Biochemický ústav LF MU (J.D.) 2008

Transkript

1 Proteiny & Glykoproteiny Biochemický ústav LF MU (J.D.)

2 Proteiny jsou polypeptidy (anhydropolymery L-AK) R H C α H α N C C C N H R C α hlavní řetězec H R H postranní řetězce mají identickou páteř: peptidové vazby oddělené α uhlíky 2

3 Úrovně popisu struktury proteinů primární struktura sekundární struktura všechny proteiny terciární struktura kvartérní struktura 3

4 Primární struktura sekvence všech aminokyselin v polypeptidovém řetězci číslování AK začíná od N-konce 4

5 Aminokyselina po odtržení H skupiny z karboxylu vytvoří aminoacyl R CH C R CH C NH 2 H NH 2 aminokyselina aminoacyl 5

6 Dipeptid je N-aminoacylaminokyselina R R H 2 N CH C NH CH CH N-konec peptidová vazba C-konec 6

7 Názvy acylů AK: přípona -in/-an se nahradí příponou yl (je pět výjimek) Ala alanyl Leu leucyl Arg arginyl Lys lysyl Asn Asp Cys Gln Glu Gly asparaginyl α-aspartyl / β-aspartyl cysteinyl glutaminyl α-glutamyl / γ-glutamyl glycyl Met Phe Pro Ser Thr Trp methionyl fenylalanyl prolyl seryl threonyl tryptofyl His histidyl Tyr tyrosyl Iso isoleucyl Val valyl 7

8 Srovnejte Alanylglycin Glycylalanin CH 3 H 3 C CH C NH CH 2 CH CH 2 C NH CH CH NH 2 NH 2 alanyl (acyl alaninu) glycyl (acyl glycinu) 8

9 Jak postupovat při určení názvu? 1. Zjistíme počet peptidových vazeb 2. Najdeme N-konec 3. Vytvoříme acyl N-koncové aminokyseliny 4. U dipeptidu přidáme název C-koncové AK 5. U tripeptidu apod. přidáme ještě další acyl(y), zakončíme názvem C-koncové AK 9

10 Příklad HN NH 2 NH H 2 N H N N H N N H 2 N H 2 H H N H 2 10

11 Peptidová vazba -C-NH- C N C N H H je rezonanční hybrid dvou mezních struktur vazba C-N má charakter částečně dvojné vazby (řád vazby cca 1,5) 11

12 π-elektrony jsou sdíleny třemi atomy C N H peptidový dusík je nebazický peptidová vazba je rigidní a planární útvar H je vtrans poloze vůči (u většiny proteinů) 12

13 Atomy -C-NH- jsou v rovině H C N C C C C N H 13

14 Šest α C Šest N atomů H peptidové vazby H N C C α leží C v rovině α C H R 14

15 Roviny peptidových vazeb mohou rotovat α C C N H H N α H C R α C C 15

16 Rotací peptidových vazeb se utváří různé typy sekundární struktury H Ψ Φ C N C C C C N H 16

17 Kombinace torzních úhlů kombinace torzních úhlů Φ a Ψ nejsou neomezené uplatňují se prostorové nároky bočních řetězců aminokyselin na Cα pro určité typy sekundární struktury existují konkrétní hodnoty obou úhlů α-helix Φ = -57 Ψ = -47 (LCH II, str. 13) β-struktura Φ = -140 Ψ = 150 natažený řetězec Φ = 180 Ψ =

18 Sekundární struktura se týká pouze určité části polypeptidového řetězce (segmentu) lokální prostorové uspořádání atomů v peptidovém řetězci bez ohledu na uspořádání postranních řetězců R bez ohledu na vztahy segmentu k jiným segmentům peptid. řetězce Typy sekundární struktury: Pravidelná (helixy, β-struktura) hybová (stočení skládaného listu, β-ohyb) Nepravidelná (deformace vlivem prolinu, plápolající konce) 18

19 α-helix Jeden úsek peptidového řetězce vytváří pravotočivou šroubovici C= a NH skupiny jsou paralelní s dlouhou osou šroubovice každá C= skupina je vázána H-vazbou s NH o čtyři AK vzdálenější H-vazby jsou souběžné s osou helixu postranní řetězce R jsou na vnější straně helixu 19

