MICHAL PAVLÍK a, JAN VACEK b, BOŘIVOJ KLEJDUS c a VLASTIMIL KUBÁŇ c

Transkript

1 STUDIUM VLIVU SACHAROSY A POLYETHYLENGLYKOLU NA PRODUKCI HYPERICINU A HYPERFORINU V ROSTLINÁCH Hypericum perfortum L. VYSOKO- ÚČINNOU KAPALINOVOU CHROMATOGRAFIÍ MICHAL PAVLÍK, JAN VACEK, BOŘIVOJ KLEJDUS c VLASTIMIL KUBÁŇ c Ústv přírodních léčiv, Veterinární frmceutická univerzit v Brně, Plckého 1 3, Brno, Biofyzikální ústv, Akdemie věd České repuliky, Královopolská 135, Brno, c Ústv chemie iochemie, Mendelov zemědělská lesnická univerzit v Brně, Zemědělská 1, 613 Brno kun@mendelu.cz Došlo , přeprcováno , přijto příliš mnoho známo. Při vyšších dávkách hypericinu yl prokázán schopnost inhiice monominoxids 3. V litertuře je tké popsán finit hypericinu k σ- opioidním receptorům 1. Hyperforin je zstoupen v rostlinách třezlky ve vyšších koncentrcích než hypericin. Má význmný účinek n serotoninový, nordrenlinový, dopminový opioidní systém živočichů, včetně člověk. Mezi popsné mechnismy in vitro ptří (i) ntgonismus ke spsmogenním účinkům, (ii) ntgonismus ke kontrkcím tenkého střev řízeným serotoninem (iii) inhiice trnsportu serotoninu 3. U 1 ze 13 klinických studií yl pozorován vyšší ntidepresivní účinek u extrktu z třezlky ve srovnání s podným plceem v některých přípdech dokonce i vyšší než u ntidepresiv Elvil, Prozc, Tofrnil neo Zoloft 3. Ukzuje se, že extrkty z třezlky mohou plnit funkci účinného doplňku k ěžně používným léčivům depresivních stvů. Cíle této práce jsou: (i) optimlizovt metodu kplinové chromtogrfie s UV-Vis detekcí k rychlému citlivému stnovení hypericinu hyperforinu v prýtech H. perfortum (ii) stimulovt rostliny pěstovné in vitro ke zvýšené produkci oou látek účinkem schrosy polyethylenglykolu (HO-[-CH 2 -CH 2 -O-] n -H) poukázt tk n Klíčová slov: hypericin, hyperforin, chromtogrfie, HPLC, UV-Vis, třezlk tečkovná, Hypericum perfortum L. Úvod Třezlk tečkovná (Hypericum perfortum L.) oshuje spektrum iologicky ktivních látek, jko jsou nftodinthrony, floroglucinoly, flvonoidy, tniny, fenylpropny, xnthony dlší 1. Většinou jde o sekundární metolity, které vykzují stimulující neo inhiující účinek n fyziologické procesy. Toto zjištění vedlo v minulosti k využívání extrktů z H. perfortum v trdiční lidové medicíně. S rozvojem frmkologie frmkochemických oorů yly účinné látky izolovány zčly se využívt i v klsické humánní medicíně. Zároveň yl ojsněn fyziologický účinek těchto látek n molekulární úrovni. Frmkoprepráty připrvené z extrktů H. perfortum se podávjí při léčě depresivních stvů předstvují lterntivu k syntetickým ntidepresivům. Účinné látky osžené v extrktech třezlky jsou schopny (i) oecně inhiovt metolismus neurotrnsmiterů, (ii) modulovt citlivost neurotrnsmiterů (iii) inhiovt synptický trnsport mediátorů nervového signálu, jko je serotonin, nordrenlin dopmin 1,2. Předmětem nšeho zájmu je hypericin derivát nftodinthronu (or. 1) hyperforin derivát fluoroglucinolu (or. 1). Oě látky jsou přítomny v extrktech H. perfortum předstvují hlvní ktivní komponenty s ntidepresivním účinkem. O iochemické podsttě ntidepresivního účinku hypericinu hyperforinu doposud není Or. 1. Strukturní vzorce () hypericinu () hyperforinu 556

