústav rostlinné výroby Praha Ruzyně Optimalizace metod elektroforézy proteinů pro identifikaci odrůd ječmene (Hordeum vulgare L.) Metodika vypracována jako výstup projektu NAZV QF 3050: Vývoj metod objektivní identifikace odrůd zemědělských plodin Autoři: Ing. Jana Bradová, Mgr. Světlana Sýkorová, CSc. Prosinec 2006

2 OPTIMALIZACE METOD ELEKTROFORÉZY PROTEINŮ PRO IDENTIFIKACI ODRŮD JEČMENE (Hordeum vulgare L.) Metodika vypracována jako výstup projektu NAZV QF 3050: Vývoj metod objektivní identifikace odrůd zemědělských plodin Ing. Jana Bradová Mgr. Světlana Sýkorová, CSc. Vydal: Výzkumný ústav rostlinné výroby, Praha Text: 2006 J. Bradová, S. Sýkorová Foto: 2006 S. Sýkorová, J. Bradová Grafická úprava: 2006 M. Sýkora Vydáno bez jazykové úpravy ISBN:

3 OPTIMALIZACE METOD ELEKTROFORÉZY PROTEINŮ PRO IDENTIFIKACI ODRŮD JEČMENE Obsah: 1. Úvod Použité metody souborné zhodnocení Metodické postupy Elektroforetická analýza hordeinů ječmene ve sloupcích škrobového gelu (SGE) Elektroforetická analýza hordeinů ječmene v zásaditém prostředí SDS (SDS PAGE) Elektroforetická analýza hordeinů ječmene v polyakrilamidovém gelu v kyselém prostředí (A PAGE) Elektroforetická analýza alel esterázových lokusů ječmene Est-1, Est-2, Est-4 a Est-5 v polyakrilamidovém gelu (PAGE esteráz) Katalog hordeinových alelických bloků a esterázových alel získaných metodami SGE, SDS PAGE a PAGE u registrovaných odrůd jarního a ozimého ječmene Sestavy hordeinových a esterázových alel odrůd ječmene v podobě hordeinových a esterázových alelických vzorců Příklad výsledku SDS PAGE hordeinů odrůd ječmene nově registrovaných v roce Příklad výsledku PAGE esteráz odrůd ječmene nově registrovaných v roce Další doporučená literatura. 36 J. Bradová, S. Sýkorová VÚRV Praha

4 1. Úvod Odrůda je jedním z nejvýznamnějších faktorů rozvoje zemědělství, je tzv "nositelem" kvality. Metody identifikace a vzájemného rozlišování odrůd významných zemědělských plodin se v posledních letech vyvíjejí v rychlém tempu. Souvisí to s obchodními aktivitami specializovaných firem a společností, kterým se u nás otevřel trh s osivem a sadbou. S obchodováním jsou vždy spojeny problémy související s právní a obchodní ochranou zboží. Ochrana práv, která se váže na určitý rostlinný genotyp resp. odrůdu, se na různých úrovních týká ochrany autorských práv jak samotného autora či majitele odrůdy, tak i dalších, kteří s odrůdou manipulují, např. na základě licence. Význam rychlého a spolehlivého určení odrůd je podmiňován odlišností odrůd v řadě hospodářsky významných vlastností. Každá odrůda se vyznačuje specifickým souborem vlastností, které rozhodují o jejím využití. Je proto v zájmu výrobců osiva a sadby i v zájmu pěstitelů, nákupu, zpracovatelského průmyslu, vnitřního a zahraničního obchodu používat jen správně zvolené a spolehlivě určené odrůdy. U obilovin může být k tomuto účelu využita sestava zásobních a enzymatických proteinů zrna (genetické bílkovinné markery), geneticky fixovaná a nezávislá na ročníku, lokalitě a podmínkách pěstování. Elektroforéza bílkovinných genetických markerů je běžným postupem separace semenných bílkovin v prostředí škrobového či polyakrylamidového gelu. Genetická interpretace, spojená především s elektroforézou ve škrobovém gelu (SGE), umožňuje identifikovat fenotypové projevy jednotlivých bílkovinných alel, jak to respektuje inovovaná státní norma (ČSN , ČSN Pšenice obecná a ječmen - Stanovení odrůdové pravosti a odrůdové čistoty Část 1: Elektroforéza bílkovin ve škrobovém gelu, resp. Část 2: Elektroforéza bílkovin v polyakrylamidovém gelu). 2. Použité metody souborné zhodnocení 1. Elektroforetická analýza hordeinů ve sloupcích škrobového gelu (SGE) 2. Elektroforetická analýza hordeinů v zásaditém prostředí SDS (SDS PAGE) 3. Elektroforetická analýza hordeinů v polyakrylamidovém gelu v kyselém prostředí (A PAGE) 4. Elektroforetická analýza alel esterázových lokusů v polyakrylamidovém gelu (PAGE esteráz) Podstata metodického přístupu uvedených metod: Zmíněné metody vycházejí ze skutečnosti, že zásobní proteiny (hordeiny) zrna ječmene i enzymový systém esteráz jsou geneticky determinovány určitými lokusy tzn. nejsou závislé na vnějších podmínkách ročníku, výživě, lokalitě, jsou polymorfní a mohou tedy sloužit jako genetické bílkovinné markery pro identifikaci genotypů i pro stanovení jejich homogenity a homo- či heterozygotního stavu. Metody jsou na pracovišti OŠM ve VÚRV prováděny standardním postupem, personál laboratoře má požadovanou erudici a odbornou způsobilost. Shrnutí základních praktických postupů Základní metodou je SGE hordeinů, kterou lze zjistit poměrně přesně sestavu hordeinových alelických bloků jednotlivých genotypů, resp. odrůd to znamená zjistit jejich rozdílnost a šíři genetického vybavení. Touto metodou lze rovněž zjistit jejich homogenitu jak analýzou dostatečného počtu jednotlivých zrn, tak i analýzou směsného vzorku. U J. Bradová, S. Sýkorová VÚRV Praha 4

5 nehomogenních (případně heterozygotních) materiálů lze určit počet hordeinových linií, bud' příbuzných sesterských (některé alely shodné) nebo nepříbuzných nesesterské (možná příměs nebo cizosprášení). Alternativou k SGE je SDS PAGE hordeinů, od níž lze očekávat přibližně totéž, co od SGE, je však pracovně i finančně poněkud náročnější; její výhodou je to, že je doporučována mezinárodní organizací pro ochranu odrůd rostlin (UPOV 1 ). Metoda PAGE esteráz představuje další stupeň zjištění polymorfismu, je vhodná při základní charakterizaci výchozích materiálů a k případnému rozlišení hordeinově identických odrůd. K determinaci hordeinových genů je možno používat další postup elektroforetické separace hordeinů, a to metodu A PAGE. Tato metoda je doporučována mezinárodní semenářskou organizací (ISTA 2 ). Je uvedena i v materiálech UPOV jako alternativa k SDS PAGE. Její nevýhodou je absence genetické interpretace získaných hordeinových elektroforetických spekter na rozdíl od ostatních výše uvedených postupů. 3. Metodické postupy Elektroforetická analýza hordeinů ječmene ve sloupcích škrobového gelu (SGE) Metoda je prováděna podle ČSN (Pšenice obecná a ječmen, Stanovení odrůdové pravosti a odrůdové čistoty, Část 1: elektroforéza bílkovin ve škrobovém gelu (SGE)) Potřebné technické vybavení Chemikálie: Etanol Methylenová zeleň Mléčnan hlinitý Kyselina mléčná Škrob pro elektroforézu Močovina Kyselina trichloroctová (TCA) Nigrosin rozpustný ve vodě. Přístroje: Přístroj pro elektroforézu ve skleněných trubičkách Zdroj stejnosměrného proudu (min. 300V, 100mA) Laboratorní centrifuga Olejová vývěva Analytické váhy Laboratorní předvážky Třepačka Vortex Sklo, laboratorní pomůcky: Skleněné trubičky o vnitřním průměru 5,5 6,0 mm a délce mm, 250 ml zábrusová baňka s kulatým dnem, skleněný nástavec pro odvzdušnění gelu, kádinky, plynový 1 UPOV Union for The Protection of New Varieties of Plants 2 ISTA - International Seed Testing Assotiation J. Bradová, S. Sýkorová VÚRV Praha 5