20 H-vazby jsou rovnoběžné s osou helixu 20

21 Každá C= skupina je vázána H-vazbou s NH skupinou o čtyři AK vzdálenější 21

22 Braggova symbolika α-helixu počet AK na jeden závit C C N C N C H 1 N C C N C 9 13 C N C C 11 N 12 C 3, C počet atomů v heterocyklu vzniklém H-vazbou: H 22

23 Další typy helixů α-helix (3,6 13 ) π-helix 4,4 16 3,0 10 -helix volnější těsnější 23

24 Strmý helix kolagenu prim. strukt. (Gly-X-Pro) a (Gly-X-hyPro) C= a NH skupiny vybočené do stran, kolmo na svislou osu helix je levotočivý a natažený H-vazby mezi třemi helixy - triplhelix velmi pevná a rigidní bílkovina 24

25 Prolin způsobuje ohnutí řetězce (zlom) N N H 25

26 β-struktura natažený řetězec ( šroubovice se dvěma zbytky na závit ) H-vazbami se spojuje se sousedními segmenty do tzv. skládaného listu H-vazby mezi NH a C jsou kolmo na řetězce postranní řetězce AK nad a pod myšlenou rovinou 26

27 Antiparalelní skládaný list (častější) C N H H C C N C C N C C N H H H H H N C C N C C N C C N H H N C 27

28 Paralelní skládaný list C N H H C C N C C N C C N H H H H C C N C C C N C C N H H C N 28

29 Deformace pravidelných struktur β-struktura β-list β-list stočený poměrně často nastává stočení nebo ohnutí pravidelných struktur skládaný list stočený list 29

30 β-hyb tetrapeptidový segment, často Gly, Pro umožňuje otočení H 2 N H R H R C C N C 3 H C řetězce o 180 C R 1 H C stabilizován H-vazbou mezi 1. a 4. AK H N C R H 4 30

31 Supersekundární struktury kombinace pravidelných sekundárních struktur vyskytují se ve stejné podobě v různých a nepříbuzných bílkovinách βαβ 4-α-helix β-meandr Řecký klíč stočené helixy β-barel zinkový prst leucinový zip 31

32 Terciární struktura prostorové uspořádání všech atomů jednom polypetidovém řetězci je udržována nevazebnými interakcemi postranních řetězců AK (H-vazby, elektrostatické, hydrofobní) polární postranní řetězce jsou lokalizovány na povrchu hydrofobní zbytky jsou zanořeny dovnitř 32

33 Vodíkové vazby C H C N NH N H H 33

34 Elektrostatická interakce (kation. anion) H N C C H 3 N solný můstek 34

35 Ionizující skupiny v postranních řetězcích AK Skupina pk A AK Náboj (ph 7,40) β-karboxyl 3,9 Asp záporný γ-karboxyl 4,3 Glu záporný Imidazolium 6,0 His kladný ε-amonium 10,5 Lys kladný Guanidinium 12,5 Arg kladný 35

36 Pět aminokyselin vytváří solné můstky Dvě kyselé: Asp, Glu v postranním řetězci záporný náboj karboxylátového aniontu (-C - ) Tři bazické: Arg, Lys, His v postranním řetězci kladný náboj na dusíku 36

37 Hydrofobní interakce H 3 C CH 3 H 3 C CH 3 Molekuly vody vytěsněné z prostoru interakce zvyšují celkovou entropii systému + okolí (viz přednáška Energetika). 37

38 Terciární struktura hemoglobinu 38

39 Silné kovalentní vazby zpevňují terciární strukturu C H N disulfidové můstky S S N H C 39

40 Příčné můstky v kolagenu vznikají reakcí koncových skupin Lys + allys C HC(CH 2 ) 4 NH 2 NH lysin H C allysin C CH (CH 2 ) 3 NH 40

41 Příčný můstek bílkovin pojiva vzniklý hydrogenací Schiffovy báze C HC NH N H C CH NH 41

42 Domény relativně samostatné kompaktní globulární oblasti (samostatné ostrůvky ve struktuře ) odděleny obvykle nestrukturovaným polypeptidem mohou zahrnovat supersekundární struktury jsou často zodpovědné za určitou aktivitu proteinu příklad: domény lehkých a těžkých řetězců imunoglobulinů 42