2 vriilní osh hypericinu hyperforinu v závislosti n podmínkách růstu rostlin třezlky. Mteriál metody Rostlinný mteriál K experimentům yly použity rostliny Hypericum perfortum L. vr. Tops, vypěstovné ze semen. Semen yl sesírán v roce 2 v Zhrdě léčivých rostlin LF MU Brno. Semen yl promýván roztokem detergentu (Jr, Procter&Gmle Rkon, Rkovník, Česká repulik) ve zkumvkách po dou 6 min. Po slití roztoku detergentu opláchnutí destilovnou vodou yl semen desinfikován 15% roztokem Sv (osh chlornnu sodného mx. 5 %, Bochemie, Bohumín, Česká repulik) po dou 2 min. Semen yl následně desetkrát opláchnut ve sterilní destilovné vodě očkován n kultivční půdu k nklíčení (13 dní). Veškeré operce yly prováděny v septickém oxu Ftrn LF (Chirn, Brno, Česká repulik). Kultivč ní médium V experimentech ylo použito komerčně dostupné 5% kultivční médium Murshige-Skoog (MS) (cit. 4 ) o koncentrci 2,151 g dm 3 s doplňkem glycinu (2 mg dm 3 ), myo-inositolu (1 mg dm 3 ), nikotinové kyseliny (,5 mg dm 3 ), hydrochloridu pyridoxinu (,5 mg dm 3 ) hydrochloridu thiminu (,1 mg dm 3 ), zpevněné Gelritem 3, g dm 3 (vše Duchef, Hrlem, Nizozemí). Složky kultivčního médi yly míchány n elektromgnetické míchčce ve zvoleném množství destilovné vody ž do rozpuštění. Poté yly homogenním kultivčním médiem (75 ml) nplněny infúzní lhve (,5 l), které yly následně uzvřeny lolem. Kultivční médium prcovní nástroje yly sterilizovány v utoklávu (typ AUT 26/2, Chirn, Brno, Česká repulik) při teplotě 121 C přetlku 11 kp po dou 2 min. Veškeré mnipulce vyždující sterilní prostředí yly prováděny v septickém oxu Ftrn LF (Chirn, Brno, Česká repulik). Kultivč ní podmínky Rostliny yly kultivovány ve sterilních podmínkách v kultivčním osvětlovcím oxu MIR Snyo (Schoeller, Německo) při teplotě 22±4 C při světelné periodě 16/8 h (světlo/tm). Zdrojem světl yly zářivky Osrm L36W/77 Fluor (Osrm, München, Německo) s mximální intentitou záření v rozmezí λ = 4 5 nm 6 7 nm méně výrzným mximem při λ = 55 nm. Tyto zářivky simulují přirozené světlo se součsným posílením vlnových délek v červené modré olsti. Po nklíčení yly mlé rostlinky přeneseny do infúzních lhví n udržovcí půdu (MS 5 %, vitmíny 1 %, schros 1 g dm 3, gierelová kyselin 75 µg dm 3 Gelrite,25 %) pěstovány 15 dnů do velikosti si 3 ž 4 cm v kultivčním osvětlovcím oxu. Kultivce rostlin n médiu s přídvkem schrosy (p.., Pliv-Lchem, Brno, Česká repulik) v koncentrcích 1, 2 3 g dm 3 polyethylenglykolu 6 (PEG, Fluk, Buchs, Švýcrsko) v koncentrcích 1,25; 2,5; 5; 1 15 g dm 3 proíhl 21 dní z výše uvedených podmínek. Uvedeným koncentrcím schrosy PEG yly vystveny rostliny pěstovné n udržovcí půdě. Odě r vzorků Po ukončení kultivce yl proveden fotodokumentce (Olympus C-44 ZOOM, Olympus, Tokyo, Jpn). Celé prýty yly vždy oderány ze všech rostlin v jedné infúzní lhvi. Od kždé vrinty yly oderány tři vzorky. Vzorky yly zváženy ihned vloženy do plstových zkumvek, zmrženy kplným dusíkem uchovávány v mrzicím oxu při konstntní teplotě 8 C. Před stnovením oshu hypericinu hyperforinu metodou HPLC yly všechny vzorky lyofilizovány v lyofilizátoru Christ Alph 1-2 B (Brun Biotech Internt., Osterode, Německo) homogenizovány mletím v kplném dusíku (Virom 2S, Jevý, Třeechovice p. O., Česká repulik). Grvimetricky yl stnoven osh vody v zřízení n stnovení vlhkosti MA 3 (Srtorius, Goettingen, Německo). Homogenizovné vzorky (2 mg) yly extrhovány 4 ml 8% (v/v) ethnolu (teplotní