6 kahan, vodní lázeň, automatická pipeta, odměrné nádoby (válce, odměrné baňky), gumová hadička o vnitřním průměru 4 mm, plastové kroužky o vnějším průměru 21 mm, plastové centrifugační kyvety 1,5 ml, injekční stříkačka s jehlou, gumový balónek s hadičkou, stojany, skleněné zkumavky, plastová střička 250 ml, laboratorní teploměr Pracovní postup Roztoky: Extrakční roztok: 65% etanol (v/v) s 0,1 g methylenové zeleně ve 100 ml. Elektrodový pufr: 1,5 g mléčnanu hlinitého a 2,5 2,8 ml kyseliny mléčné (h=1,2 g. cm -3 ) se doplní do 1000 ml destilovanou (deionizovanou vodou) pufr má mít ph 3,1 3,2. Pufr lze uchovávat při teplotě 4 8 C nejdéle 1 týden. Gelový pufr: 0,75 g mléčnanu hlinitého a 1,5 1,7 ml kyseliny mléčné se doplní do 500 ml destilovanou vodou. Pufr lze uchovávat při teplotě 4 8 C nejdéle 1 týden. Fixační roztok: 100 g kyseliny trichloroctové se doplní vodou do 1000 ml Barvicí roztok: 0,25 g nigrosinu se rozpustí a dobře rozmíchá v 1000 ml destilované vody. Příprava gelu a gelových sloupečků Pro přípravu 25 sloupečků škrobového gelu se do 250 ml skleněné zábrusové baňky odváží 8,5 g škrobu pro elektroforézu a důkladně se smísí s 80 ml gelového pufru. Směs se během 5 minut zahřeje na vodní lázni na teplotu C a přidá se 9,6 g močoviny, která se dokonale rozpustí. Směs se stále míchá a ochladí se pod tekoucí vodou na teplotu cca 55 C a během 15 s se zbaví vzduchových bublin pomocí olejové vývěvy. Škrobový gel teplý přibližně 50 C se poté nasáváním naplní do skleněných trubiček až ke značce ve výšce 110 mm. K nasávání a ke stabilizaci gelu v trubičce se uplatní nasazená gumová hadička o délce cca 100 mm, která se přehne a zajistí kroužkem. Trubičky naplněné gelem se po 25 ks umístí do kádinky o objemu 250 ml, na jejíž dno se předem nalije vrstva cca 10 mm gelu. Sloupce gelu se nechají v trubičkách ztuhnout při laboratorní teplotě po dobu hodin. Extrakce proteinů Zrna ječmene se jednotlivě rozdrtí (např. kladívkem mezi listy hladkého papíru) a drť se vloží do plastové 1,5 ml centrifugační kyvety 3, přidá se 0,2 ml extrakčního roztoku, kyvety se uzavřou, směs se promíchá pomocí Vortexu, ponechá se stát při laboratorní teplotě 20 minut, poté se znovu promíchá a uloží na 16 hodin do chladničky. Následně se extrakty odstředí po dobu 2 minut při ot/min. a supernatanty se nanesou pomocí automatické pipety na povrch připravených sloupečků škrobového gelu (0,04 ml/trub.) a zasypou se škrobem pro elektroforézu tak, aby na povrchu sloupce zůstala tenká vrstvička sypkého škrobu. Elektroforéza Skleněné trubičky se škrobovým gelem a extrakty se upevní do horní nádoby elektroforetického přístroje a jeho dolní katodová část se naplní elektrodovým pufrem vytemperovaným na 20 C. Tímtéž elektrodovým pufrem se opatrně převrství (např. injekční stříkačkou s jehlou) škrobem zasypané extrakty ve skleněných trubičkách, potom se elektrodovým pufrem doplní horní anodová nádoba přístroje (elektroforéza probíhá směrem od anody ke katodě: od + k -). Ze stabilizovaného zdroje se na elektrody přivede proud o stálé 3 V případě směsného vzorku se do centrifugační kyvety odváží 0,05 g šrotu. J. Bradová, S. Sýkorová VÚRV Praha 6

7 intenzitě 1,5 ma/trub., k čemuž se upraví potřebné napětí. Tyto podmínky se udržují po dobu minut, kdy vstoupí vyextrahované bílkoviny do gelu. Pak se proud přeruší, trubičky s gelem se vyjmou z přístroje, zasypávací škrob se z nich odstraní proudem destilované vody ze střičky, potom se trubičky vloží zpět do elektroforetického přístroje, znovu se převrství pomocí injekční stříkačky elektrodovým pufrem, kterým se opět naplní horní nádoba přístroje a přivede se proud v dané polaritě a stálé intenzitě 1,5 ma/trub. Celková doba trvání elektroforézy se určí podle průchodu barevného markeru (methylenové zeleně) tak, že se doba průchodu markeru násobí koeficientem 1,5. Fixace, barvení, odbarvení Po ukončení elektroforézy se přeruší proud, trubičky se vyjmou z přístroje, gely se z trubiček vytěsní mírným tlakem vzduchu (např. pomocí gumového balonku s hadičkou) do připravených skleněných zkumavek s fixačním roztokem, kde se ponechají v klidu 30 minut. Fixační roztok se slije a do zkumavek se nalije barvicí roztok nigrosinu. který přes noc obarví rozdělené bílkovinné složky. Pak se barvicí roztok slije a přebytečné barvivo se z gelu odstraní vodou z vodovodu, která se během 3 hodin celkem 3 vymění Vyhodnocení experimentálních dat Identifikace alel hordeinových lokusů Hrd A, Hrd B, Hrd C, Hrd D, Hrd E, Hrd F a Hrd G se provede podle katalogu hordeinových alelických bloků (Tabulka I., Obrázek 1a-d.). Identifikované alely se potom zapíší pomocí číslic a vytvoří SGE hordeinový alelický vzorec Zhodnocení finanční, časové a kapacitní náročnosti Použití uvedené metody je ve srovnání s metodami elektroforézy v polyakrylamidovém gelu relativně nerizikové z hlediska bezpečnosti práce a finančně méně náročné. Časová, pracovní a kapacitní náročnost je u metod SGE, SDS PAGE a A PAGE shodná. Výsledky elektroforetických analýz 24 jednotlivých zrn (nebo směsných vzorků) mohou být k dispozici za 48 hodin. Odborně nejnáročnější část analýz představuje vlastní vyhodnocení výsledků identifikace alel hordeinových lokusů, které vyžaduje vysoce erudovaného zkušeného odborníka Úskalí metody, nevýhody a omezení pro rutinní využití Úskalím metody může být nedodržení přesného pracovního postupu v jakémkoli kroku (např. příprava gelu, ph pufru, atd.), nevýhodou elektroforézy v trubičkách obecně je obtížná porovnatelnost jednotlivých elektroforeogramů (u uvedené metody je však tato nevýhoda zeslabena genetickou interpretací výsledků) Přednosti metody, možnosti rozšíření Předností metody je její relativní zdravotní nezávadnost a zvláště možnost genetické interpretace získaných výsledků, tj. jejich vyjádření ve formě hordeinového alelického vzorce Seznam literatury Bradová, J., Sýkorová, S., Šašek. A., Černý, J.: Identification of common barley varities by parallel electrophoresis of hordeins and esterases. Rostl. Výroba,47,2001(4): ČSN Pšenice obecná a ječmen - Stanovení odrůdové pravosti a odrůdové čistoty - Část 1: Elektroforéza bílkovin ve škrobovém gelu (SGE). Šašek, A., Bradová, J., Černý, J., Necvetajev, V. P.: A catalogue of ektrophoretic hordein spectra in assortment of winter barley varieties and new varieties. Sci. Agric. Bohemoslov. 22, 1 990,No 1, J. Bradová, S. Sýkorová VÚRV Praha 7

8 Tabulka I.: Charakteristiky hordeinových alelických bloků určených metodou SGE HRD alelický blok Charakteristika, parametry alelických bloků ( počet zón, relativní elektroforetická mobilita zón - REM ),intenzita zabarvení zón ( v závorce ) Etalonová odrůda - nositel alely* A ,0(4)-29,5(2-3)-31,0(5)-35,0(4)-39,0(5) Jarek A ,5(3)-27,0(2)-30,0(4)-31,0(5)- 34,0(1)- 36,0(5)-37,5(5)-42,0(5) Luran A ,0(4)-29,5(2)-31,0(5)-36,5(4) Olbram A A ,5(2)-28,0(4)-29,5(2)-31,0(5)-36,5(4)-40,0(2) Lumar A ,0(3)-30,0(3)-31,0(5)-34,0(5)-35,0(5) Akcent A ,0(3)-31,5(5)-33,0(1)-36,5(5)-37,5(4)-41,5(5)-42,0(5)-48,5(3)-50,5(3)- 53,0(3) Lunet A ,0(3)-31,0(5)-34,5(5)-37,5(4) Calgary A ,0(2)-27,0(3)-30,0(4)-31,0(5)-34,0(5)-35,0(1)-39,0(2) Atribut A ,0(3)-31,0(4)-32,0(5)-35,5(5)-40,0(4)-41,0(5) Jersey A ,0(4)-29,5(3)-31,0(5)-33,5(3)-35,0(4)-36,0(3)-39,0(5) Novum A - N1 25,0(2)-27,0(3)-30,0(4)-31,0(5)-34,0(5)-35,0(1)-39,0(2)-40,0(1)-41,0(2) Malz A - N2 25,0(2)-27,0(3)-30,0(4)-31,0(5)-34,0(5)-35,0(1)-36,0(2)-39,0(2) Stabil B A - N3 28,0(1)-32,0(2)-36,0(5)-39,0(2)-42,5(5) Signal A - N4 26,0(2)-30,0(3)-35,0(5)-37,0(2)-39,0(3)-42,5(5) Orthega B ,0(1)-66,0(3)-69,5(4)-70,0(5) Lunet B ,0(2)-63,5(3)-67,5(2)-69,0(4)-71,0(1)-73,5(2)-74,5(2)-78,5(2) Luran B ,0(1)-66,0(3)-69,5(4)-70,0(5)-75,0(2) Merlot B ,0(1)-66,0(3)-69,5(4)-70,0(5)-85,0(3) Jersey B ,5(4)-61,5(4)-67,5(1)-69,5(2)-72,5(3)-79,5(2)-86,5(4) Viktor B -(17) 60,5(4)-61,5(4)-67,5(3)-69,5(2)-72,5(3)76,5(1)-80,5(1)-86,5(4) Terno B ,0(2)-62,0(5)-66,5(3)-67,5(2)-71,5(2)-75,0(2) Jarek B ,5(2)-66,0(5)-69,0(2)-71,0(2)-80(1) Akcent B - (21) 62,5(1)-66,0(5)-69,0(2)-71,0(2)-80(2) Nelly B ,5(4)-62,0(4)-64,5(1)-67,0(1)-70,5(3)-75,5(2)-79,5(2)-82,5(3) Orbit B ,5(4)-61,5(4)68,0(3)-74,0(3)-83,0(3)-86,0(2) Diplom B ,5(2)-60,5(4)-61,5(4)-65,5(2)-69,5(2)-74,0(4)-77,5(2)-78,5(1)-86,0(2) Lomerit B ,0(3)-61,5(3)-65,0(5)-68,5(3)-72,0(2)-81,5(4) Heris B ,0(3)-61,5(3)-63,0(4)-66,5(3)-70,5(3) Kredit B - N1 60,0(3)-61,5(2)-64,5(3)-68,0(3)-72,0(1) Signal F Novum F ,0(4) Akcent F ,0(3-4) Jersey F ,0(3-4) Diplom C ,0(2) Amulet D ,0(2) Bolina E ,5(2) Pejas G ,5(2) Ladik Vysvětlivky: alela v závorce - alelický blok modifikovaný kvantitativní změnou exprese zabarvení zón(y) N - označení nově definované alely (VÚRV) * - registrované odrůdy zapsané ve Státní odrůdové knize (2006) J. Bradová, S. Sýkorová VÚRV Praha 8

