ČESKÁ ZEMĚDĚLSKÁ UNI VERZITA V PRAZE

Transkript

1 ČESKÁ ZEMĚDĚLSKÁ UNI VERZITA V PRAZE FAKULTA AGROBIOLOGIE, POTRAVINOVÝCH A PŘÍRODNÍCH ZDROJŮ KATEDRA OBECNÉ ZOOTECHNIKY A ETOLOGIE CHARAKTERISTIKA ZBARVENÍ U STAROKLADRUBSKÝCH KONÍ A VÝSKYT MELANOMU DISERTAČNÍ PRÁCE Doktorand: Ing. Barbora Hofmanová Školitel: Doc. Ing. Mgr. Ivan Majzlík, CSc. PRAHA 2010

2 Tato disertační práce vznikla v rámci řešení výzkumných záměrů FAPPZ: Vyuţití genetické variability u hospodářských zvířat - MSM (řešení ) Setrvalé zemědělství, kvalita zemědělské produkce, krajinné a přírodní zdroje MSM etapa Agrobiologické základy setrvale udrţitelného zemědělství (řešení ) PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, ţe jsem disertační práci na téma Charakteristika zbarvení u starokladrubských koní a výskyt melanomu zpracovala samostatně a pouţila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloţeném seznamu. V Praze dne

3 PODĚKOVÁNÍ Doc. Ing. Mgr. Ivanu Majzlíkovi, CSc. nejen za odborné vedení práce, ale i za technickou pomoc při získávání dat. Ing. Luboši Vostrému, Ph.D. za cenné rady při statististickém vyhodnocování výsledků. Národnímu hřebčínu Kladruby nad Labem a ostatním chovatelům za umoţnění měření. Přátelům, rodině a kolegům (zejména doc. Ing. Karlu Machovi, CSc.) za psychickou podporu.

4 OBSAH 1 ÚVOD LITERÁRNÍ PŘEHLED Genetická determinace základních barev u koní Molekulárně genetická charakteristika lokusu EXTENSION Molekulárně genetická charakteristika lokusu AGOUTI Determinace světlých ( ředěných ) zbarvení Lokus COLOR (CREAM) - (C) Lokus DUN (D) Lokus SILVER (Z) Lokus CHAMPAGNE (Ch) Determinace bílých zbarvení Lokus GREY (G) Lokus ROAN (Rn) Lokus WHITE (W) Determinace různých typů strakatosti Lokus TOBIANO (To) Lokus OVERO (O) Lokus SABINO (SB) Lokus LEOPARD complex (Lp) Modifikační geny Odznaky Kvantitativní charakteristika vybělování Výskyt melanomu a vitiliga u vybělujících běloušů Starokladrubský kůň Historie plemene Zbarvení starokladrubského koně Chovný cíl CÍLE PRÁCE HYPOTÉZY MATERIÁL A METODIKA Struktura dat Kvantitativní charakteristika procesu vybělování Grafické znázornění průběhu vybělování pomocí růstových křivek Hodnocení výskytu melanomu Hodnocení výskytu vitiliga Statistické vyhodnocení výsledků Koeficient inbreedingu F X a jeho vliv na sledované proměnné Podíl původních starokladrubských genů a jeho vliv na sledované proměnné Stanovení genotypu na lokusu pro vybělování (G) a jeho vliv na sledované proměnné VÝSLEDKY A DISKUSE Vybělování u starokladrubského bělouše Grafické znázornění průběhu vybělování pomocí růstových křivek Statistická analýza dalších faktorů ovlivňujících úroveň vybělení Vyhodnocení výskytu melanomu Vyhodnocení rozdílů výskytu melanomu v liniích pomocí χ 2 testu Statistická analýza dalších faktorů ovlivňujících stupeň výskytu melanomu

5 6.3 Vyhodnocení výskytu vitiliga Vitiligo v oblasti zádě (vitiligo A) Vitiligo v oblasti hlavy (vitiligo F) Fenotypové a genetické parametry Fenotypové korelace Odhad genetických parametrů Analýza vlivu koeficientu inbreedingu F X na sledované proměnné Analýza vlivu podílu původních starokladrubských genů na sledované proměnné Analýza vlivu genotypu na lokusu G na sledované proměnné Netradiční zbarvení u starokladrubských koní ZÁVĚR SEZNAM POUŢITÉ LITERATURY PŘÍLOHY

6 1 ÚVOD Zbarvení srsti u zvířat je důleţitá vlastnost, která od zahájení procesu domestikace stojí v popředí zájmu chovatelů. Hospodářská zvířata vykazují větší variabilitu ve zbarvení oproti volně ţijícím populacím. U předků domestikovaných koní dominovalo tzv. divoké zbarvení, které umoţňovalo ukrývat se před přirozenými nepřáteli. Kromě této funkce pomáhalo zbarvení přizpůsobovat se podmínkám vnějšího prostředí, především rozdílné teplotě a úrovni slunečního záření (Klungland and Vage, 2000). Studie Ludwig et al. (2009) potvrzuje jednotné zbarvení předků dnešních plemen koní na základě analýzy DNA z kosterních pozůstatků. Ostatní zbarvení se objevila později díky vzniku nových mutací. V průběhu domestikačního procesu se pak rozšířila vzhledem k omezení působení přírodní selekce a výběrem určitých barev na základě chovatelských preferencí. Existují plemena koní, u kterých je zbarvení uniformní a je uváděno jako plemenný znak (např. clevelandský hnědák), u některých plemen se naopak vyskytují jedinci různých barev (např. anglický plnokrevník). Značná variabilita ve zbarvení domestikovaných koní umoţnila studovat genetické zaloţení podle fenotypového projevu (Wright, 1917; Salisbury, 1941; Castle, 1954). Tato charakteristika je lehce pozorovatelná a lze rovněţ snadno sledovat dědění zbarvení z generace na generaci, i kdyţ vzhledem k dlouhému generačnímu intervalu u koní jsou podobné studie časově náročné. Potřebné údaje je však moţno získat i zpětně z plemenných knih a dalších chovatelských záznamů, kdy je ovšem limitujícím faktorem přesnost záznamu fenotypu zbarvení. Zbarvení se stalo jedním z prvních modelů pro studium působení genů a genových interakcí. U savců byly první genetické studie spojeny právě se zbarvením srsti. Pravidla pro dědění jednotlivých barev byla odvozena na základě rodokmenů, případně ze záměrného páření zvířat známého genotypu (Searle, 1968). Zbarvení bylo zároveň jednou z prvních vlastností, která byla analyzována na molekulární úrovni. Jako modelový organismus slouţila myš domácí (Jackson, 1994). Bylo popsáno 80 různých mutací, které mají u myší vliv na zbarvení srsti. Většina genů vykazujících souvislost se zbarvením u myši koresponduje s geny řídícími pigmentaci u člověka (Jackson, 1997). Zbarvení je znak kvalitativní, vykazuje ve většině případů jednoduchou mendelistickou dědičnost. Prostředím je ovlivněno moderovaně. U koní se často projevují, někdy i dost výrazné, rozdíly v barvě srsti v zimním a letním období (Stachurska et al., 2004). 6

7 Ačkoli nebyl prokázán přímý vztah mezi barvou u koní a uţitkovými vlastnostmi jako například výkonnost (Dušek, 1980; Stachurska et al., 2007; Stachurska and Ussing, 2007), vytrvalost, charakter, temperament (Estes, 1948), konstituční zdatnost, u chovatelů koní stálo zbarvení vţdy v popředí zájmu. Správný popis zbarvení je důleţitý pro identifikaci zvířat. Znalostí genetického řízení zbarvení je moţno vyuţít v některých případech pro ověření rodičovství nebo selekcí a sestavením vhodných rodičovských párů zajistit v populaci zvýšení počtu jedinců s preferovaným zbarvením. K získání nových poznatků o molekulární podstatě jednotlivých zbarvení přispělo velkou měrou zmapování genomu koně. V současné době je jiţ k dispozici kompletní cytogenetická mapa, s označením homologních oblastí u koně, myši a člověka (Caetano et al., 1999; Chowdhary et al., 2003; Guérin et al., 2003; Penedo et al., 2005; Leeb et al., 2006). Uspořádání DNA genomu koně je moţno nalézt například na internetových stránkách: nebo 7

8 2 LITERÁRNÍ PŘEHLED 2.1 Genetická determinace základních barev u koní (lokusy COLOR, AGOUTI A EXTENSION) Základní schéma pro genetické zaloţení zbarvení u koní uvádí např. Sponenberg (1996, 2003), Bowling (1996), Jakubec (1998), Thiruvenkadan et al. (2008). Geny ovlivňující zbarvení u koní můţeme rozdělit do dvou hlavních skupin. První skupinu tvoří geny působící na melanocyty, na jejich vznik, diferenciaci, proliferaci a migraci a do druhé skupiny řadíme geny působící přímo na syntézu pigmentu (Rieder et al., 2001). Výsledné zbarvení, tak jak jej vnímáme, nezávisí pouze na vlastní pigmentaci, ale ovlivňují ho i další faktory, především dopad a odraz světla, šířka dřeňového sloupce a obsah vzduchu v tomto sloupci. Je-li v dřeňovém sloupci obsaţeno velké mnoţství vzduchu, jeví se chlup navenek jako světlý, ačkoli korová vrstva obsahuje pigment (Bílek, 1933). Obr. 2.1: Schéma vzniku pigmentu a geny ovlivňující základní zbarvení u koní lokus C lokus E lokus A Phe Tyr DOPA C + - melanin E + - eumelanin distribuce C c C c E e E e phaeomelanin absence pigmentu - albín (u koní se pravděpodobně nevyskytuje) Podle Sponenberga (1996) Ze schématu je zřejmé, ţe o vzniku třech základních tmavých zbarvení (vraník, hnědák, ryzák) rozhoduje obsazení třech lokusů. První lokus, označovaný jako C (COLOR; v některých pramenech uváděn téţ jako ALBINO) kóduje enzym tyrozinázu, který má klíčovou roli v tvorbě pigmentu a jeho přítomnost rozhoduje o tom, zda se bude z prekurzorů barviva pigment vytvoří. Recesivně homozygotní sestava na tomto lokusu má za následek úplnou absenci pigmentu a vzniká jedinec označovaný jako albín. Výskyt pravého albinismu u koní zatím nebyl potvrzen. Na tomto lokusu byla však popsána i alela označovaná jako C Cr pro tzv. cremello ředění základního zbarvení. V případě tohoto typu ředění platí v rámci lokusu neúplně dominantní postavení alely C Cr, heterozygoti vykazují ve fenotypu částečné zesvětlení základního zbarvení, zatímco u homozygotů C Cr C Cr dochází jiţ k zesvětlení velmi 8

9 výraznému, tito jedinci mají velmi světlou aţ bílou srst, růţovou kůţi a modré oči a bývají někdy označováni jako pseudoalbíni. Alela C Cr působí především na zesvětlení červeného pigmentu phaeomelaninu, který se po zředění jeví jako ţlutý. Ředicí efekt na černý pigment eumelanin není tak výrazný a projeví se většinou pouze v případě homozygotní sestavy C Cr C Cr. Výrazně světlé zbarvení srsti spojené s modrou barvou očí bývá u některých plemen povaţováno za defekt a takto zbarvené jedince není moţno zapsat do plemenné knihy (Mariat et al., 2003). O typu vzniklého pigmentu rozhoduje lokus E (EXTENSION) a na jeho distribuci má vliv lokus A (AGOUTI). Mezi těmito dvěma lokusy platí vztah recesivní epistáze lokusu E vůči lokusu A. Lokus EXTENSION v případě recesivně homozygotní sestavy alel (E e E e ) zakládá u koní ryzé zbarvení (vytváří se pouze červený pigment phaeomelanin) a obsazení lokusu AGOUTI jiţ výslednou barvu neovlivní. V případě, ţe se na lokusu EXTENSION nachází alespoň jedna dominantní alela (E E ), vytváří se tmavý (černý, hnědý) pigment eumelanin a pro výslednou barvu je rozhodující alelická sestava na lokusu AGOUTI. V případě přítomnosti alespoň jedné dominantní alely (A + nebo A A ) na tomto lokusu je distribuce černého pigmentu omezena pouze na distální části končetin, hřívu a ocas a vzniká hnědák, v opačném případě (genotyp A a A a ) není distribuce černého pigmentu nijak omezena a vzniká vraník (tab. 2.1). Na základě těchto zásad vytvořili Lauvergne et al. (1991) schéma pro popis zbarvení u koní, které plně respektuje genetické zaloţení jednotlivých barev. Tab. 2.1: Genotypy pro základní zbarvení u koní EXTENSION LOKUS AGOUTI LOKUS VÝSLEDNÁ BARVA E e E e A A A A ; A A A a ; A a A a ryzák E E E E ; E E E e A a A a vraník E E E E ; E E E e A A A A ; A A A a hnědák Bylo zjištěno, ţe EXTENSION lokus kóduje melanocyty stimulující hormon receptor MSHR (Robbins et al., 1993), zatímco AGOUTI lokus kóduje antagonistu tohoto receptoru (Lu et al., 1994). Označení MC1R pro gen kódující MSHR vychází ze skutečnosti, ţe patří do rodiny genů kódujících receptory pro melanocortin. Melanocortin-1-receptor (MC1R) řídí hladinu tyrozinázy v melanocytech. V případě, ţe se melanocyty stimulující hormon (MSH) váţe s receptorem MC1R, hladina tyrozinázy se zvyšuje. Tyrozináza je limitujícím enzymem 9