progrm: 1. stupeň: teplot chldicího/ohřívcího loku 15 C po 3 min, ochlzení chldicího/ohřívcího loku n 3 C po 5 min; 2. stupeň: teplot chldicího/ohřívcího loku 14 C po 3 min, ochlzení chldicího/ohřívcího loku n 3 C n 5 min) v modifikovném Soxhletě přístroji fex Ik Werke 5 (IKA-Werke, Stufen, Německo). Před nástřikem vzorku do HPLC systému yl získný extrkt filtrován nylonovým memránovým filtrem (,45 µm, 13 mm průměr, Alltech Assocites, Doerfield, USA). Chemikálie pro nlýzu Acetonitril (ACN) pro HPLC octn monný (AcNH 4 ) yly dodány firmou Merck (Drmstdt, Německo). Hypericin, hyperforin dlší chemikálie ACS (Americn Chemicl Stndrd) čistoty yly od firmy Sigm Aldrich (St. Louis, USA). Zásoní roztoky hypericinu (4 µg dm 3 ) hyperforinu (1 µg dm 3 ) v methnolu yly použity pro optimlizci klirci metody yly uchovávány ve tmě při 4 C. Všechny roztoky použité pro HPLC yly filtrovány,45 µm teflonovými memránovými filtry (MetChem, Torrnce, USA). Chromtogrfie HP 11 chromtogrfický systém (Hewlett-Pckrd, Wldronn, Německo) vyvený vkuovým odplyňovcím modulem (G1322A), pumpmi (G1312A), utomtic- 557

3 kým dávkovčem vzorků (G1313A), termosttem kolon (G1316A) UV-Vis detektorem s diodovým polem (G1315A) yl řízen progrmem ChemSttion (Rev. A7.1). Hypericin hyperforin yly seprovány lineární grdientovou elucí n koloně s reverzní fázi Zorx SB- CN (75 mm 4,6 mm, velikost částic 3,5 µm, Agilent, Plo Alto, USA) moilní fázi cetonitril,1 mol dm 3 octn monný (%, v/v: min 5/5, 5 min 1/, 8 min 1/, 1 min 5/5) při průtokové rychlost moilní fáze,8 ml min 1 teplotě termosttu kolon 35 C. Výsledky diskuse Chromtogrfické stnovení hypericinu hyperforinu Extrkce hypericinu hyperforinu z lyofilizovných vzorků rostlinného mteriálu yl prováděn 8% ethnolem v modifikovném Soxhletově přístroji. Extrhovt lze i jinými technikmi, npř. v destilční prtuře se zpětným chldičem, ultrzvukem neo komerčně dostupnými extrktory 4,5. Vzorky po extrkci neo jiné mnipulci je vhodné ihned podroit nlýze, jelikož čsem mohou oě látky podléht degrdci neo oxidci, především následkem extremních hodnot ph vysokých teplot 5. Vysokoúčinná kplinová chromtogrfie ve spojení s UV-Vis spektrofotometrickým 6, fluorescenčním 7, hmotnostním 5,8 neo elektrochemickým 9 detektorem ptří vedle klsické spektrofotometrie k nejrozšířenějším metodám pro stnovení hypericinu hyperforinu. Pro seprci hypericinu z extrktů H. perfortum je možné využít izokrtickou eluci 1. Při grdientové eluci se ovykle používá jko nepolární orgnické rozpouštědlo cetonitril v kominci s vodnou fází oshující slé kyseliny (octová kyselin, trifluorooctová kyselin), jejich sole neo směsi slé kyseliny její soli 5,7,11. HPLC s detektorem s diodovým polem (DAD) yl použit pro stnovení hypericinu, hyperforinu řdy dlších komponent extrktu z H. perfortum při vlnové délce nm (cit. 11 ). Kromě hypericinu (retenční čs (RT): 49,9 min) hyperforinu (RT: 35,9 min) ylo možné při 27 nm stnovit pseudohypericin, kvercetin, rutin, hyperosid dlší. Buer spol. 1 použili kolony s reverzní fází umožňující seprci s retenčním čsem 3,8 min pro hypericin 6,8 min pro hyperforin. V nšem přípdě jsme pro rychlé (chromtogrfie s retenčními čsy do 4 min) citlivé stnovení hypericinu hyperforinu využili metodou HPLC-UV-Vis DAD s gr c λ, nm retenční čs, min 6 12 d λ, nm retenční čs, min Or. 2. Asorpční spektr () hypericinu, () hyperforinu chromtogrm směsi hypericinu hyperforinu snímný UV-vis detektorem při vlnové délce 292 nm (c) 592 nm (d); koncentrce hypericinu hyperforinu 2 ng/nástřik, chromtogrfické podmínky viz kpitolu Chromtogrfie 558

