Program přednášek z praktické mikrobiologie Vojtěch Rada

Transkript

1 Program přednášek z praktické mikrobiologie Vojtěch Rada 1) Role mikroorganismů v přírodě, historie mikrobiologie 2) Hlavní skupiny mikroorganismů: viry, bakterie a aktinomycety 3) Další skupiny mikroorganismů: kvasinky a plísně, prvoci

2 Program přednášek z mikrobiologie, BC ŢP, denní studium 4) Růst a mnoţení mikroorganismů 5) Metabolismus mikroorganismů 6) Genetika mikroorganismů 7) Koloběh biogenních prvků (C,N,P,S) 8) Mikrobiologie vody (pitná, povrchová, odpadní) 9) Mikrobiologie půdy

3 Program přednášek z mikrobiologie, BC ŢP, denní studium 10) Mikrobiologie krmiv 11) Mikroflóra trávicího traktu 12) Patogenní mikroorganismy a imunita 13) Mikrobiologie potravin Zkouška: podmínky zápočet ze cv. Forma zkoušky: písemný test, ústní zk.

4 Literatura Voříšek K.: Zemědělská mikrobiologie (sylaby přednášek), ČZU Praha 2004

5 Mikrobiologie, mikroorganismy Viry (nebuněční) Bakterie (prokaryotická buňka) Sinice (prokaryotická buňka) Mikroskopické houby (eukaryotická b.) Mikroskopické řasy (eukaryotická b.) Prvoci (eukaryotická b.)

6 Rozdělení mikrobiologie podle předmětu Virologie Bakteriologie Protozologie Algologie Mykologie

7 Rozdělení mikrobiologie podle stupně obecnosti Obecná m. Systematické Aplikovaná

8 Aplikovaná mikrobiologie Lékařská m. Veterinární m. Potravinářská m. Technická m. Zemědělská m.

9 Role mikroorganismů v přírodě Koloběh dusíku Koloběh uhlíku Koloběh síry Koloběh fosforu

10 Přizpůsobivost mikroorganismů Oxidace anorganických látek Mnoţení za vysokých teplot Růst za nepřítomnosti kyslíku Růst za vysokého tlaku Schopnost přeţít nepříznivé podmínky

11 Historie mikrobiologie 1659 Leewenhoek, pozorování mikroorganismů 1796 Jenner, vakcinace proti černým neštovicím 1860 Pasteur, podstata kvašení 1867 Lister, objev antisepse 1870 Pasteur, pasterace, sterilace 1874 Hanse, původce lepry 1877 Tyndall, frakcionovaná sterilace 1877 Koch, barvení anilinovými barvivy

12 Historie mikrobiologie 1881 Pasteur, přenos vztekliny 1881 Koch, polotuhé kultivační půdy 1883 Koch, objev původců tuberkulózy a cholery 1884 Mečnikov, objev fagocytózy 1884 Gram, gramovo barvení 1885 Pasteur, očkování proti vzteklině 1886 Escherich, objev Escherichia coli 1887 Beijerinck, izolace hlízkových bakterií

13 Historie mikrobiologie 1890 Vinogradskij, izolace nitrifikačních bakterií 1892 Ivanovskij, virus tabákové mozaiky 1901 Beijerinck, izolace azotobaktera 1907 Mečnikov, úloha mléčných bakterií 1916 Tworth a d Hérelle, bakteriofág 1923 Bergey, první mezinárodní systém bakterií 1925 Gratia, objev bakteriocinů 1928 Fleming, penicilin

14 Historie mikrobiologie 1932 Domagk, chemoterapie sulfonamidy Bush, Knoll, Ruska, Borries, elektronový mikroskop 1947 Hungate, kultivace striktních anaerobů 1953 Fázově kontrastní mikroskopie 1975 Lymská boreliosa 1980 Skenující elektronový mikroskop 1982 Vakcína proti hepatitidě B 1984 AIDS, PCR

15 Systematické zařazení mikroorganizmů nadříše: PROKARYOTA PRVOJADERNÍ říše: SUBCELLULATA NEBUNĚČNÍ oddělení: Vira Viry říše: PROTOCELLULATA PRVOBUNĚČNÍ oddělení: Bacteria Bakterie oddělení: Cyanophyta Sinice nadříše: EUCARIYOTA JADERNÍ říše: PLATAE ROSTLINY podříše: Thalobionta niţší rostliny: Algae říše: FUNGY HOUBY říše: ANIMALIA ŢIVOČICHOVÉ podříše: Protozoa - prvoci

16 Rozlišovací znaky hlavních skupin mikroorganizmů znak viry bakterie houby prvoci typ buňky buněčná stěna není prokaryotická eukaryotická eukaryotická ne ano ano ne velikost nm 1-2 (10) μm 5-10 μm μ

17 Rozdíly mezi prokaryotickou a eukaryotickou bu charakteristika prokaryotická buňka eukaryotická buňka jaderná membrána - + velikost obvykle > 2 μm velikost obvykle < 2 μm endoplazmatické retikulum (ER) umístění ribozómů volně v cytoplazmě na ER chromozómy kruhové lineární

18 Další rozdíly mezi prokaryotickou a eukaryotickou buňkou Citlivost na antibiotika Chemické sloţení buněk Metabolismus

19

20 Viry o nebuněčný (podbuněčný) organizmus o velikost nm (někdy ) o základní jednotka = virion kompletní virová rozdělení virů podle hostitele: o bakteriofágy o rostlinné viry o ţivočišné viry podle druhu nukleové kyselin o DNA viry o RNA viry podle stavby virionu

21 stavba virové částice o centrálně nukleová kyselina RNA nebo DNA o proteinová kapsida sloţená z kapsomér o plášť vnější lipidový obal kapsida plášť kapsoméra DNA/RNA

