QIAamp Viral RNA Mini uživatelská příručka

Transkript

1 Čtvrté vydání Listopad 2016 QIAamp Viral RNA Mini uživatelská příručka Pro purifikaci virové RNA z plazmy, séra, bezbuněčných tělních tekutin a supernatantu buněčných kultur Sample & Assay Technologies

2 QIAGEN Technologie vzorků a testů QIAGEN je předním poskytovatelem inovativních technologií pro vzorky a testy umožňující izolaci a detekci obsahu biologického vzorku. Naše moderní, vysoce kvalitní produkty a služby zajišťují úspěch od vzorku po výsledek. QIAGEN stanovuje standardy v: Purifikaci DNA, RNA a proteinů Testech nukleových kyselin a proteinů Výzkumu microrna a RNAi Technologiích automatizace izolace vzorků a testů Naším posláním je umožnit vám dosáhnout vynikajících výsledků a objevů. Pro více informací navštivte

3 Obsah Obsah soupravy 4 Skladování 4 Účel použití 5 Bezpečnostní informace 5 Kontrola kvality 5 Úvod 6 Princip 6 Procedura 6 Kontaminace buněčnou DNA 8 Varování a bezpečnostní opatření 9 Objemy vzorků 9 Lýze 9 Carrier RNA 10 Přidávání interní kontroly 10 Spin a vakuový protokol 11 Automatická purifikace virové RNA na přístroji QIAcube 11 Stanovení výtěžku 11 Stanovení délky virové RNA 11 Požadované materiály, které nejsou součástí dodávky 13 Důležité poznámky 14 Příprava činidel 14 Zacházení s kolonkami QIAamp Mini 17 Pokyny pro manipulaci s QIAvac 24 Plus 18 Centrifugace 21 Protokoly Purifikace virové RNA (Spin protokol) 22 Purifikace virové RNA (Vakuový protokol) 25 Koncentrace vzorku 29 Purifikace buněčné, bakteriální, nebo virové DNA z moče 30 Příručka řešení problémů 31 Příloha 35 Objednací informace 37 QIAamp Viral RNA Mini Uživatelská příručka 11/2016 3

4 Obsah soupravy QIAamp Viral RNA Kit (50) (250) Katalogové číslo Počet izolací Kolonky QIAamp Mini Spin Sběrné zkumavky (2 ml) Pufr AVL* 31 ml 5 x 31 ml Pufr AW1* (koncentrát) 19 ml 98 ml Pufr AW2 (koncentrát) 13 ml 66 ml Pufr AVE 3 x 2 ml 10 x 2 ml Carrier RNA (poly A) 310 µg 5 x 310 µg Průvodce výběrem 1 1 * Obsahuje chaotropické soli, které jsou dráždivé. Není kompatibilní s dezinfekčními činidly obsahující bělidlo, viz strana 5 bezpečnostní upozornění. Obsahuje azid sodný jako protektant. Skladování Kolonky QIAamp Mini spin by měly být skladovány suché, při pokojové teplotě (15 25 C); vyvarujte se skladování při vyšších teplotách. Všechny roztoky by měly být skladovány při pokojové teplotě, pokud není uvedeno jinak. Kolonky QIAamp Mini spin a všechny pufry a činidla mohou být skladovány za těchto podmínek do data expirace uvedeného na krabici soupravy bez jakéhokoliv snížení výkonu soupravy. Lyofilizovaná carrier RNA může být skladována při pokojové teplotě do data expirace uvedeného na krabici soupravy. Carrier RNA by měla být rozpuštěna v pufru AVE; rozpuštěná carrier RNA by měla být okamžitě přidána do pufru AVL, tak jak je popsáno na straně 14. Tento roztok by měl být připraven vždy čerstvý. Roztok je stabilní při 2 8 C po dobu až 48 h. Pufr AVL carrier RNA vytváří sraženiny při teplotách 2 8 C, které musejí být před použitím rozpuštěny zahřátím na 80 C. Nepoužitý zbytek carrier RNA rozpuštěné v pufru AVE by měl být zamrazen v alikvotech při 30 až 15 C. Nezamrazujte a nerozpouštějte alikvoty carrier RNA více než 3 krát. NEZAHŘÍVEJTE roztok pufru AVL carrier RNA více než 6 krát. NEINKUBUJTE při 80 C více než 5 minut. Časté zahřívání a prodloužená doba inkubace způsobí degradaci carrier RNA, vedoucí ke snížení zisku virové RNA a eventuelně k falešně negativním výsledkům při RT-PCR, zejména při použití vzorků s nízkými titry. 4 QIAamp Viral RNA Mini Uživatelská příručka 11/2016

5 Účel použití QIAamp Viral RNA Mini Kit je určen pro molekulárně-biologické aplikace. Tento produkt není určen pro diagnostiku, prevenci, nebo léčbu onemocnění. Věnujte péči a pozornost zacházení s produktem. Doporučujeme všem uživatelům QIAGEN produktů dodržovat pokyny NIH, které byly vytvořeny pro experiment s rekombinantní DNA, nebo jiná platná doporučení. Bezpečnostní informace Při práci s chemikáliemi používejty vždy vhodný laboratorní plášť, jednorázové rukavice a ochranné brýle. Pro více informací se prosím obraťte na příslušné bezpečnostní listy (SDSs). Ty jsou dostupné online v pohodlném a kompaktním formátu PDF na kde můžete najít, zhlédnout a vytisknout SDS pro každou QIAGEN soupravu a každou součást souprav. Pufry AVL a AW1 obsahují guanidinové soli, které mohou v kombinaci s bělidlem tvořit vysoce reaktivní sloučeniny. Jestliže rozlitá kapalina obsahuje tyto pufry, ukliďte ji vhodným laboratorním detergentem a vodou. Jestliže rozlitá kapalina obsahuje potenciálně infekční agens, ukliďte dotčenou oblast nejprve laboratorním detergentem a vodou a následně 1% (v/v) chlornanem sodným. Kontrola kvality V souladu s QIAGEN s ISO-certified Quality Management System, každá šarže QIAamp Viral RNA Mini Kit je testována proti předem stanoveným specifikacím k zajištění konzistentní kvality produktu. QIAamp Viral RNA Mini Uživatelská příručka 11/2016 5

6 Úvod Věnujte prosím několik okamžiků pečlivému čtení uživatelské příručky před zahájením vaší preparace. Důležitá upozornění na straně 14 a připomínky k QIAamp Viral RNA Mini protokolům začínají na straně 22, které jsou zvláště cenné. Princip Soupravy QIAamp Viral RNA Mini Kit poskytují nejrychlejší a nejsnadnější způsob purifikace virové RNA pro spolehlivé použití s amplifikačními technologiemi. Virová RNA může být purifikována z plazmy (ošetřené antikoagulancii, nikoliv však heparinem), séra a ostatních bezbuněčných tekutin. Vzorlky mohou být čerstvé, nebo zmrazené. V případě, že jsou zmrazené, neměly by být rozmrazené vice než jednou. Opakované zmrazování a tání vzorků plazmy vede ke sníženému virovému titru. Toho je nutné se vyvarovat pro zajištění optimální sensitivity. Kryoprecipitáty se hromadí, jestliže se vzorky opakovaně zmrazují a rozmrazují. To může vest k zanesení QIAamp membrány, při použití vakuového protokolu. Soupravy QIAamp Viral RNA Mini Kit jsou pro obecné použití a mohou být použity pro izolaci virové RNA z celé řady virů. Nicméně optimální výkon nelze zaručit pro každý virus. Procedura Soupravy QIAamp Viral RNA Mini Kit představují dobře zavedenou technologii pro všeobecné použití preparace virové RNA. Souprava kombinuje selektivní vazné vlastnosti silikátové membrány s rychlostí microspin nebo vakuové technologie. Tyto soupravy jsou vhodné především pro simultální zpracování více vzorků. QIAamp Viral RNA spin protokoly mohou být plně automatizovány na přístroji QIAcube. Vzorek je nejprve lyzován při vysoce denaturujících podmínkách za účelem inaktivace RNáz a pro zajištění izolace intaktní virové RNA. Pufrovací podmínky jsou poté upraveny tak, aby poskytovaly optimální navázání RNA na QIAamp membránu, potom co je vzorek umístěn do QIAamp Mini spin kolonky. RNA se váže na membránu a kontaminanty jsou účinně vymyty ve dvou krocích, použitím dvou různých promývacích pufrů. Vysoce kvalitní RNA je elulována ve speciálním RNase-free pufru, který je připraven k okamžitému použití nebo ke skladování. Purifikovaná RNA neobsahuje žádné proteiny, nukleázy a ostatní kontaminanty a inhibitory. Speciální QIAamp membrána garantuje extrémě vysokou výtěžnost čisté intaktní RNA za pouhých dvacet minut bez použití fenol/chloroformové extrakce nebo alkoholové precipitace. Všechny pufry a činidla mají garanci, že jsou bez RNáz. 6 QIAamp Viral RNA Mini Uživatelská příručka 11/2016

7 Plně automatizovatelné na QIAcube QIAamp Viral RNA Mini Spin Procedura QIAamp Viral RNA Mini Vacuum Procedura Vzorek Vzorek Lýze Navázání Promývání (Pufr AW1) Promývání (Pufr AW2) Eluce Čistá virová nukleová kyselina QIAamp Viral RNA Mini Uživatelská příručka 11/2016 7