9 Obrázek 1: Popis hordeinových alel získaných metodou SGE (počet pruhů, REM) 1a) Hordeinové alely na lokusu A HRD alely 0 A-2 A-3 A-4 A-5 A-12 A-14 A-18 A-21 A-23 A-32 A-N1 A-N2 A-N3 A-N b) Hordeinové alely na lokusu B B-3 B-5 B-7 B-8 B-17 B-(17) B-19 HRD alely B-21 B-(21) B-25 B-29 B-45 B-47 B-52 B-N1 J. Bradová, S. Sýkorová VÚRV Praha 9

10 1c) Hrdinové alely na lokusu F 1d) *Minoritní hordeinové alely na lokusech C, D, E, G HRD alely Minoritní HRD alely F-1 F-2 F C-1 D-1 E-1 G-1 * alely vyjádřené pouze přítomností či absencí jedné zóny Elektroforetická analýza hordeinů ječmene v zásaditém prostředí SDS (SDS PAGE) Metoda je prováděna podle UPOV: Guidelines for the conduct of tests for distinctness, uniformity and stability. Barley. (Aditional usefull explanation). TG/19/ Potřebné technické vybavení Chemikálie: Akrylamid (speciálně přečištěný pro elektroforézu) Bisakrylamid (speciálně přečištěný pro elektroforézu) Tris(hydroxymethyl)methylamin (TRIS) Dodecylsulfát sodný (SDS) Persíran amonný (APS) 2-merkaptoethanol TEMED (NNN'N' - tetramethylaethylendiamin) Kyselina trichloroctová (TCA) Ledová kyselina octová Glycin Pyronin G Glycerol (d=1,256) Methanol Dimethylformamid (DMF) Coomassie Brilliant Blue R-250 Coomassie Brilliant Blue G-250 J. Bradová, S. Sýkorová VÚRV Praha 10

11 Přístroje: Přístroj pro vertikální elektroforézu, zajišťující udržování konstantní teploty gelů. Doporučená tloušťka gelu ne více než 1.5 mm (např. přístroj pro elektroforézu Pinguin 14xl6 cm OWL) Zdroj stejnosměrného proudu (možnost nastavení jak konstantního proudu, tak i konstantního napětí např. PS 600 Desaga) Chladicí termostat Laboratorní stolní centrifuga Třepačka na barvení a odbarvení gelů Prosvětlovací panel Analytické váhy Laboratorní předvážky Třepačka Vortex Laboratorní digestoř Sklo, laboratorní pomůcky: Laboratorní sklo, skleněné desky pro přípravu gelu (gelové kazety), stativ na nalévání gelu, odměrné nádoby (válce, odměrné baňky), nádoby na fixaci a barvení gelu, plastové centrifugační kyvety 1,5 ml, injekční stříkačka s jehlou, přesná syringe Hamilton, automatická pipeta, osobní ochranné pracovní prostředky - rouška, rukavice! Pracovní postup Roztoky: Extrakční roztok: Zásobní roztok: 6,25 ml 1M TRIS HCl pufr, ph 6,8 ; 12,05 ml destilované vody; 2 g SDS; 10 mg Pyroninu; 10 ml glycerolu. Tento roztok může být skladován 2 měsíce při 4 C. Bezprostředně před použitím se připraví extrakční roztok: 28,33 ml zásobního pufrového roztoku se smísí s 7,91 ml 2-merkaptoethanolu a 15 ml DMF a doplní do 100 ml destilovanou vodou. Tento roztok musí být připravován bezprostředně před použitím a nemůže být skladován. Elektrodový pufr: Zásobní roztok: 141,1 g glycinu, 30,0 g TRIS, 10,0 g SDS doplnit do 1 l destilovanou vodou. Bezprostředně před použitím zředit tento roztok 1 : 9 destilovanou vodou. Zásobní pufrový roztok může být skladován 2 měsíce při pokojové teplotě. Zředěný pufrový roztok by neměl být skladován déle než 1 týden. Hodnota ph pufru musí být blízká 8,3. Zásobní pufrový roztok na dělicí gel (1M TRIS HCl, ph 8,8): 121,14 g TRIS a přibližně 20 ml HCl (d=1,19) doplnit destilovanou vodou do 1l. Tento pufr může být skladován při 4 C 2 měsíce. 10% (w/v) roztok SDS: 10 g SDS rozpustit v destilované vodě a doplnit do 100 ml. Tento roztok může být skladován při 4 C 2 měsíce. Před použitím zamíchat a mírně zahřát, aby došlo k opětnému rozpuštění SDS. 10% (w/v) roztok persíranu sodného: 1 g APS rozpustit v destilované vodě a doplnit do 10 ml. Tento roztok musí být připravován bezprostředně před použitím, nelze jej skladovat. Zásobní roztok akrylamidu (AA): 51,98 g akrylamidu se rozpustí v destilované vodě a doplní na 100 ml. Rukavice, rouška!! Zásobní roztok bisakrylamidu( BIS): 0,3185 g bisakrylamidu se rozpustí v destilované vodě a doplní do 130 ml. Rukavice, rouška!! J. Bradová, S. Sýkorová VÚRV Praha 11

12 Pufr na zaostřovací gel(6,8): 0,25 M Tris-HCl ph 6,8: 3,05 g Tris rozpustit v cca 80 ml dest. vody, přidat 2,1 ml konc. HCl (d=1,19) a doplnit dest. vodu do 100 ml. Tento pufr může být skladován při 4 C 2 měsíce. Zásobní roztok AA a BIS: 30% AA a 0,8 % BIS v dest. vodě, rukavice, rouška!! Fixační roztok: 150 g TCA rozpustit v menším objemu dest. vody a doplnit do 1 l. Rukavice! Barvicí roztoky: I. 0,25 g Coomassie Brilliant Blue G-250 a 0,75 g Coomassie Brilliant Blue R-250, rozpustit a doplnit destilovanou vodou na 100 ml. II. 55 g TCA, 65 ml ledové kyseliny octové, 180 ml methanolu a 25 ml roztoku I. se doplní destilovanou vodou do 1 1. Příprava gelů Podle návodu výrobce se sestaví čisté a suché kazety na gel. Dělicí (hlavní) gel (10% akrylamid, ph 8,8): Příprava dvou ploten gelu o rozměrech 180 x 160 x 1,5 mm: 20 ml zásobního roztoku akrylamidu 26 ml zásobního roztoku bisakrylamidu, 30 ml zásobního gelového pufru na dělicí gel Teplota roztoků by měla být 4 C. Podle zkušenosti není odvzdušnění nutné!! Potom se přidá: 2 ml 10 % persíranu, 0,8 ml 10 % SDS a 40µl TEMEDu. Vše se zamíchá a gelový roztok se potom pečlivě nalije tak, aby se netvořily bubliny, povrch gelů se převrství opatrně destilovanou vodou z injekční stříkačky a gely se nechají polymerovat při pokojové teplotě cca 30 minut. Voda z povrchu gelů se slije, povrch gelů se vysuší proužkem filtračního papíru a nalije se připravený zaostřovací gel. Zaostřovací gel: vlastní modifikace (podle původní metodiky UPOV neměl zaostřovací gel vhodné fyzikální vlastnosti) 6 ml zásobního roztoku AA a BIS 20 ml pufru 6,8 0,4 ml 10% SDS 0,4 ml 10% persíranu amonného 13,2 ml dest. vody 16 µl TEMED Pečlivě se zamíchá a ihned nalije zaostřovací gel na povrch dělicího gelu.vloží se "hřebeny" pro zformování jamek tak, aby se nevytvořily bublinky. Ponechá se polymerovat asi 2 hodiny. Potom se hřebeny pečlivě vyjmou z gelu a jamky se promyjí a poté naplní elektrodovým pufrem a gel je připraven pro nanášení vzorků. Extrakce proteinů Jednotlivá zrna se rozmělní kladívkem (nebo jiným nástrojem). Melivo je smícháno se zředěným extrakčním pufrem ve 3 ml propylenových nebo podobných kyvetkách se zašpičatělým koncem. Poměr meliva/ extrakčnímu pufru je 50mg/0,75ml. Vzorky se extrahují 2 hodiny při pokojové teplotě, několikrát jsou zamíchány na Vortexu, zahřáty na vroucí vodní lázni 10 minut a potom ponechány vychladnout. Kyvety jsou centrifugovány při 18,000 g po dobu 5 minut.podle tloušťky gelu a velikosti jamek může kolísat objem nanášeného extraktu. Dostatečné množství je mezi 10 a 25µl. Vzorky se nanášejí pomocí syringe Hamilton podvrstvením pod pufr v jamkách. J. Bradová, S. Sýkorová VÚRV Praha 12