10 pro syntézu melaninu, vysoká hladina tyrozinázy vede k produkci tmavého pigmentu eumelaninu, naopak při její nízké hladině se tvoří červený nebo ţlutý pigment phaeomelanin. (Marklund et al., 1996). AGOUTI lokus kóduje agouti signaling-protein (odtud označení genu téţ zkratkou ASIP), který vyřazuje z činnosti melanocyty stimulující hormon (MSH) (Rieder et al., 2001). V souvislosti s hnědým zbarvením je uváděn rovněţ lokus BROWN (B) (Sponenberg, 1996; Rieder et al., 2001). Lokus B kóduje membránový protein označovaný jako TYRP1, jehoţ úkolem je oxidace 5,6-dihydroxyindol-2-karboxylové kyseliny (Jackson, 1994). Tento lokus je zodpovědný za syntézu tzv. čokoládového melaninu, objevujícího se u tmavých játrových ryzáků a u velmi tmavých hnědáků (Rieder et al., 2001). V minulosti byl gen TYRP1 uvaţován jako jeden z moţných kandidátních genů pro vybělování u koní. Rieder et al. (2000) uvádí sníţenou hladinu mrna proteinutyrp1 u vybělujících běloušů ve srovnání se zvířaty bez známek vybělování. Ryzé zbarvení bylo prvním, u kterého byla zjištěna jednoduchá mendelistická dědičnost. Jiţ v roce 1906 Hurts (in Marklund et al., 1996) uvádí, ţe ryzé zbarvení je řízeno recesivní alelou E e. Toto tvrzení potvrzují později další práce (Adalsteinsson, 1974), které poukazují na fenotypovou podobnost recesivně ţlutého zbarvení u myší a ryzého zbarvení u koní. Tato analogie byla později studována i na molekulární úrovni porovnáním homologních úseků chromozómů u koně a u myši (Anderson and Sandberg, 1982). Odstín ryzého zbarvení vykazuje značnou variabilitu od světlých ryzáků aţ po velmi tmavé jedince (označované jako tzv. játrový ryzák). Tato variabilita vzniká pravděpodobně působením dosud neznámých modifikačních genů (Anderson, 2003). Postupujeme-li podle recesivity jednotlivých zbarvení, stojí na druhé příčce hned za ryzákem zbarvení černé (vraník). Toto zbarvení je u některých plemen poměrně vzácné, naopak existují i plemena, kde toto zbarvení dominuje (merénský kůň, fríský kůň, starokladrubský vraník). Většina autorů udává jako genotyp zakládající vrané zbarvení recesivně homozygotní sestavu alel (A a A a ) na lokusu AGOUTI, existují však názory, ţe toto zbarvení můţe být dáno i působením dominantní alely E D na lokusu EXTENSION (Sponenberg, 1996, 2003). Dominantní černé zbarvení se však pravděpodobně vyskytuje pouze u některých plemen koní (např. arabská plemena). Alela E D způsobuje méně intenzivní černé zbarvení neţ v případě řízení recesivní alelou A a. Tzv. dominantní vraníci mohou mít srst velmi tmavě hnědou místo černé. Mnoho hříbat s tímto genotypem se rodí ve zbarvení podobném hnědákům a černé barvy srsti dosáhnou aţ v pozdějším věku. 10

11 Posledním ze základních zbarvení je zbarvení hnědé, které vykazuje značnou fenotypovou variabilitu, danou existencí alelické série pro tento typ zbarvení. Sponenberg (1996, 2003) uvádí dva subtypy hnědáků. Původní hnědé zbarvení označované jako wild bay je dáno přítomností divoké alely A +, která je dominantní vůči alele A A, která determinuje druhý typ hnědého zbarvení (v anglické nomenklatuře označované pouze jako bay ). Tento typ hnědáka převaţuje u většiny současných plemen. U hnědého zbarvení typu wild bay je černá pigmentace na končetinách omezena pouze na distální části, na rozdíl od druhého subtypu bay, u kterého můţe dosahovat aţ ke karpálnímu, tarzálnímu kloubu. Jakubec (1998) uvádí, ţe pravděpodobně existuje na lokusu A alelická série tří aţ čtyř alel: A A, A a, A + a A t. Alternativní alely A + a A t způsobují odchylky v distribuci eumelaninu nebo v barevných odstínech. Alela A + odpovídá za divoké zbarvení typické například pro koně Převalského. Alela A t neovlivňuje distribuci eumelaninu, ale zesvětluje černou barvu na tmavě hnědou. Dominance alel klesá v pořadí A + > A A > A t > A a. Rieder et al. (2001) uvádí, ţe hnědáci s heterozygotní sestavou na lokusu EXTENSION (E E E e ), se projevují fenotypově světlejším odstínem hnědé barvy neţ jedinci s genotypem E E E E, coţ můţe být způsobeno o 50 % niţší aktivitou melanocortin-1-receptoru v důsledku působení alely E e. Zmíněná variabilita však můţe být dána i dosud neznámými genetickými vlivy. 11

12 2.1.1 Molekulárně genetická charakteristika lokusu EXTENSION Metodou sekvenční analýzy byla odhalena u recesivní alely E e, spojené s ryzím zbarvením u koní, bodová mutace v kodónu 83 genu MC1R (TCC TTC), která způsobí záměnu v aminokyselinovém řetězci (Ser Phe) v produktu kódovaném tímto genem. Vzhledem k tomu, ţe tato mutace vytváří restrikční místo pro enzym TaqI, je moţné ji odhalit pomocí jednoduché PCR-RFLP analýzy. Výsledkem mutace je porušení vazby melanocyty stimulujícího hormonu (MSH) na receptor (MC1R), vedoucí k nízké aktivitě tyrozinázy a tím produkci červeného pigmentu phaeomelaninu. Všichni ryzáci jsou homozygoti v uvedené mutaci, coţ potvrzuje recesivní charakter tohoto zbarvení (Marklund et al., 1996). Další polymorfismus v rámci lokusu EXTENSION popisuje u koní plemene Schwarzwälder Kaltblut Wagner a Reissmann (2000). U souboru 60 koní, kteří všichni vykazovali ve fenotypu ryzé zbarvení různého odstínu, byla prokázána přítomnost dvou různých alel na lokusu EXTENSION v té době jiţ známé alely E e a nově identifikované alely, označené jako E a. Pro nově popsanou alelu je charakteristická mutace v kodonu 84 (GAC AAC). Tato mutace způsobuje záměnu aminokyselin ve vznikajícím řetězci (Asp Asn) a zároveň zaniká restrikční místo pro enzym TaqI. Jednotlivé genotypy lze tedy potom identifikovat pomocí elektroforézy. Ve sledované populaci nebyla pozorována ţádná souvislost mezi přítomností alely E e resp. E a a fenotypovým projevem. V dalších studiích (Rieder et al., 2001) nebyla přítomnost alely E a potvrzena, je tedy moţné, ţe se jedná o alelu typickou pouze pro určitá plemena. Rendo et al. (2009) potvrdili vzácný výskyt alely E a u lokálních španělských plemen Pottoka, Jaca Navarra a Euskal Herriko Mendiko Zaldia. Rovněţ zatím nebyla na molekulární úrovni popsána u koní alela E D, která způsobuje některými autory (Sponenberg, 1996) uváděné dominantní vrané zbarvení. Dominantní černé zbarvení, způsobené alelou E D studovali na molekulární úrovni Vage et al. (1999) u ovcí. Sekvence genu MC1R u koní vykazuje vysokou shodu na úrovni nukleotidů i aminokyselin s odpovídajícími sekvencemi u člověka, myši a dalších modelových organismů (Jackson, 1997). Rovněţ u těchto savců byly popsány u jedinců s ţluto-červeným zbarvením srsti bez přítomnosti černého pigmentu analogické mutace u myši (Robbins et al., 1993), skotu (Klungland et al., 1995; Joerg et al., 1996) a u psů (Newton et al., 2000). U prasat byly na lokusu EXTENSION detekovány čtyři různé alely E + pro divoké zbarvení, E D pro dominantně černou barvu, E P pro červenou nebo bílou barvu s černými skvrnami a E e pro recesivní červené zbarvení (Kijas et al., 1998). 12

13 U člověka vykazuje gen MC1R vysoký polymorfismus. Rana et al. (1999) identifikovali šest různých mutací. Specifická bodová mutace v odpovídající oblasti byla nalezena u lidí s rezavými vlasy a světlou kůţí s tendencí ke spálení (Valverde et al., 1995). Vzhledem k tomu, ţe tento fenotyp je u lidí povaţován za jeden z rizikových faktorů zvyšující pravděpodobnost výskytu koţního melanomu, byl právě gen MC1R později studován jako moţný kandidátní gen pro jeho vznik. Asociaci konkrétní mutace (Asp84Glu) s výskytem koţního melanomu prokázali Valverde et al. (1996). Sturm (2003) uvádí další tři alely (Agr151Cys, Arg160Trp, Asp294His), které zvyšují u svých nositelů vnímavost ke koţnímu melanomu. Dále popisuje rozdílný fototyp i riziko vzniku melanomu u homozygotů a heterozygotů, coţ znamená, ţe v rámci lokusu neplatí striktně úplná dominance. Z výsledků vyplývá, ţe molekulárně genetická charakteristika lokusu má pro posouzení vnímavosti ke koţnímu melanomu lepší vypovídací schopnost neţ stanovení fototypu u sledovaných jedinců. Zahrnout charakteristiku MC1R lokusu do predikčního modelu pro riziko vzniku melanomu doporučují na základě výsledků rozsáhlé studie i Han et al. (2006). Obr. 2.2: Schéma úseku MC1R genu (Rieder et al., 2001) E CTG GCC GTG TCC GAC CTG CTG e T Taq I E Leu Ala Val Ser Asp Leu Leu e Phe Obr. 2.3: Schematické znázornění mutace na lokusu EXTENSION (Rieder et al., 2001) 13

14 2.1.2 Molekulárně genetická charakteristika lokusu AGOUTI Rieder et al. (2001) uvádí jako mutaci spojenou s recesivním vraným zbarvením (A a A a ) deleci v genu ASIP. Delece 11-bp v exonu 2 genu ASIP (ADEx2) změní sekvenci aminokyselin a pravděpodobně prodlouţí terminační signál z 210 bp na 612 bp. Změna čtecího rámce způsobená touto delecí má za následek syntézu modifikovaného agoutisignaling proteinu. V rámci lokusu A byly popsány i další tři mutace (SNP polymorfismy). První SNP byl lokalizován v intronu 1, 3 bp za exonem 1 (A845G), druhý SNP byl detekován v intronu 2 (C2374G) a třetí SNP byl nalezen v 3 - UTR (A4734G), přesně 50 bp za regulačním stop kodónem (obr. 2.4). U bodových mutací zjištěných v obou intronech nebyla prokázána souvislost s černým zbarvením. Poslední uvedená mutace (G A) nemá vliv na pořadí aminokyselin v řetězci a představuje tak tichou mutaci s dosud neznámým účinkem. Obr. 2.4: Schéma úseku ASIP genu s vyznačením nalezených polymorfismů (Rieder et al., 2001) Publikované studie naznačují, ţe gen ASIP, podobně jako u koně, myši a dalších druhů zvířat, ovlivňuje pigmentaci i u lidí. Kanetsky et al. (2002) detekovali mutaci (8818A G) v nekódující oblasti genu ASIP. Mutace je prokazatelně spojena s výskytem tmavých vlasů a hnědých očí. Vliv mutace na vnímavost vůči melanomu nebyl ve studii zjištěn. 14

