Kvalitativní chemická analýza moči

Transkript

1 Návod do laboratorního cvičení z klinické analytické chemie Kvalitativní chemická analýza moči Analýza moči má značný význam zejména pro posuzování funkce ledvin, ale i jiných orgánů jako jsou např. játra nebo pankreas. Kvalitativní vyšetření se provádí nejčastěji pomocí diagnostických proužků (DP), indikátorových tablet nebo zkumavkovými reakcemi. Hlavními parametry určovanými při kvalitativní analýze moči jsou: ph, bílkoviny (proteiny), glukóza, acetonové látky (ketony) a přítomnost krve. Dalším důležitým kvalitativním parametrem určovaným z moči je přítomnost vyšší koncentrace lidského choriového gonadotropinu (hcg), která diagnostikuje těhotenství. ph moči Udržování stálého ph, resp. acidobazické rovnováhy je základní podmínkou životních procesů. Stanovení ph se provádí co nejdříve, aby nedošlo k rozmnožení mikroorganismů, které je spojeno s produkcí amoniaku (vznikajícího rozkladem močoviny), a tím vede ke zvýšení ph. Referenční hodnota je 5,5 6,5. Test na diagnostických proužcích (DP PHAN) je založen na reakci směsného acidobazického indikátoru (0,71 % methylčerveň a 12,1 % bromthymolová modř) s barevným přechodem z oranžové přes žlutou a zelenou do modré v rozmezí ph 5 9. Hodnotu ph lze odečíst s přesností 0,5 jednotky ph. proteiny v moči Přítomnost proteinů v moči nazýváme proteinurií a rozlišujeme tři stavy proteinurie: přechodný, funkční a patologický. Přechodná proteinurie se objevuje např. při horečce malých dětí nebo u rychle rostoucích dětí a souvisí se změnami v oblasti bederní páteře. Funkční proteinurie bývá způsobena tělesnou nebo duševní námahou, těhotenstvím, teplotními výkyvy nebo některými léky. Příčinou patologické proteinurie jsou chronické záněty ledvin, nefrózy, horečnatá onemocnění, těžké srdeční a cévní choroby, požití toxických látek apod. Hlavní složkou proteinů v moči je albumin. Referenční hodnota je < 0,2 g/24 hodin, resp. < 0,1 g/l. Test na diagnostických proužcích (DP PHAN) je založen na změně barvy acidobazického indikátoru (0,21 % tetrabromofenolftalein ester, 0,35 % bromthymolová modř) vlivem proteinů. Test je zejména citlivý na albumin, podstatně nižší citlivost vykazuje vůči globulinům, mukoproteinům nebo hemoglobinu. glukóza v moči Glukóza je nejčastějším cukrem v moči (u kojených dětí ještě laktóza). Do moči se dostává glomerulární filtrací, ale většina glukózy je vstřebávána v ledvinových tubulech zpět do krve. Kapacita tubulárních buněk pro resorpci glukózy je 8 11 mmol/l v plazmě. Pokud je tato