13 Elektroforéza Elektrodové nádoby se naplní příslušným objemem elektrodového pufru, vychlazeného na 15 C. Po nanesení vzorků do jamek probíhá elektroforéza směrem od katody k anodě (od - k +) při konstantním proudu 8 ma/cm 2, až pyronin projde zaostřovacím gelem a potom při 16 ma/cm 2 gelu (maximální napětí je 300 V) dokud barevný marker nedosáhne konce gelu. Teplota by měla být udržována na 15 C pomocí chladicího termostatu. Fixace, barvení, odbarvení Gelové kazety se vyjmou z nádob, otevřou se a gely se fixují v 250 ml 15 %(w/v) TCA nejméně 30 minut. Gely se omyjí destilovanou vodou a barví se přes noc v 250 ml barvicího roztoku při pokojové teplotě. Odbarvení není obvykle nutné, ale gely by měly být omyty destilovanou vodou před jejich uložením do těsných polyethylenových sáčků Vyhodnocení experimentálních dat Vyhodnocení získaných elektroforeogramů se provádí pomocí odrůd - eta1onů, jejichž alelická sestava je známa (Tabulka II.). Tyto odrůdy - etalony jsou na našem pracovišti k dispozici a jsou nanášeny na každý gel tak, aby mohly být identifikovány příslušné alely hordeinů B, C a D (UPOV TG/l9/l0; Sýkorová, 1999,2000),(Obrázek 2a-c). Identifikované alely se potom zapíší pomocí číslic a vytvoří SDS PAGE hordeinový alelický vzorec Zhodnocení finanční, časové a kapacitní náročnosti Použití uvedené metody SDS PAGE je ve srovnání s metodou SGE mnohem rizikovější z hlediska bezpečnosti práce, roztoky akrylamidu a bis-akrylamidu jsou látky vysoce toxické a karcinogenní. Při manipulaci s nimi musejí být dodržována přísná bezpečnostní opatření, nezbytné je používání OOPP. Uvedené skutečnosti představují nároky na erudici laboratorních pracovníků i na vybavení pracoviště. Z hlediska finančního je SDS PAGE rovněž náročnější než SGE (dražší a více různých chemikálií i dokonalejší přístroje), časová, pracovní a kapacitní náročnost je u obou metod (SGE a SDS PAGE) shodná. Výsledky elektroforetických analýz 30 jednotlivých zrn (nebo směsných vzorků) mohou být k dispozici za 48 hodin. Odborně nejnáročnější část analýz představuje vlastní vyhodnocení výsledků - identifikace alel hordeinových lokusů, které vyžaduje vysoce erudovaného zkušeného odborníka. Pro vyhodnocení je nutno mít k dispozici odrůdy - etalony pro jednotlivé alely Úskalí metody, nevýhody a omezení pro rutinní využití Úskalím metody by mohla být již zmíněná rizikovost používaných chemikálií, kterou lze snížit používáním hotových komerčních roztoků akrylamidu a BIS (odpadá manipulace při navažování), tyto jsou ale nepoměrně dražší než základní chemikálie. Finančně ještě náročnější by bylo použití hotových komerčních gelů, provedení elektroforézy je pak ale podstatně standardnější. Autoři zvolili vlastní metodickou modifikaci při přípravě zaostřovacího gelu, byla zvolena příprava podle metodiky pro SDS PAGE HMW gluteninů vzhledem k tomu, že gel připravený podle původní metodiky UPOV neměl vhodné fyzikální vlastnosti Přednosti metody, možnosti rozšíření Předností metody je genetická interpretace získaných výsledků - tzn. relativní nezávislost na případných metodických odchylkách v hodnotách relativní elektroforetické mobility na jednotlivých gelech. Modifikace elektroforézy v plotnách polyakrylamidového gelu umožňuje velmi dobrou porovnatelnost mezi jednotlivými drahami na jednom gelu a přesné provádění všech metodických kroků může zvýšit standardnost získaných výsledků. J. Bradová, S. Sýkorová VÚRV Praha 13

14 Seznam literatury SDS-PAGE hordeinů podle UPOV (TG/I 9/1 O) Barley/Orge/Gerste, : metodika v angličtině Sýkorová, S.: Alely hordeinových lokusů Hrd-1 ( C), Hrd-2 (B) a Hrd -3(D) zjištěné metodou SDS-P AGE u odrůd ječmene (Hordewn vulgare L.) registrovaných v ČR. Poster. Sbomik přednášek a abstrakta za seminářů č.23 a 24 "Problematika N-Iátek v rostlinných produktech", Kroměříž září l999, řijen 2000, ISBN ,s Sýkorová, S.: Alely hordeinových lokusů HRD - I, HRD- 2 a HRD-3 zjištěné metodou SDS-P AGE u odrůd ječmene (Hordeum vulgare L.) registrovaných v ČR. Chem.Listy 94,2000,742. Tabulka II.: Hordeinové alely odrůd - standardů ječmene (UPOV) Odrůda Hordeinová alela - číslo (REM) Hor-D(3) Hor-C(1) Hor-B(2) Pozn. Aramir 1 (34) 4(66,5+71) 2( ) Jarní Atem 1 (34) 1( ) 1( ) Jarní Athos 1 (34) 4(66,5+71) 2( ) Jarní Baronesse 1 (34) 17( ) Jarní Bonaire 1(34) 3(65+68) 9( ) Jarní Camargue 1(34) 20( ) Jarní Amelia 1(34) 9(69+72) 19(81+100) Jarní Caresse 1(34) 1( ) 15( ) Jarní Caroline 1(34) 1( ) 9( ) Jarní Ditta 1(34) 14( ) Jarní Dragon 1(34) 10(64+66,5) 4( ) Jarní Felicie 1(34) 6(65) 10( ) Jarní Goldspear 1(34) 10(64+66,5) 12( ) Jarní Nomad 1(34) 6(65) 1( ) Jarní Ombelle 1(34) 11 (67+71) 1( ) Jarní Piroline 1(34) 1( ) 5( ) Jarní Regatta 1(34) 2( ) 7( ) Jarní Reseda 1(34) 1( ) 16( ) Jarní Whopie 1(34) 5(61,5+66,5+ 71) 6( ) Jarní Alpha 1(34) 1( ) 6( ) Ozimý Borwina 13(61, ) Criter 2(33) 2( ) 13( ) Ozimý Igri 1(34) 8( ) 8( ) Ozimý Marko 21( ) Ozimý Piaf 3(35) 1( ) 6( ) Ozimý Nejsou k dispozici 4 (Iris) 7(Pamela) 3 (Valerie) 5 (Princesse) 12(Albacete) 11(Sigma) 11(Kendo 18(Albacete) J. Bradová, S. Sýkorová VÚRV Praha 14

15 Obrázek 2.: Popis hordeinových alel získaných metodou SDS PAGE (počet pruhů, REM) (příklad odrůdy Atem s alelami viz tab.ii) Obrázek 2 a.: Lokus Hor-3; D- hordeiny Alela * Pozn.: * - příklad odrůdy (Atem s alelou 1) Obrázek 2 b.: Lokus Hor-1; C- hordeiny Alela * Pozn.: * - příklad odrůdy (Atem s alelou 1) Obrázek 2 c.: Lokus Hor-2; B- hordeiny Alela * Pozn.: * - příklad odrůdy (Atem s alelou 1) J. Bradová, S. Sýkorová VÚRV Praha 15

16 3. 3. Elektroforetická analýza hordeinů ječmene v polyakrylamidovém gelu v kyselém prostředí (A PAGE) Metoda je prováděna podle ČSN Pšenice obecná a ječmen Stanovení odrůdové pravosti a odrůdové čistoty - Část 2: Elektroforéza bílkovin v polyakrylamidovém gelu (A PAGE) Potřebné technické vybavení Chemikálie: Akrylamid (speciálně přečištěný pro elektroforézu) Bisakrylamid (speciálně přečištěný pro elektroforézu) Kyselina askorbová Močovina Síran železnatý TEMED (NNN'N' - tetramethylaethylendiamin) Persíran amonný (APS) 2-chlorethanol 2-merkaptoethanol Kyselina trichloroctová (TCA) Ledová kyselina octová Glycin Pyronin G Glycerol (d=i,256) Ethanol Coomassie Brilliant Blue R-250 Coomassie Brilliant Blue G-250 Přístroje: Přístroj pro vertikální elektroforézu, zajišťující udržování konstantní teploty gelů. Doporučená tloušťka gelu ne více než 1,5 mm. Zdroj stejnosměrného proudu (možnost nastavení jak konstantního proudu, tak i konstantního napětí) Chladicí termostat Laboratorní centrifuga Prosvětlovací panel Analytické váhy Laboratorní předvážky Třepačka Vortex Laboratorní digestoř Sklo, laboratorní pomůcky: Laboratorní sklo, skleněné desky pro přípravu gelu (gelové kazety), stativ na nalévání gelu, odměrné nádoby (válce, odměrné baňky), nádoby na fixaci a barvení gelu, plastové centrifugační kyvety 1,5 ml, injekční stříkačka s jehlou, přesná syringe Hamilton, automatická pipeta, osobní ochranné pracovní prostředky rouška, rukavice!. J. Bradová, S. Sýkorová VÚRV Praha 16