8 Adsorpce na QIAamp membránu Pufrovací podmínky lyzátu se musí upravit před umístěním do kolonky QIAamp Mini tak, aby nastily optimální vazebné podmínky pro virovou RNA. Virová RNA je adsorbována na QIAamp silikátovou membránu během dvou krátkých centrifugačních kroků nebo v průběhu vákua. Sůl a podmínky ph v lyzátu zajistí, že proteiny a ostatní kontaminanty, které mohou inhibovat následující enzymatické reakce, nezůstanou navázány na QIAamp membráně. Jestliže je počáteční objem větší než 140 µl, je nutné plnit lyzátem kolonku QIAamp Mini v několika krocích. Odstranění zbytkových kontaminantů Virová RNA navázaná na QIAamp membránu se promyje a zbaví nečistot během dvou krátkých centrifugačních kroků, případně během vakuových kroků. Použitím dvou odlišných promývacích pufrů AW1 a AW2 se významně zlepšuje čistota elulované RNA. Optimalizované promývací podmínky zajistí kompletní odstranění jakýchkoliv reziduálních kontaminantů bez ovlivnění navázané RNA. Eluce pufrem AVE Pufr AVE je RNase-free voda, která obsahuje 0.04% azid sodný, který zabraňuje růstu mikroorganizmů a následné kontaminaci RNázami. Azid sodný ovlivňuje spektrofotometrickou absorbanci v rozsahu mezi 220 a 280 nm, ale nemá žádný efekt na následující aplikace jako je například RT-PCR. Pokud si přejete stanovit čistotu elulované RNA, doporučujeme eluci pomocí RNase-free vody namísto pufru AVE. Kontaminace buněčnou DNA Souprava QIAamp Viral RNA Mini Kit není navržena tak, aby separovala virovou RNA od buněčné DNA. Pokud jsou tyto nukleové kyseliny přítomny ve vzorku, purifikují se společně. Aby se zabránilo kopurifikaci buněčné DNA, doporučujeme pro preparaci virové RNA používat bezbuněčné tělní tekutiny. Vzorky obsahující buňky, například mozkomíšní mok, kostní dřeň, moč a většina odběrových tampónů, by měly být nejprve filtrovány nebo centrifugovány po dobu 10 minut p ř i 1500 x g. K purifikaci by měl být pak použit pouze supernatant. Jestliže je RNA a DNA izolována pralelně, elulát může být ošetřen enzymem DNázy. DNáza musí být RNase-free, přičemž tepelná inaktivace DNázy se provádí inkubací (15 min, 70 C). 8 QIAamp Viral RNA Mini Uživatelská příručka 11/2016

9 Upozornění a opatření RNA je extrémně senzitivní k RNázám a tudíž by měla být vždy připravována s náležitou péčí. Ruce a prachové částice mohou nést bakterie a plísně, které jsou nejčastějším zdrojem kontaminací RNázami. Prosím, přečtěte si před zahájením procesu Manipulace s RNA, v příloze (strana 35) této uživatelské příručky. PCR by měla být vždy prováděna se správnou laboratorní praxí. PCR laboratoř by měla vždy být rozdělena do tří zón: zóna přípravy činidel, zóna preparace vzorku a zóna amplifikace a detekce vzorku. Díky vysoké senzitivitě PCR je absolutně nezbytné, aby zbylá činidla zůstala čistá a nekontaminovaná. Činidla by měla být pravidelně opatrně kontrolována. Kontaminovaná činidla musejí být zlikvidována. Objemy vzorků Kolonky QIAamp Mini mohou navázat RNA delší než 200 nukleotidů. Aktuální výtěžek bude záviset na objemu vzorku, skladování vzorku a na virovém titru. Procedura je optimalizována pro objem 140 µl vzorku. Na druhou stranu mohou být použity vzorky až do objemu 280 µl. Malé objemy vzorků, před naplněním kolonky, by měly být nastaveny na objem 140 µl pomocí fyziologického roztoku pufrovaného fosfátem (PBS). Vzorky s nízkým virovým titrem by měly být zakoncentrovány, před zahájením procesu, do 140 µl. Pro větší vzorky než 140 µl se množství lyzačního pufru a ostatních činidel, ve vztahu ke vzorku, musí proporčně zvýšit. Na druhou stranu množství promývacích pufrů AW1 a AW2 není obvykle nutné zvyšovat. Jestliže je zvýšen počáteční objem, aplikace lyzovaného vzorku na kolonku QIAamp Mini bude vyžadovat opakování. Není zde nebezpečí přeplnění kolonky QIAamp Mini a ani nedojde k ovlivnění kvality RNA. Pro objemy větší než 560 µl je doporučeno zakoncentrování vzorků. Viz Protokol: Zakoncentrování vzorku, strana 29. Lýze Vzorek je nejprve lyzován při vysoce denaturujících podmínkách pomocí pufru AVL. Dochází k inaktivaci RNáz, aby byla zajištěna izolace intaktní virové RNA. Carrier RNA, přidaná do pufru AVL, zlepšuje navázání virové RNA na QIAamp memránu, zejména jedná-li se o vzorek s nízkým titrem, což je limitující v případě zbytkové RNázové aktivity, kdy může ocházet k degradaci virové RNA. QIAamp Viral RNA Mini Uživatelská příručka 11/2016 9

10 Carrier RNA Carrier RNA slouží dvěma účelům. Prvním z nich je zvýšení schopnosti navázání virových nukleových kyselin na membránu QIAamp Mini, zejména v případě existujeli velmi málo cílových molekul ve vzorku. Druhým účelem přidání velkého množství carrier RNA je snížení pravděpodobnosti degradace virové RNA. Ve vzácných případech molekuly RNáz mohou uniknout denaturaci chaotropických solí a detergentů, které jsou součástí pufru AVL. Jestliže není carrier RNA přidána do pufru AVL, může to vést ke sníženému výtěžku RNA. Množství dodávané lyofilizované carrier RNA je dostatečné pro objem pufru AVL dodávaného v soupravě. Koncentrace carrier RNA byla upravena tak, aby souprava QIAamp Viral RNA Mini Kit mohla být použita jako generický purifikační systém kompatibilní s mnoha různými amplifikačními systémy a byla vhodná pro širokou škálu RNA virů. Různé amplifikační systémy mají různou účinnost. Ta je závislá na celkovém množství nukleových kyselin přítomných ve vzorku. Eluáty z této soupravy obsahují jak virové nukleové kyseliny, tak i carrier RNA. Množství carrier RNA je výrazně větší než množství nukleových kyselin. Výpočty, jaké množství eluátu je nutné přidat do následných aplikací, by měly být založeny na tom, jaké množství carrier RNA bylo přidáno. Pro získ nejvyšší senzitivity při amplifikačních reakcích může být žádoucí upravení množství carrier RNA přidané do pufru AVL. Přidání interních kontrol Používání QIAamp Viral RNA Mini protokolů v kombinaci s komerčně dostupnými amplifikačnímu systémy může vyžadovat zavedení interní kontroly do purifikačního procesu. Interní kontrola RNA nebo DNA může být přidána společně s carrier RNA, lyzačního pufru. Pro optimální účinnost purifikace by měly být molekuly interní kontroly delší než 200 nukleotidů. Menší molekuly nejsou dostatečně účinné. Za účelem stanovení optimální koncentrace se řiďte pokyny výrobce. V případě použití jiné koncentrace než té, kterou doporučuje výrobce, lze předpokládat sníženou účinnost amplifikace. 10 QIAamp Viral RNA Mini Uživatelská příručka 11/2016

11 Procedura Spin a vakuová procedura QIAamp Viral RNA Mini purifikační procedura se provádí ve třech krocích, při použití kolonek QIAamp Mini ve standardní mikrocentrifuze, na vakuovém manifoldu, nebo na přístroji QIAcube. Procedury jsou navrženy tak, aby nedošlo ke vzájemné křížové kontaminaci vzorků a aby umožnily bezpečné zacházení s potenciálně infekčními vzorky. Kolonky QIAamp Mini zapadají do většiny standardních mikrocentrifugačních zkumavek. Ve spin protokolu, vzhledem k objemu filtrátu, jsou 2 ml sběrné zkumavky (jsou dodávány) nezbytné pro kolonky QIAamp Mini během procesu plnění a promývání. Pro vakuový protokol je nutný vakuový manifold (QIAvac 24 Plus nebo ekvivalentní viz strana 18) a vakuová pumpa, která je schopna vytvořit vakuum od -800 do -900 mbar (např. Vacuum Pump). Elulovaná RNA může být umístěna ve standardní 1,5 ml mikrocentrifugační zkumavce (není součástí balení). Tyto zkumavky musejí být RNase-free, aby se zabránilo degradaci RNA RNázami. Automatická purifikace virové RNA na přístroji QIAcube Purifikace virové RNA při použití soupravy QIAamp Viral RNA Mini Kit může být plně automatizovaná na přístroji QIAcube. Inovativní QIAcube používá pokročilou technologii pro zpracování QIAGEN spin kolonek umožnující bezproblémovou integraci automatizace s nízkou propustností vzorků ve vaší laboratoři. QIAcube provádí identické kroky jako při manuální proceduře (lýze, navázání, promývání a eluce). To vám umožní pokračovat v používání soupravy QIAamp Viral RNA Mini Kit pro purifikaci vysoce kvalitní virové RNA. Přístroj QIAcube má předinstalované protokoly pro purifikaci plazmidové DNA, genomické DNA, RNA, virových nukleových kyselin a protinů. Navíc obsahuje protokoly pro přečištění DNA a RNA. Nabídka dostupných protokolů se neustále rozrůstá. Další QIAGEN protokoly lze zdarma stáhnout na Podrobné protokoly pro použití soupravy QIAamp Viral RNA Mini Kit na přístroji QIAcube jsou dodávány společně s přístrojem QIAcube. Stanovení výtěžku Výtěžek virové RNA, izolované z biologických vzorků, je obvykle menší než 1 µg a je tedy složité ho fotometricky určit. Mějte na paměti, že carrier RNA (5,6 µg na 140 µl vzorku) bude tvořit většinu přítomné RNA. Kvantitativní RT-PCR je doporučenou metodou stanovení výtěžku virové RNA. QIAamp Viral RNA Mini Uživatelská příručka 11/

12 Určení délky virové RNA Distribuce velikosti virové RNA purifikované kolonkami QIAamp spin může být zkontrolována denaturační elektroforézou na agarózovém gelu, následovanou hybridizací s virus-specifickými sondami a autoradiografií (Sambrook, J. a Russell, D. W. [2001] Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press). Obrázek 1. Automatizovaná purifikace virové RNA. Purifikace virové RNA při použití soupravy QIAamp Viral RNA Mini Kit může být plně automatizována na přístroji QIAcube. 12 QIAamp Viral RNA Mini Uživatelská příručka 11/2016

13 Požadované materiály, které nejsou součástí dodávky Vždy, když pracujete s chemikáliemi, používejte vhodný laboratorní plášť, jednorázové rukavice a ochranné brýle. Pro více informací se obraťte na příslušné bezpečnostní listy (SDSs), které jsou k dispozici u dodavatele. Ethanol (96 100%)* 1,5 ml mikrocentrifugační zkumavky Sterilní, RNase-free špičky pipet (doporučené jsou špičky s filtrem, aby se zabránilo křížové kontaminaci) Mikrocentrifuga (s rotorem pro 1,5 ml a 2 ml zkumavky) Pro vakuové protokoly QIAvac 24 Plus vakuový manifold (kat. č ) nebo ekvivalent VacConnectors (kat. č ) Vacuum Regulator (kat. Č ) pro snadné monitorování vakuových tlaků a snadné uvolnění vákua Vacuum Pump (kat. č [USA a Kanada], [Japonsko], nebo [zbytek světa]) nebo ekvivalentní pumpa schopná vytvořit vákuum mezi 800 to 900 mbar Volitelně: VacValves (kat. č ) Volitelně: QIAvac Connecting System (kat. č ) * Nepoužívejte denaturovaný alkohol, který obsahuje další substance jako methylalkohol nebo methylethylketon. QIAamp Viral RNA Mini Uživatelská příručka 11/