43 Imunoglobuliny variabilní domény jsou zodpovědné za specifitu protilátky konstantní domény odpovídají např. za vazbu ke komplemetu 43

44 Kvartérní struktura jen u oligomerních proteinů popisuje počet podjednotek (samostatných polypeptid. řetězců), jejich prostorové uspořádání a interakce mezi nimi stabilizace nevazebnými interakcemi podjednotky mohou být stejné nebo různé 44

45 Kvartérní struktura hemoglobinu α α 1 β 1 α 1 2 β 1 2 β 2 β 2 2 α 2 deoxyhemoglobin T-forma α 2 2 oxyhemoglobin R-forma 45

46 Příklady proteinů s kvartérní strukturou Protein Podjednotky Význam α-amylasa 2 štěpí škrob na maltosu Kreatinkinasa 2 fosforylace kreatinu Laktátdehydrogenasa Hemoglobin Proteinkinasa A glukoneogeneze transport 2 regulační protein Myosin 6 svalový protein Asp-karbamoyltransferasa 12 syntéza pyrimidinových bází Ferritin 20 zásoba Fe 3+ v játrech 46

47 Úrovně popisu struktury - shrnutí Struktura Popisuje Nevaz. interakce Primární jeden polypeptidový řetězec žádné Sekundární Supersekundární Terciární část jednoho řetězce několik částí řetězce jeden řetězec H-vazby všechny všechny Kvartérní několik řetězců všechny 47

48 Konformační změny (flexibilita) proteinů změny konformace proteinu jsou hybnou silou biochemických pochodů např. fosforylace proteinu vyvolá změnu konformace enzym se stává aktivním (princip aktivačního působení kinas) hormon se naváže na receptor receptor změní konformaci a stane se např. iontovým kanálem změny konformace se přenášejí z jedné molekuly na druhou (aktivace podjednotek hemoglobinu vazbou první molekuly 2 ) 48 2

49 Denaturace proteinů rozvolnění terciární a sekundární struktury rozrušení nevazebných interakcí beze změn v primární struktuře ztráta biologické funkce většinou irreverzibilní proces Nativní protein je v přirozené, biologicky účinné konformaci 49

50 Denaturace proteinů (viz Praktická cvičení, str. 37) Chemická silné kyseliny silné hydroxidy těžké kovy deproteinační činidla Fyzikální zvýšená teplota mechanické vlivy ultrazvuk ionizující záření tenzidy 50

51 Šlehání bílku z pohledu chemika vaječný bílek je viskózní roztok globulárních bílkovin (ovalbumin, ovotransferrin, ovomukoid, ovomucin, ovoglobuliny, avidin ad.) šlehání (vznik pěny) = uzavírání malých bublinek vzduchu do bílku vysoká viskozita bílku ztěžuje unikání bublinek a stabilizuje pěnu bílkoviny jsou amfoterní tenzidy, orientují se na fázovém rozhraní, tím se rozpletou do volných řetězců a ty se vzájemně propojí = denaturace z pěny se stane tuhý sníh = denaturace dokončena a nevratná denaturaci (vznik sněhu) usnadňují další faktory: zvýšená teplota (šlehání v páře) změna iontové síly (přidat špetku soli) změna ph (přidat několik kapek citronové šťávy) 51

52 Strukturní typy proteinů vláknité (nerozpustné, větší molekulová hmotnost) globulární (rozpustné, nižší molekulová hmotnost) membránové (nerozpustné, struktura uzpůsobena pro interakci s membránou) 52

53 Vláknité (fibrilární) proteiny keratiny kolagen, elastin (pojivo)* proteiny cytoskeletu svalové proteiny* fibroin *Podrobněji ve 4. semestru 53

54 Keratiny vlasy, chlupy, nehty, u zvířat kopyta, peří, srst polypeptidové řetězce jsou vzájemně vázány disulfidovýmí a vodíkovými vazbami α-helixy svinuty do protofibrily mechanicky a chemicky odolný horkou vodou se H-vazby rozruší - vlas lze natáhnout, α-helix β-list 54