2 kapacita (tzv. ledvinový nebo renální práh) překročena, dostává se glukóza do moči. Při posuzování výsledků je potřeba mít na paměti, že ledvinový práh má značné individuální kolísání. Glukosurie (vylučování cukrů v moči) může znamenat nesprávnou rychlost podání při infuzi nebo při diabetes mellitus, v těhotenství, při onemocnění ledvin a jater, akutní pankreatitidě nebo při nádorových onemocněních. Referenční hodnoty glykosurie jsou 0,11 0,83 mmol/l v ranní moči (někdy se uvádí do 0,56 mmol/l). Test na diagnostickém proužku (DP PHAN) je založen na enzymové reakci glukosoxidázy (1,3 %) a peroxidázy (1,3 %), které oxidují glukózu, a následné reakci s tetramethylbenzidinem (21 %) za vniku zeleného zbarvení. ketony v moči Vylučování ketolátek močí se označuje jako ketonurie. Mezi základní ketolátky zahrnujeme kyselinu acetooctovou, kyselinu 3-hydroxymáselnou a aceton. Tyto vznikají v játrech jako meziprodukt při metabolismu lipidů a vylučují se v poměru aceton : kyselina acetooctová : kyselina 3-hydroxymáselná 0,78 : 0,2 : 0,02. Tento poměr je téměř konstantní, proto obvykle stačí sledovat jen aceton a zbytek dopočítat. U pacientů v těžkém šoku (nedostatek kyslíku) může dojít k změně tohoto poměru. Průkaz ketolátek v moči má velký význam pro včasné rozpoznání metabolické dekompenzace diabetiků. Za normálních okolností (pokud pacient nehladoví) je koncentrace ketolátek pod mezí detekce užívaných metod. Zvýšené koncentrace se pak vyskytují u hladovění, u redukčních diet, při námaze, horečnatých onemocněních apod. Test na diagnostickém proužku (DP PHAN) je založen na principu Legalovy reakce, kdy reagují ketolátky s nitroprussidem sodným (4,9 %) v alkalickém prostředí za tvorby červenofialového zbarvení, a je citlivější na kyselinu acetooctovou než aceton (barevná srovnávací stupnice je kalibrována rovněž na kyselinu acetooctovou). krev v moči Za normálních okolností se krevní barvivo v moči nevyskytuje. Nález krve v moči nazýváme hematurie a rozdělujeme ji na erytrocyturii a hemoglobinurii. V případě erytrocyturie se může jednat o zánět ledvin, močové kameny, hemofilii, úrazy a operace močových cest apod. Hemoglobinurie znamená přítomnost hemoglobinu v moči a dochází k ní při všech stavech provázených intravaskulárním rozpadem erytrocytů, např. při akutní hemolytické anemii, při popáleninách, při otravách chlorečnany nebo některými houbami apod. Test na diagnostickém proužku (DP PHAN) je založen na peroxidasové aktivitě hemoglobinu, který katalyzuje oxidaci indikátoru (1,5 % tetramethylbenzidin) organickým hydroperoxidem obsaženým v reagenční zóně (15,2 % kumenhydroperoxid). Test je vysoce citlivý na hemoglobin. lidský choriový gonadotropin (hcg) Lidský choriový gonadotropin (hcg) je glykoprotein ze skupiny hormonů gonadotropinů. Ve chvíli, kdy se oplodněné vajíčko zahnízdí do zbytnělé děložní sliznice, začínají první buňky, které tvoří základ placenty, uvolňovat do krevního oběhu chemické látky a hormony, které zabrání příchodu další menstruace. Jde hlavně o hcg, který také jako jeden z prvních ukazatelů prokáže, zda je žena těhotná. Přítomnost hcg lze zjistit jednoduchým vyšetřením

3 z krve a moči. U zhruba 5 % budoucích maminek lze tento hormon v určující hodnotě nad 5 mui/ml najít v krvi již 3. týden po poslední menstruaci, což je asi 8. den po oplodnění. Ve většině případů lze tento hormon v krvi určit již 11. den po oplodnění. Také těhotenské testy jsou založeny na přítomnosti tohoto hormonu, který se v době, kdy je již vajíčko bezpečně uhnízděno v děloze, objeví i v moči. Koncentrace hcg v těle budoucí maminky během prvního trimestru velmi rychle narůstá. Jeho množství v krvi se zpočátku zdvojnásobuje každé 2 3 dny. Proto je možné, že těhotenský test může být negativní a druhý den již naopak pozitivní. Vrchol hladiny hcg v krvi těhotné ženy nastává kolem týdne těhotenství a pak mírně opadá. Po 25. týdnu hodnota hcg již zůstává stabilní až do porodu. Jeho vylučování močí končí asi 7. den po porodu, tj. po vypuzení plodu a placenty. Hladina hodnoty hcg na začátku těhotenství a její vývoj: Doba od početí Doba od poslední menstruace miu/ml 7 dní (1. týden) 21 dní (3 týdny) dní 28 dní (4 týdny) dní 35 dní (5 týdnů) dní 42 dní (6 týdnů) dní dní (7 8 týdnů) dní dní (8 11 týdnů) dní dní (11 15 týdnů) týden Druhý trimestr Od 25 týdne Třetí trimestr Těhotenský test je založen na přímé reakci hcg se specifickou protilátkou a dále s barvivem, které vytváří v případě vazby barevný proužek. Kromě toho test obsahuje i tzv. kontrolní zónu, která slouží k důkazu, že reakce mohla proběhnout. Vyhodnocení se potom provádí následujícím způsobem: Výsledek (T = test, C = kontrola) Vyhodnocení negativní výsledek pozitivní výsledek