14 Důležitá upozornění Jestliže připravujete RNA poprvé, přečtěte si prosím Manipulace s RNA v příloze této uživatelské příručky (strana 35). Všechny kroky QIAamp Viral RNA Mini protokolů by měly být provedeny rychle a při pokojové teplotě (15 25 C). Po odběru a centrifugaci plazmy (neošetřené nebo ošetřené antikoagulacii, nikoliv však heparinem) nebo séra lze plazmu i sérum skladovat při 2 8 C po dobu až 6 hodin. Pro dlouhodobé skladování doporučujeme vzorky v alikvotech zamrazit při teplotě 20 C až 80 C. Zmrazené vzorky plazmy nebo séra mohou být rozmrazeny pouze jednou. Opakované zmrazování a tání vede k denaturaci a precipitaci proteinů. To způsobuje snížení virového titru a následně snižuje výsledek izolované virové RNA. Navíc při opakovaném zmrazování a tání dochází k tvorbě kryoprecipitátů, ty pak mohou způsobit zanesení QIAamp membrány. Jestliže jsou viditelné kryoprecipitáty, můžete je odstranit krátkou centrifugací při 6800 x g po dobu 3 minut. Čistý supernatant bez škodlivých usazenin může být přenesen a ihned zpracován. Tento krok nesnižuje virové titry. QIAamp Viral RNA Mini procedura není navržena k oddělování RNA od DNA. Abyste se vyhnuli kontaminaci buněčné DNA, následujte následující pokyny v Kontaminace buněčnou DNA na straně 8 této uživatelské příručky. QIAamp Viral RNA Mini procedura izoluje všechny RNA molekuly větší než 200 nukleotidů. Menší RNA molekuly se nebudou kvantitativně vázat za zmíněných podmínek. Příprava činidel Přidání carrier RNA do pufru AVL* Přidejte 310 µl pufru AVE do zkumavky obsahující 310 µg lyofilizované carrier RNA, abyste získali roztok o koncentraci 1 µg/µl. Důkladně rozpusťte carrier RNA, rozdělte ji do vhodně velkých alikvotů a uskladněte ji při teplotách od 30 do 15 C. Nezamrazujte a nerozpouštějte alikvoty carrier RNA více než 3 krát. Zkontrolujte, zda pufr AVL neobsahuje precipitáty. V případě, že je to nutné, inkubujte ho při 80 C, než se precipitáty zcela rozpustí. Vypočítejte objem směsi pufru AVL carrier RNA potřebného na skupinu vzorků výběrem počtu vzorků, které mají být najednou zpracovány, viz Tabulka 1. Pro větší počet vzorků mohou být objemy vypočítány pomocí následujícího vzorce: n x 0.56 ml = y ml y ml x 10 µl/ml = z µl kde: n = počet vzorků, které mají být najednou zpracovány y = vypočítaný objem pufru AVL z = objem carrier RNA Pufr AVE, které se mají přidat do pufru AVL Jemně smíchejte převrácením zkumavky asi10 krát. Kvůli zpěnění nepoužívejte vortex. * Obsahuje chaotropické soli. Přijměte vhodná laboratorní bezpečnostní opatření a při manipulaci používejte rukavice. Není kompatibilní s dezinfekčními prostředky obsahující bělidlo. Viz strana 5 Bezpečnostní informace 14 QIAamp Viral RNA Mini Uživatelská příručka 11/2016

15 Tabulka1. Objemy pufru AVL a směsi carrier RNA pufr AVE, nutných pro QIAamp Viral RNA Mini proceduru. Počet vzorků Obj. pufru AVL (ml) Obj. carrier RNA AVE (µl) Počet vzorků Obj. pufru AVL (ml) Obj. carrier RNA AVE (µl) Poznámka: Procedura preparace vzorku je optimalizována pro 5,6 µg carrier RNA ve vzorku. V případě menšího množství carrier RNA se ukázalo, že je to lepší pro amplifikační systém. Přeneste pouze požadované množství rozpuštěné carrier RNA do zkumavky obsahující pufr AVL. (Při použití méně než 5,6 µg carrier RNA na vzorek musí být ověřeno u každého typu vzorku následným testem.) Směs pufru AVL carrier RNA by měla být připravována vždy čerstvá. Tato směs je stabilní při 2 8 C až po dobu 48 hodin. Tato směs vytváří sraženiny při skladování při 2 8 C, ty pak musejí být před použitím rozpuštěny zahřátím na 80 C. Nezahřívejte směs pufr AVL carrier RNA více než 6 krát. Neinkubujte ji při 80 C déle než 5 minut. Časté zahřívání a prodloužená doba inkubace způsobuje degradaci carrier RNA, vedoucí se snížení zisku virové RNA a eventuálně k falešné negativitě RT-PCR výsledků. Týká se to zejména vzorků s nízkým virovým titrem. QIAamp Viral RNA Mini Uživatelská příručka 11/

16 Pufr AW1* Pufr AW1 je dodáván jako koncentrát. Před prvním použitím přidejte odpovídající množství ethanolu (96 100%), tak jak je uvedeno na láhvi a v Tabulce 2. Pufr AW1 je stabilní po dobu 1 roku, jestliže je skladován řádně uzavřený a při pokojové teplotě (15 25 C), pouze ale do data expirace soupravy. Tabulka 2. Příprava pufru AW1 Soupr. kat. č. Poč. reakcí AW1 koncentrát Ethanol Finalní objem ml 25 ml 44 ml ml 130 ml 228 ml Pufr AW2 Pufr AW2 je dodáván jako koncentrát. Před prvním použitím přidejte odpovídající množství ethanolu (96 100%), tak jak je uvedeno na láhvi a v Tabulce 3. Pufr AW2 je stabilní po dobu 1 roku, jestliže je skladován řádně uzavřený a při pokojové teplotě (15 25 C), pouze ale do data expirace soupravy. Tabulka 3. Příprava pufru AW2 Soupr.kat. č. Poč. reakcí AW2 koncentrát Ethanol Finalní objem ml 30 ml 43 ml ml 160 ml 226 ml * Obsahuje chaotropické soli. Přijměte vhodná laboratorní bezpečnostní opatření a při manipulaci používejte rukavice. Není kompatibilní s dezinfekčními prostředky obsahující bělidlo. Viz strana 5 Bezpečnostní informace. Obsahuje azid sodný jako protektant. 16 QIAamp Viral RNA Mini Uživatelská příručka 11/2016

17 Zacházení s kolonkami QIAamp Mini Vzhledem k citlivosti technologií amplifikace nukleových kyselin jsou následující opatření nezbytná při manipulaci s kolonkami QIAamp Mini. Tato opatření zabrání křížové kontaminaci mezi vzorky: Opatrně aplikujte vzorek nebo roztok do kolonky QIAamp Mini. Při p ipetování vzorku do kolonky QIAamp Mini nesmáčejte okraj kolonky. Vyměňujte pipetovací špičky mezi všemi kroky přenosu kapalin. Je doporučeno používat špičky s filtrem. Vyvarujte se dotyku špičky membrány QIAamp. Po skončení všech kroků pulzního vortexování krátce zcentrifugujte 1,5 ml mikrocentrifugační zkumavky, aby došlo k odstranění kapek z vnitřní strany uzávěru. Používejte rukavice během celé procedury. V případě kontaktu rukavice se vzorkem neprodleně vyměňte rukavice. Spin protokol Uzavřete kolonku QIAamp Mini předtím než ji umístíte do mikrocentrifugy. Centrifugujte tak, jak je popsáno. Vyjměte kolonku QIAamp Mini a sběrnou zkumavku z mikrocentrifugy. Umístěte kolonku QIAamp Mini do nové sběrné zkumavky. Odstraňte filtrát a starou sběrnou zkumavku. Mějte prosím na paměti, že filtrát obsahuje nebezpečný odpad a musí být vhodným způsobem zlikvidován. Otevírejte najednou pouze jednu kolonku QIAamp Mini a dávejte pozor, aby nedocházelo k tvorbě aerosolů. Pro efektivní paralelní zpracování více vzorků je doporučeno naplnit stojánek se sběrnými zkumavkami, do kterých budou moci být kolonky QIAamp Mini přemístěny po centrifugaci. Použité sběrné zkumavky obsahující filtrát by měly být zlikvidovány a nové sběrné zkumavky s kolonkami QIAamp Mini by měly být ihned vloženy do mikrocentrifugy. Vakuový protokol na QIAvac 24 Plus QIAvac 24 Plus je navržen pro rychlé a účinné vakuové paralelní zpracování až 24 QIAGEN spin kolonek. Vzorky a promývací roztoky jsou odčerpány přes membránu kolonky pomocí vakua místo obvyklé centrifugace. Tato varianta poskytuje vyšší rychlost a snižuje dobu manipulace se vzorky v proceduře purifikace. V kombinaci s QIAvac Connecting System (volitelně), QIAvac 24 Plus může být použit jako průtokový systém. Proteklá odpadní kapalina je deponována v oddělené odpadní lahvi. Pokyny k údržbě QIAvac 24 Plus naleznete v pokynech manipulace v příručce k QIAvac 24 Plus. QIAamp Viral RNA Mini Uživatelská příručka 11/

