Radioimunologická analýza

Rozměr: px

Začít zobrazení ze stránky:

Download "Radioimunologická analýza"

Iveta Tesařová
před 8 lety
Počet zobrazení:

1 Radioimunologická analýza Reakce antigenu (nefyziologické látky kterou stanovujeme, AG) v biologickém materiálu s protilátkou (antibody, AB), kterou vytváří organismus. AB + AG AB-AG Imunochemická specifita - speciální protilátky proti určitým antigenům. Protilátky náleží do globulinové frakce proteinů. Pracuje se v substechiometrické formě reakce: do vzorku se stanovovaným antigenem se přidá známé množství izotopově značeného antigenu ( 3 H, 14 C, 135 I, 131 I) a malé (substechiometrické) množství protilátky. Značený a neznačený antigen konkurenčně reagují s protilátkou a po ustavení rovnováhy se přebytek antigenu oddělí - ultrafiltrace, chromatografie, elektroforéza, ultracentrifugace, srážení (ethanol, propanol acetonitril, dioxan), sorpce (akt. uhlí, ionexy) - a měří se aktivita komplexu antigen-protilátka. Pro sérii vzorků se stejnou koncentrací protilátky a značeného antigenu a s různou koncenrací neznač. antigenu se sestrojí kalibrační křivka

Pracuje se v substechiometrické formě reakce: do vzorku se stanovovaným antigenem se přidá známé množství izotopově značeného antigenu ( 3 H, 14 C, 135 I, 131 I) a malé (substechiometrické) množství

2 Enzymatické reakce, biochemické senzory Enzymy zabudované v membráně po styku se stanovovanou látkou změní svoji aktivitu (inhibice) a měří se odezva (zbarvení vrstvy, elektrický potenciál). Specifická činidla, dobrá citlivost, pro průběžné monitorování škodlivin. Potenciometrické biosenzory - spojení biologicky aktivních membrán s imntově selektivní elektrodou Stanovovaná látka Biokatalyzátor Detekční ISE Enzymové elektrody močovina ureasa H + glukoza glukosoxidasa + chinon e (Pt redox) acetylcholin acetylcholonesterasa H + kreatinin kreatininasa NH 3 sonda Bakteriové elektrody kys. glutamová Escheria coli CO 2 sonda arginin Streptococus lactis NH 3 sonda

Potenciometrické biosenzory - spojení biologicky aktivních membrán s imntově selektivní elektrodou Stanovovaná látka Biokatalyzátor Detekční ISE Enzymové elektrody

3 Analýza povrchů, lokální analýza anorg. látky - elektronová mikrosonda. Vhodně zaostřeným úzkým paprskem (1 µm) urychlených elektronů se působí na malou plochu vzorku a měří se interakce záření s povrchem vzorku - rentgenové záření, - odražené (Augerovy) elektrony - světelné (luminiscenční) záření - prošlé (absorbované) elektrony. Informace o složení urč. místa (lokální analýza) nebo o rozložení urč. prvků na povrchu materiálu. org. látky - reflexní techniky IČ ve spojení s Fourier. transformací (FTIR-ATR) - hmotnostní spektrometrie s laserovou desorpcí (MALDI -matrix assisted laser desorption/ionization) - desorpce a ionizace látky z povrchu matrice krátkým laserovým pulsem.

odražené (Augerovy) elektrony - světelné (luminiscenční) záření - prošlé (absorbované) elektrony. Informace o složení urč. místa (lokální analýza) nebo o rozložení urč.

4 Stopová analýza na velké vzdálenosti - automatické odběry vzorků na vzdáleném místě a jejich přenos do laboratoře - změření stopové složky ve velké vzdálenosti (monitorování) a transport signálu do laboratoře - analýza se provede skutečně na velkou vzdálenost laserová analýza - na vzdálená nebo nedostupná místa, měření prošlého nebo odraženého záření po absorpci nebo záření z přirozeného zdroje Analýza bodových zdrojů znečištěnin (komíny), znečištění vyšších vrstev atmosféry.

skutečně na velkou vzdálenost laserová analýza - na vzdálená nebo nedostupná místa, měření prošlého nebo odraženého