17 Pracovní postup Roztoky: Extrakční roztok: 20ml 2-chlorethanolu, 50mg Pyroninu, 18g močoviny, 1ml 2- merkaptoethanolu - doplnit destilovanou vodou do 100ml. Tento roztok může být skladován 2 měsíce při 4 C. Elektrodový pufr: 4 ml kyseliny octové (ledové); 0,4 g glycinu- doplnit vodou do ml (ph 3,1) Gelový pufr: 20 ml kyseliny octové (ledové); 1,0 g glycinu - doplnit vodou do ml (ph 3,2) 1% persíran amonný: 1g do 10ml dest. vody Fixační a barvící roztok: 100 ml kyseliny trichloroctové doplnit dest.vodou do 1000ml 5g Coomassie Brilliant Blue R-250 a 0,5g Coomassie Brilliant Blue G-250 rozpustit ve 100ml ethanolu Na fixaci a obarvení jednoho gelu 10ml roztoku č.2 doplnit do 200ml roztoku č.1 (lze použít 3 ). 2% glycerol: 20ml glycerolu doplnit dest. vodou do 1000 ml Příprava gelu Podle návodu výrobce se sestaví čisté a suché kazety na gel. Příprava 100ml separačního gelu: 60 ml gelového pufr 10g akrylamidu 0,4g bisakrylamidu 6g močoviny 0,1 g kyseliny askorbové 0,005 g síranu železnatého Teplota roztoků by měla být co nejnižší (blízká 0 C). Rozmíchat a doplnit do 100 ml gelovým pufrem. Potom se přidápostupně 0,3ml TEMEDu a 0,2 ml persíranu amonného, vše se zamíchá a gelový roztok se potom pečlivě nalije do připravených kazet tak, aby se netvořily bubliny. Vloží se "hřebeny" pro zformování jamek a nechá se polymerovat asi 2 hodiny (gel pro elektroforézu lze připravit den předem a uchovat v chladničce do druhého dne). Extrakce proteinů Jednotlivá zrna se rozmělní kladívkem (nebo jiným nástrojem) a přemístí do 1,5ml propylenových kyvet. Přidá se 0,4 ml extrakčního roztoku, obsah se důkladně promíchá na Vortexu a nechá (uzavřený nebo utěsněný) přes noc stát při laboratorní teplotě. Obsah kyvet je centrifugován při 18,000 g po dobu 5ti minut µl extraktu se nanáší pomocí syringe Hamilton podvrstvením pod pufr v gelových jamkách. Elektroforéza Po zpolymerizování se hřeben vytáhne z gelu a jamky pro vzorky se promyjí elektrodovým pufrem a desky se upevní do přístroje. Do jamek v gelu se pomocí Hamiltonky nanese příslušné množství vzorku (podvrstvit opatrně pod pufr) a elektrodové nádoby se naplní vychlazeným elektrodovým pufrem. Aparatura se uzavře víkem a připojí ke zdroji proudu. Elektroforéza běží při konstantním napětí 500 V po dobu dvojnásobku běhu markeru Pyronin G. Je třeba pamatovat na to, že anoda (+) je v tomto systému horní elektrodou, a J. Bradová, S. Sýkorová VÚRV Praha 17

18 podle toho je třeba nastavit polaritu elektrického pole. Teplota by měla být udržována na 10 C pomocí chladicího termostatu. Fixace, barvení, odbarvení Gelové kazety se vyjmou z nádob, otevřou se a gely se vloží do plastikové nádoby obsahující 10 ml 1 % roztoku barviva ve 200 ml 10% kyseliny trichloroctové. Barvíme přes noc. Precipitované barvivo se z povrchu gelu opatrně odstraní štětečkem. Pro zvýšení kontrastu se gel promyje ve vodě. Gely je možné uchovávat v polyetylenových sáčcích při teplotě 4 C několik měsíců bez zhoršení kvality. Gely lze uchovávat v suchém stavu. Sušení gelů Polyakrylamidové gely získané touto metodou lze poměrně jednoduše sušit a poté pohodlně skladovat v usušeném stavu. Postup sušení: Připraví se skleněná deska (rozměry desky musí být větší než velikost výsledného PAGE gelu). Dále je nutno připravit dva obdélníky z celofánu (rozměry 1. obdélníku se rovnají rozměrům skleněné desky; strany 2. obdélníku jsou cca o 2 cm delší než strany skleněné desky). Takto připravený celofán a PAGE gel se ponoří do 2% roztoku glycerolu (cca 2 hodiny). Poté se 1. celofánový obdélník položí na skleněnou desku, na něj se umístí PAGE gel a přikryje se 2. celofánovým obdélníkem. Okraje celofánu se přehnou pod skleněnou desku a plocha se eventuelně vyhladí plastovým válečkem (odstranění vzduchových bublin). Ponechá se sušit při laboratorní teplotě v dostatečné vzdálenosti od zdrojů tepla a světla Vyhodnocení experimentálních dat Identifikace elektroforetických hordeinových spekter se provádí porovnáním s elektroforetickými spektry etalonů jednotlivých odrůd. Přitom se srovnává počet jednotlivých zón (proužků), jejich vzájemná poloha charakterizovaná relativní elektroforetickou mobilitou (REM) a relativní intenzitou zbarvení (RIB). Toto porovnání se provádí vizuálně. K vyhodnocení lze též využít počítačové denzitometrie Zhodnocení finanční, časové a kapacitní náročnosti Použití uvedené metody A PAGE je rizikové z hlediska bezpečnosti práce, roztoky akrylamidu a bis-akrylamidu jsou látky vysoce toxické a karcinogenní. Při manipulaci s nimi musejí být dodržována přísná bezpečnostní opatření, nezbytné je používání OOPP. Uvedené skutečnosti představují nároky na erudici laboratorních pracovníků i na vybavení pracoviště. Z hlediska finančního je A PAGE podobně jako SDS PAGE náročnější (dražší a více různých chemikálií i dokonalejší přístroje), časová, pracovní a kapacitní náročnost je jako u výše uvedených metod (SGE a SDS PAGE) shodná Úskalí metody, nevýhody a omezení pro rutinní využití Úskalím metody by mohla být již zmíněná rizikovost používaných chemikálií, kterou lze snížit používáním hotových komerčních roztoků akrylamidu a BIS (odpadá manipulace při navažování), tyto jsou ale nepoměrně dražší než základní chemikálie. Finančně ještě náročnější by bylo použití hotových komerčních gelů, provedení elektroforézy je pak ale podstatně standardnější. Nevýhodou metody je absence genetické interpretace elektroforetických spekter hordeinů. J. Bradová, S. Sýkorová VÚRV Praha 18

19 Přednosti metody, možnosti rozšíření Standardní referenční metoda, kterou schválila organizace International Seed Testing Association (ISTA,Draper 1987) Předností metody je možnost dlouhodobého skladování a snadné manipulace s usušenými gely. Modifikace elektroforézy v plotnách polyakrylamidového gelu umožňuje velmi dobrou porovnatelnost mezi jednotlivými drahami na jednom gelu a přesné provádění všech metodických kroků může zvýšit standardnost získaných výsledků Seznam literatury Draper,S.R: ISTA variety committee. Report ofthe working group for biochemical test for cultivar identification Seed Sci. Technol., 15, 1987: ČSN Pšenice obecná a ječmen - Stanovení odrůdové pravosti a odrůdové čistoty - Část 2: Elektroforéza bílkovin v polyakrylamidovém gelu (A PAGE) 3.4. Elektroforetická analýza alel esterázových lokusů ječmene Est-1, Est-2, Est-4 a Est- 5 v polyakrylamidovém gelu (PAGE esteráz) Metoda elektroforézy esteráz v 7 denních listech ječmene je prováděna podle Sýkorové a Šaška, 1996 (modifikovaná metoda podle Davise a Jonese) a představuje další možnost, jak rozšířit škálu genetických markerů u odrůd ječmene, jejichž genetický základ je poměrně úzký Potřebné technické vybavení Chemikálie: Akrylamid (speciálně přečištěný pro elektroforézu) Bisakrylamid (speciálně přečištěný pro elektroforézu) Tris(hydroxymethyl)methylamin (TRIS) Persíran amonný (APS) TEMED (NNN'N' - tetramethylaethylendiamin) Ledová kyselina octová Glycin Dimethylformamid (DMF) Riboflavin Sacharoza Glycerol NaH 2 PO 4 Na 2 HPO 4 l-naftylacetát 2- naftylacetát Fast Blue RR Bromfenolová modř J. Bradová, S. Sýkorová VÚRV Praha 19