18 Zpracování kolonek QIAamp Mini na QIAvac 24 Plus Kolonky QIAamp Mini lze zpracovat pomocí QIAvac 24 Plus použitím VacConnectors a opakovaně použitelnými VacValves. VacValves (volitelně) jsou přímo zasunuty do připravených slotů manifoldu QIAvac 24 Plus. Toto příslušenství zajišťuje stálý průtok, který usnadňuje paralelní zpracování vzorků různého charakteru (např. plazma a sérum), různých objemů, nebo viskozity. Měly by být použity v případě, že je žádoucí mít signifikantně odlišný průtok u jednotlivých vzorků. VacConnectors jednorázové konektory, které se vkládají mezi kolonky QIAamp Mini a VacValves, nebo mezi kolonky QIAamp Mini a manifold QIAvac 24 Plus. Zabraňují přímému kontaktu mezi kolonkou a VacValve, nebo manifoldem QIAvac 24 Plus během purifikace. Tím zabraňují křížové kontaminaci mezi vzorky. VacConnectors se odstraňují po každém použití. Pokyny pro manipulaci s QIAvac 24 Plus QIAvac 24 Plus umístěte vždy na bezpečné místo pracovního prostoru. V případě pádu může manifold QIAvac 24 Plus prasknout. Uskladňujte vždy QIAvac 24 Plus čistý a suchý. Pro informace o čištění čtěte uživatelskou příručku ke QIAvac 24 Plus. Součásti QIAvac 24 Plus nejsou odolné vůči některým rozpouštědlům (Tabulka 4). Jestliže jsou rozpouštědla vylita na jednotku, důkladně ji opláchněte vodou. K zajištění konzistentního výkonu, neaplikujte silikonové nebo jiné mazivo na jakoukoliv část manifoldu QIAvac 24 Plus. Používejte manifold opatrně a při práci s ním používejte ochranné brýle. Kontaktujte QIAGEN Technical Services nebo vašeho lokálního distributora v případě nutnosti informací o náhradních dílech. Vakuový tlak je odlišný tlak mezi vnitřkem vakuového manifoldu a atmosféry (staardní atmosférický tlak je 1013 milibarů nebo 760 mm Hg) a lze ho změřit použitím QIAvac Connecting System nebo vakuovým regulátorem (viz Obrázek 1). Vakuový protokol vyžaduje vakuovou pumpu schopnou vytvořit vakuum v rozpětí od 800 do 900 mbar (např. QIAGEN, Vacuum Pump). Vyvarujte se vyšších vakuových tlaků. Použití nižšího vakuového tlaku než toho, který je doporučen, může snížit výtěžek DNA a jeho čistotu. Rovněž může zvýšit frekvenci ucpání membrán. 18 QIAamp Viral RNA Mini Uživatelská příručka 11/2016

19 Tabulka 4. Vlastnosti chemické odolnosti QIAvac 24 Plus Odolné k: Kyselina octová Chaotropické soli Chlorové bělidlo Kys. chromová Kys.chlorovodíková SDS Chlorid sodný Hydroxid sodný Tween 20 Močovina Není odolné k: Benzen Chloroform Éthery Fenol Toluen Měřák regulátoru Knoflík Obrázek 2. Schematický diagram Vacuum Regulator. QIAamp Viral RNA Mini Uživatelská příručka 11/

20 Nastavení vakuového manifoldu QIAvac 24 Plus 1. Připojte QIAvac 24 Plus ke zdroji vakua. Používáte-li QIAvac Connecting System, připojte systém k manifoldu tak, jak je popsáno v příloze A uživatelské příručky ke QIAvac 24 Plus. 2. Doporučeno: Vložte VacValve do každého připraveného slotu v QIAvac 24 Plus, který má být použit (viz Obrázek 2). VacValves by měly být použity v případě, že je žádoucí mít signifikantně odlišný průtok u jednotlivých vzorků. 3. Vložte VacConnector do každého VacValve (viz Obrázek 2) nebo přímo do každého slotu QIAvac 24 Plus, který má být použit. Uzavřete nepoužité sloty zátkami nebo vlože VacValve. Proveďte tento krok přímo před začátkem purifikace. Vyhnete se tak potenciální kontaminaci VacConectors ze vzduchu. 4. Umístěte kolonky QIAamp Mini do VacConnectors v manifoldu (viz Obrázek 2). 5. Pro purifikaci nukleových kyselin následujte instrukce ve vakuovém protokole. Po použití VacConnectors zlikvidujte odpovídajícím způsobem. Nechte uzávěr kolonky QIAamp Mini otevřený v průběhu aplikace vakua. Vypněte vakuum mezi kroky, aby se zajistilo, že vakuum je konzistentní. Pro rychlejší uvolnění vakua by měl být použit vakuový regulátor (viz Obrázek 1). Poznámka: Každý VacValve může být uzavřen individuálně, jestliže vzorek kompletně protekl skrz spin kolonku, což umožňuje paralelní zpracování vzorků různých objemů a viskozit. 6. Po zpracování vzorků, vyčistěte QIAvac 24 Plus (viz Čištění a Dekontaminace QIAvac 24 Plus v QIAvac 24 Plus Uživatelské příručce). Poznámka: Pufry AVL a AW1 použité v QIAamp Viral RNA Mini proceduře nejsou kompatibilní s dezinfekčními prostředky obsahující bělidlo. Viz strana 5 Bezpečnostní upozornění. 20 QIAamp Viral RNA Mini Uživatelská příručka 11/2016

21 6 Obrázek 3. Nastavení QIAvac 24 Plus s kolonkami QIAamp Mini při použití VacValves a VacConnectors. 1. QIAvac 24 Plus vakuový manifold 2. Připravené sloty v QIAvac 24 Plus 3. VacValve (volitelně)* 4. VacConnector* 5. QIAamp kolonky 6. Připravené sloty uzavřené uzávěry * Musejí být koupeny odděleně. Centrifugace Kolonky QIAamp Mini se vejdou do většiny 1,5 ml nebo 2 ml mikrocentrifugačních zkumavek. Další 2 ml sběrné zkumavky jsou dostupné odděleně. Centrifugace kolonek QIAamp Mini se provádí při 6000 x g (8000 rpm) za účelem omezení hluku mikrocentrifugy. Centrifugace na maximální rychlost neovlivní výtěžek RNA. Centrifugace při nižších rychlostech v případě lyzátu a prvního promývacího kroku je možná za předpokladu, že celý objem roztoku protekl skrz membránu. Ve druhém promývacím kroku je centrifugace na maximální rychlost důrazně doporučena. Všechny centrifugační kroky se provádějí při pokojové teplotě (15 25 C). QIAamp Viral RNA Mini Uživatelská příručka 11/

22 Spin Protokol Protokol: Purifikace virové RNA (Spin protokol) Tento protokol je určen pro purifikaci virové RNA ze 140 µl plazmy, séra, moče, buněčných kultur, nebo bezbuněčných tělních tekutin použitím mikrocentrifugace. Pro automatickou purifikaci virové RNA použitím QIAamp Viral RNA Mini Kit na přístroji QIAcube, viz QIAcube Uživatelský manuál a příslušný list protokolu. Větší úvodní objemy vzorků až do 560 µl (v násobcích 140 µl) mohou být zpracovány proporčně zvýšenými úvodními objemy a vícenásobným naplněním kolonky QIAamp Mini, tak jak je popsáno níže v protokole. Některé vzorky s nízkými virovými titry mohou být zkoncentrovány před zahájením procedury; viz Protokol: Koncentrace vzorku (strana 29). Alternativně, větší objemy vzorků mohou být zpracovány použitím jedné z následujících souprav, které umožňují simultánní purifikaci virové DNA a RNA. QIAamp MinElute Spin Kit* 200 µl QIAamp MinElute Vacuum Kit 500 µl QIAamp UltraSens Virus Kit 1000 µl Důležité body před zahájením Čtěte Důležitá upozornění (strana 14 21) před zahájením protokolu. Všechny centrifugační kroky se provádějí při pokojové teplotě (15 25 C). Co dělat před zahájením Nechte ustálit vzorky na pokojovou teplotu (15 25 C). Nechte ustálit eluční pufr AVE na pokojovou teplotu pro eluci v kroku 11. Zkontrolujte, zda pufry AW1 a AW2 byly připraveny dle instrukcí uvedených na straně 16. Přidejte carrier RNA rekonstituovanou v pufru AVE do pufru AVL dle instrukcí uvedených na straně 14. Procedura 1. Pipetujte 560 µl připraveného pufru AVL obsahující carrier RNA v 1,5 ml mikrocentrifugační zkumavce. Jestliže je objem vzorku větší než 140 µl, zvyšte proporčně množství roztoku p u f r AVL carrier RNA (např. 280 µl vzorku vyžaduje 1120 µl pufru AVL carrier RNA) a použijte větší zkumavku. * Plně automatizovatelné na přístroji QIAcube. Viz pro protokoly. 22 QIAamp Viral RNA Mini Uživatelská příručka 11/2016

23 Spin Protokol 2. přidejte 140 µl plazmy, séra, močesupernatantu buněčných kultur, nebo bezbuněčné tělní tekutiny k roztoku pufru AVL-carrier RNA v mikrocentrifugační zkumavce. Smíchejte pomocí pulzního vortexování po dobu 15 s. K zajištění účinné lýze je nezbytné, aby byly vzorky důkladně promíchány s p u f r e m AVL, aby byl získán homogenní roztok. Zmražené vzorky, které byly rozmraženy pouze jednou lze rovněž použít. 3. Inkubujte při pokojové teplotě (15 25 C) po dobu 10 min. Lýze virových částic je kompletní po 10 min při pokojové teplotě. Delší doba inkubace nemá žádný vliv na výtěžek nebo kvalitu purifikované RNA. Potenciálně infekční agens a RNázy jsou inaktivovány pufrem AVL. 4. Krátce zcentrifugujte zkumavku, aby se odstranily kapky z vnitřní strany uzávěru. 5. Přidejte 560 µl ethanolu (96 100%) do vzorku a smíchejte pulzním vortexováním po dobu 15 s. Po smíchání krátce centrifugujte, aby se odstranily kapky z vnitřní strany uzávěru. Pouze ethanol by měl být použit, neboť jiné alkoholy mohou mít za následek snížený výtěžek a čistotu RNA. Nepoužívejte denaturovaný alkohol, který obsahuje další substance jako methanol nebo methylethylketon. Jestliže je objem vzorku větší než 140 µl, proporčně zvyšte množství ethanolu (např. 280 µl vzorku bude vyžadovat 1120 µl ethanolu). K zajištění účinného navázání je nezbytné vzorky důkladně promíchat s ethanolem, aby vznikl homogenní roztok. 6. Opatrně aplikujte 630 µl roztoku z kroku 5 na kolonku QIAamp Mini (v 2 ml sběrné zkumavce) bez potřísnění okraje. Zavřete uzávěr a centrifugujte při 6000 x g (8000 rpm) po dobu 1 min. Umístěte kolonku QIAamp Mini do čisté 2 ml sběrné zkumavky a odstraňte zkumavku obsahující filtrát. Uzavřete každou spin kolonku, aby se zabránilo křížové kontaminaci během centrifugace. Centrifugace se provádí při 6000 x g (8000 rpm), aby se redukoval hluk mikrocentrifugy. Centrifugace na maximální rychlost neovlivní výtěžek nebo čistotu virové RNA. Jestliže roztok kompletně neprošel skrz membránu, opakujte centrifugaci při vyšší rychlosti do té doby, než roztok kompletně projde skrz membránu. 7. Opatrně otevřete kolonky QIAamp Mini a opakujte krok 6. Jestliže byl objem vzorku větší než 140 µl, opakujte tento krok do té doby, než bude lyzát naplněn do spin kolonky. 8. Opatrně otevřete kolonku QIAamp Mini a přidejte 500 µl pufru AW1. Uzavřete uzávěr a centrifugujte při 6000 x g (8000 rpm) po dobu 1 min. Umístěte kolonku QIAamp Mini do čisté 2 ml sběrné zkumavky (součást dodávky) a odstraňte zkumavku obsahující filtrát. Není nutné zvyšovat objem pufru AW1, jestliže je úvodní objem vzorku větší než 140 µl. QIAamp Viral RNA Mini Uživatelská příručka 11/