15 2.2 Determinace světlých ( ředěných ) zbarvení Ze základních tmavých zbarvení (vraník, ryzák, hnědák) odvozujeme tzv. zbarvení zředěná, pro která je charakteristické zesvětlení pigmentu. Souhrnné označení plavák, pouţívané v české nomenklatuře (Bílek, 1957), nerespektuje genetické zaloţení jednotlivých zbarvení. Celkem byly popsány čtyři odlišné genetické mechanismy (typy) plavého zbarvení u koní Lokus COLOR (CREAM) - (C) Působením neúplně dominantní alely C Cr na lokusu COLOR (CREAM) vzniká tzv. cremello ředění pigmentu, které bylo popsáno jiţ v předchozím textu. Vzhledem k charakteru dědičnosti (neúplná dominance) je moţno určit genové obsazení tohoto lokusu na základě fenotypového projevu (Locke et al., 2001). U heterozygotů dochází k částečnému zesvětlení pigmentu, hnědé zbarvení přechází na plavé zbarvení označované jako buckskin, z ryzáků vznikají palomina. Oči a kůţe palomin a buckskinů bývají zpravidla poněkud světlejší neţ u nezředěných variant. U homozygotních jedinců dochází k velmi výraznému zesvětlení srsti na slonovinově bílou, kůţe je růţová, oči modré. Tito jedinci bývají označováni jako pseudoalbíni ( cremello, perlino, smoky cream ), přičemţ je někdy obtíţné určit, jaké bylo jejich výchozí zbarvení. Ověřením vazby s mikrosatelity pomocí metody LOD skóre byla potvrzena lokalizace genu pro cremello ředění pigmentu na chromozóm ECA21 mezi markery COR73 a LEX31 (Locke et al., 2001). Jako moţné kandidátní geny pro cremello ředění pigmentu byly studovány geny MYO10 a MATP, u nichţ se předpokládá umístění na stejném chromozómu (ECA21). Ve studii Mariat et al. (2003) byl vyhodnocen jako nejpravděpodobnější kandidátní gen MATP (membrane-associated transporter protein), který kóduje transportní protein a má vliv i na jeden z typů albinismu u člověka. 15

16 Obr. 2.5: Polymorfismus v genu MATP (Mariat et al., 2003) Za příčinnou mutaci kompletně spojenou s cremello alelou C Cr označují autoři záměnu nukleotidů v exonu 2 (G A), v důsledku čehoţ je do řetězce zařazen asparagin místo kyseliny asparagové. Mutace pravděpodobně poruší funkci transportního proteinu, coţ se ve fenotypu projeví zředěním pigmentu. Stejná mutace, způsobující hypopigmentaci, byla popsána u člověka (Newton et al., 2001 in Mariat et al., 2002) a u myši (Du et al., 2002 in Mariat et al., 2002). Pouţití testu pro stanovení mutace v MATP genu pomůţe chovatelům odhalit nositele cremello alely C Cr i v případě, kdy to není moţné zjistit podle fenotypového projevu, například z důvodu epistatického účinku alely G G, způsobující vybělování. Skrytými nositeli alely C Cr mohou být rovněţ vraníci, u kterých se heterozygotní sestava na lokusu C (C + C Cr ) ve fenotypu neprojeví ředěním pigmentu Lokus DUN (D) Dun ředění pigmentu je zaloţeno na účinku úplně dominantní alely D D a takto vzniklý jedinec je v anglické nomenklatuře označován termínem dun (podle výchozího zbarvení rozlišujeme zebra dun vzniká z hnědáka, red dun vzniká z ryzáka nebo grullo, který je zředěnou variantou vraníka). S působením alely D D je spojen i výskyt tzv. primitivních znaků (úhoří pruh, zebrování na končetinách, maska na hlavě, pruhy a stíny na pleci, krku, bílé ţíně v hřívě a ohonu), které jsou rozhodující pro určení o jaký typ ředění pigmentu se jedná. Stachurska (1999) se domnívá, ţe vznik primitivních znaků je podmíněn působením genů na odlišném lokusu (M), který je v úzké vazbě s lokusem D. Zcela odlišnou teorií, která však není zatím podloţena ţádnou vědeckou publikací, je, ţe alela D D naopak nepůsobí na zesvětlení primitivních znaků, které existují u všech koní a v případě zesvětlení ostatních částí těla se pouze stávají vizuálně zřetelné (Castle, 2008). Zbarvení dun bylo typické pro předky dnešních plemen koní (kertak, tarpan) a spolu s primitivními znaky se vyskytuje v současnosti především u málo prošlechtěných plemen (např. huculský kůň). Masuda et al. (2007) se domnívají ţe současná plemena mongolských koní získala primitivní znaky od svého předka kertaka. U některých jedinců se mohou vyskytovat alely pro více typů ředění současně a můţe tedy vzniknout například zbarvení palomino nebo cremello s úhořím pruhem. U více zesvětlených barev (pseudoalbínů) bývá však identifikace primitivních znaků obtíţná. 16

17 Dun lokus byl pomocí skupiny mikrosatelitních markerů ASB14 a LEX023 lokalizován Brieckerem et. al (2003) na chromozóm ECA8. Kódovaný protein není dosud známý, kandidátní geny budou s největší pravděpodobností umístěny na chromozómech HSA18q, MMU18q a MMU1q (Rieder, 2009) Lokus SILVER (Z) Pro zbarvení označované jako silver nebo také silver dapple je charakteristické zředění černého pigmentu (eumelaninu) v srsti, které je patrné především u dlouhých ţíní v hřívě a ocasu a na spodních částech končetin (Sponenberg, 1996). Hříbata mají velmi světlou barvu a bílou hřívu a ocas, charakteristické jsou rovněţ prouţky na kopytech a bílé řasy. Prouţky na kopytech zpravidla po prvním roce ţivota mizí. Identifikace silver zbarvení je poměrně obtíţná, mnoho mladých koní bývá nesprávně popsáno jako tmaví flaxen ryzáci. Právě prouţky na kopytech mohou slouţit jako dobrý identifikační znak. Silver zbarvení vykazuje autozomálně dominantní dědičnost (Sponenberg, 1996). Dominantně homozygotní jedinci (S Z S Z ) se mohou projevovat ve srovnání s heterozygoty výraznějším zesvětlením, tuto tendenci je však nutno ještě podrobněji sledovat a ověřit (Brunberg et al., 2006). Alela S Z působí pouze na ředění černého pigmentu eumelaninu, pigment phaeomelanin neovlivňuje. Castle and Smith (1953) uvádí, ţe alela S Z v kombinaci s dominantní alelou G G urychluje proces vybělování. Alela S Z byla zdokumentována u plemen shetlandský pony, miniaturních a islandských koní a vzácně se vyskytuje u koní arabských. Brunberg et al. (2006) zjistili kompletní asociaci silver zbarvení s bodovou mutací (C T) v exonu 11 genu PMEL17 (premelanosomal protein 17), který se nachází na chromozómu ECA6q23 (Rieder, 1999). Mutace způsobí záměnu aminokyseliny (arginin cystein) v řetězci. Reissmann et al. (2007) detekovali stejnou bodovou mutaci u plemene shetlandský pony Lokus CHAMPAGNE (Ch) Poslední typ ředění pigmentu je řízen dominantní alelou Ch Ch na lokusu CHAMPAGNE. Kůţe nositelů této alely je šedorůţová s tmavšími oblastmi v okolí očí, nozder a genitálií, oči jsou u hříbat po narození modré a v průběhu ţivota získají jantarovou 17

18 barvu. Některá hříbata se rodí s tmavou srstí, která postupně zesvětluje a často vykazuje kovový lesk (Sponenberg, 2003). U koní se neobjevují primitivní znaky typické pro dun ředění. Důleţitým odlišovacím znakem od ředění typu cremello, v případě hnědé výchozí barvy, je barva hřívy, ocasu a spodků končetin, která je u champagne koní hnědá, zatímco u plaváků typu buckskin by měla být černá. Barva srsti champagne ryzáků a palomin můţe být někdy téměř totoţná, k odlišení slouţí rozdílné charakteristiky v barvě kůţe a očí (Sponenberg and Bowling, 1996). Přesná identifikace je však v tomto případě značně obtíţná a vyţaduje určitou zkušenost. Lokus CHAMPAGNE se nachází na chromozómu ECA14 mezi mikrosatelity UM010 a TKY329. V této oblasti byly vytipovány 4 kandidátní geny SPARC (secreted protein, acidic, cysteine-rich), SLC36A1 (solute carrier 36 family A1), SLC36A2 (solute carrier 36 family A2) a SLC36A3 (solute carrier 36 family A3). Cook et al. (2008) zjistili kompletní asociaci SNP (nukleotidová substituce C188G v exonu 2 genu SLC36A1, vedoucí k záměně threoninu za arginin v aminokyselinovém řetězci) s fenotypovým projevem champagne ředění pigmentu. Vzhledem k tomu, ţe identifikace champagne ředění pouze podle fenotypového projevu bývá většinou dosti obtíţná, chovatelé jistě uvítají molekulárněgenetický test, vycházející z výše uvedeného poznatku, který nositele champagne genu odhalí spolehlivě. 18

19 2.3 Determinace bílých zbarvení Lokus GREY (G) Geny umístěnými na GREY lokusu je řízeno zbarvení označované v české nomenklatuře termínem vybělující bělouš. Tento typ zbarvení je spolu se třemi základními barvami (vraník, hnědák, ryzák) rozšířen mezi plemeny koní na celém světě. Nejstarší písemné záznamy o výskytu běloušů pocházejí od řeckého historika Herodota, který popisuje, ţe na bílém posvátném koni jezdil perský vládce Xerxes. Oblíbenost běloušů a s tím spojená pozitivní selekce vedla k upevnění a rozšíření mutace v populaci (Pielberg et al., 2008). U některých plemen koní (lipický kůň, starokladrubský bělouš, francouzské plemeno Camarque) představuje převaţující typ zbarvení, vyskytuje se však i u dalších plemen (např. arabský, případně anglický plnokrevník). Vykazuje autozomálně dominantní dědičnost, platí pravidlo, ţe bílý kůň musí mít alespoň jednoho bílého rodiče (Henner et al., 2002a). Zároveň tedy není moţné pouze na základě fenotypového projevu spolehlivě určit, zda se jedná o jedince s heterozygotní nebo homozygotně dominantní sestavou alel na lokusu GREY, i kdyţ u homozygotních jedinců bylo pozorováno rychlejší a úplnější vybělení neţ u heterozygotů (Pielberg et al., 2008). Vůči ostatním barvám je tento typ zbarvení v epistatickém postavení, tzn., ţe v přítomnosti alespoň jedné dominantní alely pro vybělování v genotypu jedince, je potlačeno působení ostatních genů pro zbarvení a ve fenotypu dospělého jedince se základní barvy nemohou projevit (Rieder et al., 2001). Vybělování je progresivní proces. Hříbata se rodí v některém ze základních zbarvenívraník (obr. 9.1), hnědák (obr. 9.2), ryzák a bílou barvu získávají aţ v průběhu ţivota. Bílého zbarvení dosáhnou vybělující bělouši aţ ve věku 6-7 let, přičemţ u některých jedinců nikdy nedojde v úplnému vybělení. Kůţe zůstává tmavě pigmentována (s výjimkou bílých odznaků na hlavě a končetinách, popřípadě vitiliga, které se projevuje jako důsledek stárnutí) (Henner, 2002b), srst se jeví jako bílá. Tento projev označujeme také jako leucismus.vybělování postupuje od hlavy, která bývá vţdy světlejší neţ ostatní části těla (obr 9.3). Zatím nebylo zcela objasněno, zda se jedná pouze o poruchu transportu melaninu či o úplné zastavení jeho syntézy (Rieder et al., 2000). Vybělování bývá téţ povaţováno za analogii šedivění vlasů u člověka (Henner, 2002b). Rychlost a úroveň vybělování je různá, liší se mezi plemeny, ale i jedinci v rámci stejného plemene vykazují mnohdy značnou variabilitu. Je moţné, ţe tento proces ovlivňují 19