22 Virus chřipky (8 segmentů RNA) Virion HIV (2 molekuly RNA)

23 Stavba bakteriofága kapsid bičík límeček pochva RNA hlavička bičík bičíková vlákna bazální destička

24

25

26 Reprodukce virů lytický x lyzogenní cyklus

27 LYTICKÝ CYKLUS navázání na b. stěnu bakterie penetrace, genetický materiál vniká do bakterie replikace genomu bakteriofága produkce komponent bakteriofága z komponent se vytváří fágové částice rozpad bakterie a uvolnění bakteriofágů do prostředí

28 Bakterie základní údaje oprokaryotická buňka oúplná samostatnost buňky onepřítomnost jádra chybí jaderná membrána, pouze nukleoid tvořen jediným kruhovým chromozomem onepřítomnost buněčných organel oodlišná stavba ribozomů opeptidoglykan v buněčné stěně oanaerobní i aerobní ofixace N 2 ovelmi krátká generační doba omenší než eukaryotická buňka oživiny přijímány celým povrchem, velký aktivní povrch k objemu

29 Tvary bakterií o koky o tyčinky o vláknité bakterie podrobně na cvičení

30 STAVBA BAKTERIÁLNÍ BUŇKY

31 glykokalyx o polysacharidová vlákna o adherence na povrchy o vymezení prostoru pro exoenzymy Vnější struktury postradatelné bičík o jen některé bakterie o orgán pohybu o antigenní vlastnosti o bílkovinná vlákna flagelin o mono-, lofo-, amfi- a peritricha fimbie a pily o bílkovinná vlákna, výběţky cytoplazmatické membrány o uchycení k povrchům, F-(sex)pily pro konjugaci, receptor pro uchycení virů

32 Vnější struktury postradatelné pouzdro, kapsula, slizovitý obal o ochrana buňky o zejména u patogenních bakterií o sloţeny hlavně z polysacharidů o pevná struktura (slizovitý obal nestrukturní) o antigenní vlastnosti

33 Buněčná stěna oochrana, udržuje stálý tvar opostradatelná onení u některých eukaryontů a archaebakterií onepropustná pro velké molekuly oantigenní charakter oobsahuje receptory ourčuje barvitelnost podle Grama, velké rozdíly ve složení u Gram + a - bakterií otypickým komponentem je PEPTIDOGLYKAN peptidoglykan on-acetylmuramová kyselina + N-acetylglukosamin vytváří síťovitou strukturu oproteiny, aminokyseliny

34 Buněčná stěna G+ bakterií barví se do fia o jednovrstevná o jednoduchá stavba o silná (30 nm) o peptidoglykan aţ 90 % o teichové a lipoteichové kyseliny rody: Bacillus, Clostridium, Lactobacillus, Micrococcus, Staphylococcus, Streptococcus, Streptomyces

35 Buněčná stěna G- bakterií barví se do če o složitější struktura o tenká cca nm o trojvrstevná: vnější membrána proteiny, lipidy peptidoglykanová vrstva periplasmatický prostor - gel rody: Acetobacter, Azotobacter, Escherichia, Pseudomonas, Rhizobium, Salmonella

36 Vnitřní struktury nepostradatelné Cytoplazmatická membrána o rozhoduje o transportu látek o polopropustná o bariérová funkce o energetické a metabolické procesy o iniciuje replikaci DNA o obsahuje fosfolipidy, bílkoviny, glykolipidy o 5-10 nm

37 STAVBA CYTOPLAZMATICKÉ MEMBRÁN fofátová skupina + glycerol (hydrofilní) fosfolipidová dvouvrstva mastné kyseliny (hydrofóbní)

38 mesozom o vchlípenina cytoplazmatické membrány ohlavní složkou jsou bílkoviny oenergetické procesy, metabolizmus, syntézy oúčast na dělení buněk cytoplazma ovoda + bílkoviny (50 %, enzymy) (= cytosol) okoloidní charakter, není amorfní ovymezuje prostor pro vnitřní součásti ometabolizmus buňky ocytoplazma + cytoplazmatická membrána = PROTOPLAST

39 ribozomy o tis. v buňce, závislost na metabolické aktivitě (anabióza 50 %) o syntéza bílkovin (translace) o velikost vyjadřována sedimentační rychlostí 70S dvě podjednotky 50S = 23S rrna, 5S rrna, bílkoviny 30S = 16S rrna, bílkoviny 60 % RNA, 40 % bílkoviny

40 nukleoid o chromatin, chromatinové tělísko o dvouvlákenná kruhová DNA (dsdna) o stopy RNA a bílkovin, bez jaderné membrány o 1 chromozom, genů, genetický kód o % veškeré dědičné informace buňky plazmidy o postradatelné, zvýšení genetické variability o dvojvlákenná kruhová DNA o vlastní replikační cyklus o přenos z buňky do buňky o v buňce (stejné plazmidy ve více kopiích) o F-plazmidy (fertility = plodnosti) konjugace bakte o R-plazmidy (rezistence) přeţití nepříznivých podm o temperovaný dočasná součást chromozomu

41 spóra (endospóra) oodolný klidový útvar, vzniká uvnitř některých bakterií oneslouží k rozmnožování! oodolnost k vnějším podmínkám odlouhodobě životaschopná ovíce obalů než vegetativní buňka osnížení obsahu vody oméně ribozomů onulová metabolická aktivita opro syntézu důležitý Ca a Mn onepřijímá živiny obacillus, Clostridium

42 Systematika bakterií DRUH základní systematická jednotka soubor totoţných buněk (klonů) charakterizovaný stejnými morfologickými, fyziologickými, biochemickými, kultivačními a dalšími vlastnostmi KMEN vzniká pomnoţením jediné buňky binomické názvosloví (binární název, vţdy jen jeden) o rodový název (velké písmeno na začátku): Escherichia o druhový název: coli o druh: Escherichia coli o poddruh (subsp., ssp.):

43

44 Systémy bakterií fylogenetický vývojová příbuznost taxonomických jednotek morfologický nejpouţívanější fenotypové projevy původně zaloţen na morfologii později: Gramovo barvení, vztah ke kyslíku, atd. numerická taxonomie kaţdému znaku přiděleny body číselný kód vyhodnocuje počítač pomocí statistických metod rrna taxonomie

