Detekce včelích virů (Picornaviridae), jejich variabilita, přenos a patogeneze

Transkript

1 Přírodovědecká fakulta Univerzity Karlovy Katedra zoologie Detekce včelích virů (Picornaviridae), jejich variabilita, přenos a patogeneze Bakalářská práce David Šesták Školitel: Mgr. Štěpán Ryba Praha 2010

2 Prohlášení Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma Detekce včelích virů čeledi (Picornaviridae), jejich variabilita, přenos a patogeneze vypracoval samostatně. Materiály k této práci jsem čerpal především z internetu. Většinu článků jsem vyhledal na serverech Web of Science, Pubmed a Google Scholar. Mnoho cenných rad a pomocných materiálů mi poskytl můj školitel Mgr. Štěpán Ryba, kterému tímto děkuji. Důležité informace poskytli i vážený pan Philippe Blanchard a vážená paní Petra Forgách. Veškerou použitou literaturu a podkladové materiály uvádím v přiloženém seznamu literatury. V Praze dne Podpis

3 Obsah Abstrakt... 5 Abstract... 5 Klíčová slova... 5 Seznam zkratek Úvod Apis mellifera Včelí viry Picornaviridae Iflavirus Dicistroviridae Cripavirus Metody detekce včelích virů Reverzní PCR Příprava Izolace RNA ze vzorku cdna PCR Elektroforéza a focení Interakce včelích virů a jiných činitelů, CCD Varroa destructor ABPV Acute Bee Paralysis Virus Popis a výskyt Taxonomie, genom a partikule Transmise Patogeneze BQCV Black Queen Cell Virus Popis a výskyt Taxonomie, genom a partikule Transmise Patogeneze CBPV Chronic Bee Paralysis Virus Popis a výskyt Taxonomie, genom a partikule Transmise Patogeneze DWV Deformed Wing Virus Popis a výskyt Taxonomie, genom a partikule Transmise Patogeneze IAPV - Israeli Acute Paralysis Virus Popis a výskyt Taxonomie, genom a partikule Patogeneze KBV Kashmir Bee Virus Popis a výskyt Taxonomie, genom a partikule Transmise

4 12.4. Patogeneze KV - Kakugo Virus Popis a výskyt Taxonomie, genom a partikule Transmise Patogeneze SBV Sacbrood Virus Popis a výskyt Taxonomie, genom a partikule Transmise Patogeneze Ostatní včelí viry Podobnost a společný výskyt virů Závěr Seznam použité literatury

5 Abstrakt Včela medonosná (Apis mellifera) je hostitelem devatenácti DNA a RNA virů. Včelí viry z čeledí Picornaviridae a Dicistroviridae patří mezi neobalené RNA viry s jedním pozitivním vláknem (+ss RNA viry). Současný výzkum se soustřeďuje především na osm virů. Jedná se o ABPV, BQCV, CBPV, DWV, IAPV, KBV, KV a SBV. Všechny tyto patogeny se stávají extrémně nebezpečnými především v kombinaci s dalšími stresovými faktory, jako např. špatné počasí. Hlavním problémem posledních třiceti let je společný výskyt virů a jiných parazitů včel. Především se jedná o roztoče Varroa destructor, Tropilaelaps mercedesae a hmyzomorku Nosema apis. Společným působením včelích virů a výše zmíněných eukaryotických parazitů může dojít k vyhubení celých kolonií včel. Abstract Honeybee (Apis mellifera) is a host of nineteen DNA and RNA viruses. Honeybee viruses from Picornaviridae and Dicistroviridae family belong to the uncoated positive-strand RNA viruses (+ss RNA viruses). Current research is focused in eight viruses. These are ABPV, BQCV, CBPV, DWV, IAPV, KBV, KV and SBV. All these pathogens become extremely dangerous mainly in combination with another stress factors, such as bad weather. Main problem of the last thirthy years is the coincidence between bee viruses and other honeybee parasites. These are Varroa destructor, Tropilaelaps mercedesae and Nosema apis. By the joint influence of bee viruses and eucaryotic parasites mentioned above, whole bee colonies may become eradicated. Klíčová slova: ABPV, Apis mellifera, BQCV, CBV, DWV, IAPV, KBV, KV, SBV, Varroa destructor, včelí viry 5

6 Seznam zkratek aa... amino acid ABPV... acute bee paralysis virus AGID... agarose gel immunodiffusion AHBs... americké včely pocházející ze tří podruhů AIV... apis iridescent virus ABV... arkansas bee virus BBPV... berkeley bee picornavirus BLAST... basic local alignment search tool BPMS... bee parasitic mite syndrome BQCV... black queen cell virus BVX... bee virus X BVY... bee virus Y CBPV... chronic bee paralysis virus CCD... colony collapse disorder CPVA... chronic paralysis virus associate CtRLVaRNA... Carrot red leaf luteovirus associated RNA CWV... cloudy wing virus DWV... deformed wing virus EBV... egypt bee virus eif... eukaryotic translation initiation factor ELISA... enzyme-linked immunosorbent assay Et al... et alli FV... filamentous virus HEX... random hexamer primer IAPV... izraeli acute paralysis virus IRES... internal ribosome entry site KBV... kashmir bee virus MW... molecular weight nt... nucleotid NVC... nucleospin viral columns ORF... open reading frame RdRP... RNA-dependent RNA polymerase 6