20 genetické modifikátory, které způsobují i výskyt tzv. muškovitosti nebo grošování (Swinburne et al., 2002). Lokus pro vybělování byl několika nezávislými vědeckými týmy lokalizován na chromozóm ECA25 (Henner et al., 2002a,b; Locke et al.; 2002; Swinburne et al.; 2002), později bylo umístění upřesněno na oblast odpovídající 6,9 Mb na chromozómu HSA9q, na kterém se však nenacházejí ţádné známé kandidátní geny související s pigmentací (Pielberg et al., 2005). Aţ do roku 2008 nebylo moţné určit výbavu na lokusu G na úrovni DNA a vzhledem k úplné dominanci znaku bylo moţno heterozygotní jedince odhalit pouze analýzou rodokmenů. V roce 2008 Pielberg et al. detekovali v intronu 6 genu STX17 duplikaci 4,6 kb, která byla ve všech případech spojena s fenotypovým projevem vybělování. U koní ostatních barev nebyla tato mutace detekována v ţádném z případů, proto se autoři domnívají, ţe se jedná o příčinnou mutaci. V oblasti mutace pro vybělování se nachází 4 geny (NR4A3, STX17, TXNDC4 a INVS). Ţádný z těchto genů nebyl v minulosti spojován s poruchami pigmentace ani s výskytem melanomu. V genech NR4A3, TXNDC4 a INVS nebyl detekován ţádný polymorfismus. Tato analýza rovněţ vyvrátila moţnost, ţe vybělování je způsobeno translokací genu z jiné oblasti chromozómu. Pielberg et al. (2008) se dále domnívají, ţe všichni vybělující bělouši získali mutaci od jednoho společného předka, jelikoţ SNPs v intervalu odpovídajícím pozici od 28,7 do 29,1 Mb (350 kb) na chromozómu ECA25, vykazují úplnou vazbu s tímto typem zbarvení u osmi studovaných různých plemen. Obr. 2.6: Molekulární charakteristika G lokusu s vyznačením duplikace zodpovědné za vybělování (Pielberg et al., 2008) 20

21 2.3.2 Lokus ROAN (Rn) Úplně dominantní alela Rn Rn způsobuje tzv. prokvetlost srsti, tj. příměs bílých chlupů do některé ze základních barev (černá, hnědá, ryzá). Poměr bílých a barevných chlupů se s věkem nemění, nejedná se tedy o progresivní proces jako u leucistických (vybělujících) běloušů. Hlava zůstává zpravidla po celý ţivot tmavší neţ ostatní části těla, hovoříme o tzv. nevybělujících bělouších. Je však moţno pozorovat určité odchylky v odstínu srsti v závislosti na ročním období. Nejsvětlejší bývají tito koně na jaře po vylínání zimní srsti, v zimě je srst naopak nejtmavší a nemusí být na první pohled zřejmé, ţe se jedná o jedince s aktivní alelou Rn Rn (Sponenberg, 1996). Genotyp Rn Rn Rn Rn byl dlouho povaţován za letální (Hintz and Van Vleck, 1979), existují však i publikace, popisující výskyt jedinců homozygotních v tomto znaku (Geurts, 1977 in Bowling, 2000; Yokohama et al., 2002). Příčinná mutace způsobující zbarvení roan (nevybělující bělouš) není dosud známá. Marklund et al. (1999) uvádí silnou, ne však úplnou, asociaci substituce (C2613T) v exonu 19 genu KIT s tímto fenotypovým projevem. Asociace inzerce 79 bp mezi exony 1 a 2 v genu KIT, vedoucí k posunu čtecího rámce a syntéze nefunkčního proteinu, s roan zbarvením byla pozorována u belgických koní, u jiných plemen však nebyla potvrzena. Je moţné, ţe zbarvení roan můţe být geneticky nejednotné a můţe vznikat vlivem různých mutací v KIT genu nebo případně i v genech jiných Lokus WHITE (W) Geny na lokusu W ovlivňují přítomnost pigmentu v kůţi a srsti. Úplně dominantní alela W W, způsobuje neschopnost tvořit pigment v kůţi a srsti, a tak znemoţňuje projev ostatních genů. Její nositel má růţovou kůţi a bílou srst, coţ je způsobeno úplnou absencí melanocytů a melaninu. Oči jsou tmavě hnědé, méně často modré. Hříbata se rodí bílá, ale mohou mít pigmentovanou srst na uších a kolem nich, někdy i v hřívě a na hřbetě, časem pigment vymizí. Dominantně homozygotní sestava (W W W W ) působí letálně většinou jiţ v embryonálním stádiu, případně hříbata hynou velmi brzy po narození (Bowling, 1996). Lokus WHITE je v epistatickém postavení vůči ostatním lokusům pro zbarvení. Mau et al. (2004) lokalizovali pomocí vazby s mikrosatelitem ABS23 W lokus na chromozóm ECA3q, tj. do stejné oblasti, do které byl jiţ dříve lokalizován gen KIT, zodpovědný za roan zbarvení (Marklund et al., 1999). U plemene Swiss Franches 21

22 Montagnes Horse SNP detekovaný v intronu 3 genu KIT (G258A) vykazoval vazbu s mikrosatelitem ASB23 a s dominantní alelou W W. Na základě sledování výskytu fenotypu spojeného alelu W W v rodokmenu se Mau et al. (2004) domnívají, ţe se jednalo o spontánní mutaci u jedné z klisen. Později Haase et al. (2007, 2009) objevili další mutace v genu KIT, spojené s výskytem dominantně bílého zbarvení u koní různých, především německých, plemen. Gen KIT vykazuje vůbec největší alelickou heterogenitu mezi geny, které nějakým způsobem ovlivňují zbarvení koní. Celkem bylo popsáno 14 různých alel (mutací), které se ve fenotypu projeví plášťově bílým zbarvením (white), příměsí bílé srsti (roan) nebo strakatostí (tobiano, sabino) (Rieder, 2009). 22

23 2.4 Determinace různých typů strakatosti Klasifikace strakatosti a rozpoznání jejich různých typů je poměrně sloţitá záleţitost, kterou ještě komplikuje fakt, ţe česká nomenklatura nemá, podobně jako je tomu u ředěných barev, zavedeny termíny, které by respektovaly rozdílný genetický základ jednotlivých fenotypů. Je to pravděpodobně dáno tím, ţe u plemen chovaných na našem území nebylo strakaté zbarvení příliš rozšířeno. To se však v současné době mění v souvislosti s importem strakatých plemen, pouţívaných zejména pro tzv. westernové jeţdění, které se stává velmi populární. Označení strakoš je v tomto případě zcela nedostatečné. Kromě nutnosti zavést podrobnější názvosloví pro klasifikaci strakatých fenotypů je zapotřebí věnovat pozornost i závaţným dědičným chorobám, které se vyskytují právě ve spojitosti se strakatým zbarvením (např. syndrom úhynu bílých hříbat OLWFS). I v anglicky psané literatuře se v klasifikaci strakatých zbarvení objevují určité rozdíly. Poměrně názorně uvádí přehled strakatých fenotypů například příručka APHA Coat Color Genetics Guide (2009), která uvádí i fenotypy kombinující různé typy strakatosti dohromady Lokus TOBIANO (To) Kůň se zbarvením tobiano má zpravidla srst na hlavě, prsou a ve slabinách barevnou a ostatní partie jsou bílé. Bílá srst vyrůstá na nepigmentované růţové kůţi. Podíl nepigmentovaných ploch můţe být různý od 20 do 80 %, přičemţ je důleţité, ţe bílé plochy alespoň v jednom místě přecházejí přes páteř zvířete. Oči jsou hnědé, výjimečně modré. Odznaky na hlavě jsou v běţném rozsahu, končetiny bývají zpravidla bílé. Skvrny jsou celistvé s pravidelnými okraji. Hranice mezi bílou a tmavou barvou je tvořena pigmentovanou kůţí, překrytou bílými chlupy, takţe vypadá jako stín, který vrhá tmavá barva na bílý podklad. Strakatost typu tobiano vykazuje autozomálně dominantní dědičnost, podle fenotypu nelze rozlišit dominantní homozygoty od heterozygotů (APHA, 2009). Vzhledem k tomu, ţe strakatost typu tobiano vykazuje autozomálně dominantní dědičnost a není tedy moţné podle fenotypu rozeznat dominantní homozygoty a heterozygoty, měli chovatelé velký zájem na vytvoření molekulárně genetického testu, který by identifikoval homozygotní jedince (To To To To ), kteří jsou chovatelsky cennější, jelikoţ zajistí produkci pouze preferovaných, strakatých potomků. Brooks et al. (2002) detekovali substituci v intronu 3 genu KIT, která vykazovala silnou asociaci s tobiano fenotypem. Alela vyskytující 23

24 se u jednobarevných jedinců byla označena KM0, alela pro strakatost KM1. PCR-RFLP analýza ukázala, ţe všichni testovaní tobiano jedinci byli nositeli KM1 alely. Alela KM1 se však ojediněle vyskytla i u nestrakatých jedinců, coţ znamená, ţe se nejedná o příčinnou mutaci. Později byla Brooks et al. (2007) jako příčinná mutace popsána rozsáhlá inverze na chromozómu ECA3, která se vyskytuje pouze u jedinců s projevem strakatosti tobiano ve fenotypu. Tato inverze začíná ve vzdálenosti pouze 70kb od genu KIT a nepřerušuje ţádné dosud popsané geny. Autoři se domnívají, ţe pravděpodobně můţe ovlivnit regulační oblast KIT genu. Asociaci této chromozomální inverze se strakatostí tobiano potvrdili o rok později i Haase et al. (2008) u několika různých německých plemen koní Lokus OVERO (O) Pro strakatost typu overo je charakteristický výskyt bílých ploch na břiše, oblast hřbetu mezi kohoutkem a ocasem je vţdy barevná. Bílá barva se hojně vyskytuje i na hlavě, oči bývají často modré. Nohy a kopyta bývají tmavé, pokud se nevyskytují na končetinách odznaky podobně jako u jednobrevných koní. Skvrny jsou asymetrické s nepravidelnými okraji (APHA, 2009). V souvislosti s tímto typem strakatosti se vyskytuje tzv. syndrom úhynu bílých hříbat (OLWS), tj. jedinců s homozygotně dominantní sestavou na lokusu OVERO (O O O O ). Pro syndrom úhynu bílých hříbat jsou charakteristické abnormality střevního traktu, které mají za následek fatální koliky. U hříbat dochází zpravidla k úhynu do 12 hodin po narození. Podobná porucha byla popsána i u člověka. Jedná se o tzv. Hirschsprungovu nemoc vrozenou poruchu projevující se absencí nervových buněk v tlustém střevě a chronickou zácpou. Některé případy tohoto onemocnění u člověka byly způsobeny mutací v endotelin B receptor genu (EDNRB). Endotelin B receptor gen byl studován i jako moţný kandidátní gen pro syndrom úhynu bílých hříbat a strakatost typu overo. Yang et al. (1998), Santschi et al. (1998) a Metallinos et al. (1998) zjistili nezávisle na sobě, ţe dinukleotidová mutace (TC AG) v genu pro endothelin-b receptor (EDNRB) je spojena v homozygotním stavu s výskytem tzv. syndromu úhynu bílých hříbat (OLWS) a v heterozygotním stavu se strakatostí typu overo. Tato mutace vede k záměně aminokyselin (lysin isoleucin) v proteinu, coţ má negativní vliv na normální rozvoj střevních ganglií. Díky defektní funkci střev hříbata uhynou velmi brzy po narození na těţkou koliku. Gen EDNRB se nachází na chromozómu ECA 17q. 24