20 Přístroje: Přístroj pro vertikální elektroforézu, zajišťující udržování konstantní teploty gelů. Doporučená tloušťka gelu ne více než 1.5 mm. (např. OWL Pinguin 14x16 cm) Zdroj stejnosměrného proudu (možnost nastavení jak konstantního proudu, tak i konstantního napětí - např. PS 600 Desaga) Chladicí termostat (např. Frigostat Desaga) Chladnička Chlazená centrifuga (K 24) Magnetická míchačka Prosvětlovací panel Zdroj UV světla (zářivka) Analytické váhy Laboratorní předvážky Laboratorní digestoř Sklo, laboratorní pomůcky: Laboratorní sklo,porcelánové třecí misky s tloučky, skleněné desky pro přípravu gelu (gelové kazety), stativ na nalévání gelu, odměrné nádoby (válce, odměrné baňky), skleněné nádoby na inkubaci gelu, plastové centrifugační kyvety 1,5 ml, injekční stříkačka s jehlou, přesná syringe Hamilton, automatická pipeta, osobní ochranné pracovní prostředky rouška, rukavice! Pracovní postup Roztoky: : Extrakční pufr: 0,1 M Tris - HCl ph 7,5 s 10% glycerolu (2,42 g Tris, 1,125 ml konc.hcl a 20 ml glycerolu) doplnit do 200 ml destilovanou vodou. Elektrodový pufr ph 8,3: 0,025 M Tris a 0,19 M glycin : 3,02 g Tris a 14,2633 g glycinu - doplnit do 1l destilovanou vodou, ph upravit 0,175 ml konc. HCI Gelové roztoky: A: Tris - pufr ph 8,9: Tris 73,2g; TEMED 0,46ml; 13,8ml konc.hcl; dest. voda do 200ml - skladovat v lednici B: Tris - pufr ph 6,7: Tris 2,99g; TEMED 0,2ml; kapek konc.hcl; dest. voda do 50ml - skladovat v lednici C: Akrylamid 56g; BIS - akrylamid 1,468g ; dest. voda do 200ml (koncentrace je 28,73%- neskladovat v lednici) - opatrně manipulovat v rukavicích!! D: Akrylamid l0g; BIS - akrylamid 2,5g ; dest. voda do 100ml (koncentrace je 12,5% - neskladovat v lednici) opatrně manipulovat v rukavicích!! E: Persíran amonný 70mg / 100ml roztoku (voda) - vždy čerstvě! F: Riboflavin: 2mg / 50ml roztoku (voda) - vždy čerstvě! G: Sacharoza 40% : 40g sacharozy a 60ml dest. Vody Fosfátový puft ph 6,4: 9,1g NaH 2 PO 4 a 12,1g Na 2 HPO 4 doplnit do 11 destilovanou vodou (rozpouští se pomalu je možno urychlit mírným zahřátím a intenzivním mícháním na magnetické míchačce) Pufr 0,25 M Tris-HCl ph 6,8: 6,1g Tris a 3,56-4,12ml konc. HCl (podle šarže) doplnit do 200 ml dest. vodou měřit ph pomocí phan papírků Vzorkový pufr: ("sample buffer" - Jones): 10 ml 0,25 M Tris-HCl ph 6,8; 0,9926 g sacharozy; 2 mg bromfenolové modři (lze dlouho skladovat v lednici) J. Bradová, S. Sýkorová VÚRV Praha 20

21 Zastavovací roztok: 7 % kyselina octová: 70 ml ledové kys. octové a 930 ml destilované vody Substráty a kopulační barvivo: na 1 gel: 10 mg l-naftylacetátu + 10 mg 2- naftylacetátu rozpustit v 1 ml dimethylformamidu 100 mg Fast Blue RR rozpustit v 1 ml dimethylformamidu vše vmíchat do 100 ml fosfátového puftu - těsně před detekcí a tak připravit detekční roztok. Příprava gelu Veškerá manipulace v rukavicích! Spodní dělicí gel: A (9 ml), C (18 ml), voda (9 ml), E (36 ml) - smíchat, nalít mezi skleněné desky cca 3 cm pod okraj, opatrně injekční stříkačkou převrstvit vodou a nechat cca 30 minut polymerovat, potom vodu slít a opatrně vysušit povrch gelu filtračním papírem. Horní zaostřovací gel: B (3,5 ml), D (11,2 ml), F (3,5 ml), G (14 ml) - smíchat v uvedeném pořadí, nalít na spodní gel, vložit hřebeny a nechat cca 20 minut polymerovat na UV světle (při míchání gelu chránit před přímým slunečním světlem, jinak zpolymeruje velmi rychle ještě v kádince!), po zpolymerování horního gelu vyjmout hřebeny, promýt jamky injekční stříkačkou s elektrodovýrn pufrem, naplnit jamky el. pufrem, vložit desky s gelem do přístroje a nanést vzorky. Příprava rostlinného materiálu a extrakce enzymů Na navlhčený filtrační papír na Petriho misky se vysadí zrna ječmene (cca 30 ks), misky se zakryjí víčky a zrna se ponechají klíčit na světle za laboratorní teploty 7 dní. Během klíčení je třeba udržovat podklad stále vlhký (ale nepřelít) a pravidelně případně odstraňovat neklíčící zrna nebo zrna napadená plísní. Jakmile se objeví první list, ponechají se misky bez víček a udržuje se stálá vlhkost kořenů. Po 7 dnech se provede extrakce enzymů: první list z každého klíčence ustřihnout, každý zvážit, rozstříhat na malé kousky a ve vychlazené třecí misce rozetřít s l0násobným objemem vychlazeného extrakčního pufru, přenést do malých (1,5 ml) centrifugačních kyvet bez víček - ty vložit do větších (10 ml) kyvet pro centrifugu K 24. Centrifugovat při -4 C 10 minut při ot/min., potom přepipetovat 100µl čirého supernatantu do jamek titrační destičky a přidat 5µl vzorkového pufru. V jamkách promíchat skleněnou tyčinkou a uchovávat v lednici. Elektroforéza Vychladit elektroforetický přístoj pomocí Frigostatu na 2 C (cca 1 hod.). Do jamek v gelu nanést pomocí Hamilton syringe po 30 µl vzorku (podvrstvit opatrně pod pufr), naplnit vychlazeným elektrodovým pufrem vrchní (-) a spodní (+) elektrodový prostor (celkem 600 ml pro aparaturu OWL 14x16), uzavřít víkem a připojit ke zdroji proudu. Nastavit počáteční podmínky elfo: 50 ma a 300 V. Spustit zdroj. Stabilizuje se proud 50 ma. Jakmile markerovací modré čelo projde horním gelem (cca po 30 minutách), zvýšit proud na 75 mastabilizuje se napětí cca 300 V. Elektroforéza probíhá tak dlouho, dokud modré čelo nedoputuje cca 2 cm k dolnímu okraji gelu (cca za 2 hod. 50 min.).vypnout zdroj, vyjmout gel z přístroje a vložit jej do detekčního roztoku. Detekce esterázových alel Veškerá manipulace s detekčním roztokem v rukavicích! Gely ponechat cca minut v detekčním roztoku, mírně nakláněním nádoby promíchávat roztok, chránit před přímým slunečním světlem. Jakmile se objeví hnědé a J. Bradová, S. Sýkorová VÚRV Praha 21

22 červené proužky esteráz, je třeba sledovat postup vybarvování a nenechat je příliš difundovat. Slít detekční roztok, který poměrně rychle tmavne, a přelít gely zastavovacím roztokem, ponechat je v něm cca 20 min. za mírného promíchávání nakláněním, potom slít zastavovací roztok a přelít gely destilovanou vodou. Takto jsou již esterázy ustáleny Vyhodnocení experimentálních dat Vyhodnocení provést na plošném prosvětlovači pomocí publikovaných alel etalonových odrůd, které byly naneseny na gel současně se vzorky (Tabulka III, Obrázky 3a,b ). Osvědčilo se použití odrůd Atlas (Al, Fr, At, Pi); Drost ( Ca,Dr,Nz,Pi) a Rikote ( Pr,Fr,Su, Ri), které mají rozmanitou sestavu esterázových alel (uvedeno v pořadí stoupající mobility: Est1, Est 2, Est 4, Est 5) Zhodnocení finanční, časové a kapacitní náročnosti Uvedená metoda je časově i pracovně náročnější než SGE a SDS PAGE hordeinů vzhledem k tomu, že enzym se extrahuje z listů. Testované materiály musejí mít dostatečnou klíčivost, aby bylo možno získat 7denní zelené listy. Příprava gelů a detekce enzymových alel je poněkud citlivější na dodržení všech metodických podmínek. Podmínkou je přítomnost etalonových spekter z odrůd etalonů na gelu společně se vzorky. Tyto materiály je třeba udržovat a obnovovat. Výhodou metody při vyhodnocování výsledku je genetická interpretace elektroforetických spekter pomocí známých esterázových alel etalonových odrůd Úskalí metody, nevýhody a omezení pro rutinní využití Neklíčivé materiály nemohou být tímto způsobem analyzovány. Roztoky akrylamidu a bisakrylamidu, jakož i detekční roztoky substrátů jsou vysoce toxické, proto je třeba bezpodmínečně používat ochranné pomůcky. Metoda klade vyšší nároky na kvalitu provedení (vyškolení pracovníků). Vyhodnocení výsledků vyžaduje určitou zkušenost Přednosti metody, možnosti rozšíření Výhodou metody při vyhodnocování výsledku je genetická interpretace elektroforetických spekter pomocí známých esterázových alel. Použití metody je vhodné pro případy, kdy zjistíme shodnou sestavu hordeinových lokusů u genotypů, které chceme dále rozlišit - tento další systém může, ale také vždy nemusí znamenat rozšíření polymorfismu genetických markerů Seznam literatury Sýkorová, S. Šašek, A.: Alely esterasových lokusů v souboru českých odrůd jarního a ozimého ječmene obecného (Hordeum vulgare L). Gen. a Šlecht., 32,1996(2): J. Bradová, S. Sýkorová VÚRV Praha 22