7 RPM... rotations per minute RT-PCR... reverse transcription polymerase chain reaction SBV... sacbrood virus SmV A... sclerophthora macrospora virus A SPV... slow paralysis virus TSBV... thai sacbrood virus UTR... untranslated region VDV-1... varroa destructor virus 1 Vpg... viral protein genome-linked VPS... virus particles size 7

8 1. Úvod Tato práce se zabývá včelími viry z čeledi Picornaviridae a jejich vlivem na život včel. První studie zabývající se touto problematikou pochází již z počátku dvacátého století (White, 1917 in Ghosh et al., 1999). Intenzivnější výzkum včelích virů začal probíhat od druhé poloviny minulého století (Bailey, 1963, 1968). Včelí viry, zmiňované v této studii, patří do čeledí Picornaviridae a Dicistroviridae. Obě tyto čeledě obsahují viry s genomem tvořeným RNA o kladné polaritě a sdílí celou řadu společných znaků. Mezi rozdílné vlastnosti patří počet cistronů genomu, poloha strukturálních a nestrukturálních genů a struktura a počet IRES (Flint, 2004; Knipe et al., 2007; Le Gall et al., 2008). Do čeledě Dicistroviridae patří ABPV, BQCV, IAPV a KBV (Mayo, 2002; Christian et al., 2005 in Blanchard et al., 2008). DWV, KV a SBV patří do rodu Iflavirus řazeného do čeledi Picornaviridae (Ghosh et al., 1999; Mayo, 2002; Fujiyuki et al., 2004). CBPV zůstává prozatím nezařazen (Olivier et al., 2007). Tyto viry se stávají extrémně nebezpečnými především v kombinaci s dalšími stresovými faktory, jako jsou např. nepříznivé klimatické podmínky, pesticidy nebo únava kolonie způsobená zvýšenou aktivitou včelstva během letních měsíců (Allen and Ball, 1996). Hlavním problémem je společný výskyt virů a jiných parazitů včel. Především se jedná o roztoče Varroa destructor (Bowen- Walker, 1998), Tropilaelaps mercedesae (Dainat et al., 2008; Forsgren et al., 2009) a mikrosporidie Nosema ceranea a Nosema apis (Allen and Ball, 1996; Higes et al., 2006). Společným působením včelích virů a výše zmíněných parazitů může dojít k oslabení včelího společenstva nebo k jeho kolapsu (Hung et al., 1996). Práce je rozdělena do několika kapitol. V první kapitole se zabývám popisem včely medonosné (Apis mellifera) a obecnou charakteristikou čeledí Picornaviridae a Dicistroviridae. Další kapitoly jsou věnovány popisu nejčastějších detekčních metod, s důrazem na reverzní PCR, a ektoparazitickému roztoči Varroa destructor. Největší část práce je věnována charakteristice osmi nejvýznamnějších virů včely medonosné. U každého je zmíněn jak popis viru, tak i výskyt, popis genomu, proces přenosu a patogeneze. Poslední kapitoly jsou věnována ostatním včelím virům a vzájemné podobnosti virů, z čeledí Picornaviridae a Dicistroviridae, a jejich společnému výskytu. Cílem této práce je přehledně utřídit veškeré relevantní informace jak o včelích virech nezařazených, tak o virech z čeledí Picornaviridae a Dicistroviridae a nastínit oblasti, kterými by se mohl ubírat budoucí výzkum. 8

9 2 Apis mellifera Včela medonosná patří mezi blanokřídlý sociální hmyz a jedná se o nejvýznamnějšího opylovače živočišné říše. Samičky se dělí na královny a dělnice. Každá kolonie má jen jednu královnu, která je jediná z celé kolonie schopná produkovat vajíčka. Dělnice mají nevyvinuté pohlavní orgány a jejich úkolem je vyhledávání a sběr potravy, tvorba plástů, ochrana kolonie a krmení královny, trubců i plodu. Samci, trubci, mají za úkol oplodnit královnu. (www zdroje 1;2) Včely jsou hostiteli několika více či méně nebezpečných parazitů. Kromě virů jsou včely běžně napadány bakteriemi, houbami, prvoky, roztoči a brouky (Ellis and Munn, 2005). 3. Včelí viry Včela medonosná (Apis mellifera) je hostitelem devatenácti dosud znamých virů: ABPV, ABV, AIV, BBPV, BQCV, BVY, BVX, CBPV, CPVA, CWV, DWV, EBV, FV, IAPV, KBV, KV, SBV, SPV, TSBV (Allen and Ball, 1996; Fujiyuki, 2004; Maori et al., 2007). Kromě dvou výjimek v podobě AIV a FV se jedná o plus RNA viry z čeledí Picornaviridae a Dicistroviridae a jeden virus nezařazený (Yue, 2006). Čeledě Picornaviridae a Dicistroviridae sdílejí celou řadu společných znaků. Předně se jedná o neobalené viry, jejichž genom je tvořen jednořetězcovou lineární RNA v kladném smyslu translace. To znamená, že virová RNA slouží stejně jako mrna přímo k tvorbě proteinů. Nejprve vzniká polyprotein. Ten je dále dělen autoproteolyticky, tedy bez účasti proteáz hostitelské buňky, již během translace, na jednotlivé virové proteiny. Všechny důležité proteázy si viry z těchto čeledí kódují sami. Replikace virů probíhá v cytoplazmě hostitelské buňky. Nejprve je vytvořen (-) RNA řetězec a podle něj jsou pak vytvářeny (+) RNA genomy. (Flint, 2004; Knipe et al., 2007; Le Gall et al., 2008). Délka genomu včelích virů z těchto čeledí se pohybuje mezi nt. K 5 -konci je kovalentně připojen VPg o relativní molekulové hmotnosti menší než 5 kda. 3 -konec je polyadenylován (Flint, 2004; Knipe et al., 2007; Le Gall et al., 2008). U eukaryotických mrna, které mají na svém 5 -konci methylguanosinovou čepičku, prohlíží ribozom vlákno od 5 -konce dokud nenarazí na AUG kodon, který iniciuje translaci. U čeledí Picornaviridae a Dicistroviridae je iniciace translace odlišná. Zástupci těchto čeledí obsahují IRES, což je nt dlouhý úsek vysoce strukturované RNA umístěné v 5 UTR. Tento element umožňuje provádět translaci nezávisle jak na čepičce, tak na skenování od 5 -konce (Borman et al., 1997). 9