5 Analýza nejvýznamnějších organických znečištěnin v životním prostředí Patří sem mnoho látek přírodního nebo umělého charakteru. Nejnebezpečnější N-nitrososločeniny, polycyklické aromatické uhlovodíky (PAH), polychlorované bifenyly (PCB), polychlorované dibenzodioxiny a dibenzofurany (PCDD, PCDF) - mají průkazné genotoxocké projevy, přímé ohrožení lidské populace. N-nitrosoloučeniny hlavně N-nitrosaminy, nejúčinnější karcinogeny. Jak přírodní (v některých houbách) a bakteriálním působením na dusičnamy v materiálech obsahujících vhodné aminy (siláže, vody), tak hlavně umělé (tabák. kouř, kosmetika, potraviny, léčiva), Problémy při analýze: Vyskytují se ve velmí nízkých koncentracích ( µg/kg) Mnoho látek má podobné fyzikálně che. vlastnosti (odběry vzorků, příprava k analýze, analýza) Všudypřítomné - možnost kontaminace vzorku přímo během zpracování a analýzy Úprava vzorků k analýze: pro těkavé nízké N-nitrosaminy destilace z vodného roztoku, násl. extrakce nevod. rozpouštědlem, zakoncentrování odpařením pod kolonou nebo aparátkem Kuderna - Danish. Citlivé na denní a výbojkové světlo. Stanovení: po derivatizaci - stanovení jako dusitany po rozkladu UV světlem, oxidací na nitraminy, redukce na hydrazin. Málo používané. přímé - hmotnostní spektrometrie, GC (HPLC) s TEA detektorem (thermal energy analyzer) - detektor citlivý pouze k látkám uvolňujícím nitrosylové radikály. Vysoká citlivost až 0.01 ppb, vysoká selektivita - není nutná složitá předseparace. Velice drahý detektor.

projevy, přímé ohrožení lidské populace. N-nitrosoloučeniny hlavně N-nitrosaminy, nejúčinnější karcinogeny.

6 Polycyklické aromatické uhlovodíky chemické karcinogeny. V životním prostředí nejvíce sledována skupina 16 PAH - největší výskyt a význačné karcinogenní účinky - prioritní polutanty podle EPA a NIOSH. Zdroje: průmysl: elektrárny, spalování LTO, koksovny, plynárny; doprava, cigaretový kouř, zahřívání asfaltu, hoření dřeva. Kontaminace hlavně ve vzduchu, půdě okolo chem provozů, říční kaly a sedimenty. Kontaminace potravin zprostředkovaná nebo přímo (uzení). Často sledování pouze určitého PAH (např. benzo(a)pyren) a posuzování znečištění (karcinogenity) podle něho. Úprava vzorku k analýze: odběry plynných vzorků zakoncentrováním na filtrech plněných skelnými vlákny (možnost impregnace), polyuretanovou pěnou (molitan), zachycení na patronách se sorbentem (akt. uhlí, C18, Tenax). U kapalin nutná dobrá homogenizace, do skla obaleného Al fólií (proti rozkladu UV světlem). Pevné vzorky do doby analýzy uchovávat zmrazené. Extrakce: podle povahy matrice volba rozpouštědla, biolog. materiály se musí zmýdelnit NaOH (maso, ryby) nebo se po homogenizaci extrahují acetonem, acetonitrilem (ovoce, zelenina, káva). Uhlíkaté materiály: extrakce vroucím xylenem nebo benzenem Zakoncentrování extraktu: extrakce v systému kapalina - kapalina; chromatografie na sloupci silikagelu - oddělení PAH od alifatických uhlovodíků a od polárních aromat slouč, PAH se eluují v jedné frakci caklohexanem; GPC na Sephadexu LH-20 - elucí isopropanolem se oddělí alifat. a aromat. sloučeniny. Separace, detekce, identifikace GC na kapilárních kolonách, detekce FID; HPLC s FL detekcí - eluce gradientem acetonitrilu ve vodě na spec C18 kolonách, dobrá separační účinnost i citlivost detekce.

Kontaminace hlavně ve vzduchu, půdě okolo chem provozů, říční kaly a sedimenty. Kontaminace potravin zprostředkovaná nebo přímo (uzení). Často sledování pouze určitého PAH (např.