4 retenční čs, min retenční čs, min Or. 3. Chromtogrm hypericinu hyperforinu reálných vzorků po Soxhletově extrkci při () 292 () 592 nm; chromtogrfické podmínky viz kpitolu Chromtogrfie dientovou elucí cetonitrilem,1 mol dm 3 octnem monným s detekcí při 592 nm pro hypericin při 292 nm pro hyperforin (or. 2,). Z dných experimentálních podmínek (viz výše) yly při koncentrci 2 ng hypericinu hyperforinu n nástřik (5 µl) při vlnové délce 292 nm sorpčního mxim hyperforinu (or. 2) detegovány dv doře vyvinuté chromtogrfické píky (or. 2c) v retenčních čsech 3,51 3,99 min, neoť při této vlnové délce soruje i hypericin (or. 2). Oě látky tk lze nlyzovt součsně, nicméně vyšších signálů u hypericinu se dá dosáhnout sledováním sornce při 592 nm (or. 2d). Chromtogrmy extrktů H. perfortum získné při různých vlnových délkách detekce jsou znázorněny n or. 3. Klirční závislosti yly lineární v koncentrčním rozshu 2 2 ng/nástřik (5 µl) hypericinu hyperforinu s korelčními koeficienty R 2 >,999. Meze detekce (LOD pro 3 S/N kriterium) yly 9 pg/nástřik pro hypericin při 592 nm 27 pg/nástřik pro hyperforin detegovný při 292 nm. Vliv schrosy PEG n morfologii vzhled H. perfortum Rostliny H. perfortum yly pěstovány n 5% MS kultivčním médiu po dou 15 dnů. Získné semenáčky yly přeneseny do médi s různými přídvky schrosy PEG. Po 21 dnech kultivce yly sledovány morfologické změny, osh vody koncentrce hypericinu hyperforinu v prýtech experimentálních rostlin. Pro schrosu yly použity koncentrce 1, 2 3 g dm 3 kultivčního médi. S rostoucí koncentrcí schrosy v médiu se zřetelně snižovl vzrůst počet pter, zkrcovl se internodi, ojevilo se červenání listů stonků nepříliš zřetelné zmenšování listové plochy (or. 4). Červenání listů se poprvé ojevovlo při koncentrci schrosy 2 g dm 3. I zde všk ylo málo zřetelné ojevovlo se pouze v nejspodnějších částech rostlin. Lodyhy yly v dolní části nrůžovělé. Při koncentrci schrosy 3 g dm 3 ylo červené zrvení rostlin již zřetelnější (někde ž rudé) zshovlo místy i do vyšších částí rostlin. Červenání listů stonků je prvděpodoně způsoeno hromděním nthokynů v pletivech. Jde o červená, modrá neo filová rviv, která jsou rozpustná ve vodě částečně se podílejí n zrvení květů plodů způsoují zrvení listů stonků. Pomáhjí rostlině se vyrovnt se stresovými podmínkmi vnějšího prostředí (syntéz nthokynů se při osmotickém stresu zvyšuje). Ptrně tké snižují vodní potenciál v listech, čímž se zvyšuje příjem vody kořeny omezuje se ztrát vody trnspircí v listech 12. V závislosti n množství PEG v médiu je u vrint s koncentrcí schrosy 1 g dm 3 snížený dlouživý růst počet pter. Některé části stonků i některé listy nekrotizují červenjí. Červenání prkticky chyí při nejnižších koncentrcích PEG (1,25 g dm 3 ) zčíná se ojevovt teprve při vyšších koncentrcích PEG (2,5 5 g dm 3 ). Se vzrůstjící koncentrcí PEG přiývá i nekróz. Mnohé listy jsou podélně tmvě žíhné. Kořeny jsou ve srovnání s kořeny kontrolních rostlin tenčí. U vrint s koncentrcí schrosy 2 g dm 3 se tké redukuje dlouživý růst v