10 Viriony virů z čeledí Picornaviridae a Dicistroviridae jsou neobalené, velké v průměru kolem 30 nm a mají ikosahedrální symetrii. Kapsida je složená ze tří strukturálních proteinů o molekulové váze přibližně 25 kda (VP1, VP2, VP3 resp. CP1. CP2, CP3). Čtvrtý protein VP4 se nachází uvnitř kapsidy a od předchozích tří se liší strukturou i sekvencí aminokyselin. Triangulační číslo je rovno třem, ale jedná se spíše o pseudo-t. Kapsida je tvořena šedesáti kapsomerami, z nichž každá je složená ze tří přibližně stejně velkých, ale nestejných domén. Jednotlivé domény jsou od sebe většinou proteolyticky odděleny. Zástupci obou čeledí mají v genomu jednotku složenou ze tří domén, obsahující helikázu typu III (Hel), cysteinovou proteázu (Pro) a RNA-dependentní RNA polymerázu (Pol) (Flint, 2004; Knipe et al., 2007; Le Gall et al., 2008) Picornaviridae Genom je monocistroní a virová RNA je infekční sama o sobě. Hned po vstupu do buňky je genom překládán a jsou tvořeny virové proteiny (Flint, 2004; Knipe et al., 2007; Le Gall et al., 2008). Pro navázání 40S podjednotky ribozomu je nutná speciální sekvence IRES. V buňkách, ve kterých se viry z čeledi Picornaviridae množí, dochází k rozštípání eif4g, pomocí proteázy 2A pro. To vede k zastavení translace téměř všech buněčných proteinů. Translace virových proteinů běží dál, protože C-terminální část eif4g stimuluje translaci zprostředkovanou přes IRES. Tato C-terminální část obsahuje vazebná místa pro eif3 a eif4a. Zdá se tedy, že 40S podjednotka ribozomu interaguje s eif3 na C-terminální části, která se váže na IRES. (Knipe et al., 2007) Iflavirus Rod Iflavirus patří do čeledi Picornaviridae. Na 5 -konci genomu se nachází geny strukturální (strukturální proteiny) a na 3 -konci geny nestrukturální (helikáza, proteáza, polymeráza) (Chen et al., 2004). Do rodu Iflavirus jsou řazeny Deformed wing virus (Fujiyuki et al., 2004), Kakugo virus (Mayo, 2002) a Sacbrood virus (Christian et al., 2002) Dicistroviridae Genom je bicistroní nesegmentovaný a obsahuje dvě ORF. Translace upstream ORF začíná na IRES podobnému IRES virů z čeledi Picornaviridae. Downstream ORF je translatováno z jiného IRES zcela nezávisle na translaci upstream ORF (Flint et al., 2004). Dicistroviridae má tedy dva ORF pro dva polyproteiny oddělené mezerou. ORF2 nezačíná běžným AUG kodónem, ale tripletem CCU. IRES uvnitř UTR váže 80S ribozom 10

11 za nepřítomnosti iniciační Met-tRNA i a iniciačních faktorů. Syntéza proteinů začíná od druhého kodónu GCU ležícího v A-místě ribozomu. Této specifické translace se účastní speciální struktura, která nahrazuje interakci mezi Met-tRNA i a P-místem iniciačního kodónu (Knipe et al., 2007). Prekurzorové proteiny jsou zpracovány proteázami kódovanými samotnými viry. Tyto proteázy jsou homologní 3C proteáze picorna virů. Nestrukturální geny se nachází na 5 -konci a strukturální geny na 3 -konci (Chen et al., 2004; Flint, 2004; Knipe et al., 2007; Le Gall et al., 2008) Cripavirus Čeleď Dicistroviridae obsahuje jediný rod Cripavirus (Mayo, 2002), do kterého patří Acute bee paralysis virus (Mayo, 2002), Black queen cell virus (Mayo, 2002). Kashmir bee virus (Mayo, 2002) a na základě homologického genomu i Izraeli acute paralysis virus (Christian et al., 2005 in Blanchard et al., 2008). Tabulka včelích virů z čeledí Dicistroviridae a Picornaviridae Virus Čeleď Rod Délka genomu GenBank ABPV Dicistroviridae Cripavirus 9491 nt AF BQCV Dicistroviridae Cripavirus 8550 nt AF DWV Picornaviridae Iflavirus nt AJ IAPV Dicistroviridae Cripavirus 9499 nt EF KBV Dicistroviridae Cripavirus 9524 nt AY KV Picornaviridae Iflavirus nt AB SBV Picornaviridae Iflavirus 8832 nt AF Metody detekce včelích virů Jedinci infikovaní včelími viry z čeledí Picornaviridae a Dicistroviridae často nejeví žádné příznaky. Proto se před samotnou detekcí může použít metoda sloužící k namnožení virů uvnitř hostitele. Aby se virus mohl dostatečně rozmnožit, využívá se zcentrifugovaný supernatant z rozmělněných patologicky podezřelých nebo asymptomatických jedinců rozpuštěný ve fyziologickém roztoku. Tento extrakt je poté injekčně vpraven do larev nebo do 11