25 2.4.3 Lokus SABINO (SB) Tento typ zbarvení je běţný nejen u plemene paint horse, ale vyskytuje se i u plnokrevníků a chladnokrevných clydesdaleských koní. Končetiny i kopyta bývají bílé. Bílá barva stoupá od končetin vzhůru v roztřepených pruzích a rozlévá se od břicha po celém trupu. Na hlavě převaţuje bílá barva a běţné jsou modré nebo modrohnědé oči. Častá je příměs bílých chlupů v barevné srsti (prokvetlost). Hranice mezi bílou a základní barvou nebývá ostře ohraničená. V případě, ţe se sabino zbarvení projeví s minimální intenzitou, má kůň pouze bílé končetiny a širokou lysinu a je prakticky k nerozeznání od jednobarevných koní s odznaky. Mohou se vyskytnout i jedinci, kteří zbarvením připomínají nevybělující bělouše. Na rozdíl od nich však sabino koně nemají tmavou hlavu a končetiny. Existují i jedinci, kteří jsou téměř úplně bílí, trocha barvy zůstává na uších, případně na hrudi nebo u kořene ocasu. To, ţe úplně bílá hříbata přeţívají, naznačuje, ţe se jedná o odlišný genetický typ zbarvení neţ je strakatost overo (APHA, 2009). Na základě podobných fenotypových projevů u člověka a prasat, byl studován jako kandidátní pro sabino zbarvení gen KIT. Sekvenováním genu KIT odhalili Brooks a Bailey (2005) substituci T A v exonu 16, která vykazovala kompletní asociaci se zbarvením sabino u plemene Tennessee Walking Horse. Mutace má za následek vystřiţení exonu 17 genu KIT. Homozygotní stav se projeví ve fenotypu téměř bílým zbarvením. U homozygotních (bílých) sabino jedinců se neprojevují, na rozdíl od jinak geneticky determinovaných bílých fenotypů, ţádné zdravotní problémy a můţou být tak pro chovatele cenným plemenným materiálem. Genetický test je důleţitý i vzhledem k tomu, ţe sabino fenotyp je velmi snadné zaměnit s fenotypovým projevem roan. Pro chovatele bylo v minulosti matoucí bezproblémové přeţívání bílých hříbat, která byla ve skutečnosti homozygotní na lokusu SABINO a nikoli ROAN. Strakatost typu sabino má pravděpodobně heterogenní genetický základ, jelikoţ uvedená mutace nevysvětluje všechny sabino fenotypové projevy (např. u clydesdaleských koní). 25

26 2.4.4 Lokus LEOPARD complex (Lp) Přítomnost alespoň jedné dominantní alely (Lp Lp ) způsobuje strakatost typu appaloosa, pro kterou jsou charakteristické malé vejčité barevné skvrny obklopené bílou srstí na nepigmentované kůţi. Jedinci s homozygotní sestavou (Lp Lp Lp Lp ) mají obvykle větší plochy bílé srsti neţ heterozygoti (Lp Lp Lp lp ) (Sponenberg, 1996, 2003). Terry et al. (2001, 2002) vyloučili vazebnou analýzou KIT (tyrosine kinase receptor), MGF (mast cell growth factor) a MITF (micropthalmia-associated transcription factor) jako kandidátní geny pro strakatost typu leopard (appaloosa). Tyto geny byly povaţovány za kandidátní, jelikoţ jsou zodpovědné za podobný fenotypovový projev u jiných druhů zvířat (Moller et al., 1996) a u člověka (Spritz et al., 1993). Pozdější studie Terry et al. (2004) mapuje lokus Lp na chromozóm ECA1 mezi mikrosatelity ASB08 a 1CA43. Srovnáním zmíněného úseku na chromozómu ECA1 s homologními úseky na chromozómu 15 u člověka a 7 u myši, byly vytipovány dva nové moţné kandidátní geny pro strakatost typu appaloosa: pink eye dilution gene (p) a transient receptor potential cation channel subfamily M, member 1 (TRPM1), známý téţ jako melastatin (MLSN1). Homozygotně dominantní sestava (Lp Lp Lp Lp ) je pravděpodobně u koní spojena s vrozenou noční slepotou (CSNB), která je způsobena sníţenou regulací exprese TRPM1 v kůţi a retině (Bellone et al., 2008). 26

27 2.5 Modifikační geny Kromě dosud uvedených genů existuje i řada tzv. modifikačních genů, které mají vliv na výsledný fenotypový projev a v praxi mohou komplikovat správné určení zbarvení u koní. Přesný genetický mechanismus u většiny modifikací není zatím zcela přesně známý. Nejvýznamnějšími modifikačními geny jsou: SOOTY, způsobující přítomnost tmavě kouřových míst v srsti, MEALY (PANGARÉ), způsobující tzv. moučný efekt, patrný především na spodní části břicha, ve slabinách, na hubě a okolo očí, FLAXEN, způsobující zesvětlení hřívy a ocasu u ryzáků na ţlutou aţ krémovou barvu. 2.6 Odznaky Bílé odznaky vznikají v důsledku absence melanocytů v chlupových cibulkách a v kůţi v ohraničených oblastech na těle zvířat. U primitivních koní se odznaky nevyskytovaly a rozšířily se, podobně jako všechny fenotypy, projevující se větším či menším podílem bílých ploch na těle, aţ v průběhu domestikace. Chovatelské preference a s nimi související selekční postupy jsou v otázce výskytu bílých odznaků nejednotné. Existují plemena (např. starokladrubský vraník) nebo specielní vyuţití (drezurní koně), kde je výskyt bílých odznaků neţádoucí a je tedy proti nim selektováno, naopak například u arabských koní odznaky zvyšovaly cenu jedince. Odznaky jsou vţdy uváděny v popisu koně a mají význam pro identifikaci, obzvláště u uniformně zbarvených plemen (např. francouzské plemeno Camarque, fríský kůň, hafling). Rieder et al. (2008) uvádí, ţe bílé odznaky jsou vysoce dědivé (h 2 > 0,5). Rovněţ potvrzuje silnou pozitivní korelaci mezi recesivní alelou E e na lokusu EXTENSION (tj. ryzím zbarvením u koní) a výskytem bílých odznaků, publikovanou jiţ dříve Woolfem (1991, 1992), který se domnívá, ţe tyto rozdíly mohou být způsobeny buď pleiotropním působením genů MC1R a ASIP nebo geny, které jsou s nimi v úzké vazbě. U odznaků na končetinách zdokumentoval Woolf (1993, 1998) rozdílný výskyt mezi předními a zadními končetinami a rovněţ mezi pravou na levou stranou a zároveň ukazuje u obou asymetrií na jejich genetický základ. 27

28 Silný genetický základ vyplývá ze zjištěných genotypových korelací pro výskyt odznaků na hlavě i končetinách, které převyšují korelace fenotypové (Rieder et al., 2008). Další výsledky práce nasvědčují tomu, ţe výskyt bílých odznaků nemusí být řízen polygenně, jak se dosud vědci domnívali, ale jedním genem, kdy recesivní alela způsobí projev odznaků ve fenotypu. Výsledky vazebné analýzy nasvědčují umístění kandidátního lokusu na chromozómu ECA3q v blízkosti genu KIT. V současné době byly jiţ lokalizovány geny téměř pro všechna základní zbarvení u koní, byly odhaleny mutace spojené s konkrétními fenotypovými projevy a jsou známy metody, které umoţňují stanovit výbavu na jednotlivých lokusech na úrovni DNA (Rieder, 2009). Pomocí metody real-time PCR nebo techniky SNaPshot TM je moţné simultánní genotypování genů MC1R, ASIP a MATP na lokusech EXTENSION, AGOUTI a COLOR- CREAM (Royo et al., 2008; Kakoi et al., 2009; Rendo et al., 2009). Především technika SNaPshot TM umoţňuje v krátkém čase a s nízkými náklady zpracovat velký počet vzorků a poskytnout chovatelům potřebné informace o genotypu zvířat. 28

29 Tab. 2.2: Přehled lokusů a genů pro determinaci zbarvení u koní Název lokusu Označení genu Chromozóm Genotypy Fenotypový projev Poznámka Lokusy (geny) pro základní zbarvení EXTENSION AGOUTI MC1R ECA3p ASIP ECA22q E E E E E E E e E e E e A A A A A A A a A a A a produkce tmavého pigmentu eumelaninu černé nebo hnědé výsledné zbarvení (závisí na obsazení lokusu AGOUTI) stejný projev jako E E E E produkce pigmentu phaeomelaninu ryzé zbarvení distribuce černého pigmentu omezena pouze na distální části končetin, hřívu a ocas - hnědák stejný projev jako A A A A černý pigment rovnoměrně distribuován po celém těle - vraník recesivní epistáze E e E e vůči lokusu AGOUTI Lokusy (geny) způsobující ředění základního zbarvení COLOR (ALBINO, CREAM) DUN MATP ECA21q není známý ECA8 C c C c albinismus u koní nebyl popsán C Cr C + částečné zesvětlení (zředění) pigmentu C Cr C Cr C + C + D D D D D D D d D d D d 29 silné zředění základního zbarvení (pseudoalbinismus) ţádný efekt na základní zbarvení zředění základního zbarvení + výskyt tzv. primitivních znaků stejný projev jako D D D D ţádný efekt na základní zbarvení efekt pouze na pigment phaeomelanin

30 CHAMPAGNE SILVER SLC36A1 ECA14 PMEL17 ECA6q Ch Ch Ch Ch Ch Ch Ch ch Ch ch Ch ch Z Z Z Z Z Z Z z Z z Z z zesvětlení základní barvy srsti, zesvětlení kůţe stejný projev jako Ch Ch Ch Ch ţádný efekt zesvětlení černého pigmentu převáţně v hřívě a ocasu stejný projev jako Z Z Z Z ţádný efekt Lokusy (geny) pro bílé zbarvení způsobující překrytí maskování základního zbarvení WHITE GREY ROAN KIT ECA3q STX17 ECA25q KIT ECA3q W W W W W W W w W w W w G G G G G G G g G g G g Rn Rn Rn Rn Rn Rn Rn rn Rn rn Rn rn letální v embryonálním stádiu absence pigmentu v kůţi, srsti a očích, bílé zbarvení úplná pigmentace srsti progresivní vybělování s věkem, kůţe zůstává pigmentována (leucismus) stejný projev jako G G G G (pomalejší vybělování) bez známek vybělování pravděpodobně letální příměs bílých chlupů v srsti po celém těle (prokvetlost) ţádný efekt dominantní epistáze vůči ostatním genům pro zbarvení dominantní epistáze vůči ostatním genům pro zbarvení dominantní epistáze vůči ostatním genům pro zbarvení Lokusy (geny) způsobující strakatost TOBIANO OVERO KIT ECA3q EDNRB ECA17q To To To To strakatost typu tobiano To To To to stejný projev jako To To To To To to To to ţádný efekt O O O O letální faktor Syndrom úhynu bílých hříbat (OLWS) O O O o strakatost typu overo O o O o ţádný efekt 30

31 SABINO LEOPARD complex (APPALOOSA) KIT ECA3q TRPM1 ECA1q SB SB SB SB SB SB SB sb SB sb SB sb Lp Lp Lp Lp Lp Lp Lp lp Lp lp Lp lp jedinci téměř bílí strakatost typu sabino ţádný efekt strakatost typu appaloosa strakatost typu appaloosa, menší podíl bílých ploch neţ Lp Lp Lp Lp ţádný efekt vrozená noční slepota (CSNB) Modifikující lokusy (geny) MEALY (PANGARÉ) SOOTY FLAXEN Pa Pa Pa Pa Pa Pa Pa pa Pa pa Pa pa způsobuje tzv. moučný efekt stejný projev jako Pa Pa Pa Pa ţádný efekt přítomnost tmavě kouřových míst v srsti světle krémové nebo šedoţluté zbarvení hřívy u ryzáků. genetický mechanismus není dosud přesně známý genetický mechanismus není dosud přesně známý 31