závislosti n vzrůstjící koncentrci PEG. Klesá rovněž počet pter zmenšuje se listová čepel. Při koncentrci PEG 1,25 g dm 3 se již místy zčíná ojevovt červenání stonků listů hlvně v dolních prtiích rostliny. Se stoupjící koncentrcí PEG pk červenání postupuje i do vyšších částí. Mír nekrotizce rovněž nrůstá s koncentrcí PEG. Kořeny jsou silnější než kořeny rostlin pěstovných při koncentrci schrosy 1 g dm 3. Stejně jko v předchozích přípdech, i u vrint s koncentrcí schrosy 3 g dm 3 se v závislosti n rostoucí koncentrci PEG snižuje vzrůst, klesá počet pter zmenšuje se listová ploch. Červenání i nekrózy stonků listů přiývá v závislosti n množství PEG. Celkově je červenání nejzřetelnější ve srovnání s vrintmi s množstvím schrosy 1 2 g dm 3. Tloušťk kořenů je podoná jko u rostlin pěstovných při koncentrci schrosy 2 g dm

5 A Souhrnně lze konsttovt, že mír červenání nekrotizce se zvyšuje s rostoucí koncentrcí PEG (snižuje se dlouživý růst zmenšuje se velikost listové čepele). U vrint se stejnou koncentrcí PEG jsou pk tyto projevy výrznější v závislosti n zvyšující se koncentrci schrosy. Všeoecně se červenání listů stonků ojevuje při nižších koncentrcích schrosy PEG než nekrózy listů stonků (v závislosti n vzrůstjící koncentrci schrosy PEG rostlinné části nejprve zčervenjí potom teprve nekrotizují viz or. 4). Vliv schrosy PEG n produkci hypericinu hyperforinu B C c d e Or. 4. Rostliny třezlky tečkovné (Hypericum perfortum L.) po 21 dnech pěstování n MS médiu s (A) 1, (B) 2 (C) 3 g dm 3 schrosy různými koncentrcemi PEG; zlev: ; 1,25; 2,5; 5; 1; 15 g dm 3 Přítomnost hypericinu hyperforinu je u H. perfortum spojován s rekcí rostliny n iotický stres npdení pthogenem. Rostliny třezlky je možné k produkci hypericinu hyperforinu stimulovt plikcí chemických (jsmonová kyselin methyl-jsmonát) i iotických (Colletotrichum gloeosporioides) stimulátorů 13,14. Hypericin hyperforin, který rostliny produkují, je toxický pro celou řdu pthogenů. Ze součsných pozntků vyplývá, že přítomnost stresového fktoru může koncentrci hypericinu hyperforinu v rostlinných uňkách výrzně ovlivnit. U H. perfortum yl studován vliv chemických stimulátorů n produkci hypericinu, pseudohypericinu hyperforinu po indukci různými koncentrcemi ( 2 µmol dm 3 ) methyl-jsmonátu slicylové kyseliny. Oě látky, v závislosti n koncentrci, pozitivně ovlivňují koncentrci hypericinu hyperforinu v mldých rostlinách třezlky 13. Kromě chemických stimulátorů neo látek vyvolávjících stres ovlivňuje koncentrci hypericinu hyperforinu tké iotický stres. Ten může ýt způsoen různými pthogeny neo herivorními škůdci 13,15. V nšich experimentech jsme studovli vliv jednoduchého cukru (schrosy) polymeru (polyethylenglykolu) n produkci hypericinu hyperforinu. Koncentrce hypericinu hyperforinu yl nlyzován po 21 dnech kultivce. Se zvyšující se koncentrcí schrosy (1, 2 3 g dm 3 ) v kultivčním médiu se zvyšuje koncentrce hypericinu hyperforinu v pletivu H. perfortum. U hypericinu yl pozorován nárůst koncentrce v pletivech třezlky ze 3 n 4 µg g 1 (or. 5). Ve srovnání s nměřenými koncentrcemi hypericinu yly u hyperforinu stnoveny koncentrce tisícinásoně vyšší. Rozdíl v oshu hyperforinu u rostlin, které yly pěstovány v MS médiu s oshem schrosy 1 3 µg dm 3, činil cc 15 µg g 1 (or. 5). Se zvyšující se koncentrcí