24 Spin Protokol 9. Opatrně otevřete kolonku QIAamp Mini a přidejte 500 µl pufru AW2. Uzavřete uzávěr a centrifugujte na maximální rychlost (20,000 x g; 14,000 rpm) po dobu 3 min. Pokračujte přímo krokem 11, nebo abyste eliminovali možnost rezidua pufru AW2, zopakujte krok 10 a poté pokračujte krokem 11. Poznámka: Zbytek pufru AW2 v eluátu může způsobit problémy v následných aplikacích. Některé rotory centrifug mohou vibrovat během brždění, což může vyústit protečením tekutiny obsahující pufr AW2 kontaktem s kolonkou QIAamp Mini. Odstraňování kolonky QIAamp Mini a sběrné kolonky z rotoru může rovněž způsobit protečení a kontakt s kolonkou QIAamp Mini. V tomto případě je nutné provést volitelný krok Doporučeno: Umístěte kolonku QIAamp Mini do nové 2 ml sběrné zkumavky (není součástí dodávky) a odstraňte použitou sběrnou zkumavku s filtrátem. Centrifugujte na maximální rychlost po dobu 1 min. 11. Umístěte kolonku QIAamp Mini do čisté 1,5 ml mikrocentrifugační zkumavky (není součástí dodávky). Odstraňte použitou sběrnou zkumavku s filtrátem. Opatrně otevřete kolonku QIAamp Mini a přidejte 60 µl pufru AVE ustáleného na pokojovou teplotu. Uzavřete uzávěr a inkubujte při pokojové teplotě po dobu 1 min. Centrifugujte při 6000 x g (8000 rpm) po dobu 1 min. Jediná eluce s 60 µl pufru AVE je dostačující pro eluci nejméně 90% virové RNA z kolonky QIAamp Mini. Provádění dvojité eluce s 2 x 40 µl pufru AVE zvýší výtěžek až o 10%. Eluce s objemem nižším než 30 µl vede ke snížení v ý t ě ž k u a nevede ke zvýšení finální koncentrace RNA v eluátu. Virová RNA je stabilní po dobu jednoho roku při uskladnění při teplotách od -30 do -15 C nebo při -70 C. 24 QIAamp Viral RNA Mini Uživatelská příručka 11/2016

25 Vakuový Protokol Protokol: Purifikace virové RNA (Vakuový Protokol) Tento protokol je určen pro purifikaci virové RNA ze 140 µl plazmy, séra, moče, kultivovaných buněk, nebo bezbuněčných tělních tekutin pomocí QIAvac 24 Plus nebo ekvivalentního manifoldu. Větší úvodní objemy vzorků až do 560 µl (v násobcích 140 µl) mohou být zpracovány proporčně zvýšenými úvodními objemy a vícenásobným naplněním kolonky QIAamp Mini, tak jak je popsáno níže v protokole. Některé vzorky s nízkými virovými titry mohou být zkoncentrovány před zahájením procedury; viz Protokol: Koncentrace vzorku (strana 29). Alternativně, větší objemy vzorků mohou být zpracovány použitím následujících souprav, které umožňují simultánní purifikaci virové DNA a RNA. QIAamp MinElute Spin Kit* 200 µl QIAamp MinElute Vacuum Kit 500 µl QIAamp UltraSens Virus Kit 1000 µl Důležité body před zahájením Čtěte Důležitá upozornění (strana 14 21) před zahájením protokolu. Veškeré centrifugační kroky se provádějí při pokojové teplotě (15 25 C). Co dělat před zahájením Nechte vzorky ustálit na pokojovou teplotu (15 25 C). Nechte ustálit eluční pufr AVE na pokojovou teplotu pro eluci v kroku 10. Zkontrolujte, zda pufry AW1 a AW2 byly připraveny podle instrukcí uvedených na straně 16. Přidejte carrier RNA rekonstituovanou v roztoku pufru AVE s pufrem AVL podle instrukcí na straně 14. Pro zpracování použijte VacConnectors a VacValves, nastavte QIAvac 24 Plus, tak jak je popsáno na straně 20. * Plně automatizovatelné na přístroji QIAcube. Viz pro protokoly. QIAamp Viral RNA Mini Uživatelská příručka 11/

26 Procedura Vakuový protokol 1. Pipetujte 560 µl připraveného pufru AVL obsahující carrier RNA do 1,5 ml mikrocentrifugační zkumavky. Jestliže je objem vzorku větší než 140 µl, zvyšte proporčně množství roztoku pufr AVL carrier RNA (např. 280 µl vzorku vyžaduje 1120 µl pufru AVL carrier RNA) a použijte větší zkumavku. 2. Přidejte 140 µl plazmy, séra, moče, supernatantu buněčné kultury, nebo bezbuněčnou tělní tekutinu do roztoku pufru AVL carrier RNA v mikrocentrifugační zkumavce. Smíchejte pomocí pulzního vortexování po dobu 15 s. K zajištění účinné lýze je nezbytné, aby byly vzorky důkladně promíchány s pufrem AVL, aby byl získán homogenní roztok. Zmražené vzorky, které byly rozmraženy pouze jednou lze rovněž použít. 3. Inkubujte při pokojové teplotě (15 25 C) po dobu 10 min. Lýze virových částic je kompletní po 10 min při pokojové teplotě. Delší doba inkubace nemá žádný vliv na výtěžek nebo kvalitu purifikované RNA. Potenciálně infekční agens a RNázy jsou inaktivovány pufrem AVL. 4. Zkumavku krátce zcentrifugujte, aby došlo k odstranění kapek z uzávěru. 5. Přidejte 560 µl ethanolu (96 100%) ke vzorku a promíchejte pulzním vortexováním po dobu 15 s. Po smíchání krátce centrifugujte, aby došlo k odstranění kapek z uzávěru. Vložte kolonku QIAamp Mini do VacConnector umístěném ve vakuovém manifoldu QIAvac 24 Plus. Pouze ethanol by měl být použit, neboť jiné alkoholy mohou mít za následek snížený výtěžek a čistotu RNA. Nepoužívejte denaturovaný alkohol, který obsahuje další substance jako methanol nebo methylethylketon. Jestliže je objem vzorku větší než 140 µl, proporčně zvyšte množství ethanolu (např. 280 µl vzorku bude vyžadovat 1120 µl ethanolu). K zajištění účinného navázání je nezbytné vzorky důkladně promíchat s ethanolem, aby vznikl homogenní roztok. Sběrné zkumavky z blistrového balení mohou být ušetřeny pro centrifugační krok Ujistěte se, zda hlavní vakuový ventil (mezi vakuovou pumpou a vakuovým manifoldem) a šroubovací uzávěr ventilu (na konci QIAvac 24 Plus vacuového manifoldu) je uzavřen. Zapněte vakuovou pumpu zmáčknutím vypínače. Vakuum je aplikováno pouze na connecting systém (je-li použit) a nikoliv na vakuový manifold. Poznámka: Pro rychlé a spolehlivé uvolnění vakuového tlaku b y m ě l b ý t p o u ž i t QIAvac Connecting System nebo Vacuum Regulator, viz objednací informace, strana QIAamp Viral RNA Mini Uživatelská příručka 11/2016

27 Vakuový protokol 7. Opatrně aplikujte 630 µl lyzátu z kroku 5 do kolonky QIAamp Mini bez potřísnění okraje. Nedotýkejte se membrány kolonky QIAamp Mini column špičkou pipety. 8. Otevřete hlavní vakuový ventil. Ujistěte se, že jste nechali uzávěry kolonek QIAamp Mini otevřené zatímco aplikujete vakuum. Po úplném protečení lyzátu membránou kolonky QIAamp Mini uzavřete hlavní vakuový ventil a otevřete šroubovací uzávěr ventil pro uvolnění podtlaku v manifoldu. Uzavřete šroubovací uzávěr ventilu potom, co je uvolněn podtlak v manifoldu. Po uzavření hlavního vakuového ventilu, je vakuum aplikováno pouze do connecting systému (je-li použito) a nikoliv do vakuového manifoldu. Jestliže lyzáty jednotlivých vzorků ještě neprošly skrz membránu, přestože VacValves všech ostatních k o l o n e k QIAamp Mini jsou uzavřeny, umístěte kolonku QIAamp Mini do čisté 2 ml sběrné zkumavky (není součástí balení), zavřete uzávěr a centrifugujte na maximální rychlost po dobu 3 min nebo do té doby, než kapalina zcela proteče skrz membránu. Pokračujte krokem 7 spin protokolu na straně 23. Dodatečné sběrné zkumavky lze zakoupit samostatně, viz objednací informace, strana 40. Centrifugace se provádí při 6000 x g (8000 rpm), aby se snížil hluk mikrocentrifugy. Centrifugace při maximální rychlosti neovlivní výtěžek nebo čistotu virové RNA. 9. Opakujte kroky 7 a 8. Jestliže je objem vzorků větší než 140 µl, opakujte tyto kroky do té doby, než bude veškerý lyzát zpracován na kolonce QIAamp Mini. 10. Aplikujte 750 µl pufru AW1 do kolonky QIAamp Mini bez potřísnění jejího okraje. Nedotýkejte se membrány kolonky QIAamp Mini špičkou pipety. Není nutné zvyšovat objem pufru AW1 i v případě, že počáteční objem byl větší než 140 µl. 11. Otevřete hlavní vakuový ventil. Poté, co veškerý pufr AW1 proteče skrz kolonku QIAamp Mini, uzavřete hlavní vakuový ventil a otevřete šroubovací uzávěr ventilu, pro uvolnění podtlaku v manifoldu. Uzavřete šroubovací uzávěr ventilu poté, co se uvolní podtlak v manifoldu. 12. Aplikujte 750 µl pufru AW2 do kolonky QIAamp Mini bez potřísnění jejího okraje. Nedotýkejte se membrány kolonky QIAamp Mini špičkou pipety. Nechte otevřen uzávěr kolonky. 13. Otevřete hlavní vakuový ventil. Poté, co veškerý pufr AW2 proteče skrz kolonku QIAamp Mini, uzavřete hlavní vakuový ventil a otevřete šroubovací uzávěr ventilu pro uvolnění podtlaku v manifoldu. Uzavřete šroubovací uzávěr ventilu poté, co se uvolní podtlak v manifoldu. QIAamp Viral RNA Mini Uživatelská příručka 11/