45 Identifikace bakterií podmínka správné identifikace čistá kultura! morfologické vlastnosti: tvar, velikost, seskupení buněk, pohyblivost, umístění bičíku, barvitelnost podle Grama, spóry,... kultivační vlastnosti: tvar, pigmentace, okraje kolonií, růst v tekutém médiu fyziologické vlastnosti: vztah ke kyslíku, teplota, ph, tolerance k solím, ţluči a jiným látkám biochemická vlastnosti: zdroje ţivin, enzymy, metabolity

46

47

48

49

50

51

52

53 Mikroskopické houby: kvasinky a plísně (mikromycety)

54 Mikroskopické houby oeukaryotické organizmy onemají chlorofyl ohlavně plísně a kvasinky ojedno-, dvou-, vícejaderné ojedno-, vícebuněčné okromě zygot jsou haploidní oheterotrofní, symbiotické, saprofytické, parazitické obuněčná stěna bez peptidoglykanu, obsah chitinu, někdy celulózy oněkdy myceliární (vláknitý) tvar ostélka (thallus)

55 Mikroskopické houby: kvasinky a plísně (mikromycety)

56 Fruktifikační orgány Mycelium: nepřehrádkované (neseptované); přehrádkované (septované)

57 Říše: Houby (Fungi) Oddělení: Hlenky (Myxomycota) Oddělení: Chytridomycety (Chytridomyceta) Oddělení: Oomycety (Oomyceta) Oddělení: Eumycety (Eumycota, houby pravé)

58 Oddělení: Eumycety (Eumycota, houby pravé) Třída: Zygomycetes (Mucor, Rhizopus) Třída: Endomycetes (Saccharomyces) Třída: Ascomycetes ( Penicillium, Aspergillus) Třída: Basidiomycetes Třída: Deuteromycetes (Candida, Monilia, Fusarium)

59 Příbliţné mnoţství druhů Zygomycety 600 Askomycety Bazidiomycety Deuteromycety

60 Stavba buňky kvasinky jaderná membrána endoplazmatické retikulum vakuola jádro mitochondrie cytoplazmatická membrána buněčná stěna

61 Rozmnožování mikroskopických hub vegetativní ofragmenty mycelia opučení nepohlavní částice ofruktifikační orgány okonidie, sporangiospóry pohlavní opohlavní orgány (gametangia) antheridium, oogonium; tvorba pohlavních spór - pohlavní spóry vytvoří mycelium fúze pohlavních mycelií (dikariotické mycelium), fúze jader, redukční dělení

62 Schéma pučení

63 Význam mikroskopických hub Půda omineralizace ohumifikace odetoxikace okoloběh biogenních prvků Voda a vzduch onepříznivé podmínky pro množení ošíření, kontaminace Krmiva a potraviny ozhoršení organoleptických vlastností orozklad živin oprodukce metabolitů, mykotoxinů okancerogenní účinky okulturní mikroorganizmy

64 MYKOTOXINY Mykotoxiny jsou sekundární metabolity plísní Mezi hlavní mykotoxiny nalézané v potravinách patří: o aflatoxin B1 (produkovaný Aspergillus flavus) o citrinin (Penicillium citrinum, P. viridicatum) o fumonisin (Fusarium spp.) o ochratoxin (Aspergillus ochraceus, Penicillium viridicatum) o vomitoxin (Fusarium spp)

65 o Obiloviny a zelenina sklízená ke krmným a nutričním účelům vždy obsahuje spory toxikogenních plísní o Nízká vodní aktivita zabraňuje růstu plísní o Růst plísní může být redukován také přídavky organických kyselin, hlavně k. propionové o Lidem hrozí pravděpodobně největší riziko otrav mykotoxiny z přímé konzumace kontaminovaných obilovin, luštěnin a zeleniny o Z potravin živočišného původu je riziko pravděpodobně menší i když mykotoxiny byly nalezeny v mase, mléku, vejcích a také ve zpracovaných surovinách např. v párcích

66 Faktory ovlivňující produkci mykotoxinů o Vlhkost o Množství spór o Teplota o Konkurenční mykoflóra o Substrát o Mikrobiílní interakce o Přítomnost plynů

67 Pravidla produkce mykotoxinů o Zástupci několika rodů mohou produkovat stejný toxin o Jeden rod (druh, kmen) může produkovat více mykotoxinů o Přítomnost toxikogenních plísní neznamená nutně přítomnost toxinů

68 Mykotoxiny sledované v potravinách (od ) o Aflatoxiny (B1, suma) o Deoxynivalenol o Zearalenon o Ochratoxin A o Fumonisiny o T-2 toxin o HT-2 toxin

69 Členění mykotoxinů podle toxických účinků k cílovým orgánům toxický účinek dermatotoxiny estrogeny genotoxiny hematotoxiny hepatotoxiny imunotoxiny nefrotoxiny neurotoxiny toxiny GI traktu mykotoxiny tichoteceny, psolareny, verukariny, sporidesminy zearalenon aflatoxiny, sterigmatoxystin, ochratoxin A, citrinin, zearalenon, patulin, trichoteceny, fumonisiny, fusarin C, griseofulvin aflatoxiny, ochratoxin A, zearalenon, trichoteceny aflatoxiny, luteoskyrin, sterigmatoxystin aflatoxiny, ochratoxin A, trichoteceny, patulin, gliotoxin, sporidesmin citrinin, ochratoxin A penitrem A, fumitremorgeny, verukulogeny, fumonisiny trichoteceny

70 Vybrané potraviny, které mohou být nejčastěji kontaminované mykotoxiny (BEVIS, 2003) Aflatoxiny Aflatoxin M 1 Ochratoxin A Zearalenon Fumoniziny B 1, B 2, G 1, G 2 mandle mléko pšenice pšenice kukuřice burské oríšky jogurt ječmen ječmen popcorn Vlašské ořechy sýry oves rýže müsli obilniny zrna obilnin a produkty z nich máslo rýže krmiva potraviny pro děti sušené ovoce potraviny pro děti víno Sója medikamenty pivo Koření káva krmiva sušené ovoce medikamenty koření čokoláda ledviny prasat krmivá zvierat kakao