12 hrudní oblasti dospělých včel, kde se virus množí (Bailey and Woods, 1977; Ribiére, 2000). Obecným pravidlem je fakt, že včelí viry se množí rychleji v larvách než v dospělých jedincích (Bailey and Woods, 1974). K detekci virů byly dlouho používány serologické metody, ELISA a elektronová mikroskopie (Bowen-Walker et al., 1999; Kukielka et al., 2007). Tyto techniky ale nebyly schopny zachytit viry, které se vyskytovaly ve formě asymptomatické infekce. Citlivost a specifita byly také nedostačující (Chen et al., 2004). Dnes už se proto používá téměř výhradně vysoce účinná, rychlá a cílená RT-PCR, která je i ekonomicky výhodnější (Benjeddou et al., 2001; Grabensteiner et al., 2001; Bakonyi et al., 2002, Ribiére et al. 2002; Fujiyuki et al., 2004; Yue and Genersch, 2005; Chen and Siede, 2007) a AGID test (Ball 1999; Ribiére et al. 2000; Benjeddou et al., 2001). Celá PCR může být ještě více zefektivněna vytvořením speciálních primerů, které mohou společně pracovat jako multiplex (Grabensteiner et al., 2007). Pro detekci ABPV, BQCV, DWV, SBV je možno použít i velmi přesnou SYBR Green RT-PCR spolu se speciálními primery. V některých případech může být Syber Green RT-PCR, přesnější až o 90 % oproti klasické RT-PCR. Kromě toho je metoda méně časově i finančně náročná (Kukielka et al., 2007, Kukielka et al., 2009). Další velmi sensitivní metodou je Western blotting užitá např. k identifikaci dalších CBPV asociovaných proteinů (Ribiére et al, 2000). K samotné extrakci RNA z infikovaných jedinců lze použít například Nucleospin RNAII total RNA isolation kit od Macherey-Nagel (Benjeddou et al., 2001). Nutné je zmínit i RP49 mrna, což je standardně užívaný kontrolní gen včely medonosné. Užívá se jako ověřovací sonda při použití TagMan RT-PCR (Ward, 2007) Reverzní PCR Reverzní PCR a následný AGID test patří mezi nejrozšířenější a nejspolehlivější metody detekce RNA. Níže uvedené parametry a množství jsou variabilní a mohou být různými autory uváděny jinak Příprava Při reverzní PCR používáme k detekci hlavu, hruď bez křídel a zadeček. Vzorky uchováváme při -80 C až -20ºC. Vybrané tkáně homogenizujeme 10 minut při frekvenci 30 a následně centrifugujeme (8000 RPM/1 min). 12

13 Izolace RNA ze vzorku Používáme NucleoSpin RNA Virus. 1) Smícháme 150 µl vzorku + 5 µl Proteinase K Solution a na 10 minut dáme do 40 C lázně. 2) Přimícháme 600 µl RAV 1 a na 5 minut vložíme do lázně 70 C. 3) Přidáme 600 µl % etanolu a sekund mícháme. 4) Šest NVC vložimé do 2ml sběrných tub a do každé NVC napipetujeme 700 µl zlyzovaného roztoku a centrifugujeme (8000 RPM/1 min). 5)Vyměníme sběrné tuby za čisté. NVC naplníme 500 µl bufferu RAW a centrifugujeme (8000 RPM/1 min). 6) Sběrné tuby vyměníme a do NVC napipetujeme 600 µl bufferu RAV3 (k RAV3 je nutné před použitím přidat 50 µl etanolu) a centrifugujeme (8000 RPM/1 min). 7) Sběrné tuby vyměníme za nové a do NVC přidáme 200 µl bufferu RAV3 a centrifugujeme (11000 RPM/4 min). 8) NVC umístíme do 1,5 ml centrifugačních tub a přidáme 50 µl RNAse-free vody předehřáté na 70ºC a dvě minuty inkubujeme. 9) Centrifugujeme (11000 RPM/1 min). Vzorky uchováváme v mrazáku při -20ºC (Macherey-Nagel, 2008) cdna 1) Smícháme 2 µl RNA (vzorek), 6 µl destilované vody, 1 µl HEXu a zahřejeme na 70ºC. 2) Do 1,5 ml ependorfky napipetujeme 6 µl destilované vody, 4 µl RT-bufferu, 1 µl Rnasinu (Ribolock RNAse), 2 µl 10 mm dntps, 1 µl RT (RevertAid TM). Po každém kroku důkladně propipetujeme. 3) Do ependorfky z kroku 1 přidáme 14 µl roztoku připraveného v kroku 2. 4) Cycler 48 C/60 min a 80 C/10 min PCR 1) Master mix: smícháme 13 µl destilované H 2 O + 2 µl bufferu (Brito A.S. 10 x Buffer) + 0,4 µl dntps (10 mm). Poté dáme na led a přidáme 0,1 µl Polymerázy Biotol. 2) Do zkumavky přidáme 0,155 µl (10 µm) forward primeru pro příslušný virus a 0,155 µl (10 µm) reverse primeru pro příslušný virus. 3) Do zkumavek z kroku 2 přidáme 1 µl vzroku a 15,9 µl Master mixu. 13