28 Vakuový protokol 14. Zavřete uzávěr kolonky QIAamp Mini. Vyjměte ji z vakuového manifoldu a odstraňte VacConnector. Umístěte kolonku QIAamp Mini spin do čisté 2 ml sběrné zkumavky, kterou jste ušetřili v kroku 5 a centrifugujte při maximální rychlosti po dobu 1 min, aby to došlo k úplnému vysušení membrány. 15. Umístěte kolonku QIAamp Mini spin do čisté 1,5 ml mikrocentrifugační zkumavky (není součástí balení). Odstraňte sběrnou zkumavku obsahující filtrát. Opatrně otevřete kolonku QIAamp Mini spin. Přidejte 60 µl pufru AVE ustáleného na pokojovou teplotu. Uzavřete uzávěr a inkubujte při pokojové teplotě po dobu 1 minuty. Centrifugujte při 6000 x g (8000 rpm) po dobu 1 min. Jediná eluce s 60 µl pufru AVE je dostačující pro eluci až 90% virové RNA z kolonky QIAamp Mini spin. Provedení dvojnásobné eluce 2 x 40 µl pufrem AVE zvýší výtěžek až o 10%. Eluce s objemy nižšími než 30 µl vedou ke snížení výtěžku a nevedou ke zvýšené finální koncentraci RNA v eluátu. Virová RNA je stabilní až po dobu 1 roku při uskladnění při 30 do 15 C nebo 70 C. 28 QIAamp Viral RNA Mini Uživatelská příručka 11/2016

29 Koncentrace vzorku Protokol: Koncentrace vzorku Plazma, sérum, moč, mozkomíšní mok, kostní dřeň a ostatní tělní tekutiny obsahují často velmi nízké virové titry. V těchto případech se doporučuje zkoncentrovat vzorky až z 3,5 ml do finálního objemu 140 µl. Důležitý bod před zahájením Používejte centrifugační mikrokoncentrátory jako Centricon 100 (Amicon: 2 ml, kat. č. 4211), Microsep 100 (Filtron: 3.5 ml, kat. č. OD100C40), Ultrafree CL (Millipore: 2 ml, kat. č. UFC4 THK 25), nebo ekvivalentní od ostatních dodavatelů. Procedura 1. Aplikujte až 3,5 ml vzorku do mikrokoncentrátoru. Řiďte se pokyny výrobce. 2. Centrifugujte podle pokynů výrobce až do finálního objemu 140 µl. Některé vzorky, zejména plazma, můžou být problematické zakoncentrovat na 140 µl díky jejich vysoké viskozitě. V tomto případě je často zapotřebí centrifugace až po dobu 6 hodin. 3. Pipetujte 140 µl koncentrovaného vzorku do a 1,5 ml mikrocentrifugační zkumavky a následujte protokol QIAamp Viral RNA Mini spin, strana22. QIAamp Viral RNA Mini Uživatelská příručka 11/

30 Protokol: Purifikace buněčné, bakteriální nebo virové DNA z moče Pufr AVL, používaný v proceduře QIAamp Viral RNA Mini, inaktivuje mnoho neidentifikovatelných PCR inhibitorů nacházejících se v moči. Pro izolaci buněčné, bakteriální nebo virové DNA z moč pro účely amplifikace pomocí PCR doporučujeme používat QIAamp Viral RNA Mini spin protokol (strana 22). Moč často obsahuje velmi malý počet buněk, bakterií, nebo virů. V tomto případě doporučujeme zkoncentrovat vzorky až z 335 ml na finální objem 140 µl, tak jak je popsáno níže, úkony před zpracováním. Pro purifikaci DNA z Gram-pozitivních bakterií, kontaktujte prosím QIAGEN Technical Services. Důležitý bod před zahájením Používejte mikrocentrifugační koncentrátory jako jsou Centricon-100 (Amicon: 2 ml, kat. č. 4211), Microsep 100 (Filtron: 3.5 ml, kat. č. OD100C40), Ultrafree- CL (Millipore: 2 ml, kat. č. UFC4 THK 25) nebo ekvivalentní od ostatních dodavatelů. DNA from Urine Procedura 1. Aplikujte až 3,5 ml vzorku do mikrokoncentrátoru a řiďte se pokyny výrobce 2. Centrifugujte podle pokynů výrobce až na objem 140 µl. Některé vzorky, zejména plazma, mohou být obtížně koncentrovány na 140 µl díky vysoké viskozitě. V tomto případě je často zapotřebí centrifugace až po dobu 6 hodin. 3. Pipetujte 140 µl zkoncentrovaného vzorku do 1,5 ml mikrocentrifugační zkumavky a následujte protokol QIAamp Viral RNA Mini spin na straně QIAamp Viral RNA Mini Uživatelská příručka 11/2016

31 Průvodce řešením problémů Tento průvodce řešením problémů může být užitečným v případě řešení problémů, které se mohou vyskytnout. Pro více informací viz také webová stránka Často kladené otázky na Technical Support Center: Vědci v QIAGEN Technical Services vám vždy rádi odpovědí na jakoukoliv otázku. Ať už se jedná doplňující informaci nebo konkrétní dotaz ke konkrétnímu protokolu z této uživatelské příručky, případně o dotaz k testovací technologii (pro kontaktní informace, viz zadní obálka, nebo navštivte Náměty a připomínky Nedostatek nebo žádná RNA v elulátu a) Carrier RNA nebyla přidána do pufru AVL b) degradovaná carrier RNA Rekonstituujte carrier RNA v pufru AVE a smíchejte s pufrem AVL, tak jak je popsáno na straně 14. Opakujte purifikaci s novými vzorky Carrier RNA rekonstituovaná v pufru AVE nebyla uskladněna při 30 až 15 C, nebo prodělala mnohonásobný cyklus zmrazení a rozpuštění. Případně, směs pufru AVL carrier RNA byla uskladněna více jak 48 hodin při 2 8 C. Připravte novou zkumavku carrier RNA rozpuštěné v pufru AVE a smíchejte s pufrem AVL. Opakujte purifikaci s novými vzorky. c) Vzorky byly zmrazeny a rozpuštěny více než jedenkrát Vyvarujte se opakovanému zmrazování a rozpouštění vzorků. Vždy používejte čerstvé, nebo pouze jednou rozpuštěné vzorky. d) Nízká koncentrace Zkoncentrujte vzorek na objem 140 µl, při použití viru ve vzorku mikrokoncentrátoru. Opakujte proceduru purifikace RNA s novými vzorky. Viz Protokol: Koncentrace vzorku na straně 29. e) Neúčinná denaturace Precipitát, vytvořený ve směsi pufru AVL-carrier RNA proteinu v pufru AVL po uskladnění v 2-8 C, nebyl dostatečně rozpuštěn zahříváním, před zahájením procedury. Řádně rozpusťte precipitát a opakujte purifikaci s novými vzorky. f) Nesprávně připravený Zkontrolujte precipitáty v pufru AVL. Rozpusťte QIAamp Viral RNA Mini Uživatelská příručka 11/

32 pufr AVL precipitáty zahřátím na 80 C g) Nebyl přidán ethanol Opakujte purifikaci RNA s novými vzorky. k lyzátu (krok 5) h) Byl použit málo Opakujte purifikační proceduru s novými vzorky. koncentrovaný ethanol V kroku 5 používejte % ethanol. Nepoužívejte denaturovaný alkohol, ten může obsahovat různé substance, jako methanol, nebo methylethylketon. i) Byl použit isopropanol Striktně doporučujeme používat ethanol, neboť místo ethanolu isopropanol způsobuje snížení výtěžku. j) Degradace RNA RNA je často degradována RNázami v původním materiále (plazma, sérum, tělní tekutiny). Zajistěte urychlené zpracování vzorků. Je-li to nutné, přidejte do vzorku inhibitor RNáz. Zkontrolujte kontaminaci RNázami v pufrech a vodě a zajistěte, aby se žádné RNázy nedostaly do vzorku během procedury. k) Kontaminace pufru AVE Odstraňte kontaminovaný pufr AVE. Opakujte RNázami purifikační proces s novými vzorky a čistými zkumavkami s pufrem AVE. Pufr AVE lze objednat dodatečně, viz strana 40 Objednací informace. l) Pufr AW1 nebo AW2 byl Zkontrolujte zda koncentráty pufrů AW1 a AW2 připraven nesprávně byly rozředěny se správným objemem ethanolu (96-100%). Nepoužívejte denaturovaný alkohol, který obsahuje další substance jako methanol nebo ethylmethylketon. Opakujte purifikační proceduru s novými vzorky. m) Pufr AW1 nebo AW2 Zkontrolujte, zda koncentráty pufrů AW1 a AW2 byly byl připraven s 70% ethanolem rozředěny % ethanolem. Opakujte purifikační proceduru s novými vzorky. n) Pufry AW1 a AW2 byly Ujistěte se, že pufry AW1 a AW2 byly použity použity ve špatném pořadí ve správném pořadí, tak jak je uvedeno v protokolu. Opakujte purifikační proceduru s novými vzorky. RNA nevykazuje dobré výsledky v následných enzymatických reakcích a) Nedostatek, nebo žádná RNA v eluátu Zkontrolujte nedostatek nebo nepřítomnost RNA, zda se nejedná o jeden z výše zmíněných důvodů. 32 QIAamp Viral RNA Mini Uživatelská příručka 11/2016