71 Prevence výskytu mykotoxinů o omezení infekce zemědělských plodin a potravin o rychlé vysušení a správné skladování o použití konzervačních látek (chemické látky, protektivní kultury)

72

73 ANTIBIOTIKA specifické sekundární metabolity působí v malých koncentracích Účinek - bakteriostatický - bakteriocidní Spektrum účinnosti - úzké (penicilin, streptomycin) - široké (tetracyklin, chloramfenikol) Produkována - bakteriemi - aktinomycetami - mikromycetami Rezistence - přirozená - získaná

74 ÚČINEK ANTIBIOTIK inhibice syntézy buněčné stěny inhibice syntézy nukleových kyselin inhibice proteosyntézy ovlivnění funkce membrán inhibice energetického metabolismu jiný mechanizmus účinku

75 Mikroorganismy produkující antibiotika BAKTERIE Bacillus: Bacitracin, Kolistin AKTINOMYCETY Streptomyces: Erythromycin, Chloramphenicol, Neomycin, Streptomycin, Tetracyklin MIKROMYCETY Penicillium: Penicilin, Ampicilin, Oxacilin Cephalosporium: Cephalosporin 2006 zákaz EU používání ATB ke krmným účelům (výjimka monensin do 2013)

76 Růst a mnoţení baktérií Generace 0 Nediferencované dělení buněk 1 2 Bakterie se mnoţí dělením

77 Růstová křivka bakteriální populace (statická, jednorázová kultivace)

78 Parametry růstové křívky Parametry exponenciální fáze: generační doba (T), specifická růstová rychlost (µ), rychlost dělění (R) Ostatní: doba lagu (L), počet buněk (x), počet generací (n)

79 Růst a mnoţení baktérií Generace Bakterie se mnoţí dělením

80 Mnoţení bakterií v exponenciální fázi Generace Počet bakterií n 2 n Počet bakterií obecně: x = x 0. 2 n

81 Počet bakterií obecně: x = x 0. 2 n logx = logx 0 + nlog2 Počet generací: n = (logx logx 0 )/log2 Rychlost dělení: R = n/t = [(logx logx 0 )/log2]/(t-t 0 ) Generační doba: T = 1/R = log2[(t-t 0 )/(logx logx 0 )]

82 Generační doba = doba zdvojení Je doba potřebná ke zdvojnásobení počtu buněk v kultuře Je doba dělení buňky Doba, za kterou dojde ke zdvojnásobení mikrobiální biomasy Fyzikální rozměr: h

83 Mikroorganismus Generační doba (h) Streptococcus thermophilus 0,20 Escherichia coli 0,35 Bacillus subtilis 0,43 Clostridium botulinum 0,58 Mycobacterium tuberculosis 12 Saccharomyces cerevisiae 2 Prvoci 10

84 Specifická růstová rychlost: µ Udává mnoţství biomasy vytvořené jednotkou biomasy za jednotku času Udává zlomek buňky vytvořené jednou buňkou za jednotku času Fyzikální rozměr: h -1

85 Růstová křivka bakteriální populace (statická, jednorázová kultivace)

86 Specifická růstová rychlost: µ µ = ln2/t µ = (lnx lnx 0 )/(t t 0 )

87 Mikroorganismus Spec. Růst. rychlost (h -1 ) Streptococcus thermophilus 3,47 Escherichia coli 1,98 Bacillus subtilis 1,61 Clostridium botulinum 1,19 Mycobacterium tuberculosis 0,06 Saccharomyces cerevisiae 0,35 Prvoci 0,07

88 Metody měření růstu bakterií Kultivační Turbidimetrie Konduktometrie

89 (10) (320)

90 Bifidobacterium sp.

91

92

93 (1,61 h)

94 (0,43 h -1 )

95 Ovlivnění růstu bakterií Substrát (ţiviny) (mikroorganismů) Antimikrobiální látky (desinfekční l., ATB, bakteriociny) Teplota (minimum, optimum, maximum)

96 Vliv teploty na růst mikroorganismů

97 Vliv teploty na růst mikroorganismů Psychrotrofové, psychrofilové (<20 O C): plísně, kvasinky, Pseudomonas Mezofilové (20-40 O C): E. coli, Lactococcus Termofilové (40-60 O C): Jogurtové bakterie, Clostridium Hypertermofilové: (70-90 O C): Thermus aquaticus, sirné bakterie

98 Semikontinuální a kontinuální kultivace Trávicí trakt (vole u drůbeţe, slepá střeva, bachor) Turbidostat Chemostat

99

100 Vitamíny jako kofaktory enzymů Vitamín Vit. B1 - thiamin Kys. nikotinová Kys. listová Vit. E Funkce Metabolismus pyruvátu Součást NAD, transfer elektronů Kofaktor při syntese pyrimidinů a purinů Potřebný pro syntesu makromolekul

101 Biochemické reakce probíhají pomocí enzymů Oxidoreduktasy: Laktátdehydrogenasa Transferasy: Aminotransferasy Hydrolasy: Amylasy Lyasy: Dekarboxylasy Isomerasy: Alanin racemasa Ligasy: Glutamin syntasa

102

103

104 Kvašení (fermentace) a dýchání (respirace) Polysacharidy (škrob, celulosa) monosacharidy pyruvát organické kyseliny, alkoholy, CO 2 = Kvašení (anaerobní podmínky, 2 ATP) Pyruvát acetyl CoA Krebsův cyklus Dýchací řetězec CO 2, H 2 O = Dýchání (aerobní podmínky, 38 ATP)

105 Konečné produkty fermentace

106 Kvašení - fermentace Mléčné kvašení homofermentativní: konečný produkt kyselina mléčná; Lactobacillus acidophilus, Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis Mléčné kvašení heterofermentativní: konečné produkty kyselina mléčná (50%), kyselina octová, etanol, CO 2 ; Pediococcus, Lactobacillus brevis, L. fermentum Význam mléčného kvašení: siláţ, kysané zelí, mléčné kysané výrobky, fermentované salámy, součást střevní mikroflóry