14 4) Cycler - reversní transkripce 50 C/30 min, následuje iniciace denaturace 94 C/2 min. Poté 35 amplifikačních cyklů 94 C/30 s, 60 C/30 s, a následně 72 C/30 s. Konečné nastavení 72 C/7 min Elektroforéza a focení Gel pro elektroforézu: smícháme 100 ml TBE 0,5 M + 0,7 agarózy µl ethidiumbromidu (přidává se až po ochlazení na 50 C). Přidáme 2,5 4 µl ORANGE G do každé zkumavky. Do levého výřezu přidáme standard a poté do každé zdířky napipetujeme 20 µl vzorku. Elektroforéza: 130 V/20 min. Focení: Používáme např. program AlphaDigiDoc. 5. Interakce včelích virů a jiných činitelů, CCD Většina virů se u včel nijak neprojevuje a jedná se tedy o asymptomatické přetrvávájící infekce, které propuknou většinou, až v přítomnosti dalšího faktoru, jakým může být nepříznivé počasí, bakteriální onemocnění, jednobuněční i mnohobuněční parazité či chemické látky vypouštěné do přírody člověkem. Hlavní roli samozřejmě hrají insekticidy a pesticidy, kterým jsou včely vystaveny při konzumaci nektaru (Bromenshenk, 1991). Problémem mohou být i látky používané proti včelím parazitům, jako např. akaricid používaný k hubení roztočů V. destructor, které oslabují imunitní systém včel (Broedsgaard,1996). CCD je soubor několika spolupůsobících faktorů charakteristický významným úbytkem dospělých včel. Tento úbytek zatím nebyl uspokojivě vysvětlen, protože v kolonii ani jejím okolí nebývají nalezeni žádní mrtví dospělci. V takto postižených společenstvech se o královnu stará jen několik málo mladých dospělců. (Cox-Foster et al., 2007). 6. Varroa destructor V. destructor ektoparazitický roztoč živící se hemolymfou včel (Rosenkranz et al., 2010). Původně napadal pouze východní včelu Apis cerana (Oudemans, 1904 in Rosenkranz et al., 2010). Do Evropy se virus dostal nejspíše v první polovině minulého století přes Rusko. Během posledních čtyřiceti let se roztoč rozšířil po celém světě. Až do roku 2000 byl V. destructor označován V. jacobsoni (Rosenkranz et al., 2010). 14

15 V. destructor je svým životním cyklem plně vázán na včely. Samičky prochází během životního cyklu dvěma fázemi. Foretickou fázi prožívají samičky na dospělých včelách, které je dopraví do larválních komůrek dělnic a trubců. V těchto komůrkách se odehrává fáze rozmnožovací. Samečci a nymfální stádia nežijí příliš dlouho a vyskytuji se pouze v larválních komůrkách (Kuenen and Calderone, 1997). Symptomy jednotlivých kolonií postižených V. destructor se lišily dle ročního období, ačkoli zastoupení virů zůstávalo stejné. V březnu bylo pozorováno rapidní snížení počtu jedinců v kolonii. Během července a srpna byl nejvyšší výskyt dezorientovaných a černých včel. Na podzim a v zimě byly zaznamenány náhlá zhroucení celých kolonií. Typickými příznaky jsou plazící se zmrzačené včely, poruchy sociálního chování, nedostatečná péče o larvy a především prudké vymření velké části kolonie (Berényi et al., 2006, Rosenkranz et al., 2010). V. destructor je hlavní příčinnou prudkého poklesu počtu včelstev v Evropě (Rosenkranz et al., 2010). Jinak téměř neškodné viry jako ABPV a KBV se v přítomnosti tohoto roztoče stávají extrémně nebezpečnými (Allen and Ball, 1996). V. destructor působí na včely několika způsoby. Intenzivní odsávání lymfy oslabuje infkované jedince. Způsobenými rankami se včely mohou infikovat viry a jinými patogeny a samozřejmě viry mohou být při sání přenášeny z roztoče přímo do hemolymfy včel. V těle V. destructor byly prozatím detekovány viry ABPV, DWV, IAPV, KBV a SBV. (Shen et al., 2005; Tentcheva et al., 2004; Boecking and Genersch, 2008). 7. ABPV Acute Bee Paralysis Virus 7.1. Popis a výskyt První zmínka o ABPV pochází z roku 1963, kdy byl popsán ve Velké Británii jako přetrvávající infekce bez znatelných symptomů. Jeho objev souvisí se studií přenosu KBV. Při tomto pokusu byl ABPV objeven jako znečišťující látka (Bailey et al., 1963). Hlášen byl prozatím z Itálie, Francie, Polska, Jugoslávie, Německa, Skandinávie, Maďarska, Rakouska, USA, Kanady, Brazílie, Uruguaje a Thajska (Bailey, 1965; Ritter et al., 1984 in Martin 2001; Kulnicevic et al., 1990 in Bákonyi et al., 2002; Carpana et al., 1991; Faucon et al., 1992; Topolska et al., 1995 in Bákonyi et al., 2002; Bákonyi et al., 2002; Antúnez et al., 2006; Sanpa a Chantawannakul, 2008; Teixeira et al., 2008). Tímto patogenem je nejspíše infikováno přes padesát procent evropské populace včel. Ve Francii se jedná o 67 % (Tentcheva et al., 2004) a v Maďarsku o 57 % testovaných včelstev (Bákonyi et al., 2002). 15