32 Tab. 2.3: Přehled barev koní s příslušnými genotypy (Sponenberg, 1996; Jakubec, 1998) Anglický termín Tradiční český název Genotyp Black vraník E E - A a A a C + C + D d D d G g G g W w W w Rn rn Rn rn To to To to O o O o SB sb SB sb Lp lp Lp lp Bay hnědák E E - A A - C + C + D d D d G g G g W w W w Rn rn Rn rn To to To to O o O o SB sb SB sb Lp lp Lp lp Chestnut (Sorrel) ryzák E e E e - - C + C + D d D d G g G g W w W w Rn rn Rn rn To to To to O o O o SB sb SB sb Lp lp Lp lp Buckskin plavák E E - A A - C Cr C + D d D d G g G g W w W w Rn rn Rn rn To to To to O o O o SB sb SB sb Lp lp Lp lp Palomino izabela E e E e - - C Cr C + D d D d G g G g W w W w Rn rn Rn rn To to To to O o O o SB sb SB sb Lp lp Lp lp Perlino albín E E - A A - C Cr C Cr D d D d G g G g W w W w Rn rn Rn rn To to To to O o O o SB sb SB sb Lp lp Lp lp Cremello albín E e E e - - C Cr C Cr D d D d G g G g W w W w Rn rn Rn rn To to To to O o O o SB sb SB sb Lp lp Lp lp Smoky cream albín E E - A a A a C Cr C Cr D d D d G g G g W w W w Rn rn Rn rn To to To to O o O o SB sb SB s Lp lp Lp lp Dun plavák E E - A A - C + C + D D - G g G g W w W w Rn rn Rn rn To to To to O o O o SB sb SB sb Lp lp Lp lp Red dun plavák E e E e - - C + C + D D - G g G g W w W w Rn rn Rn rn To to To to O o O o SB sb SB sb Lp lp Lp lp Grullo šedý plavák, myšák E E - A a A a C + C + D D - G g G g W w W w Rn rn Rn rn To to To to O o O o SB sb SB sb Lp lp Lp lp Grey Bay /red /blue roan bělouš (vybělující) hnědý/červený /modrý bělouš, mourek G G - W w W w G g G g W w W w Rn Rn White albín W W W w Tobiano strakoš G g G g W w W w Rn rn Rn rn To To - O o O o SB sb SB sb Lp lp Lp lp Overo strakoš G g G g W w W w Rn rn Rn rn To to To to O O O o SB sb SB sb Lp lp Lp lp Sabino strakoš G g G g W w W w Rn rn Rn rn To to To to O o O o SB SB - Lp lp Lp lp Appaloosa hermelín (tygr) G g G g W w W w Rn rn Rn rn To to To to O o O o SB sb SB sb Lp Lp - 32

33 2.7 Kvantitativní charakteristika vybělování Rozdíl v rychlosti vybělování u starokladrubských koní uvádí jiţ Lerche (1956). Při chovateli oblíbeném kříţení běloušů s vraníky, které dává vzniknout heterozygotním jedincům (G G G g ), se tmavé zbarvení a grošování udrţovalo aţ do věku deseti let. Lerche (1956) rovněţ uvádí, ţe některé rodiny vybělují dříve a ve stáří čtyř let jsou jejich příslušníci úplně bílí, jiné rodiny vybělují pomalu a později. Přítomnost červených nebo černých teček (muškovitost) se ve větší míře vyskytovala u jedinců s podílem arabské krve (klisny kmene Shagya z kladrubských matek). Kvantitativní charakteristikou procesu vybělování u lipických koní se zabývali např. Curik et al. (2004). Koně do šesti let věku vykazovali značnou fenotypovou proměnlivost v úrovni vybělení. V deseti letech věku jiţ všechna zvířata dosáhla svého konečného zbarvení. Curik et al. (2004) zjistili poměrně značný vliv dědičnosti na rychlost i úroveň vybělení. Do studie bylo zahrnuto celkem 706 jedinců plemene lipický kůň v průběhu pěti let. Zbarvení bylo měřeno objektivně pomocí přístroje Minolta Chromameter CR210, statistické vyhodnocení bylo provedeno pomocí programu SAS. Vysoké koeficienty heritability a opakovatelnosti byly odhadnuty pro koně starší sedmi let, pro koně do sedmi let věku byly koeficienty heritability a opakovatelnosti dokonce velmi vysoké. Obecně vyšší koeficienty dědivosti a opakovatelnosti byly odhadnuty pro úroveň vybělení na zádi a na břiše neţ pro oblast krku a ramen. Je moţné, ţe tyto oblasti mohou vykazovat větší variabilitu v úrovni vybělení způsobenou vlivem prostředí (Curik et al., 2004). Kvantitativní charakteristika procesu vybělování u lipických koní je zahrnuta i v práci Sölknera et al. (2004). Pro objektivní měření zbarvení bylo pouţito rovněţ přístroje Minolta Chromameter CR210. Ze získaných dat byl odhadnut velmi vysoký koeficient heritability pro vybělování (h 2 =0,76). Pro výpočet koeficientu heritability byli ze souboru vyřazeni starší jedinci, u kterých uţ byl proces vybělování zcela ukončen. V případě ponechání těchto jedinců v souboru vychází koeficient heritability podstatně niţší (h 2 =0,49), coţ koresponduje i s výsledky Curika et al. (2004). Ve studii nebylo hodnoceno, do jaké míry můţe být variabilita ovlivněna genotypem zvířat (homozygoti G G G G nebo heterozygoti G G G g ), vzhledem k tomu, ţe tato informace nebyla u zvířat k dispozici. Předpokládaná frekvence recesivní alely G g v populaci je však poměrně nízká (q g =0,1). Pielberg et al. (2008) později zjistili v souboru 694 lipických koní rychlejší a úplnější vybělování u dominantních homozygotů (G G G G ) ve srovnání s heterozygoty (G G G g ). 33

34 2.8 Výskyt melanomu a vitiliga u vybělujících běloušů U vybělujících běloušů byla prokázána zvýšená vnímavost pro výskyt koţního melanomu (Fleury et al., 2000a,b; Heizerling et al., 2001). Koţní melanom se objevuje obvykle u takto zbarvených koní ve věku 5 6 let (Jeglum, 1999). Byly však pozorovány i vzácné případy výskytu raných stádií melanomu jiţ u tříletých koní (Rodríguez et al., 1997). Bylo odhadnuto, ţe u některých populací se melanom objeví v dospělosti aţ u 80 % jedinců (Valentine, 1995; Jeglum, 1999). Fleury et al. (2000a,b) uvádí u francouzského plemene Camarque výskyt melanomu u koní starších 15 let 67 %. Ve studii provedené u lipických koní Seltenhammer et al. (2003) byl zaznamenán výskyt melanomu u koní starších 15 let v 75 % případů. Rodríguez et al. (1997) dokonce uvádí 100 % frekvenci výskytu melanomu u koní starších 10 let. Fintl a Dixon (2001) zdokumentovali výskyt melanomu u běloušů různých plemen velšský pony, anglický plnokrevník, highland pony a irský taţný kůň. Ve všech případech šlo o koně starší osmi let. Typickými místy pro výskyt melanomu u běloušů je oblast pod ocasem, perianální a anální okrsek, perineální okrsek, vemeno, předkoţka, pysky a oční víčka a okolí, ušní boltce (Fleury et al., 2000a). Zvýšený výskyt melanomu u běloušů koní bývá některými autory dáván do souvislosti s věkem spojenými depigmentacemi kůţe (tzv. vitiligo), které je moţno pozorovat ve stejných místech na těle, na kterých se vyskytuje i koţní melanom (Rieder et al., 1999). Souvislost výskytu melanomu a vitiliga byla studována i u lidí (Milton et al., 1971; Lerner and Kirkwood, 1984; Schallreuter et al., 1991). Vitiligo je porucha pigmentace kůţe charakterizovaná výskytem bílých skvrn různého rozsahu, které vznikají v důsledku absence melanocytů v epidermis (Sölkner et al., 2004). Pro vysvětlení příčin vzniku vitiliga existuje několik hypotéz, z nichţ jako nejpravděpodobnější se jeví interakce faktorů genetických a faktorů prostředí. Silný vliv genetických faktorů byl potvrzen ve studiích u blízce příbuzných jedinců. Zjištěním rozdílné manifestace vitiliga u jednovaječných dvojčat byl prokázán vliv podmínek prostředí (Alkhateeb et al., 2003). Ačkoli bylo vytipováno mnoho různých rizikových faktorů prostředí pro vznik vitiliga, neexistují zatím ţádné vědecké publikace, které by jejich přímý vliv jednoznačně potvrdily (Spritz, 2007). Pro vznik vitiliga existují tři hlavní hypotézy (Ongenae et al., 2003). Nejčastěji je vitiligo vysvětlováno jako autoimunitní porucha. Pro tuto teorii svědčí vazba výskytu vitiliga s výskytem různých nemocí rovněţ s autoimunitním pozadím 34

35 (Schallreuter et al., 1994; Laberge et al., 2005) - např. poruchy funkce štítné ţlázy (Hegedüs et al., 1994), lupénka (Hwang et al., 1998), revmatická artritida, zhoubná anémie (Abraham et al., 1993), chronická ledvinová nedostatečnost (Mulligan et al., 1985), lupus, lichen planus (Anstey et al., 1993; Rubisz-Brzezinska et al., 1996). Druhá hypotéza předpokládá moţnost destrukce melanocytů a tím zastavení syntézy melaninu v důsledku nahromadění toxinů produkovaných nervovými zakončeními (Bystryn, 1997). Poslední moţností je destrukce melanocytů v důsledku autotoxicity metabolitů vznikajících při syntéze melaninu (Pawelek et al., 1980). Podobné depigmentace jako u člověka byly pozorovány kromě koní i u mnoha dalších druhů zvířat - např. u myší (Lerner et al., 1986; Spritz et al., 2003), psů (Kern et al., 1985), skotu, prasat (Millikan et al., 1973) a drůbeţe (Smyth et al., 1981). Přestoţe bělouši vykazují zvýšenou vnímavost k melanomu v závislosti na věku, byli i u starších jedinců různého pohlaví a plemene zaznamenány případy zcela bez výskytu melanomu. Vzhledem k existenci těchto jedinců nelze vybělování povaţovat za přímou příčinu vzniku melanomu (Rieder et al., 2000). Genetický vliv na výskyt tohoto onemocnění byl poprvé studován v roce 2000 (Rieder et al., 2000). Vzhledem k omezenému počtu zvířat (71) zařazených do studie však nebyli autoři schopni rozhodnout o jaký typ dědičnosti by se mohlo v tomto případě jednat (jeden gen, polygenní zaloţení, smíšený model). Přesto však model zahrnující polygenní sloţku popisoval data přesněji neţ negenetický model. Ve studii provedené Seltenhammer et al. (2003) u lipických koní byl odhadnut koeficient heritability pro výskyt melanomu na h 2 =0,36. Curik et al.(2002) zjistili u souboru 351 lipických koní (soubor vznikl rozšířením souboru pouţitého v práci Seltenhammer et al.(2003), hodnoty koeficientů heritability h 2 =0,24±0,11 pro melanom a h 2 =0,46±0,09 pro úroveň vybělení, s genetickou korelací 0,46±0,25. Podobné hodnoty koeficientu heritability uvádí i Sölkner et al.(2004) h 2 =0,36 ovšem pouze, pokud byla pro odhad koeficientu pouţita data získaná od jedinců starších šesti let. V případě zahrnutí 5-6 letých koní, klesá koeficient heritability na h 2 =0,19, v případě zahrnutí všech zvířat, včetně mladších 5 let, dokonce na h 2 =0,12. Ve studii Sölkner et al. (2004) byl hodnocen u zvířat i výskyt vitiliga. Koeficienty heritability pro jeho výskyt v podstatě odpovídaly koeficientům pro výskyt melanomu, opět v případě zařazení dat získaných od mladších koní výrazně klesaly. Poměrně překvapivý je poznatek, ţe mezi úrovní vybělování a výskytem melanomu nebyla zjištěna ţádná genetická korelace, coţ bylo v rozporu s předpokládanou hypotézou (Fleury et al., 2000a; Seltenhammer, 2000). Pozitivní vztah mezi úrovní vybělování 35