23 Tabulka III.: Alely esterázových lokusů stanovené PAGE u odrůd-standardů ječmene setého (Sýkorová, Šašek, 1996) Odrůda Alely esterazových lokusů Est 1 Est 2 Est 4 Est 5 Afghan Af Fr Su Ag Algerian Al Fr At Pi Atlas Al Fr At Pi Betzes Pr Fr Su Pi Bonus Ca Dr At Pi Carlsberg II Ca Fr At Pi CIHo 5888 Pr Fr Su Ri Drost Ca Dr Nz Pi Flynn Ca Fr At Pi Glacier Al Fr At Pi Lyallpur Ca Dr Su null Meloy Ca Un Nz Me New ZZ Al Fr Nz Pi Palmella Blue Ca Pl Nz Ri Rikote Pr Fr Su Ri Sultan Pr Dr Su Pi Tern Ca Fr Su Te Union Beardless Ca Un Nz Me Obrázek 3: Alely esterázových lokusů (Est) (Sýkorová, Šašek, 1996) Obrázek 3a: Est 1, Est 2 a Est 4 + * - * Dr, **Fr, ***Un Est 4- Nz (Drost), Su (Ricote) At (Atlas) Est 2- Dr (Drost), Fr (Ricote), Un (Union Beardless) Est 1- Pr (Ricote), Al (Atlas), Ca (Drost) Pozn.: v závorce název odrůdy, u které se alela vyskytuje J. Bradová, S. Sýkorová VÚRV Praha 23

24 Obrázek 3b: Est 5 Est 5- Te (Tern), Me (Meloy), Pi (Atlas), Ri (Ricote), Ag (Afghan) Pozn.: v závorce název odrůdy, u které se alela vyskytuje 4. Katalog hordeinových alelických bloků a esterázových alel získaných metodami SGE, SDS PAGE a PAGE u registrovaných odrůd jarního a ozimého ječmene Zjištěné sestavy hordeinových a esterázových alel jednotlivých odrůd ječmene vyjádřené v podobě hordeinových a esterázových alelických vzorců jsou přehledně uvedeny v tabulkách IV (jarní) a V (ozimé). Využívání registrovaných odrůd ječmene je spojeno s jejich rychlou identifikací. Význam rychlého a spolehlivého určení odrůd je podmiňován odlišností odrůd v řadě hospodářsky významných vlastností, protože každá odrůda se vyznačuje specifickým souborem vlastností, které rozhodují o jejím využití. Předpokladem využití metody bílkovinných genetických markerů (hordeinů, případně esteráz) pro identifikaci odrůd je jedinečnost a specifičnost elektroforetických spekter každé registrované odrůdy ječmene. Dále je nezbytná znalost případného vnitroodrůdového bílkovinného polymorfismu. V případě polymorfních odrůd je jejich genetická struktura charakterizována počtem bílkovinných linií, a je proto nutné verifikovat a identifikovat tyto odrůdy podle počtu a zastoupení jednotlivých bílkovinných linií, typických pro danou odrůdu. Odrůdy jarního i ozimého ječmene se vyznačují nižším stupněm hordeinového a esterázového polymorfismu, což nepříznivě ovlivňuje identifikaci odrůd pomocí odrůdových elektroforetických spekter. Řada odrůd, resp. linií ječmene, totiž vykazuje v důsledku zmíněného nižšího polymorfismu zcela totožná hordeinová, resp. esterázová spektra a nelze je proto v rámci daného elektroforetického systému rozlišit. Vhodná kombinace výše uvedených metod však umožňuje mnohem přesnější vzájemné rozlišení registrovaných odrůd ječmene, jak je ilustrováno následujícími tabulkami (Tabulky VI až XI) J. Bradová, S. Sýkorová VÚRV Praha 24

25 4. 1. Sestavy hordeinových a esterázových alel odrůd ječmene v podobě hordeinových a esterázových alelických vzorců Tabulka IV. : Hordeinové (SGE; SDS PAGE) a esterázové genetické markery jarních odrůd ječmene setého registrovaných v ČR Odrůda Hordeinové markery Esterázové markery HRD alelické bloky (SGE) HRD alel. bloky (SDS PAGE) Alely esterázových lokusů linie % A B F min. hor. linie % D(3) C(1) B(2) linie % Est-1 Est-2 Est-4 Est-5 Rok reg. USJ A a (16) e1 70 Ca Dr Su Pi Akcent e2 30 Ca Fr Su Pi Amulet A E,C a e1 100 Ca Dr Su Pi Annabell A E,C a e1 100 Ca Fr Su null Atribut A a e1 100 Ca Dr Su null Biatlon A a e1 100 Pr Fr Su Pi Bojos A a e1 100 Ca Fr Su Pi ,7 Bolina A D a e1 100 Pr Fr Su Pi 2004 N Calgary A a e1 100 Ca Fr Su Pi Class A E a e1 100 Ca Fr Su Pi ,9 Diplom A a e1 100 Pr Fr Su null Ditta A a ne 14 e1 100 Pr Dr Su Pi 1996 N Ebson A a e1 100 Ca Fr Su Ri 2002 * Faustina A D a e1 100 Ca Fr Su Ag Forum A 100 N1 8 2 a e1 100 Pr Fr Su Pi Heris A E a e1 100 Pr Fr Su Pi 1998 N Jarek A a e1 100 Ca Fr Su Ri Jersey A a e1 100 Ca Fr Su Pi A a e1 100 Ca Fr Su Te Jubilant B 6 N b Kompakt A a e1 100 Pr Fr Su Pi B b Ladik A G a e1 100 Ca Fr Su Pi 1992 N Lumar A a e1 100 Ca Fr At Ri Madeira A a e1 100 Ca Fr Su Pi J. Bradová, S. Sýkorová VÚRV Praha 25

26 Odrůda Hordeinové markery Esterázové markery HRD alelické bloky (SGE) HRD alel. bloky (SDS PAGE) Alely esterázových lokusů linie % A B F min. hor. linie % D(3) C(1) B(2) linie % Est-1 Est-2 Est-4 Est-5 Rok reg. USJ Madonna A a e1 100 Ca Dr Su Pi Malz A 100 N1 8 2 a e1 100 Pr Fr Su Pi Maridol A 100 N3 N2 1 a e1 100 Ca Fr Su Pi A 60 N1 3 2 a e1 100 Pr Fr Su Pi Nitran B b C D Nordus A a e1 100 Ca Dr Su Pi Novum A a e1 100 Ca Un Nz Pi A G a e1 100 Ca Dr Su Me Olbram B Orbit A a e1 100 Ca Fr At Ri 1986 N Orthega A 100 N a e1 100 Ca Fr At Pi 1999 N Pax A a e1 100 Pr Fr Su Pi 1994 N A a e1 100 ca Fr Su Pi 2003 * Pedant b Pejas A E a e1 100 Ca Fr At Pi 1996 N B Philadephia A a e1 100 Ca Fr Su Pi Prestige A a e1 100 Ca Fr Nz Te Pribina A a e1 100 Ca Fr At Pi 2006 N A a e1 75 Ca Fr Su Ri 1995 N Primus B b e2 25 Ca Fr Su Pi 1995 N Prosa A a e1 100 Ca Fr At Pi 1998 N Radegast A E a e1 100 Ca Un Su Pi/null ,0 Respekt A a e1 100 Pr Fr At Pi Sabel A E a e1 100 Ca Fr Su Pi Saloon A a e1 100 Ca Fr Su null J. Bradová, S. Sýkorová VÚRV Praha 26

27 Odrůda Hordeinové markery Esterázové markery HRD alelické bloky (SGE) HRD alel. bloky (SDS PAGE) Alely esterázových lokusů linie % A B F min. hor. linie % D(3) C(1) B(2) linie % Est-1 Est-2 Est-4 Est-5 Rok reg. USJ A D a e1 100 Pr Fr Su Pi Scarllet B b C 17 N1 8 2 D Sebastian A a e1 100 Ca Un Su Pi/null ,2 Signal A 100 N3 N2 1 a e1 100 Ca Fr At Pi 1996 N A G a n e1 100 Ca Dr Su Ri Sladko B E,G b A a e1 80 Ca Fr At Pi Stabil B 17 N e2 20 Ca Dr Su Ri Terno A (17) 2 a e1 100 Ca Fr Su Pi B 25 2 (17) 2 b Timory A E a e1 100 Ca Fr Su Pi ,2 Tolar A a e1 100 Ca Fr Su Pi Viktor A a e1 85 Ca Fr At Pi 1994 N B E e2 15 Ca Fr Su Pi Vysvětlivky: tučně vyznačené - polymorfní odrůdy (víceliniové) alela v závorce - alelický blok modifikovaný kvantitativní změnou exprese zabarvení zón(y) velká písmena - SGE hordeinová linie malá písmena - SDS PAGE hordeinová linie e1,e2 - esterázová linie C,D,E,G (sloupec 7)- minoritní hordeinové složky n-dosud nekatalogizovaný alelický blok (SDS PAGE) USJ- ukazatel sladařské jakosti (9 nejvyšší, 1 nejnižší) * bez ověření užitné hodnoty (ÚKZÚZ) N-nesladovnická jakost J. Bradová, S. Sýkorová VÚRV Praha 27