107 Kvašení - fermentace Alkoholové kvašení: konečné produkty etanol, CO 2 ; kvasinky Saccharomyces, bakterie Zymomonas Význam alkoholového kvašení: Výroba piva, vína, destilátů, technický líh, kaţení potravin (dţusy)

108 Kvašení - fermentace Propionové kvašení: konečné produkty kyselina propionová, octová, CO 2 ; Propionibacterium freudenreichii, P. acnes Význam: výroba sýrů s tvorbou ok (ementál), akné

109 Kvašení - fermentace Máselné kvašení: konečné produkty kyselina máselná, kyselina octová, CO 2, H 2 ; Clostridium butyricum, Cl. tyrobutyricum Význam: pozdní duření tvrdých sýrů, kaţení siláţe a potravin

110 Kvašení - fermentace Smíšené kvašení: ţádný konečný produkt nepřevaţuje př. E. coli kyselina mléčná, k. jantarová, k. mravenčí, etanol, CO 2, H 2 Kvašení uskutečňované rodem Bifidobacterium: konečné produkty kyselina octová a mléčná v poměru 3:2, význam: mléčné kysané výrobky (probiotika), součást střevní mikroflóry

111 Nepravá kvašení Ve skutečnosti nejsou kvašeními, ale jsou to procesy navazující na kvašení Tvorba kyseliny octové: navazuje na alkoholové kvašení, Acetobacter Tvorba kyseliny citronové, Aspergillus

112 Průmyslové vyuţití fermentací Konečný produkt fermentace Vyuţití komerční a průmyslové Výchozí materiál (surovina) Pouţívaný Mikroorganismus Etanol Pivo, víno,palivo Melasa, mošt Saccharomyces cerevisiae Kyselina mléčná Kyselina propionová Aceton, butanol Glycerol Kyselina citronová Jogurt, kysané zelí, chléb, salám Ementál Chemický průmysl Farmacie, průmysl Potravinářský průmysl Mléko, mouka, zelí, maso Lactobacillus, Streptococcus Kyselina mléčná Propionibacterium Melasa Melasa Melasa Clostridium acetobutylicum Saccharomyces cerevisiae Aspergillus

113 Rozdělení bakterií podle zdroje uhlíku Autotrofní CO 2 Heterotrofní organický uhlík Mixotrofní auto i heterotrofní

114 Rozdělení bakterií podle zdroje energie Chemotrofní: chemolitotrofní, chemoorganotrofní Fototrofní: fotolitotrofní, fotoorganotrofní

115 Vztah mikroorganismů ke kyslíku Obligátně (striktně) aerobní: plísně, Bacillus, Pseudomonas Mikroaerofilní: Campylobacter, některé laktobacily Fakultativně anaerobní: E. coli, Enterococcus, kvasinky Saccharomyces Obligátně (striktně) anaerobní: Clostridium, Bifidobacterium, Fibrobacter

116 Regulace metabolismu Regulace rychlosti enzymové reakce (koncentrace substrátu, zpětná vazba) Regulace rychlosti syntézy a degradace enzymů Pasteurův efekt Efekt Crabtree

117 Genetika bakterií základní pojmy

118 Genetika bakterií základní pojmy DNA (RNA) Genetická informace genom Gromozom Gen Mikrosatelitní DNA Lokus Genotyp Fenotyp

119 Stavební kameny DNA (RNA) Purinové báze: adenin, guanin Pyrimidinové báze: cytosin, thymin, uracil Cukr pentosa: deoxyribosa, ribosa Kyselina trihydrogen fosforečná H 3 PO 4

120 Báze DNA

121

122 Struktura DNA

123 Struktura DNA fosfát cukr báze

124 Genetický kód je: Tripletový Degenerovaný Univerzální

125 Bakteriální chromozom Kruhový 1-4 tisíce genů (min. 500 genů) Délka asi 1 mm (E. coli) Přichycen na CM

126 Plazmidy bakterií Malé kruhové molekuly DNA Dělení nezávislé na hlavním chromozómu Postradatelné replikony Počet 0-stovky v jedné buňce Konjugativní a nekojugativní Rychlá replikace cca 2 min

127 Nejznámější plazmidy F plazmid R plazmidy Kryptické plazmidy

128 Vyuţití plazmidů Plazmidové vektory Schuttle vektory (kyvadlové vektory) Identifikace bakterií (plazmidové profily)

129 Realizace genetické informace Mezi buňkami téže generace Mezi generacemi Uvnitř buňky

130 Genová exprese Regulace GE Bez regulace konstitutivní bílkoviny (enzymy) Adaptabilní (inducibilní ) bílkoviny Regulace induktorem (laktosa, E coli) Regulace represorem

131 Struktura genu Promotor Operátor Strukturní gen

132 Mutace genů Delece báze Adice báze Změna báze

133 Přenos genetické informace bakterií Konjugace Transdukce Transformace

134 Příklady vyuţití genetických manipulací u mikroorganismů Produkce lidského insulinu pomocí E. coli Produkce alfa-interferonu pomocí E. coli a Saccharomyces cerevisiae Produkce gama-interferonu pomocí E. coli Výroba vakcíny proti hepatitidě B Saccharomyces cerevisiae (geny viru v plazmidu)

135 Účast mikroorganismů na koloběhu prvků Koloběhy biogenních prvků Koloběh C Koloběh N Koloběh S Koloběh P Koloběhy ostatních prvků: Fe, Mn, Zn, Co, Cu

136 Koloběh uhlíku

137 Koloběh uhlíku rozklad polysacharidů Polysacharidy: rostlinné, ţivočišné (glykogen) Rostlinné polysacharidy: strukturní, zásobní Strukturní p.: celulosa, hemicelulosa, pektin Zásobní p.: škrob, inulin Rzklad polysacharidů: aerobní, anaerobní Aerobní rozklad konečné produkty: CO 2, H 2 O Anaerobní rozklad konečné produkty: organické kyseliny (máselná, octová, mléčná), alkoholy (etanol, butanol), CO 2, H 2