16 7.2. Taxonomie, genom a partikule Čeleď: Dicistroviridae Rod: Cripavirus (Mayo, 2002) Genom ABPV je dlouhý nukleotidů a je tvořen jednovláknovou pozitivní RNA s polyadenylovaným 3 -koncem (Govan et al., 2000). Nestrukturální proteiny jako RNAdependentní RNA-polymeráza, helikáza a proteáza jsou kódovány ORF1. ORF2 kóduje jeden vedlejší a tři základní proteiny kapsidy, které jsou dohromady přepisovány jako jeden polyprotein. Kompletní kapsidový polyprotein se nachází v pozici 6509 až 9253 a kóduje 914 aminokyselin dlouhý polypeptid (Bákonyi et al., 2002). Partikule jsou velké kolem 30 nm v průměru (Govan et al., 2000). Nukleotidová sekvence Rakouského izolátu se nachází v GenBank pod přístupovým kódem AY až AY (Bákonyi et al., 2002). Krátké sekvence pocházející z USA jsou pod kódy AF263724; AF263733; AF a AF až AF (Evans et al., 2001). Izolát z UK lze nalézt pod označením AF (Ghosh et al., 1999). Brazilské vzorky mají přiděleno přístupové číslo EU Kompletní genom má kód AF (Govan et al., 2000). Molekulární váhy tří hlavních proteinů jsou 24, 33 a 35 kda, vedlejší protein má mw 9,4 kda (Govan et al., 2000). Sedimentační koeficient částic ABPV je 163 S a vznášivá hustota má hodnotu 1380 g/ml při ph 7 a při ph 9 se zvětšuje až na 1430 g/ml (Bailey, 1968; Govan et al., 2000). V roce 2002 byla zpracována fylogenetická studie založená na 401 nukleotidů dlouhém úseku ( ) náležejícímu do regionu kapsidového proteinu (GenBank AF Govan and Davidson, 2000). Strom se skládal z celkem 32 izolátů pocházejících z Polska, Maďarska, Rakouska, Německa, USA a Velké Británie. Vyšly dvě hlavní větve, které odpovídaly regionálnímu rozdělení. První větev obsahovala izoláty z USA a UK, ve druhé se nacházely vzorky ze střední Evropy. V rámci střední Evropy se strom dělil na polskou, maďarskou a rakousko-německo-polskou větev. (Bákonyi et al., 2002) Transmise ABPV byl u včel detekován v mozku, ve slinných a podhltanových žlázách mozku, ve hrudi i v zadečku (Bailey and Milne, 1968; Ball, 1985 in Benjeddou et al., 2001) a ve spermatu trubců (Yue et al. 2006). V Austrálii byl ABPV izolován i z mrtvé larvy královny (Allen and Ball, 1996). U dospělých královen virus detekován nebyl (Chen, 2005). Při krmení se virus horizontálně šíří skrze slinné žlázy. ABPV je uchováván i v zásobách potravy, do kterých jsou přidávány výměšky slinných žláz (Ball, 1985 in Benjeddou et al., 2001). Včelí královna se běžně páří až s 28 trubci (Kraus et al. 2005). 16