36 (0,46±0,25) a výskytem melanomu uvádí rovněţ Curik et al.(2002), v tomto případě byla ovšem pro výpočet pouţita data od mladých i starších zvířat dohromady. V případě vyřazení mladších zvířat klesá hodnota korelačního koeficientu na 0,27±0,10. Vitiligo vykazuje vysokou korelaci (0,66±0,10) s úrovní vybělování (Sölkner et al., 2004). Vyhodnocením vlivu inbreedingu na výskyt melanomu se zabývali Curik et al. (2000). Do studie bylo zahrnuto 296 lipických koní s průměrným koeficientem inbreedingu F=0,107. Výsledky ukázaly, ţe inbreeding ve sledovaném souboru neměl na výskyt melanomu statisticky průkazný vliv. Vzhledem k tomu, ţe gen pro vybělování můţe mít potencionálně pleiotropní efekt s působením nejen na vybělování, ale i na výskyt melanomu (Swinburne et al., 2002), je pro pochopení této souvislosti klíčovým momentem identifikace příslušného genu a odhalení mutace zodpovědné za vybělování. Přesná lokalizace genu pro vybělování poprvé publikována v práci Pielberg et al. (2008), která jako příčinnou mutaci uvádí duplikaci 4,6 kb v genu STX17 na chromozómu ECA25q. Následná analýza potvrdila vliv mutace nejen na vybělování, ale i na vnímavost k výskytu koţního melanomu. Homozygotní jedinci kromě rychlejšího a úplnějšího vybělování vykazovali průkazně vyšší výskyt melanomu a depigmentací typu vitiligo. Studium genu STX17 u lidí ţádnou souvislost mezi zjištěnými polymorfismy a výskytem melanomu naopak neodhalilo (Zhao et al., 2009). Charakter nádorů u vybělujících běloušů není zatím zcela známý, předpokládá se, ţe jde o nádor nezhoubný, s moţností přechodu do zhoubného stádia (Sölkner, 2004). Koţní melanomy u běloušů mají podobný charakter jako tzv. modré névy u člověka, proto se někteří autoři domnívají, ţe se nejedná o novotvary, ale o poruchu spojenou s ukládáním pigmentu (Sutton and Coleman, 1993). Později Seltenhammer (2000) pomocí histologických analýz dokázala, ţe se jedná o skutečné nádory, pro které je charakteristická absence nádorových buněk ve vrstvě epidermis. Valentine (1995) rozděluje nádory u běloušů do dvou skupin koţní melanom a koţní melanomatóza. Obě kategorie jsou histologicky velmi podobné a klasifikace je moţná pouze podle klinických příznaků. Koţní melanomy vykazují obvykle solitérní výskyt, léze je moţné chirurgicky odstranit. Koţní melanomatóza se projevuje ve formě mnohočetných lézí, které se často spojují, s výskytem nejčastěji v okolí genitálií a v perineální oblasti, podobně jako koţní melanom. Tento typ nádoru jiţ není zpravidla moţné zcela odoperovat a můţe být rovněţ 36

37 doprovázen metastázami ve vnitřních orgánech. Metastázy mohou, ale nemusí být spojeny s klinickými projevy orgánové dysfunkce. Většina těchto koní umírá nebo je utracena z jiných důvodů neţ je postiţení melanomem. Častými příznaky u koní trpících metastazujícím melanomem jsou deprese, úbytek hmotnosti, kolika a periferní edém, krváceniny z nosní dutiny, potíţe s dýcháním, ataxie a neschopnost normálního pohybu. U melanomatózy je moţné provést debulking (zmenšení nádorové masy), ale úplné odstranění nádoru není většinou moţné (Bertone, 2006). Výskyt melanomu u koní ostatních barev je všeobecně povaţován za velmi vzácný. Pokud se však objeví, bývá většinou agresivnější neţ u běloušů (Patterson-Kane and Ginn, 2003). Jejich výskyt není vázán na určité tělesné partie a mohou se objevit prakticky kdekoli (Schöniger and Summers, 2009). U nevybělujících koní bývají melanomy nejčastěji klasifikovány jako benigní melanocytické névy nebo velmi zřídka jako anaplastické maligní melanomy s typickou zvýšenou úrovní mitózy (Foley et al., 1991, Valentine, 1995). Jedna z moţných hypotéz říká, ţe díky omezené nebo dokonce ukončené aktivitě melanocytů u běloušů, se výrazně zpomaluje proliferace nádorů a výskyt metastáz. To vysvětluje fakt, ţe někteří jedinci přeţívají s tímto onemocněním poměrně dlouhou dobu bez váţnějších komplikací (MacGillivray et al., 2002). Naproti tomu podobně postiţení nevybělující koně umírají relativně brzy vzhledem k výskytu četných metastáz. Je moţné, ţe právě proto v populacích běloušů můţeme pozorovat výrazně vyšší počet přeţívajících jedinců s výskytem melanomu neţ u ostatních populací (Rieder et al., 2000). Sutton and Coleman (1997) však uvádí četný výskyt metastáz u běloušů poraţených na jatkách ve vyšším věku. Vzhledem k tomu, ţe léze se často nacházejí i v kosterní svalovině, není moţné maso postiţených zvířat vyuţít. Někteří zpracovatelé v Austrálii z tohoto důvodu dokonce přímo odmítali bělouše vykupovat. Metastázy v páteřním kanále u 12-letého hřebce bělouše popisují Patterson-Kane et al. (2001). Melanom můţe negativně ovlivnit welfare zvířat, především nachází-li se na citlivých místech těla ve větším rozsahu a můţe rovněţ omezit nebo dokonce úplně znemoţnit vyuţívání postiţených jedinců (Swinburne et al., 2002). Rovněţ můţe dojít vhledem k oblastem, na kterých se melanom zpravidla vyskytuje, k negativnímu ovlivnění některých fyziologických aktivit (močení, vyprazdňování, pohlavní akt) (Rodríguez et al., 1997). Vzhledem k předpokládané vysoké genetické determinaci výskytu melanomu, výběr jedinců bez projevů tohoto onemocnění, má rozhodující dopad na zdraví zvířat v konkrétní populaci (Rieder et al., 2000). 37

38 Vnímavost na výskyt melanomu v lidské populaci bývá spojována s chromozómem 9p21. Na úseku tohoto chromozómu se nachází inhibitor 2a regulátor cyclin-dependentní kinázy (CDK). Rakovina je porucha charakterizovaná ztrátou kontroly buněčného cyklu. Právě CDK a její inhibitory jsou klíčovými regulátory tohoto cyklu. Mutace nebo absence inhibitorů CDK indikují vznik zhoubných nádorů. (Canon-Albright et al., 1994). U člověka jsou v současné době známy dva geny, které mají vliv na predispozici ke vzniku melanomu. První gen CDKN2A je lokalizován na chromozómu 9p21. Druhý gen CDK4 se nachází na 12q13. Přestoţe určité mutace v CDKN2A genu prokazatelně zvyšují u svých nositelů vnímavost ke vzniku melanomu, byli rovněţ zaznamenáni homozygotní jedinci s těmito mutacemi, u kterých se melanom neprojevil. Tyto studie naznačují, ţe se na patogenezi melanomu podílejí pravděpodobně ještě další, dosud neznámé modifikační geny a ţe na fenotypový projev melanomu mají značný vliv i podmínky vnějšího prostředí. Nejdiskutovanějším rizikovým faktorem je vystavení organismu UV záření (Goldstein and Tucker, 2001). Vzhledem k podobnému charakteru melanomu u koně a u člověka můţe kůň dobře slouţit jako modelový organismus. V některých případech se jeví dokonce, vzhledem k vyššímu doţitému věku, který umoţní sledovat změny v průběhu stárnutí, jako výhodnější neţ běţně vyuţívaná myš domácí (Casal and Haskins, 2006). 38

39 2.9 Starokladrubský kůň Historie plemene Starokladrubský kůň je původní, u nás vyšlechtěné plemeno, dle fylogenetického původu patří do skupiny koní východních orientálních a vzniklo na podkladě krve starošpanělských a staroitalských koní. Patří mezi tzv. barokní plemena. O jeho unikátnosti svědčí i fakt, ţe byl kladrubský bělouš v roce 1995 prohlášen, spolu s objektem hřebčína Kladruby nad Labem, státní kulturní památkou. Starokladrubského koně řadíme mezi teplokrevná plemena, i kdyţ jeho lebka nese známky skupiny koní západních, chladnokrevných (Lerche, 1956). Bílek (1957) uvádí, ţe starokladrubský kůň je nositelem genů koně norického. Současní koně mají evidované předky aţ do poloviny osmnáctého století a tvoří pět čistokrevných klasických kmenů a tři čistokrevné neklasické kmeny, z nichţ jsou Generale, Favory a Rudolfo bělouši, Solo a Siglavi Pakra vraníci a Generalissimus, Sacramoso a Romke se vyskytují v obou barevných variantách. Čistokrevný klasický kmen Napoleone zanikl v r (Řád plemenné knihy starokladrubského koně, 2005). Přehled aktuálních linií staroladrubského koně s uvedením roku narození jejich zakladatele a původu uvádí tabulka. Tab. 2.4: Přehled aktuálních linií starokladrubského koně (Vostrý et al., dosud nepublikováno) Linie Barva Narození zakladatele Generale bělouš 1787 Generale - Generalisimus bělouš 1938 Favory plavák 1779 Favory - Generalisimus bělouš 1965 Sacramoso bělouš/vraník 1800 Solo vraník 1927 Siglavi Pakra vraník 1946 Romke vraník 1966 Rudolfo bělouš 1968 Plemeno Starokladrubské Starokladrubské Starokladrubské Starokladrubské Italskošpanělské Starokladrubské Lipické Fríské Lusitano Původ Česká republika Slovensko Slovensko Česká republika Itálie Česká republika Slovinsko Nizozemsko Portugalsko Za zakladatele populace starokladrubských běloušů je povaţován hřebec Generale, narozený v roce Jeho první syn Generalissimus, narozený v roce 1797 z klisny Bellona se stal zakladatelem stejnojmenného samostatného kmene. Posledním plemeníkem linie Generalissimus byl Generalissimus Almada XXII, který však nezanechal samčího pokračovatele linie, která tak po více neţ 130 letech zanikla. Dvě klisny linie Generalissimus daly vzniknout dvěma novým subliniím. První z nich je odvozena od původní linie Generale, 39

40 druhá od lipické linie kladrubského původu Favory. Původ bílé linie Sacramoso je shodný s vranou linií aţ po hřebce Sacramoso XXX (1920). Jeho druhý syn, šedý bělouš, Sacramoso XXXIII (1944) zaloţil v Kladrubech bílou linii. Zakladatelem linie Favory byl stejnojmenný hřebec, který se narodil roku 1779 v Kladrubech nad Labem. Později byl převezen do hřebčína Lipica, kde zaloţil samostatnou linii, která se rozšířila do všech hřebčínů chovajících lipické koně. Při výběru lipických hřebců pro hřebčín Kladruby se ukázalo, ţe právě kmen Favory představuje koně nejbliţší koním starokladrubským svým typem a rámcem (David, 1987). Kromě zaloţení samostatné linie poslouţili lipičtí hřebci v kladrubském stádě pro rozšíření genové základny. Dalším fylogeneticky příbuzným plemenem vyuţitým pro rozšíření krevní základny kladrubského bělouše s cílem sníţení rizika příbuzenské plemenitby bylo plemeno lusitano hřebcem Rudolfo, který je zakladatelem stejnojmenné linie. Původ starokladrubských koní lze vysledovat k osmi zakladatelkám čistokrevných klasických rodin (Africa, Rava, Deflorata, Almerina, Sardinia, Ragusa, Cariera, Madar VI) a sedmi zakladatelkám čistokrevných neklasických rodin (15 Narcis, 67 Xandra, 154 Bárta, Favora Č3912, Dana (G) Č3934, 292 Ritorna, Gita (G) Č399) Zbarvení starokladrubského koně Starokladrubský kůň je chován ve dvou barevných variantách (bělouš v Kladrubech nad Labem, vraník ve Slatiňanech) od počátku 19. století, do té doby byly v chovu zastoupeny prakticky všechny ostatní barvy, které se u koní vyskytují. Zpočátku převládali v kladrubském stádě koně tmavých barev. Polovina hřebců pouţívaných v Kladrubech nad Labem do roku 1750 byla hnědého zbarvení (např. linie Pompejus, Imperatore, Spagniolo). V chovu se vyskytovali kromě vraníků a běloušů i ryzáci, plaváci, albíni a strakoši (Lerche, 1956). Obr. 2.7: Starokldrubský bělouš Obr. 2.8: Starokladrubský vraník 40