4 neplatný výsledek Těhotenský test je typickým příkladem diagnostiky, která je v dnešní době stále více využívána. Výroba takového testu je celkem jednoduchá nejběžněji se dodává ve dvou variantách viz obrázek níže. Obrázek 1: Těhotenské testy Nicméně design vlastního testu je v obou případech stejný (viz obrázek níže). Na plastovém vyztužení je položena membrána. Na levé straně membrány (začátek testu) je jedna nebo více podložek, které slouží k aplikaci vzorku nebo dalších imunoreagencií. Na vlastní membráně jsou pak minimálně dvě místa, na kterých jsou imobilizovány protilátky nebo konjugáty proteinů s analytem, v podobě úzkých příčných linek. O místě, kde je protilátka nebo konjugát protein-analyt imobilizován, rozhoduje zvolený formát detekce. Na pravé straně membrány (konec testu) je absorpční podložka, která urychluje tok membránou. Celý systém může být, zejména pro komerční účely, uložen v plastovém krytu, který má otvory pouze pro aplikaci vzorku a vizuální kontrolu testovací a kontrolní linie. Nejvýznamnější složky imunochemického testu jsou membrána, protilátka jako činidlo specificky vázající analyt a značka použitá k barevnému zviditelnění výsledku testu.

5 Obrázek 2: Struktura těhotenských testů Membrány používané pro přípravu diagnostických proužků představují jednu z nejdůležitějších částí systému. Jsou vesměs tenké a křehké, a proto jsou umístěny na plastovém vyztužení. Nejčastěji používaným materiálem je nitrocelulosa, kterou vyrábí řada firem, např. Whatman, Millipore. Využívány jsou však i jiné polymerní materiály, např. nylon nebo polyethylen19. Důležitá kritéria pro výběr membrány jsou její schopnost dobře vázat detekční činidlo, tj. proteiny (protilátky nebo konjugát protein-analyt) a vhodná velikost jejich pórů, která ovlivňuje kapilární síly a tím i průběh detekčního procesu. Velikost pórů vyráběných membrán je mezi 0,05 až 12 mm. Vlastnosti membrán však lépe charakterizuje rychlost průtoku kapaliny jejich kapilárami v cm/s. Rychlost průtoku roztoků analytu nebo značených molekul membránou významně ovlivňuje interakce detekčního činidla a analytu, a tudíž i výsledek analýzy. Obecně platí, že větší velikost pórů rozšiřuje testovací linku a potom je citlivost detekce nižší. Zatím však nebyl v literatuře popsán výběr vhodné membrány, a tak optimální podmínky detekce si musí zjistit každý experimentátor sám. Membrány s imobilizovanými proteiny mohou být skladovány při běžných teplotách v laboratoři po dobu několika měsíců.

6 Detekční systém obsahuje, kromě diagnostické membrány, ještě podložky pro aplikaci vzorku a konjugátu. Podložka pro vzorek je z celulózy a podložka pro konjugát je tvořena skleněnými, celulosovými nebo polyesterovými vlákny. Podložka sloužící pro aplikaci vzorku může být využita různým způsobem. Kromě jednoduché, přímé aplikace vzorku k analýze, může být tato podložka nasycena různými reagenciemi, např. proteiny, detergenty, které ovlivňují rychlost průtoku vzorku diagnostickou membránou, reakční dobu analýzy, ale mohou také působit jako filtr, který odstraňuje hrubé částice přítomné v analyzovaném vzorku. Rovněž v tomto případě musí experimentátor sám vyhledat optimální podmínky průběhu analýzy. Absorpční podložka působí jako tampon, nasává roztok z membrány a urychluje tak postup detekce. Nejčastěji se používají celulosové filtry. Výroba těchto systémů probíhá ve větším formátu a až na konci jsou testy nařezány proužky (viz obrázek). Obrázek 3: Výroba testovacích proužků Principem těhotenského testu je jednoduchá imunochemická reakce (resp. imunochemická reakce a chromatografie). Na konjugační podložku je nanesena barevně označená protilátka proti hcg (značená anti-hcg IgG). Na membránu je nanesena protilátka proti hcg (anti-hcg IgG) na testovací proužek a sekundární protilátka proti použité IgG (anti-igg) na kontrolní proužek. V případě, že je na podložku na vzorek nanesen vzorek obsahující hcg, dojde k jeho interakci se značenou protilátkou IgG (na konjugační podložce) a jeho transportu na membránu. Na testovacím proužku dojde k vytvoření barevného imunokomplexu značená anti-hcg IgG hcg anti-hcg IgG ( sendvič ). Na kontrolním proužku pak dojde k vytvoření barevného imunokomplexu značená anti-hcg IgG anti-igg. Pokud vzorek neobsahuje hcg, pak se nevytvoří sendvičový komplex (testovací proužek se nezbarví). Nicméně i tak je membránou unášena značená anti-hcg IgG, která zreaguje s anti-igg (vytvoří se imunokomplex značená anti-hcg IgG anti-igg ), takže se zbarví kontrolní proužek). Schéma tohoto principu je na následujícím obrázku.