17 Virus by se tedy mohl poměrně snadno šířit i vertikální cestou. Nicméně v kolonii, v níž byly všechny vzorky spermatu pozitivní, nebyli nalezeni infikovaní dospělci a ani při umělé inseminaci infikovaným spermatem nebylo potomstvo pozitivní (Yue et al., 2006). Přenos z roztoče V. destructor na dospělce, larvy i kukly byl potvrzen v laboratorních podmínkách (Allen and Ball, 1996). ABPV se, stejně jako např. DWV vyskytuje i u několika čmeláků rodu Bombus a v některých případech se tedy může jednat i o mezidruhový přenos (Bailey and Gibbs, 1964). V. destructor působí jako vektor, protože skrze jeho kousnutí se virové partikule dostávají do hemolymfy (Scott-Dupree and McCarthy, 1995 in Govan et al., 2000). Účinnost přenosu ABPV z V. destructor na kukly a dospělce je v závislosti na použité detekční metodě 50-80% (Wiegers, 1988) Patogeneze Jedinci napadení virem ABPV většinou nejeví žádné příznaky nákazy. Přesto může být tento virus pro včely neslučitelný se životem. (Bailey, 1965). Opravdu nebezpečným se virus stává především při spojení s V. destructor. V tomto případě je virus smrtelný pro dospělce i larvy a způsobuje kolapsy celých kolonií. Dokud nebyl do Evropy zavlečen V. destructor, nebyl ABPV izolován (Bailey et al., 1963; Allen and Ball, 1996). Při podání vyšších dávek infikované potravy nebo při umělém vpravení pomocí injekce je ABPV téměř vždy smrtelný. Známky ochrnutí jsou patrné do dvou dnů a po třech dnech včely umírají (Bailey et al., 1963; Nordström, 2000). Koncentrace ABPV v různých tělních částech dospělých včel se nemění, jsou-li včely virem krmeny (Bailey and Milne, 1968). Dávka ABPV v infikovaných koloniích je přibližně dvacetkrát vyšší než v koloniích zdravých (Berényi et al., 2006). 8. BQCV Black Queen Cell Virus 8.1. Popis a výskyt Virus byl původně popsán u mrtvých jedinců Apis mellifera získaných z volné přírody. Poprvé byl BQCV, i přes své jméno, získán nejen z larev královen, ale i z larev dělnic. Virus se vyskytuje na starém i novém kontinentu (Bailey and Woods, 1977). Izolován byl v Brazílii, Španělsku, Uruguaji, USA, Velké Británii, na Novém Zélandu i Asii (Hornitzky and Anderson, 1993; Allen and Ball, 1996; Antúnez et al., 2006, Kukielka et al., 17

18 2008; Teixeira et al., 2008). V Maďarsku byl tento patogen detekován u přibližně u 53 % testovaných kolonií (Forgách et al., 2007) Taxonomie, genom a partikule Čeleď: Dicistroviridae Rod: Cripavirus (Mayo, 2002) Až do roku 2002 byl řazen do skupiny picorna-like virů, které napadají včely (Leat et al., 2000). Genom je nečleněný a obsahuje dva cistrony (Berényi et al., 2006). Vzorek BQCV pocházející z Jižní Afriky má genom, bez poly(a), dlouhý 8550 nukleotidů a obsahuje dva otevřené čtecí rámce (ORF). 5 -proximální ORF kóduje nejspíše replikázový protein a další nestrukturální geny. 3 -proximální ORF kóduje kapsidový polyprotein a další strukturální geny (Leat et al., 2000; Berényi et al., 2006). Prozatím byly identifikovány čtyři proteiny kapsidy o molekulové hmotnosti 6, 29, 32 a 34 kda (Leat, 2000). Genovou sekvenci izolátu pocházejícího z Brazílie lze najít v GenBank pod kódem EU (Teixeira et al., 2008), vzorek pocházející z Jižní Afriky má přiděleno přístupové číslo AF a původní isolát (Rothamsted) je k nahlédnutí po zadání kombinace AF (Leat et al., 2000) Transmise U včelích královen byl BQCV detekován ve střevě, vaječnících a výkalech (Chen, 2005). Na rozdíl od CBPV či SBV se BQCV nemnoží v mozku (Bailey, 1977). V rámci přenosu BQCV se nejspíše uplatňují především paraziti V. destructor (Shimanuki et al., 1994) a Nosema apis (Allen and Ball, 1996). Larvy dělnic nebývají nakaženy tak často jako larvy královen, které se nejspíše infikují virovými partikulemi obsaženými v potravě (Allen and Ball, 1996) Patogeneze Ačkoli se BQCV běžně vyskytuje u dospělých včel, příznaky jsou nejlépe pozorovatelné na kuklách královen či ještě nezakuklených královnách (Laidlaw, 1979 in Chen and Siede, 2007). Stejně jako u SBV jsou jedinci po smrti tmaví (Berényi et al., 2006). Název viru je ale odvozen od černě zbarvených skvrn na stěnách komůrek, ve kterých se nachází napadení jedinci, nikoli od černých mrtvých individuí (Bailey et al., 1983). Při umělé infikaci larev dochází k zastavení vývinu během několika málo dní (Bailey and Woods, 1977). Příznaky infekce virem BQCV jsou nejlépe patrné během jara a také na počátku léta (Laidlaw, 1979 in Chen and Siede, 2007). Virus se často vyskytuje v koloniích zamořených 18