28 Tabulka V. Hordeinové (SGE; SDS PAGE) a esterázové genetické markery ozimých odrůd ječmene registrovaných v ČR v r Hordeinové markery Esterázové markery Odrůda HRD alelické bloky (SGE) HRD alel. Bloky (SDS PAGE) Alely esterázových lokusů Rok reg. USJ linie A B F Min. hor. Linie D(3) C(1) B(2) linie Est-1 Est-2 Est-4 Est-5 šestiřadý ječmen Alissa A a e1 Pr Fr Su null 2001 * Amarena A a e1 Pr Fr Su Ag 2006 N Angela A E a e1 Ca Fr Su null 2001 * Campill A a e1 Pr Fr Su null 2005 * Carola A a e1 Ca Fr At null 2001 * Gilberta A a e1 Pr Fr Su null 2006 N Lomerit A a e1 Ca Fr At null 2002 * Lunet A a e1 Ca Fr Su Pi 1990 * Luran A a e1 Pr Fr Su null 1998 * Luxor A a e1 Pr Fr Su null 1996 * Merlot A a e1 Pr Fr Su null 2002 * Nelly A a e1 Pr Fr Su null 2001 * Nives A a e1 Ca Fr Su null 2005 * Okal A a e1 Pr Fr Su null 1992 * Silke A a e1 Pr Fr Su null 1999 * Traminer A 2 21 (1) a e1 Pr Fr At null 2003 * J. Bradová, S. Sýkorová VÚRV Praha 28

29 Hordeinové markery Esterázové markery Odrůda HRD alelické bloky (SGE) HRD alel. Bloky (SDS PAGE) Alely esterázových lokusů Rok reg. USJ linie A B F Min. hor. Linie D(3) C(1) B(2) linie Est-1 Est-2 Est-4 Est-5 dvouřadý ječmen Babylone A a e1 Pr Fr Su Pi 1997 N Camera A a e1 Ca Fr At Pi 2001 N Duet A a e1 Pr Fr Su Pi 1999 N Graciosa A a e1 Ca Fr Su Pi 2006 N Jolante A a e1 Ca Fr Su Pi 1999 N Mascara A a e1 Pr Fr Su Pi 2006 N Monaco A a e1 Ca Dr Su Pi 1995 N Premuda A a e1 Pr Fr Su Pi/null 2005 N Reni A a e1 Ca Fr Su null 2001 N Tifanny A a e1 Pr Fr Su Pi Vilna A a e1 Ca Fr Su null 2001 N Vysvětlivky: alela v závorce - alelický blok modifikovaný kvantitativní změnou exprese zabarvení zón(y) velká písmena - SGE hordeinová linie malá písmena - SDS PAGE hordeinová linie e1 - esterázová linie E (sloupec 6)- minoritní hordeinová složka USJ- ukazatel sladařské jakosti (9 nejvyšší, 1 nejnižší) * bez ověření užitné hodnoty (ÚKZÚZ) N-nesladovnický J. Bradová, S. Sýkorová VÚRV Praha 29

30 Tabulka VI.: Skupiny hordeinově identických elektroforetických spekter odrůd ječmene jarního získaných metodou SGE Skupina HRD alelické bloky zon na lokusech A,B,F Odrůdy, případně HRD linie Kompakt B, Nitran B D Nitran C Respekt, Scarlett B D Scarlett A, Faustina, Bolina Prestige, Terno B, Class Viktor A, Pedant E Viktor B, Annabell Ebson, Jarek, Kompakt A, Pax, Prosa, Tolar Primus B Sabel Pejas B, Stabil A, Pribina E Heris, Pejas A, Radegast G Olbram A Olbram B Lumar Akcent G Sladko A E,G Sladko B C,E Amulet (3) Calgery Scarlett D Terno A Atribut, Orbit, Primus A Jersey Sebastian G Ladik Krona, Madonna, Nordus, Biaton, Diplom, Jubilant B, Madeira, Philadephia, Saloon, Bojos Novum Ditta 30 N Nitran A 31 N Forum, Malz, Scarlett C 32 N Jubilant A 33 N Stabil B 34 N3 - N2-1 Maridol, Signal 35 N Orthega J. Bradová, S. Sýkorová VÚRV Praha 30

31 Tabulka VII. Skupiny hordeinově identických elektroforetických spekter odrůd ječmene jarního získaných metodou SDS PAGE Skupina HRD alelické bloky zon na lokusech D,C,B Odrůdy, případně HRD linie Annabell, Viktor, Nitran a Prestige Pejas arod, Jarek, Kompakt a, Prosa, Tolar,Nitranb, Pedant-b Novum Heris, Jersey Kompakt- b Pax Terno- a Primus a, Scarllet- b, Bolina Olbram Scarllet a, Stabil Krona, Madonna Sabel, Saloon Respekt Ladik Lumar, Pedant-a Amulet, Malz Akcent, Sladko- b N Sladko- a Terno- b Atribut, Jubilant-a, Orbit, Primus- b Forum Jubilant- b 25 1 N - 14 Ditta Nordus arodil, Orthega Madeira Signal Philadelphia Diplom J. Bradová, S. Sýkorová VÚRV Praha 31

32 Tabulka VIII. Skupiny esterázově identických elektroforetických spekter odrůd ječmene jarního Skupina Alely ester. lokusů Est1 Est2 Est4 Est5 Odrůdy, případně est. linie 1 Ca Dr Su Pi Akcent-e1, Amulet, Madonna, Nordus, 2 Ca Dr Su null Atribut 3 Ca Dr Su Me Olbram 4 Ca Dr Su Ri Sladko, Stabil- e2 5 Ca Fr Su Pi Akcent-e2, Krona, Jersey, Ladik, Madeira, Maridol, Philadephia, Primus-e2, Sabel, Terno, Tolar, Viktor-e2, Pedant, Bojos, Class 6 Ca Fr At Pi Orthega, Pejas, Prosa, Signal, Stabil-e1, Viktor -e1, Pribina 7 Ca Fr At Ri Lumar, Orbit 8 Ca Fr Su Ri Ebson, Jarek, Primus-e1 9 Ca Fr Su Te Jubilant 10 Ca Fr Su null Annabell, Saloon 11 Ca Fr Su Ag Faustina 12 Ca Fr Nz Te Prestige 13 Ca Un Su Pi Radegast, Sebastian 14 Ca Un Nz Pi Novum 15 Pr Dr Su Pi Ditta 16 Pr Fr Su Pi Forum, Heris, Kompakt, Pax, Biaton, Calgery, Malz, Scarlett, Bolina, Nitran 17 Pr Fr At Pi Respekt 18 Pr Fr Su null Diplom Tabulka IX. Skupiny hordeinově identických elektroforetických spekter odrůd ječmene ozimého(sge) Skupina HRD alelické bloky zon Odrůdy, případně HRDlinie Angela, Gilberta, Mascara Nelly, Traminer Camera, Monako, Tifanny, (45) - 3 Lomerit Luran, Luxor, Marna, Okal, Reni, Vilna, Campill Nives Lunet Alissa, Babylone, Carola, Duet, Silke, Amarena, Graciosa, premisa Jolante Merlot J. Bradová, S. Sýkorová VÚRV Praha 32

33 Tabulka X. Skupiny hordeinově identických elektroforetických spekter odrůd ječmene ozimého (SDS PAGE) Skupina HRD (SDS PAGE) alelické bloky zon na lokusech D,C,B Odrůdy Alissa, Silke Mascara Nelly Duet Premuda Amarena, Graciosa Monako, Camera Jolante Luran, Luxor, Okal, Reni Babylone,Tifanny Vilna Lunet Angela, Lomerit Nives Gilberta Carola, Merlot, Traminer Campill Tabulka XI. Skupiny esterázově identických elektroforetických spekter odrůd ječmene ozimého Skupina Alely esterázových lokusů Odrůdy, případně est. linie Est1 Est2 Est4 Est5 1 Ca Dr Su Pi Monako 2 Ca Dr Su Te Marna 3 Ca Fr At null Carola, Lomerit,Traminer 4 Ca Fr At Pi Camera 5 Ca Fr Su Pi Lunet, Jolante, Graciosa 6 Ca Fr Su null Angela, Reni, Vilna, Nives 7 Pr Fr Su Ag Amarena 8 Pr Fr Su Pi Tifanny,Babylone, Duet, Mascara, Premuda 9 Pr Fr Su null Alissa, Luran, Luxor, Merlot, Nelly, Okal, Silke, Campill, Gilberta J. Bradová, S. Sýkorová VÚRV Praha 33

34 Optimalizace metod elektroforézy proteinů pro identifikaci odrůd ječmene Příklad výsledku SDS PAGE hordeinů odrůd ječmene nově registrovaných v roce 2006 Obrázek 4: Příklad výsledku SDS PAGE hordeinů odrůd ječmene nově registrovaných v roce SDS PAGE hordeinů (UPOV) elfo /1 1-5 Mascara; 6 Felície; 7 Nomad; 8 Ombelle; 9-13 Pribina; Gilberta SDS PAGE hordeinů (UPOV) elfo /2 1-5 Graciosa; 6 Igri; 7 Criter; 8 Reseda; 9-10 Gilberta; Amarena Tučně vyznačené - etalonové odrůdy J. Bradová, S. Sýkorová VÚRV Praha 34

35 4. 3. Příklad výsledku PAGE esteráz odrůd ječmene nově registrovaných v roce 2006 Obrázek 5: Příklad výsledku PAGE esteráz odrůd ječmene nově registrovaných v roce Amarena (Pr Fr Su Ag); 5,6, 10,11,12 - Gilberta (Pr Fr Su null); 7 Atlas (Al Fr At Pi); 8 Drost (Ca Dr Nz Pi); 9 Respekt (Pr Fr Su Pi) ; Maskara (Pr Fr Su Pi) ,2 Maskara (Pr Fr Su Pi) ; 3-6,10 Pribina (Ca Fr At Pi); 7 Atlas (Al Fr At Pi); 8 Drost (Ca Dr Nz Pi); 9 Respekt (Pr Fr Su Pi); Graciosa (Ca Fr Su Pi) tučně jsou vyznačeny etalonové odrůdy J. Bradová, S. Sýkorová VÚRV Praha 35