33 b) Neúčinná lýze viru v pufru AVL c) Špatně připravený AVL pufr d) Příliš mnoho carrier RNA v eluátu Důvodem může být vzniklý precipitát ve směsi pufr AVL carrier RNA díky teplotním změnám před zahájením procesu. Opakujte proceduru s novými vzorky a ujistěte se, že není přítomen precipitát vytvořený ve směsi pufr AVL carrier RNA před zahájením procesu. Ujistěte se, že carrier RNA byla rekonstituována v pufru AVE a byla přidána do pufru AVL (viz strana 14). Určete maximální množství carrier RNA vhodné pro vaší RT-PCR. Nastavte podle toho koncentraci carrier RNA přidanou do pufru AVL. e) Snížená senzitivita Určete maximální objem eluátu vhodného pro vaši RT-PCR. Snižte objem eluátu přidaného do RT-PCR. f) Pufry AW1 a AW2 Ujistěte se, že pufry AW1 a AW2 byly použity ve byly použity v správném pořadí, tak jak je uvedeno v protokole. špatném pořadí Opakujte purifikační proceduru s novými vzorky. g) Nová kombinace Jestliže se změní enzymy, možná bude nutné Taq DNA polymerázy znovu nastavit množství carrier RNA přidané do AVL a reverzní transkriptázy pufru Kontaminace DNA Přítomnost DNA a RNA Obecné zacházení Abyste se vyhnuli kopurifikaci s DNA, používejte bezbuněčné tělní tekutiny pro preparaci virové RNA. Vzorky obsahující buňky, jako je mozkomíšní mok, kostní dřeň, moč a většina odběrových tampónů, by měly být zbaveny buněk filtrací nebo centrifugací. Používáte-li centrifugaci, centrifugujte 10 min při 1500 g a supernatant použijte pro izolaci virové RNA. Jestliže chcete získat čistou RNA bez DNA, ošetřete ji RNase free DNázou. DNáza v eluátu musí být tepelně inaktivována (15 min, 70 C). a) Lyzát kompletně neprošel Při použití spin protokolu: Centrifugujte 1 min na skrz membránu maximální rychlost nebo do té doby, než lyzát kompletně projde membránou. Použití vakuového protokolu: Bylo aplikováno QIAamp Viral RNA Mini Uživatelská příručka 11/

34 nedostatečné vakuum, nebo uzávěr kolonky zůstal uzavřený. Zvyšte vakuum a otevřete uzávěr během aplikace vakua. Jestliže již nejde dále zvyšovat velikost vakua, vložte kolonku QIAamp Mini do čisté 2 ml sběrné zkumavky, zavřete uzávěr a centrifugujte při 6000 g (8000 rpm) po dobu 3 min. nebo do té doby než lyzát kompletně projde skrz membránu. Umístěte kolonku QIAamp Mini do nové sběrné zkumavky a odstraňte sběrnou zkumavku obsahující filtrát. Pokračujte krokem 7 spin protokolu na straně 23. b) Ucpaná membrána Mohou to způsobit kryoprecipitáty, které se tvoří v plazmě během opakovaného zmrazování a rozmrazování. Nepoužívejte plazmu, která byla rozmražena více než jedenkrát c) Křížová kontaminace mezi vzorky Abyste se vyhnuli křížové kontaminaci při zacházení s kolonkami QIAamp Mini spin, následujte instrukce v Manipulace s kolonkami QIAamp Mini na straně 17. Opakujte purifikační proceduru s novými vzorky. d) Vakuový tlak je příliš vysoký/příliš nízký Použitím příliš vysokého vakuového tlaku může dojít k poškození QIAamp membrány. Použitím příliš nízkého vakuového tlaku může dojít ke snížení výtěžku a čistoty RNA. Používejte vakuový regulátor (viz informace o objednání na straně 41) pro nastavení tlaku od 800 do 900 mbar pro všechny vakuové kroky. 34 QIAamp Viral RNA Mini Uživatelská příručka 11/2016

35 Příloha Manipulace s RNA Ribonukleázy (RNázy) jsou velmi stabilní a aktivní enzymy, které obvykle nepotřebují kofaktory pro svoji funkci. Vzhledem k tomu, že RNázy je obtížné inaktivovat a pouze nepatrné množství je schopno zničit RNA, nepoužívejte jakékoliv platové nebo skleněné vybavení bez toho, aniž byste eliminovali možnost kontaminace RNázami. Velká péče by měla být věnována tomu, aby se zabránilo nechtěnému vniknutí RNáz do vzorku během nebo po procesu purifikace. Pro vytvoření a udržení prostředí RNase-free musí být přijata následující opatření během fáze přípravy izolace a použití jednorázových pomůcek při manipulaci s RNA. Obecná manipulace Správné mikrobiologické aseptické techniky by měly být vždy používány během práce s RNA. Ruce a prachové částice mohou nést bakterie a plísně, které jsou největším společným zdrojem kontaminací RNázami. Vždy používejte latexové nebo vinylové rukavice, jestliže manipulujete s činidly a vzorky. Zabráníte tím kontaminaci RNázami z povrchu pokožky nebo ze zaprášeného laboratorního vybavení. Často rukavice vyměňujte a udržujte zkumavky zavřené, kdykoliv je to možné. Během procedury pracujte rychle, zabráníte tím degradaci RNA endogenními nebo zbytkovými RNázami. Jednorázový plastový materiál Doporučujeme používání sterilních jednorázových polypropylenových zkumavek ve všech krocích procedury. Tyto zkumavky jsou obvykle RNase-free a nevyžadují ošetření z důvodu odstranění RNáz. Nejednorázový plastový materiál Ne jednorázový plastový materiál by měl být před použitím ošetřen, aby bylo zajištěno, že je RNase- free. Plastový materiál by měl být důkladně ponořen do 0,1M NaOH, * 1 mm EDTA* a následně opláchnut RNase-free vodou (viz Roztoky, strana 36). Alternativně, chloroform- resistentní plastový materiál může být ponořen do chloroformu* za účelem inaktivace RNáz. Skleněný materiál Skleněný materiál by měl být před použitím ošetřen, aby bylo zajištěno, že je RNasefree. Skleněný materiál používaný pro práci s RNA by měl být vyčištěn detergentem, * důkladně ponořit a vypálit při >240 C po dobu více než 4 hodin (přes noc, pokud je to pohodlnější). Autoklávování samo o sobě ne zcela plně inaktivuje většinu RNáz. Pouze vypálení zajistí úplnou inaktivaci * Při práci s chemikáliemi, noste vždy vhodný laboratorní plášť, jednorázové rukavice a ochranné brýle. Pro více informací, konzultujte s příslušným bezpečnostním listem (SDSs), dostupné u dodavatele produktu. QIAamp Viral RNA Mini Uživatelská příručka 11/

36 ribonukleáz. Alternativně, skleněný materiál může být ošetřen DEPC* (diethyl pyrocarbonátem). Pomořte skleněné vybavení do 0,1% DEPC (0,1% ve vodě) přes noc (12 hodin) při 37 C a potom autoklávujte, nebo zahřejte na 100 C po dobu 15 minut, aby se odstranilo zbytkové DEPC. Poznámka: Corex zkumavky by měly být zbaveny RNáz ošetřením DEPC a nikoliv vypálením. Tento způsob sníží možnost poškození zkumavky během centrifugace. Elektroforetické nádoby Elektroforetické nádoby by měly být vymyty roztokem detergentu (např. 0.5% SDS),* vypláchnuty vodou a vysušeny ethanolem,* a poté naplněny roztokem 3% H O. * 2 2 Po 10 minutách při pokojové teplotě (15 25 C), by měly být elektroforetické nádoby důkladně propláchnuty RNase-free vodou. Roztoky Roztoky (voda a ostatní roztoky)* by měly být ošetřeny 0,1% DEPC. DEPC reagují s primárními aminy a nemůže být použito přímo pro ošetření Tris pufrů.* DEPC je vysoce nestabilní v přítomnosti Tris pufrů a rychle se rozkládá na ethanol a CO2. Při přípravě Tris pufrů nejprve ošetřete pomocí DEPC vodu a až potom rozpusťte Tris za účelem vytvoření vhodného pufru. DEPC je silný, nikoliv však absolutní inhibitor RNáz. Obvykle se používá o koncentraci 0,1% pro inaktivaci RNáz na skleněném nebo plastovém vybavení nebo pro tvorbu RNase-free roztoků a vody. DEPC inaktivuje RNázy kovalentními modifikacemi. Stopové množství DEPC modifikuje purinové zbytky v RNA karbethoxylací. Karbethoxylovaná RNA je translatována s velmi nízkou účinností v bezbuněčných systémech. Nicméně schopnost tvořit hybridy DNA:RNA nebo RNA:RNA není zásadním způsobem ovlivněna, pokud nedojde k modifikaci velké části purinových zbytků. Zbytkové DEPC musí být vždy odstraněno z roztoků nebo nádob autoklávováním nebo zahřátím na 100 C po dobu 15 minut. Přidejte 0,1 ml DEPC do 100 ml roztoku, který má být ošetřen. Důkladně promíchejte, aby DEPC přešlo do roztoku, nebo ponechte 12 hodin při 37 C. Autoklávujte po dobu 15 minut pro odstranění i stopového množství DEPC. Může být žádoucí testovat zdroj vody na přítomnost kontaminujících RNáz, přestože mnoho zdrojů destilované vody jsou deklarovány jako bez RNázové aktivity. Poznámka: QIAamp Viral RNA pufry nejsou považovány za RNase-free ošetřením DEPC, a tudíž neexistuje možnost kontaminace DEPC. * * Při práci s chemikáliemi, noste vždy vhodný laboratorní plášť, jednorázové rukavice a ochranné brýle. Pro více informací, konzultujte s příslušným bezpečnostním listem (SDSs), dostupné u dodavatele produktu. Některé plastové elektroforetické nádoby nejsou odolné vůči ethanolu. Věnujte jim náležitou péči podle instrukcí výrobce. 36 QIAamp Viral RNA Mini Uživatelská příručka 11/2016

37 Objednací informace Produkt Obsah Kat. č. QIAamp Viral RNA Mini Kit Pro 50 miniprepů: 50 QIAamp Mini (50) Spin Kolonek, Carrier RNA, Pufry, a Sběrné zkumavky (2 ml) QIAamp Viral RNA Mini Kit Pro 250 miniprepů: 250 QIAamp Mini (250) Spin kolonek, Carrier RNA, Pufry a Sběrné zkumavky (2 ml) QIAcube a QIAcube příslušenství Pro plně automatizovanou preparaci vzorku pomocí QIAGEN spin-column souprav. QIAcube (110 V)* QIAcube (230 V) Záruka PLUS 2 Full, QIAcube Robotická stanice pro automatickou purifikace DNA, RNA, nebo proteinů použitím QIAGEN spin-column souprav, 1-rok záruky na díly a práci 3-letá záruka, 48-hour (2 pracovní dny) prioritní odpověď, práce, náhradní díly Starter Pack, QIAcube Balení obsahuje: reagent bottle (3); Označovací proužky (8); 200 µl špičky s filtrem (1024); 1000 µl špičky s filtrem (1024); 1000 µl špičky s filtrem, široký otvor (1024); 30 ml reagent lahve (18); rotor adaptéry (240); držák rotor adapteru Špičky s filtrem, 1000 µl (1024) Sterilní,jednorázové špičky s filtrem. (rak) Rotor Adaptéry (10 x 24) QIAamp Viral RNA Mini Pro 240 prepů: 240 jednorázové Rotor Adaptéry; Pro použití s QIAcube Další Pufry a Činidla; Accessory Set Pro použití s až 11 x QIAamp Viral RNA Mini Kits (50), katalog. číslo 52904, nebo 5 x QIAamp Viral RNA Mini Kit (250), katalog. číslo 52906, na QIAcube * * US, Kanada a Japonsko Zbytek světa. QIAamp Viral RNA Mini Uživatelská příručka 11/