19 hmyzomorkou Nosema apis a může být hlavní příčinnou úmrtnosti včel v těchto koloniích (Bailey et al., 1983; Allen and Ball, 1996). V Británii se oba parazité objevují v koloniích v pravidelných cyklech, přičemž největší výskyt lze pozorovat na jaře a začátkem léta (Allen and Ball, 1996). V Rakousku byl výskyt Nosemy v BQCV infikovaných koloniích 75 % (Berényi et al., 2006). BQCV je nejběžnější především na jaře a začátkem léta, kdy napadá larvy, larvy královen i dospělé včely (Berényi et al., 2006). Při uměle vyvolané infekci se BQCV množí pouze u larev včel. U dospělců dochází k množení až v případě, že jsou jim v potravě podány spory druhu Nosema apis (Bailey et al., 1983). Stejně jako u ABPV i u tohoto viru je virová dávka postižených kolonií asi dvacetkrát vyšší oproti koloniím neinfikovaným (Berényi et al., 2006). 9. CBPV Chronic Bee Paralysis Virus 9.1. Popis a výskyt CBPV byl popsán již v šedesátých letech minuého století (Bailey, 1968 in Blanchard et al., 2007). Tento virus se dá označit za kosmopolitní patogen napadající dospělé včely (Blanchard et al., 2007), protože jeho výskyt byl potvrzen na všech kontinentech (Dall, 1985, Antúnez et al., 2006; Teixeira et al., 2008). V některých zemích může být postižena více než pětina včelstev (Blanchard et al., 2007), naopak v Maďarsku nebyl pozitivní ani jeden z padesáti dvou včelích vzorků (Forgách et al., 2007). Ve studii zaměřené na včelí královny bylo pozitivních 40 % testovaných vzorků (Chen et al., 2005) Taxonomie, genom a partikule CBPV nebyl prozatím zařazen do žádné čeledi. Dle fylogenetické studie založené na porovnání RdRp by byl CBPV, spolu s RNA satelitem CtRLVaRNA a SmV A, členem monofyletické skupiny mezi čeleděmi Tombusviridae a Nodaviridae. Při srovnání aminokyselinových sekvencí CBPV se sekvencemi dostupnými na NCBI nebyla nalezena žádná podobnost. Stejně tak porovnání osmi sekvencí kolem konzervovaných domén RdRp členů čeledě Dicistroviridae a CBPV prokázalo celkovou podobnost mezi 5,4% u BQCV až 12,5% u CrPV (Cricket paralysis virus). Zdá se tedy, že CBPV by mohl být prozatím jediným členem nové čeledi virů s RNA genomem o kladné polaritě (Olivier et al., 2007). CBPV se řadí mezi plus RNA viry s jednovláknovým článkovaným genomem. Sekvence RNA1 a RNA2 jsou dostupné na stránkách NCBI pod kódy EU a EU

20 Tyto dvě hlavní nukleové kyseliny se liší délkou. RNA1 je dlouhá přibližně 3674 nukleotidů a obsahuje tři ORF. RNA2 obsahuje asi 2305 nukleotidů a má ORF čtyři (Olivier et al, 2007). Částice tohoto viru mohou nabývat celé škály tvaru, od elipsoidů velikosti nm na 20 nm až po větveně struktury s délkou dosahující 640 nm (Bailey et al., 1963; Ball and Bailey, 1991 in Olivier et al., 2007). Ačkoli byl původně znám jen jeden protein virální kapsidy o 23,5 kda, byly před devíti lety Ribiérem za použití metody Western botting, objeveny další čtyři polypeptidy spojené s CBPV. Jejich molekulové hmotnosti činí 20, 30, 50 a 75 kda (Ribiére et al., 2000) Transmise Virus byl ve včelách identifikován v několika tělesných oddílech. V hlavové části byl výskyt potvrzen v mozkové tkáni a v čelistních a podhltanových gangliích. V hlavě včel se nachází několik milionů virových částic, což je asi polovina celkového množství (Blanchard et al, 2007; 2008). Postižená mohou být i zadečková a hrudní ganglia (Giauffret, 1966b, 1970 in Ribiére et al., 2002) a epitel střeva (Giauffret et al., 1966a in Ribiére et al., 2002). Naopak svalová a tuková tkáň se jeví bez výskytu virových partikulí (Lee and Furgala, 1965). U královen byl výskyt viru potvrzen pouze v hemolymfě a zbytcích těla, z něhož byly odstraněny spermatéka, střevo, vaječníky a hlava, které byly negativní (Chen et al, 2005). Včelí stráže obsahují obecně vyšší dávky viru než dělnice (Blanchard et al., 2007). Přenos je nejspíše uskutečňován buď příjmem virových partikulí spolu s potravou nebo průnikem skrze různá zranění (Berényi et al., 2006). Pomocí TagMan RT-PCR byly měřeny i hladiny CBPV u kukel, larev a vajec. Výsledky napovídaly, že vertikální přenos mezi královnou a potomstvem se nejspíše neuskutečňuje (Blanchard et al., 2006). Naopak mladší Chenova studie ukazuje, že jak vejce (50%), tak larvy (17%) postižených královen jsou pozitivní. Nepřítomnost CBPV v královniných vaječnících se dá vysvětlit nízkou nedetekovatelnou hladinou viru (Chen et al., 2004). Téměř dvojnásobné množství kopií CBPV, oproti dělnicím, bylo zjištěno u včelích stráží. Vzhledem k úloze stráží v úlu je pravděpodobné, že se mohou snáze infikovat díky častějšímu kontaktu s ostatními včelami. Až do roku 2007 byl CBPV zjištěn pouze u Apis mellifera (Allen and Ball, 1996). Výskyt u předpokládaného hlavního vektora, tedy V. destruktor potvrzen nebyl (Tentcheva et al., 2004; Yue and Genersch, 2005), ačkoli byl tento roztoč přítomen v úlech včel s jasnými příznaky nákazy (Blanchard et al., 2007). Blanchard a jeho kolektiv se začali zabývat otázkou, zda nemohou být za přenos zodpovědní i jiní vektoři. Do styku s pozorovanými včelami 20