schrosy klesl osh vody v pletivech kultivovných rostlin (or. 5c). Cukry (primárně schros v koncentrci 2 g dm 3 ) yly součástí MS médi pro pěstování třezlky 13. Pro pěstování Hypericum ndrosemum L. yl použit 16 koncentrce schrosy 3 g dm 3. Nše výsledky poukzují n skutečnost, že neude možné srovnávt nměřené hodnoty oshů hypericinu hyperforinu u experimentů, ve kterých neyl použit stejná koncentrce schrosy v kultivčním médiu. Dále yl studován vliv přídvku PEG (1,25; 2,5; 5; 1 15 g dm 3 ) k rostlinám, u kterých yl přítomn v kultivčním médiu schros v koncentrcích 1, 2 3 g dm 3. PEG má význmný vliv n produkci hypericinu hyperforinu, to především v koncentrčním rozshu 2,5 ž 5 g dm 3 více (viz or. 6). Jk u hypericinu, tk i u hyperforinu vykzovly závislosti jejich oshu n 56

6 c Or. 6. Vliv polyethylenglykolu n produkci () hypericinu, () hyperforinu při různých koncentrcích schrosy; 1 g dm 3, 2 g dm 3, 3 g dm 3 v kultivčním médiu po 21 dnech pěstování; počet opkování n = 3 Or. 5. Vliv schrosy n produkci () hypericinu, () hyperforinu v sušině (c) osh vody (w %) v prýtech H. perfortum po 21 dnech pěstování; počet opkování n = 3 koncentrci PEG mxim při plikci 2,5 neo 5 g dm 3 PEG. Z výsledku vyplývá, že zvýšení produkce hypericinu hyperforinu lze dosáhnout přídvkem nižších koncentrcí PEG. Při vyšších koncentrcích PEG se koncentrce oou látek v rostlinách H. perfortum snižuje neo sttisticky význmně nemění. Osh vody se v prýtech H. perfortum snižovl se zvyšující se koncentrcí PEG v kultivčním médiu, podoně jko v přípdě smotné schrosy. Tyto výsledky jsou v souldu s morfologickými změnmi u rostlin H. perfortum. Pokud y yl osh hypericinu neo hyperforinu sledován ěhem několikměsíčního pěstování (popř. u rostlin rostoucích v přírodních podmínkách), je tře zohlednit vliv sezónních změn v koncentrci oou látek. U hypericinu ylo zjištěno, že se jeho koncentrce v průěhu roku prokztelně mění 17. Závěr Postupy převzté z trdiční medicíny mohou sloužit jko doplněk klsické medikmentózní léčy u celé řdy onemocnění. Zjímvé efekty yly zjištěny v klinických studiích kontrolovných plceem 18, npř. u preprátů z jinnu dvojlločného (Ginkgo ilo) náprstníku (Digitlis). V prolemtice využití H. perfortum ve fytomedicíně se ve větší míře výzkumné zájmy orientují ke studiu hyperforinu než hypericinu, jelikož hyperforin vykzuje výrzně vyšší účinek při potlčování depresivních symptomů než hypericin. Znlosti o vlivech vnějších fktorů n produkci hypericinu hyperforinu u H. perfortum jsou důležité pro stndrdizci frmkopreprátů. Nové sndno plikovtelné metody nlýzy frmceuticky využívných látek jsou velmi význmné, jelikož většin účinných látek izolovných z výše uvedených rostlin vykzuje kromě léčeného efektu i toxický účinek, popř. se léčený efekt dostvuje pouze při určité koncentrci účinné látky v preprátu. Námi dosžené výsledky poukzují n vriilitu koncentrce hypericinu hyperforinu v závislosti n koncentrci schrosy PEG, kterým yly rostliny H. perfortum vystveny v průěhu pěstování. Získné pozntky 561