138 Rozklad polysacharidů obecné schéma Polysacharidy (škrob, celulosa, inulin, pektin) hydrolasy Monosacharidy (glukosa, fruktosa, uronové kys.) Aerobní rozklad CO 2, H 2 O, H 2 glykolysa Pyruvát anaerobní rozklad organické kyseliny alkoholy, CO 2

139 Mikroorganismy rozkládající polysacharidy Aerobní rozkladačí: baktérie Bacillus; plísně = mikromycety (Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, Mucor) Anaerobní rozkladači: v půdě, vodě bakterie (Clostridium); v bachoru bakterie (Fibrobacter, Bytyrivibrio); plísně (Anaeromyces)

140 Konečné produkty rozkladu Aerobně: CO 2, H 2 O polysacharidů Anaerobně: organické kyselin (máselná, mléčná, octová), alkoholy (etanol, butanol), CO 2, H 2

141 Rozklad škrobu Zásobní polysacharid Základní stavební jednotka glukosa Dvě formy amylosa (80%, glukosy spojené α 1-4 glykosidickou vazbou), amylopektin (20%, větvení α 1-6 glykosidická vazba) Stěpení pomocí amylas Škrob dextriny maltosa glukosa

142 Rozklad škrobu Aerobně: plísně, Bacillus Anaerobně: Clostridium, Lactobacillus, Bifidobacterium

143 Rozklad celulosy Strukturní polysacharid, hlavně v buněčných stěnách rostlinných buněk Základní stavební jednotky - glukosy spojené ß 1-4 glykosidickou vazbou, struktury primární, sekundární, terciální

144 Rozklad celulosy Celulosa celulosodextriny celobiosa glukosa Enzymy štěpící celulosu: exo a endocelulasy, celobiasa

145 Rozklad celulosy probíhá v Půdě (vodě) V trávicím traktu býloţravých ţivočichů Při kvašení odpadků

146 Rozklad celulosy v půdě Aerobně plísně a bakterie (Cytophaga, Sporocytophaga, Cellvibrio) Anaerobně Clostridium

147 Rozklad celulosy v trávicím traktu V bachoru přeţvýkavců (skot, ovce, koza): bakterie (Fibrobacter, Butyrivibrio), anaerobní plísně (Anaeromyces) U nepřeţvýkavců v tlustém (kůň, slon) a slepém střevě (králík, morče) Na štěpení celulosy často navazuje tvorba metanu (metanové bakterie Methanobacterium): CO 2 + H 2 CH 4

148 Rozklad celulosy při kvašení odpadků Probíhá zprvu aerobně (plísně) pak anaerobně Clostridium Na štěpení celulosy často navazuje tvorba metanu (metanové bakterie Methanobacterium): CO 2 + H 2 CH 4 Výroba metanu (bioplynu): skládky, čistírny odpadních vod, domácí výroba Metan a ţivotní prostředí

149 Rozklad ostatních uhlíkatých látek Rozklad pektinu, hemicelulos Rozklad chitinu Rozklad ligninu

150 Rozklad pektinových látek o o o o mezibuněčné prostory rostlin pektin = polygalakturonidy exoenzymy propektinázy, pektázy, pektinázy meziprodukty k. galakturonová, galaktóza, xylóza, arabinóza Aerobní rozklad o o o úplná respirace všech meziproduktů Bacillus, Mucor, Alternaria mineralizace org. látek v půdě, pektinolytické enzymy, rosení lnu Anaerobní rozklad o meziprodukty (kromě k. galakturonové) podléhají máselnému kvašení o k. galaktronová, organické kyseliny, alkoholy CO 2, H 2 o Clostridium

151 Rozklad hemicelulóz opolysacharidy buněčné stěny rostlin (hexózy, pentózy, uronové kyseliny, xylózy, manóza) ohlavně za aerobních podmínek (xylanázy) oanaerobně máselné kvašení (Clostridium, Butyrivibrio) oaerobně -celulolytické bakterie, Streptomyces, mikromycety

152 Rozklad ligninu o o o o o komplexní C-látka doprovází celulózu a hemicelulózu zejména ve dřevinách hydrolýza na jednodušší C-látky aerobní rozklad houbami (basidiomycéty, askomycéty), aktinomycety, Pseudomonas půdní proces, trávicí trakt termiti

153 Koloběh dusíku

154 AMONIFIKACE organické N-látky NH 4+, NH 3 o mineralizace AK, proteiny, NK, močovina, kyselina močová, chitin, peptidoglykan,... o vyuţití NH 4+, NH 3 syntéza AK, nitrifikace, příjem rostlinami, volatizace (únik do ovzduší), vyplavení, fyzikálně-chemická vazba na půdní komplexy Amonifikace bílkovin proteolytické enzymy hydlolýza peptidické vazby proteiny poly- oligo- di- peptidy aminokyseliny AK výstavba mikrobiálních bílkovin, deaminace, transaminace, dekarboxylace Aerobní rozklad o NH 4+, NH 3, CO 2 o aerobní, fakultativně anaerobní, Bacillus, Pseudomonas, Proteus, plísně Anaerobní rozklad o aminy, indol, skatol, merkaptany, organické kyseliny,

155 Amonifikace močoviny CO(NH 2 ) 2 CO 2 + NH 3 o o o Urobakterie: Micrococcus ureae, Planosarcina ureae stájové prostředí trávicí trakt (bachor)

156 NITRIFIKACE - oxidace redukovaných forem, aerobní Autotrofní nitrifikace 2 fáze: NH 4 + NH 2 OH NO 2 - NO 3 - aerobní, autotrofní, chemolitotrofní, mezofilní, ph 7 typický půdní proces zdroj C = CO 2 (Calvinův cyklus) Nitritace NH O 2 NO H + + H 2 O + E - Nitrosomonas, Nitrosococcus, Nitrosolobus Nitratace NO O 2 NO E - Nitrobacter, Nitrococcus