7 Obrázek 4: Princip imunochemické reakce na testovacím proužku A pohled z boku, B princip reakce, C pohled shora, D komerční souprava, a podložka pro vzorek, b podložka pro konjugát, c testovací linie, d kontrolní linie, e absorpční podložka, f membrána, g podložka pod membránu, h plastový kryt, i konjugát inertní bílkoviny s haptenem, j hapten, k konjugát primární protilátky protilátky s barevnou částicí, l sekundární protilátka Použitá literatura: 1. S. Göselová a kol.: Imunodetekce v laterálním toku na membráně. Chem. Listy 108 (2014) Rapid Lateral Flow Test Strips: Considerations for Product Development. Merck Millipore. Billerica, MA, Internetové zdroje

8 ÚKOL Proveďte kvalitativní diagnostiku moči pomocí diagnostických proužků PHAN a pomocí těhotenského testu. Vyrobte si a otestujte vlastní diagnostický test na moč. POSTUP Se všemi vzorky pracujte jako s potenciálně infekčním materiálem v rukavicích! Diagnostika pomocí DP PHAN (ph, proteiny, glukóza, ketony, krev): 1. Vyjměte z tuby jen tolik proužků, kolik potřebujete. Tubu ihned zavřete původní zátkou obsahující sušidlo. Nedotýkejte se rukou reakčních zón. 2. Proužek krátce ponořte do vyšetřované moči (1 2 s) tak, aby všechny reagenční zóny byly smočeny. 3. Proužek otřete hranou o okraj nádoby a následně ještě hranu osušte buničinou, aby byla odstraněna přebytečná moč. Proužek ponechte ve vodorovné poloze. 4. Po cca 1 minutě vyhodnoťte zbarvení reagenčních zón vizuálně srovnáním s barevnou stupnicí na tubě DP PHAN. Diagnostika pomocí těhotenského testu: 1. Otevřete sáček s testovacím proužkem. Ponořte testovací proužek do vzorku moči tak, aby šipka směřovala do vzorku. Po 10 sekundách proužek vyjměte a položte jej na vodorovný, čistý a suchý povrch. 2. Pozitivní výsledek lze pozorovat již po 1 minutě. Pro potvrzení negativního výsledku je třeba vyčkat 3 minuty. Výsledek testu nelze odečíst po uplynutí delší doby jak 5 minut. Výroba diagnostického testu: 1. Nejprve připravíme konjugát protilátek s částicemi zlata ( značená anti-hcg IgG ). K 4 ml suspenze zlatých nanočástic se přidá 0,1 M K 2 CO 4, aby hodnota ph byla 8,8. K této suspenzi se za míchání přikapává 100 µl protilátky (roztok v 5 mm borátovém pufru, ph 8,8) o celkovém množství 50 µg. Po 2 h mírného míchání se přidá 200 µl 5 % BSA a suspenze míchá 30 minut. Následuje odstředění ( rpm, 5 C, 15 min), supernatant se odstraní, pelety jsou resuspendovány v 8 ml 5 mm borátového pufru (s 0,1 % BSA) a suspenze se opět 15 minut odstředí. Toto se opakuje ještě dvakrát, finální resuspendace je ve 2 ml 10 mm borátového pufru (s 1 % BSA, 2 % sacharózou, 0,02 % NaN 3 ). Takto připravený konjugát je uchováván v tmavé lahvi při 4 C. Konjugát je pro účely cvičení již připraven. 2. Dále se připraví konjugační podložka. Z papíru ze skleněných vláken se vystřihne podložka o velikosti cca 1,5 x 4 cm. Podložka pro konjugát se namočí do 10 mm PBS pufru ph 7,4 s 1 % BSA, 0,25 % Tween20, 1 % sacharózou a 0,02 % NaN 3 a usuší se při