7 ude možné využít v technologii pěstování H. perfortum pro frmceutické účely k detekci nízkých koncentrcí hypericinu hyperforinu. LITERATURA 1. Greeson J. M., Snford B., Monti D. A.: Psychophrm. 153, 42 (21). 2. Muller W. E.: Phrmcol. Res. 47, 11 (23). 3. Chtterjee S. S., Bhttchry S. K., Wonnemnn M., Singer A., Muller W. E.: Life Sci. 63, 499 (1998). 4. Murshige T., Skoog F.: Physiol. Plnt. 15, 473 (1962). 5. Fuzzti N., Gett B., Strepponi I., Vill F.: J. Chromtogr., A 926, 187 (21). 6. Štěrová D., Klejdus B., Krmářová E., Kuáň V.: Chem. Listy 96, 22 (22). 7. Drves A. H., Wlker S. E.: J. Chromtogr., B 749, 57 (2). 8. Riedel K. D., Rieger K., Mrtin-Fcklm M., Mikus G., Hefeli W. E., Burhenne J.: J. Chromtogr. B 813, 27 (24). 9. Likussr W., Rueckert U., Ortner A.: Eur. J. Phrm. Sci. 23, S64 (24). 1. Buer S., Stormer E., Gruum H. J., Roots I.: J. Chromtogr., B 765, 29 (21). 11. Li W. K., Fitzloff J. F.: J. Chromtogr., B 765, 99 (21). 12. Chlker-Scott L.: Photochem. Photoiol. 7, 1 (1999). 13. Sirvent T. M., Gison D. M.: Physiol. Mol. Plnt Pthol. 6, 311 (22). 14. Wlker T. S., Bis H. P., Vivnco J. M.: Phytochemistry 6, 289 (22). 15. Sirvent T. M., Krsnoff S. B., Gison D. M.: J. Chem. Ecol. 29, 2667 (23). 16. Guedes A. P., Amorim L. R., Vicente A. M. S., Rmos G., Fernndes-Ferreir M.: J. Agric. Food Chem. 51, 1399 (23). 17. Southwell I. A., Bourke C. A.: Phytochemistry 56, 437 (21). 18. Goldmn P.: Ann. Intern. Med. 135, 594 (21). M. Pvlík, J. Vcek, B. Klejdus c, nd V. Kuáň c ( Deprtment of Nturl Drugs, Veterinry nd Phrmceuticl University, Brno, Institute of Biophysics, Acdemy of Sciences of the Czech Repulic, Brno, c Deprtment of Chemistry nd Biochemistry, Mendel University of Agriculture nd Forestry, Brno): High Performnce Liquid Chromtogrphic Study of Influence of Scchrose nd Poly(ethylene glycol) on Production of Hypericin nd Hyperforin y Hypericum perfortum L. The influence of scchrose nd poly(ethylene glycol) present in the cultivtion medium on production of hypericin nd hyperforin y Hypericum perfortum L. ws evluted in in vitro experiments. Hypericin nd hyperforin were isolted y modified Soxhlet extrction with 8% ethnol nd determined y HPLC with UV-Vis detection t 592 nd 292 nm in less thn 4 min. Clirtion grphs were liner in the concentrtion intervl 2 2 ng per injection (5 µl) with correltion coefficients R 2 >.999. Limits of detection (for the 3 S/N criterion) were 9 nd 27 pg per injection for oth hypericin nd hyperforin. Addition of scchrose (1, 2 nd 3 g dm 3 ) or PEG ( g dm 3 ) to cultivtion medium incresed the production of oth sustnces in plnt tissues. Synthesis of oth sustnces in most experimentl plnts ws the sme or lower t higher contents of PEG. Concentrtions of hypericin nd hyperforin in plnts were of the order 1 nd 1 3 µg g 1, respectively. Morphologicl chnges induced y scchrose nd poly(ethylene glycol) were lso oserved nd descried. VŠCHT Prh přijme vědeckého prcovník/prcovnici pro olst technické minerlogie n Ústv skl kermiky. Poždovný profil vhodného uchzeče: VŠ vzdělání technického neo přírodovědného směru, vědecká hodnost Ph.D. (Dr. neo CSc.), přípdně perspektiv jejího ohájení v krátké doě, zkušenosti v olsti mteriálů, minerlogie či optické mikroskopie jsou vítány. Nízíme: smosttnou práci n špičkovém prcovišti, příležitost k profesnímu rozvoji, prcoviště v lízkosti metr, pružnou prcovní dou, příspěvek n strvování, návštěvu kulturních sportovních zřízení, rekreci, penzijní připojištění. Nástup: září 27 Kontkt: doc. RNDr. Ondrej Gedeon, Ph.D., tel , ondrej.gedeon@vscht.cz 562