157 Heterotrofní nitrifikace RNH 2 NO 2 - NO 3 - o o o heterotrofové, zdroj C organická látka kyselé půdy, chlévská mrva houby(aspergillus), aktinomycéty (Streptomyces), bakterie (Arthrobacter)

158 Význam nitrifikace: o zdroj energie pro nitrifikační bakterie o ţivina pro rostliny (hlavní zdroj NO 3- ) o substrát pro denitrifikaci o neţádoucí proces v chlévském hnoji o nitráty silně pohyblivé, neakumulují se, ztráty vyplavením = moţnost vzniku nitrosoaminů (karcinogen) = ztráta ţiviny = zhoršená kvalita vody o povrchové vody eutrofizace o spodní vody zvýšený obsah NO - 3 neumoţňuje jejich vyuţití jako pitné vody (methemoglobinemie)

159 DENITRIFIKACE o o o redukce oxidovaných forem N anaerobní respirace (zdroj energie) anaerobní půdní proces Disimilativní denitrifikace NO H + N 2 + H 2 O + E (NO - 3 NO - 2 NO N 2 O N 2 ) o uvolňování N z půdy (chlévské mrvy) do ovzduší o odstraňování NO - 3 z pitné a odpadní vody o anaeroby a fakultativních anaeroby - Pseudomonas, Paracoccus, Propionibacterium, Thiobacillus

160 Asimilativní denitrifikace NO H + NH H 2 O + E NO - 3 NO - 2 NO NH 3 OH NH 3 o půdní proces o anaerobní, pozměněný dýchací řetězec, příjem O 2 z dusičnanů o zisk E a N látek pro syntézu AK a bílkovin NO H + NO H 2 O + E běţná redukce (nitrátreduktáza) NO H + N 2 + H 2 O + O 2 + E O 2 vyuţit pro aerobní respiraci organických sloučenin NO H 2 O + S N 2 + SO H + + E sirné bakterie (redukce nitrátů spojená

161 FIXACE VZDUŠNÉHO DUSÍKU - redukce N 2 na NH + 4 N = N HN=NH H 2 N-NH 2 2 NH 3 2 NH + 4 AK N e ATP + 10 H + 2 NH 3 + H ADP + o 16 nitrogenázy P i - přenos H + na N 2 o návrat N z atmosféry do koloběhu biogenních prvků o aerobní i anaerobní o intenzivní především při nedostupnosti jiných zdrojů N diazotrofní bakterie: o o volně ţijící v půdě - Azotobacter, Clostridium, Azotomonas,. asociativní Azospirillum,.

162 Azotobacter o o o plejomorfní (diplokoky, tyčinky) aerobní mesofilní bakterie náročný na podmínky prostředí: neutrální půdní reakce (Ca 2+ ) vysoký obsah organických látek (zdroj E jednodušší C-látky) strukturní půdy (humus, vzduch) dobrá zásoba biogenních prvků (P, Ca, K ) fixace při nedostatku jiných zdrojů N výskyt jen v kvalitních půdách (vyuţíván jako indikátor)

163 Rhizobium (symbiotická fixace) o o o o o o symbiosa s kořeny rostlin (Fabaceae) vytváří hlízky (hlízkové bakterie), rostlina poskytuje glycidy, bakterie N-sloučeniny aerobní nesporulující plejomorfní tyčinka, v kořenech jako bakteroidy (aţ T, Y tvary) specifita věrnost hostitelské rostlině zvýšená zásoba půdního N omezuje fixaci (30) (800) kg/ha; Ø 140 kg/ha inokulace semen před výsevem (Rizobin)

164 Koloběh síry

165 Sulfurikace o oxidace redukovanějších sloučenin S (aerobní) o H 2 S S S 2 O 2-3 SO 2-4 o sirné bakterie Thiobacillus o zpřístupnění S organizmům, zisk energie o okyselení půd o podíl na zvětrávání mateční horniny Desulfurikace o redukce oxidovanějších forem S o SO 2-4 S H 2 S o anaerobní respirace, zdroj energie o sirné bakterie Desulfovibrio o ztráta ţivin

166 KOLOBĚH P onk, enyzmy, hormony, ATP,... ofosfor přítomen v živých org. Vždy jako H 3 PO 4 Mineralizace P organických sloučenin (ATP, NK, fosfolipidy, fytáty) anorganický P (H 2 PO 4-, HPO 4 2-, PO 4 3- ) ofosfatázy alkalické, kyselé onezastupitelná součást koloběhu biogenních prvků ozdroj živin pro mikroorganismy a rostliny

167 Mikrobiologie krmiv Mikrobiologie zelených krmiv Mikrobiologie sena Mikrobiologie siláţe a senáţe Mikrobiologie krmných směsí

168 Mikrobiologie zelených krmiv Epifytní mikroflóra

169 Mikrobiologie sena Sušení sena Mikroorganismy v senu: převáţně spory plísně, Bacillus Syndrom farmářských plic Samozahřetí sena: fáze fyziologická, mikrobiologická, chemická

170 Mikrobiologie siláţe Mikroorganismy v siláţi: Hlavní mikrokfóra Bakterie mléčného kvašení (BMK), Lactobacillus plantarum, Leuconostoc, Pediococcus Doprovodná mikroflóra: kvasinky, Clostridium

171 Podmínky pro siláţování Cukerné minimum dostatek zkvasitelných cukrů (ph 4-4,2) Anaerobní podmínky Přítomnost BMK

172 Krmiva pro siláţování Snadno siláţovatelné: kukuřice Těţko siláţovatelná: luční porosty Nesiláţovatelná: vojtěška, luštěniny

173 Fáze rozvoje mikroorganismů v siláţi Fáze rozvoje smíšené mikroflóry Fáze rozvoje BMK, koky, tyčinky Konečná fáze pokles počtu mikroorganismů, doba zrání 6-8 týdnů, konečné ph 4,0 4,2