7 Polychlorované bifenyly Chlorované deriváty bifenylu (mono- až deka-). Nejsledovanější kontaminanty ž. p. Prokázané karcinogenní vlastnosti Kapaliny s vysokým bodem varu, použití jako teplosměnná média, přísady do barev, retardanty hoření. Mimořádná schopnost bioakumulace v tukových tkáních. U nás hlavně Delor (Chemko Strážské). Jednotlivé výrobky mají charakteristický "otisk palce". Problémy s asanací zamořených míst a likvidací odpadů obs. bifenyly. Úprava vzorků k analýze Ve vzorcích v koncentracích mg/kg (oleje, tuky) až µg/l (vody). Nutnost dodržovat čisotu použ. nádobí vzhledem k všudypřítomnosti PCB. Extrakce a zakoncentrování: vody - extrakce nepolárním rozpouštědlem s násl. zakoncentrováním; transf. oleje - předseparace na koloně plněné Florisilem a eluce isooktanem. Výhodné použití kombinovaných silikagelovách kolon s více různými vrstvami (s kys. sírovou, s NaOH, s AgNO 3 ) pro odstranění širokého spektra interferujících látek. Tuhé vzorky - extrakce v Soxhletově extraktoru. Tuky a oleje - extrakce kys. sírovou Vzduch - zachycení na adsorbentech (PU pěna, skelná vata,..) Separace, detekce: téměř výlučně kapilární GC na nepolárních imobilizovaných stacionárních fázích HP-1, OV-1 nebo HP-5, DB-5. Detekce buď ECD (vyhovuje lépe pro rutinní analýzy s malým obsahem interferujících látek) nebo MS: Pracuje se v modu SIM, zaznamenávají se píky molekulových iontů M + a (M+2) +. Jejich poměr charakteristický pro konkrétní počet chlorů v molekule. Kvantifikace výsledků použitím vnějších standardů (Delor 103, Delor 106). Problémy se vzorky prošlými biolog. procesem - poměr izomerů neodpovídá vých. směsi. Kongenerová analýaza - celková odezva dané skupiny izomerů je vztahována na jeden standardní izomer této skupiny.

U nás hlavně Delor (Chemko Strážské). Jednotlivé výrobky mají charakteristický "otisk palce". Problémy s asanací zamořených míst a likvidací odpadů obs. bifenyly.

8 Polychlorované dibenzo-p-dioxiny a dibenzofurany U PCDD celkem 75 sloučenin, u PCDF celkem 135 sloučenin. Extrémní toxicita, nejnebezpečnější izomery s 2,3,7,8-substitucí. Vznikají jako vedlejší produkty výroby organických chlorovaných látek (pesticidy, fenoly,..) - s nimi se zanášejí do ž. p., a spalování arom. látek obs. chlor (spalovny). Obsah v popílku, sedimentech, kalech, živ. tkáních. Vysoká perzistence v ž. p. Poločas rozpadu delší než 1 rok. Úprava vzorků k analýze Vzhledem k extrémní toxicitě nutno dodržovat zásady práce s toxickými látkami. Separace PCDD apcdf z matrice Vody - extrakce kapalina - kapalina nebo sorpce na Amberlite XAD-2 patrony s extrakcí v Soxhletu. Pevné matrice - extrakce ulrazvukem nebo v Soxhletu - benzen, hexan, aceton, metylenchlorid. Živoč. tkáně - loužení s NaOH nebo kyselinami, extrakce hexanem, acetonitrilem. Matrice se zpracovávají s přídavkem vnitřního standardu ( 13 C nebo 37 Cl). Clean-up techniky Odstarnění koextrahovaných složek z extraktu - jejich koncentrace je v exreaktu vyšší o několik řádů než stan. složek. Hlavně DDT, PCB, PCN, chlorované bifenyletery,... Čištění na sloupci aluminy (bazická i kyselá), sloupci silikagelu nebo Florisilu. Použití práškového uhlí v kombinaci s jinými materiály na oddělení PCDD a PCDF od nepolárních org. látek (PCB). Konečný extrakt se zakoncentruje na minimální objem. Separace, detekce Téměř výlučně kapilární GC s MS detekcí (kvadrupól i vysokorozlišující). Použití spec. kolon na dioxiny. Hl. požadavkem dobrá separace 2,3,7,8-substituovaných izomerů. MS detekce v režimu SIM, detegují se molekulové ionty. Stanovení se provádí kogenerovým způsobem. Výsledky se uvádějí pro každou skupinu chlorovaných izomerů a zvlášť pro 2,3,7,8-izomery

Obsah v popílku, sedimentech, kalech, živ. tkáních. Vysoká perzistence v ž. p. Poločas rozpadu delší než 1 rok.

Podobné dokumenty

Pentachlorfenol (PCP)

Pentachlorfenol (PCP) Zpracováno podle Raclavská, H. Kuchařová, J. Plachá, D.: Podklady k provádění Protokolu o PRTR Přehled metod a identifikace látek sledovaných podle Protokolu o registrech úniků a přenosů znečišťujících