9 37 C. Na podložku se pak nanese konjugát protilátek s částicemi zlata ředěný 1:2 10 mm PBS pufrem ph 7,4 (s 1 % BSA, 1 % sacharóza, 0,02 % NaN 3 ). Podložku pak usušíme při 37 C. 3. Pak se připraví podložka pro vzorek. Z celulózy se vystřihne podložka o velikosti cca 1,5 x 4 cm. Podložka pro vzorek se namočí do 10 mm PBS pufru ph 7,4 s 1 % BSA, 0,25 % Tween20 a 0,02 % NaN 3 a usuší se při 37 C. 4. Nyní připravíme vlastní testovací platformu. Ze samolepící fólie si vystřihneme panel 7 x 4 cm. Naznačíme si na něj tužkou prostor pro membránu 1 cm od horního okraje (konce testu) a 2 cm od spodního okraje (startu testu). 5. Vystřihneme si panel nitrocelulózové membrány 4 x 4 cm. Membránu stříháme včetně podkladového papíru (lépe se stříhá). Membránu následně přilepíme na fólii (lepíme ze strany membrány, ale včetně podkladového papíru; po přilepení papír odstraníme). 6. Na membránu naneseme ve vzdálenosti 3,5 cm od startu roztok hcg protilátky o koncentraci 50 µg/ml v PBS pufru (testovací proužek) a 4,5 cm od startu roztok IgG protilátky o koncentraci 200 µg/ml v PBS pufru (kontrolní proužek). Nanášíme mikropipetkou přes vyříznutou fólii, nanesené roztoky obou směsí vysušíme při 37 C, nanášíme 3x. 7. Pří lepení dalších částí testu nesmí dojít ke kontaminaci obou proužků (ani bychom na ně neměli sáhnout). 8. Následně na fólii nalepíme vysušenou konjugační podložku (podložku lepíme ze strany startu, tak aby o cca 0,5 cm překrývala membránu; podložku přiložíme na membránu a pak ji přilepíme na fólii). 9. Pak na fólii nalepíme absorpční podložku, tak aby o cca 0,5 1 cm překrývala membránu (podložku lepíme ze strany konce testu; podložku přiložíme na konec fólie a lepíme ji směrem k membráně). 10. Jako poslední nalepíme na fólii podložku pro nanesení vzorku. Tuto lepíme vysušenou tak aby překrývala o cca 0,5 1 cm konjugační podložku. Podložka na nanesení vzorku nikdy nesmí být v kontaktu s membránou. Podložku opět lepíme ze strany startu směrem ke konjugační podložce. 11. V této fázi dochází v praxi k laminování a řezání testů. V našem případě připravený test na kancelářské řezačce (nebo nůžkami) rozdělíme na dva proužky o šířce 2 cm. Pro lepší uchycení podložek můžeme příslušné části obalit izolepou. Takto připravený test je nachystaný pro použití. 12. Otestujeme použití připraveného testu na moči. Postupujeme stejně jako v případě komerčního testu na stanovení hladiny hcg. Vzorek by se měl dávkovat pouze na podložku pro nanesení vzorku! To znamená, že v případě testu, na který se vzorek kape, kápneme moč pouze na podložku na nanesení vzorku v místě, kde se nepřekrývá s konjugační podložkou. V případě testu, kdy test (proužek) ponoříme do vzorku moče, musíme vyznačit na podložce pro vzorek maximální linii pro ponoření (cca 0,5 cm pod konjugační podložkou).