174 Hodnocení siláţe Organoleptické hodnocení Sloţení organických kyselin: mléčná 1,7%, octová 0,7%, máselná 0,3%

175 Siláţní přísady Zdroje cukru: melasa Enzymy : amylasy Zdroje N Mikroorganismy: L. plantarum, Enterococcus faecium

176 Tabulka 2: Výskyt patogenních mikroorganismů v krmivech. Podle Hinton (13). Kategorie (a) Infekční agens přenosná na člověka z hospodářských zvířat, tj. zoonózy (b) Nezoonotické infekční agens nebo jejich produkty (metabolity), které působí onemocnění hospodářských zvířat a lidí (c) Infekční agens, které působí epidemie hospodářských zvířat u lidí může způsobit pouze lehká onemocnění nikoliv vážná onemocnění c (d) Neinfekční agens, které působí nemoci hospodářských zvířat a lidí (e) Produkty neinfekčních agens, které působí onemocnění hospodářských zvířat a lidí Krmiva a komponenty krmiv Spory Bacillus anthracis Priony BSE a Salmonella enteritidis Virus pseudomoru drůbeže b Virus afrického moru prasat Kulhavka a slintavka Mor prasat Spory a hyfy plísní působící alergická onemocnění Sušená nebo fermentovaná píce Toxoplasma gondii Toxin Clostridium botulinum Listeria monocytogenes Spory a hyfy plísní působící alergická onemocnění Pastva Spory Bacillus anthracis Mycobacterium spp. Vajíčka tasemnic např. Cysticercus bovis Mykotoxiny Mykotoxiny Mykotoxiny Krmiva ze zbytků potravin a odpadků Trichinella spiralis Virus afrického moru prasat Kulhavka a slintavka Mor prasat a Předpokládáno, ale ještě stále ne zcela prokázáno b virus pseudomoru drůbeže se může přenášet na drůbež přes krmivo a ze zvířat na člověka prostřednictvím aerosolu. Riziko infekce je velmi malé, u člověka může dojít k lehkému zánětu spojivek.

177 PATOGENNÍ BAKTERIE V KRMIVECH Salmonella Campylobacter (Bacillus anthracis) (Clostridium botulinum)

178 KONTAMINACE KRMIV SALMONELAMI Kontaminovány jsou krmiva rostlinného (0-18%) i živočišného (0-12%) původu. Úroveň kontaminace u masokostních mouček a rybích mouček je 0 až 13% pozitivních vzorků. Salmonely jsou nalézány také v obilninách a semenech olejnin. Značně více jsou kontaminovány olejniny a jejich vedlejší produkty než obilniny.

179 ZOONÓZY Podle zprávy EK z roku 2002 (9) je třeba věnovat pozornost celkem jedenácti zoonózám: Salmonelóza ( případů ročně) Kampylobakterióza ( ) Yersinióza (10147) VTEC (2664) Brucelóza (2386) Listerióza (860) Toxoplazmóza (477) Echinokokóza (266) Tuberkulóza (49) Trichinelóza (48) Vzteklina (1)

180 ZÁVĚRY: Největší mikrobiální riziko v krmivech představuje výskyt Salmonella spp. a Campylobacter spp.. Tyto bakterie jsou nebezpečné jako pro člověka tak pro zvířata. Zvláště pro salmonely je typický přenos krmivem, kde tyto bakterie mohou i dlouhou dobu přežívat Přenos prionů BSE krmivy je reálný. Je proto nezbytné vyloučit živočišné moučky z výživy přežvýkavců. Je třeba zabránit míchání rybích a masokostních mouček. Některá rizika jako je botulismus a antrax jsou v praxi málo pravděpodobná, avšak následky jejich manifestace mohou být fatální, a proto je nelze zcela opomíjet. Na rozdíl od kontaminace chemickými látkami jsou nebezpečná i malá množství mikroorganismů v krmivech, neboť mikroorganismy se při špatném skladování (teplo, vlhko) mohou pomnožit a produkovat toxiny. Reálné riziko představují mykotoxiny. Hlavním mykotoxinem v krmivech je aflatoxin B1. Bylo by žádoucí rutinně testovat i další mykotoxiny např. toxiny Fusarium spp. Častý výskyt mykotoxinů je v kukuřici. Je třeba zavést jednotný systém kontroly kvality krmiv (HACCP).

181 Mikrobiologie vody

182 MIKROBIOLOGIE VODY obsah mikroorganizmů velmi variabilní obsah ţivin, kontaminace mikrobiální plankton autochtonní mikroflóra typická mikroflóra psychrofilní (mezofilní), Pseudomonas, Achromob alochtonní mikroflóra kontaminující střevní a půdní mikroorganizmy

183 Definice pitné vody: o voda nezávadná, která po dlouhodobém uţívání nezpůsobuje onemocnění a zdravotní poruchy Druhy pitných vod: o pitná voda (PV) o balená voda (BV) Hodnocení kvality pitných vod: o mezná hodnota (MH) o nejvyšší mezná hodnota (NMH)

184 Mikrobiologické parametry pitné vody o Escherichia coli (EC) o Koliformní bakterie (KB) o Enterokoky (EK) o Mezofilní bakterie (MB) = počty kolonií při 36 C o Psychrofilní bakterie (PB) = počty kolonií při 22 C o Pseudomonas aeruginosa (PA) o Clostridium perfringens (CP)

185 HODNOTY PRO PITNOU VODU (KTJ) Skupina Typ limitu PV BV EC NMH 0/100 ml 0/250 ml KB MH 0/100 ml 0/100 ml EK NMH 0/100 ml 0/250 ml PA NMH - 0/250 ml CP MH 0/100 ml 0/100 ml 36 C MH/NMH 100/1 ml 20/1 ml 22 C MH/NMH 200/1 ml 500/1ml Opatření při překročení: DESINFEKCE o Ag, Cu, Cl (plynný, Savo, chloramin), O 3 o UV a γ záření