41 Obr. 2.9: Výskyt hnědého zbarvení v linii Pompejus (Lerche, 1956) Pompejus (1797) hnědák Pompejus (1819) vraník Pompejus (1803) hnědák Aragona II (1813) hnědka Benevola (1793) hnědka Amico (1798) hnědák Aragona I (1793) hnědka Paduer (1786) hnědák Benevola (1778) hnědka Amico (1788) hnědák Brittania (1787) hnědka Imperatore (1783) hnědák Aragona (1782) hnědka Paduer (1772) Musica (1772) hnědka Galliardo (1765) hnědák Bayona (1765) hnědka Pálffy III (1778) hnědák Calabria (1777) hnědka Imperatore (1775) bělouš Bellafiglia (1776) Obr. 2.10: Výskyt hnědého a plavého zbarvení v linii Spagniolo (Lerche, 1956) Spagniolo (1775) bělouš Spagniolo (1763) hnědák Spagniolo (1759) plavák Argentina (1758) hnědka Spagniolo bělouš Electa (1741) plavka Danese vraník Argentina (1747) hnědka Spagniolo (1783) bělouš Normandia (1763) bělka Pluto (1765) bělouš Diana (1777) bělka Corduana (1765) bělka Spagniolo (1749) bělouš Corduana (1750) vranka Galanteria (1738) vranka Philosopho vraník Carbona (1741) vranka 41

42 Od počátku 19.století se chov koní v hřebčíně ustálil na dvou barvách bílé a černé. Časté bylo připařování běloušů a vraníků mezi sebou. Potomci z těchto páření byli velmi oblíbení pro své výrazné grošování. Zajímavý je fakt, ţe některé linie běloušů vznikly v podstatě z vraných předků. Příkladem můţe být rodokmen hřebce Generale Vallona (obr ), který je povaţován za nejvýznamnějšího hřebce kmene Generale. Oba jeho rodiče byli bělouši, ale jiţ v jeho II. generaci se objevuje vranka Mosca a v další generaci je polovina předků vraníků (Lerche, 1956). Z rodokmenů je zřejmé, ţe velká část běloušů musela být heterozygotních na lokusu pro vybělování. Obr. 2.11: Rodokmen hřebce Generale Vallona (Lerche, 1956) Generale Vallona (1796) bělouš General (1787) bělouš Vallona (1774) bělka Imperatore (1775) bělouš Mosca (1774) vranka Bizarro (1769) bělouš Tirnava (1774) bělka Pepoli (1764) vraník Aurora (1764) bělka Mosto (1764) vraník Salvatica (1765) vranka Danese (1764) vraník Tirnava (1754) bělka Geny pro, v dnešní době, netradiční zbarvení u starokladrubských koní byly do populace dále vneseny pouţitím hřebců jiných plemen za účelem rozšíření genové základny a omezení příbuzenské plemenitby a s tím spojené inbrední deprese. Podrobný výčet hřebců pouţitých pro osvěţení krve starokladrubské populace uvádí Lerche (1956). V letech bylo 7 klisen po vraníkovi North Star zapuštěno anglickým plnokrevníkem 125 Salamander, kaštanovým hnědákem. Potomstvo bylo jednak barvy hnědé, jednak vraníci. V dalším chovu se však tito jedinci neuplatnili. V letech bylo zapuštěno 18 kladrubských vranek východopruským hnědákem Hindu. Potomstvo bylo vesměs hnědé barvy a ztratilo kladrubský typ, proto bylo pouţito v anglickém plnokrevném stádě. V letech byli na kladrubské vranky i bělky připuštěni hnědě zbarvení lipičtí hřebci Neapolis, Conversano a Pluto Higio. V letech bylo zapuštěno 19 kladrubských vranek ryzákem Gidran-K. Všechna narozená hříbata byla sice hnědáci, ale zároveň zákonitě nositeli recesivní alely E e. 42

43 Roku 1827 začíná první etapa pouţití arabských hřebců ve stádě kladrubských běloušů. Většina jich byla běloušů, ale byli mezi nimi i dva hnědáci (Koheil 2, Vezier 2). V hřebčíně Lipica byla roku 1779 zaloţena linie pojmenovaná po svém zakladateli hřebci Favory, který byl plavého zbarvení. V druhé polovině 19. století byli pouţiti ve stádě kladrubských bělek čtyři hřebci anglického plnokrevníka hnědák Blue Boy, černý hnědák Hulton, kaštanový hnědák Braggadocio a hnědák Hornpool. Od roku 1954 působil ve státním hřebčíně jako kmenový plemeník, určený pro stádo běloušů, orlovský klusák Legion, bělouš z ryzé matky, tedy nositel recesivní alely E e. Z výše uvedeného vyplývá, ţe u současných generací starokladrubských koní je moţno očekávat vyštěpení barevných forem (např. hnědák, ryzák) v případě, ţe lokus G je u pářených zvířat v heterozygotní sestavě (tab 9.32) Chovný cíl Chovným cílem je kůň středně velkého aţ velkého tělesného rámce s korektní stavbou těla, harmonickými proporcemi a typickou klabonosou hlavou s výrazným velkým tmavým okem. Vyznačuje se pravidelnými kadencovanými chody s typickou vysokou akcí hrudních končetin v klusu. Cílem je zachování jediného původního českého plemene koní v typu galakarosiera, s vyuţitím k ceremoniální a reprezentativní sluţbě, soutěţím spřeţení, drezuře, baroknímu a rekreačnímu jeţdění. Pro svůj dobrý charakter a vyrovnanou povahu se hodí i pro hipoterapii. Ţádoucí jsou dvě barevné varianty bělouši a vraníci. Z plemenitby se nevylučují ani jiné barevné varianty hnědáci a ryzáci (Řád plemenné knihy starokladrubského koně, 2005). Plemeno bylo zařazeno mezi genové rezervy a od roku 2002 je populace starokladrubských koní uzavřena přílivu krve jiných plemen. K bylo evidováno 57 plemenných hřebců (28 běloušů, 29 vraníků) a 479 plemenných klisen (234 bělek, 245 vranek). Do genetických zdrojů bylo, z celkového stavu 479 plemenných klisen, zařazeno 352 klisen, tj. 73,5 % (Dyková, 2010). Genetickým zdrojem je autochtonní nebo dlouhodobě adaptované plemeno. V české republice je postavení plemene-genetického zdroje dáno zákonem č. 154/2000 Sb. o šlechtění, plemenitbě a evidenci hospodářských zvířat, který v 14 definuje genetické zdroje a jejich ochranu. Navazující vyhláška č. 471/2000 uvádí jako genetický zdroj plemeno starokladrubský kůň. 43

44 Jedním z poţadavků pro zařazení hřebců a klisen starokladrubského koně do genetických zdrojů je stanovení podílů tzv. původních genů v rodokmenech aktuálních zvířat (podrobněji v kapitole METODIKA). Oproti původnímu limitu 35 % jsou do genetických zdrojů od roku 2004 zařazována zvířata s minimálně 50 % podílem původních starokladrubských genů, stanoveným podle upravené a radou plemenné knihy schválené metodiky (Volenec, 2004). Chovatelům koní zařazených do genetických zdrojů poskytuje Ministerstvo zemědělství na základě ţádosti a při splnění stanovených podmínek peněţní dotaci. Jednou z podmínek je odebrání genetického materiálu (krev, inseminační dávka) a jeho uloţení v genobance Výzkumného ústavu ţivočišné výroby v Praze Uhříněvsi. Dle pravidel FAO se plemena dělí do 5 kategorií (tab. 2.5). Základní kriterium pro klasifikaci statutu plemene je aktuální efektivní velikost populace Ne, stanovená dle Falconer a Mackay (1996) jako: N e kde: 4N N m m N N f f N m je počet čistokrevných plemeníků v přirozené plemenitbě a inseminaci N f je počet samic v čistokrevné plemenitbě Tab.2.5: Stupeň ohrožení plemene v závislosti na velikosti efektivní populace N e Hodnota N e Kategorie ohrožení > 1000 bez ohroţení zranitelná ohroţená kriticky ohroţená < 50 neudrţitelná S ohledem na výše uvedenou klasifikaci patří starokladrubský kůň (efektivní velikost populace vypočtená z aktuálních stavů 57 plemenných hřebců a 479 klisen N e = 204) mezi ohroţená plemena, přičemţ se počet klisen ještě nedávno přibliţoval kritickému stavu (Jakubec a Záliš, 2000). Při sestavování připařovacích plánů v malé populaci je nutné respektovat zejména příbuznost jedinců a vyhledávat rodičovské páry tak, aby mezi nimi byl koeficient příbuznosti nulový nebo alespoň minimální. Aplikuje se systém tzv. rotačního skupinového páření mezi stávajícími otcovskými liniemi. Principem systému je střídání plemeníků mezi skupinami klisen určité linie v kaţdé generaci. To umoţňuje páření mezi jedinci po dobu 4-5 generací neţ dojde k setkání genů stejné linie (Jakubec a Volenec, 2003). 44

45 3 CÍLE PRÁCE 1. Kvantitativní charakteristika vybělování a proměnlivosti zbarvení u starokladrubského koně, analýza zdrojů proměnlivosti zbarvení. 2. Vyhodnocení vztahu mezi stavem a průběhem vybělování a výskytem melanomu a vitiliga u starokladrubských běloušů. 3. Ověření vztahu mezi genovou výbavou na lokusu GREY (G), procesem vybělování, výskytem melanomu a vitiliga. 4. Ověření vztahu mezi koeficientem inbreedingu F X, procesem vybělování, výskytem melanomu a vitiliga. 5. Ověření vztahu mezi podílem původních starokladrubských genů, procesem vybělování, výskytem melanomu a vitiliga. 4 HYPOTÉZY 4.1 Proces vybělování Obsazení lokusu G (G G G G, G G G g ) ovlivňuje rychlost a úplnost vybělování Liniová příslušnost ovlivňuje rychlost a úplnost vybělování. 4.2 Výskyt melanomu a vitiliga Pravděpodobnost výskytu melanomu a vitiliga se zvyšuje s věkem koní Stupeň výskytu melanomu a vitiliga se zvyšuje s věkem koní Na výskyt melanomu a vitiliga má vliv obsazení lokusu G Na výskyt melanomu a vitiliga má vliv liniová příslušnost. 45

46 5 MATERIÁL A METODIKA 5.1 Struktura dat Celkem bylo sledováno 376 různých koní plemene starokladrubský bělouš ve věku od 1 do 28 let. Pro kvantitativní analýzu bylo k dispozici celkem 702 záznamů, získaných opakovaným měřením v letech (1 4 záznamy od kaţdého jedince). Z 376 koní bylo 230, tj. 61% klisen a 146, tj. 39 % hřebců (valachů), pokud uvaţujeme opakovaná měření, představují údaje získané od klisen 68 %, od hřebců (valachů) pak 32 %. Zastoupení jednotlivých linií je patrné z grafů 5.1. a 5.2. Z podobnosti obou grafů je zřejmé, ţe opakovaným měřením nebylo liniové zastoupení nijak významně ovlivněno. Graf 5.1: Rozdělení sledovaných zvířat podle linií Graf 5.2: Liniové zastoupení v opakovaných měřeních 46

47 Z grafu 5.3 je patrné, ţe nejvíce údajů pochází od mladých koní, ve věku 2 3 roky. Tato struktura je výhodná pro hodnocení procesu vybělování. Pro hodnocení výskytu melanomu jsou zajímaví koně přibliţně od šesti let věku, vhledem k tomu, ţe u mladších jedinců se melanom prakticky nevyskytuje. Pro kvantitativní charakteristiku vybělování a vyhodnocení výskytu melanomu a vitiliga v závislosti na věku byla všechna zvířata starší 21 let sloučena do jedné skupiny. Graf 5.3: Věkové zastoupení v opakovaných měřeních Kromě koní chovaných v hřebčíně Kladruby nad Labem, byla zařazena i zvířata z menších soukromých chovů (Hřebčín Favory Benice; Barokní a kočároví koně Barták Nahoruby; L. Dobrovský, Vacenovice; E. Šimáčková, Nebanice; V. Davídková, Blovice). Procentické zastoupení jednotlivých chovů uvádí graf 5.4. Vzhledem k početním stavům koní v jednotlivých chovech, byl logicky největší počet měření získán v hřebčíně Kladruby nad Labem. V menších chovech shrnutých do skupiny Ostatní navíc nebyla z technických důvodů provedena opakovaná měření. Graf 5.4: Zastoupení jednotlivých chovů v opakovaných měřeních 47