38 Objednací informace Produkt Obsah Kat. č. Související produkty QIAamp Virus Kit Pro kopurifikaci virové RNA a DNA z plazmy nebo séra QIAamp MinElute Virus Spin Kit (50)* QIAamp MinElute Virus Vacuum Kit (50) Pro 50 miniprepů: 50 QIAamp MinElute kolonek, QIAGEN proteáza, Carrier RNA, Pufry, sběrné zkumavky (2 ml) Pro 50 miniprepů: 50 QIAamp MinElute Kolonek, QIAGEN Proteáza, Carrier RNA, Pufry, prodloužené zkumavky (3 ml), Sběrné zkumavky (1.5 ml) QIAamp UltraSens Virus Kit Pro 50 izolací vir. Nukl kys.: (50) 50 QIAamp Mini Spin Kolonek, Proteináza K, Carrier RNA, Sběrné zkumavky (2 ml), Pufry QIAamp MinElute Media Kit Pro purification of DNA from liquid media QIAamp MinElute Media Kit Pro 50 miniprepů: 50 QIAamp MinElute Kolonek, QIAGEN Proteináza K, Carrier RNA, Pufry, prodloužené zkumavky (3 ml), Sběrné zkumavky (1.5 ml) QIAamp Media MDx Kit Pro automatickou purifikaci DNA z tekutých médií použitím stanice BioRobot MDx QIAamp Media MDx Kit Pro 12 x 96 prepů: 12 QIAamp (12) 96 destiček, Pufry, Proteináza K, S-Blocks, jednorázový zásobník, Raky s eluč. mikrozkumavkami CL (0.4 ml), Carrier RNA, Top Elute Fluid, uzávěry, Tape Pad QIAamp Virus BioRobot Kit Pro automatizovanou, high-throughput purifikaci virové RNA a DNA z plazmy nebo séra QIAamp Virus BioRobot Pro 12 x 96 prepů: 12 QIAamp * Pro plnou automatizaci na QIAcube. Viz pro protokoly. Ostatní velikosti souprav ; viz * Promývací pufry jsou označeny čárovými kódydatum expirace je uvedena na Q-card uvnitř soupravy. 38 QIAamp Viral RNA Mini Uživatelská příručka 11/2016

39 Objednací informace Produkt Obsah Kat. č. EZ1 Virus Mini Kit v2.0 Pro automatickou purifikaci virových nukleových kyselin z 1 6 nebo 1 14 vzorků v jednom běhu EZ1 Virus Mini Kit v2.0 (48) EZ1 Virus Card v2.0 Pro 48 prepů: Reagent Cartridges (Virus Mini v2.0), jednorázové špičky s filtrem, jednorázový Tip-Holders, zkumavky na vzorky (2 ml), eluční zkumavky (1.5 ml), pufr AVE, Carrier RNA Předprogramovaná karta pro EZ1 Virus v2.0 protokoly MagAttract Virus Mini M48 Kit Pro automatickou, kopurifikaci virové DNA a RNA ze séra, plazmy, použitím stanice BioRobot M48 MagAttract Virus Mini M48 Kit (192) App. Package, M48, Pro inf. onemocnění Pro 192 prepů vir. nuk.kys.: MagAttract Suspension B a RNase-Free činidla a pufry Software protocol package pro apl. inf.onemocnění, v. 2.0, na stanici BioRobot M48 QIAamp RNA Blood Mini Kit Pro total RNA purification from blood a body fluids QIAamp RNA Blood Mini Kit (50) Pro 50 RNA preps: 50 QIAamp Mini Spin Kolonek, 50 QIAshredder Spin kolonek, sběrné zkumavky (1.5 ml a 2 ml), RNase-free činidla a pufry QIAamp DNA Blood Mini Kit Pro purifikaci genomové DNA z krve a tělních tekutin QIAamp DNA Blood Mini Kit Pro 50 miniprepů: 50 QIAamp Mini (50)* Spin kolonek, QIAGEN Proteáza, činidla, Pufry, a Sběrné zkumavky (2 ml) * Pro plnou automatizaci na QIAcube. viz pro protokoly. Ostatní velikosti souprav jsou dostupné ; viz QIAamp Viral RNA Mini Uživatelská příručka 11/

40 Objednací informace Produkt Obsah Kat. č. QIAamp 96 DNA Blood Kit Pro high-throughput purifikaci genomové DNA z krve a tělních tekutin QIAamp 96 DNA Blood Kit Pro 4 x 96 prepů: 4 QIAamp 96 dest., (4)* QIAGEN proteáza, činidla, pufry, Lyzační dest. a sběrné nádoby QIAamp DNA Mini Kit Pro purifikaci genomové DNA z tkáně, krve a tělních tekutin QIAamp DNA Mini Kit (50)* Pro 50 miniprepů: 50 QIAamp Mini Spin kolonek, proteináza K, činidla, pufry a sběrné zkumavky (2 ml) Příslušenství Pufr AW1 (koncentrát) Pufr AW2 (koncentrát) Pufr AVL Pufr AL 242 ml Wash Pufr 1 koncentrát pro 1000 preparací 324 ml Wash Pufr 2 koncentrát pro 1000 preparací 5 x 31 ml Viral Lysis Pufr a 5 x 310 µg Carrier RNA pro 250 preparací 216 ml Pro 1000 preparací Pufr ATL 200 ml Tissue Lysis Pufr pro 1000 preparací Pufr AE 240 ml Elution Pufr pro 1000 preparací Pufr AVE (108 x 2 ml) Carrier RNA (12 x 1350 µg) Sběrné zkumavky (2 ml) QIAGEN Proteáza QIAGEN Proteáza 1000 sběrné zkumavky (2 ml) 125 mg (40 45 mau/mg lyophilized) 4 x 125 mg (40 45 mau/mg * Ostatní velikosti souprav jsou dostupné ; viz Vyžaduje použití QIAGEN 96-Well-Plate centrifugační systém. Informujte se prosím. Pro plnou automatizaci na QIAcube. viz pro protokoly.. 40 QIAamp Viral RNA Mini Uživatelská příručka 11/2016

41 Objednací informace Produkt Obsah Kat. č. Rozpuštěná proteáza QIAGEN Proteináza K (2) 2 ml (>600 mau/ml, roztok) QIAGEN Proteináza K (10) 10 ml (>600 mau/ml, roztok) QIAvac 24 Plus Vakuový manifold pro zpracování spin kolonek: včetně QIAvac 24 Plus vakuového manifoldu, Luer rychlospojky VacConnectors (500) 500 jednorázových konenktorů pro užití s QIAamp spin kolonkami v luer connektorech VacValves (24) 24 valves pro užití s QIAvac a QIAvac 24 Plus Vakuová pumpa Univerzální vakuová pumpa (kapacita 84000* 34 L/min, 8 mbar vakua abs.) QIAvac Connecting System System pro spojení manifoldu a Vakuové pumpy: včetně misky, odpad.lahví, hadic, spojek, ventilů, rozboček, 24 VacValves Vacuum Regulator Pro užití s QIAvac manifoldem Pro aktuální licenční informace a produktově specifické prohlášení, viz příslušná QIAGEN uživatelská příručka nebo uživatelský manuál. QIAGEN uživatelské příručky a uživatelské manuály jsou dostupné na nebo mohou být vyžádány od QIAGEN Technical Services, nebo od lokálního distributora. * Japonsko. US a Kanada. Zbytek světa. QIAamp Viral RNA Mini Uživatelská příručka 11/

42 Poznámky 42 QIAamp Viral RNA Mini Uživatelská příručka 11/2016

43 Ochranné známky: QIAGEN, QIAamp, QIAcube, BioRobot, EZ1, MagAttract, MinElute, UltraSens (QIAGEN Group); Centricon, UltraFree (Merck KGaA); Corex (Corning, Inc.); Tween (ICI Americas Inc.). Limitované licenční ujednání pro QIAamp DNA Mini Kit a QIAamp DNA Blood Mini Kit Použití tohoto výrobku znamená souhlas jakéhokoli kupujícího nebo uživatele výrobku s následujícími podmínkami: 1. Produkt může být použit pouze v souladu s protokoly a touto uživatelskou příručkou, dodáváných společně s výrobkem. QIAGEN neposkytuje žádnou licenci v rámci kteréhokoliv svého duševního vlastnictví k použití, nebo k začlenění přiložených komponent sady s komponenty, které nejsou zahrnuty v této soupravě, s výjimkou případů uvedených v příručce této soupravy a dodatečných protokolech dostupných na Některé z těchto dodatečných protokolů mohou být poskytnuty uživateli QIAGEN pro uživatele QIAGEN. Tyto protokoly nebyly důkladně testovány společností QIAGEN. QIAGEN nezaručuje a nenese odpovědnost, že poruší práva třetích stran 2. QIAGEN neposkytuje žádnou jinou záruku než výslovně stanovené licence v tom smyslu, že tato sada a/nebo její použití nenarušuje práva třetích stran 3. Tato sada a její díly jsou licencovány k jednorázovému použití a nesmí se používat opakovaně, přepracována ani opakovaně prodávat 4. QIAGEN specificky odmítá jakékoliv další výslovné nebo nepřímé licence s výjimkou těch, které jsou uvedeny výslovně. Kupující a uživatel této sady souhlasí s tím, že neposkytne a nepovolí nikomu jinému provádět žádné kroky, které by mohly vést nebo by usnadnily jakékoliv shora zakázané činnosti. QIAGEN může zákazy tohoto Omezeného licenčního ujednání prosadit u každého soudu a vyžadovat úhradu všech vyšetřovacích a soudních poplatků, vč. poplatků za advokáta, v rámci jakéhokoliv postupu k prosazení tohoto Omezeného licenčního ujednání nebo jakýchkoliv jiných práv duševního vlastnictví vztahujících se na tuto soupravu a/nebo její komponenty Pro aktuální licenční ujednání, viz QIAGEN, všechna práva vyhrazena.

44 Australia Austria Belgium Brazil Canada China Denmark Finland France Germany Hong Kong India Ireland Italy Japan Korea (South) Luxembourgh Mexico The Netherlands Norway Singapore Sweden Switzerland UK USA