55 Keratin a trvalá ondulace vlasový keratin obsahuje mnoho disulfidových můstků působením thioglykolové kyseliny (HS-CH 2 -CH) se disulfidové můstky zredukují na -SH skupiny vlasy jsou pak natočeny do nového tvaru H 2 2 oxiduje -SH skupiny na -S-S- 2 2 můstky a ty fixují keratin v novém tvaru 55

56 Keratin a moli ve skříni keratin je pro člověka nestravitelný (Pozor na vlas v polévce) ovčí vlna je keratin mol šatní (larva) má v zažívacím traktu značné množství thiolů R-SH, kterými houževnatě a vytrvale redukuje -S-S- můstky v keratinu vlněného oblečení keratin pak může nutričně využít 56

57 Kolagen kolagen je hlavní bílkovina pojiva, mechanicky pevná (30 % glycinu, 20 % prolinu, 10 % alaninu) trojšroubovice tropokolagenu asociují do mikrofibril, které jsou zpevněné kovalentními příčnými můstky želatina je produkt denaturace kolagenu, skládá se z volných řetězců bez příčných můstků 57

58 Fibroin je produkt hmyzu a pavouků bílkovina hedvábí a pavučin struktury β-listů jsou vrstevnatě uspořádány mezi postranními řetězci jsou hydrofobní interakce 58

59 Srovnejte Bavlna (cotton) celulosa rostlinný produkt polysacharid H-vazby dobře saje pot cena: Hedvábí (silk) fibroin živočišný produkt bílkovina hydrofobní interakce špatně saje pot cena: 59

60 Globulární proteiny α-proteiny - převažuje α-helix (hemoglobin, myoglobin) β-proteiny - převažuje β-list (proteasy, imunoglobuliny) α/β-proteiny - supersekundární struktury interagujících α-helixů a β-struktur (kinasy) (α+β)-proteinyα β - α-helixy a β-struktury neinteragují (insulin) 60

61 Membránové proteiny periferní - vázány volně, globulární integrální - zanořeny nebo procházejí, často tvoří kanály mohou být zanořeny i několikrát (sedmihelixový typ) v oblasti membrány jsou hydrofobní části molekuly do ECT a ICT vyčnívají hydrofilní řetězce funkce přenašečů a receptorů 61

62 Membránové proteiny sacharidová složka periferní integrální periferní integrální 62

63 Glykoproteiny glykosylované proteiny, typický obsah sacharidů 1-15 % sacharidy vázané kovalentní vazbou, dvojím způsobem: N-glykosidově (Asn) -glykosidově (Ser, Thr) oba typy se liší způsobem biosyntézy Biosyntéza glykoproteinů glykosylace je nejčastější posttranslační modifikace proteinů probíhá buď v ER v průběhy syntézy proteinu nebo po ukončení syntézy v Golgiho aparátu 63

64 Sacharidové složky glykoproteinů hexosy (mannosa, galaktosa) N-acetylhexosaminy (GlcNAc, GalNAc) pentosy (arabinosa, xylosa) 6-deoxyhexosy = methylpentosy (L-fukosa) sialové kyseliny 64

65 N-Glykoproteiny Vazba přes Asn v polypeptidovém řetězci H N H C... H NH NH N-glykosidová vazba C CH 3 65

66 -Glykoproteiny Vazba přes serin v polypeptidovém řetězci H H N... H -glykosidová vazba NH C CH 3 66

67 Diverzita oligosacharidů spojování monosacharidů glykosidovou vazbou dva monosacharidy mohou být spojeny několika typy glykosidových vazeb velká možnost větvení α1,2 α1,3 α1,4 α1,6 β1,2 β1,3 β1,4 β1,6 srovnejte s možností spojení dvou aminokyselin velká diverzita struktur oligosacharidů 67

68 Funkce sacharidové složky glykoproteinů zvyšuje polaritu (rozpustnost) proteinu ve vodě vytváří povrchový náboj (sialové kyseliny) chrání protein před účinkem proteas často určuje biologický poločas proteinu (desializace) ovlivňuje správnou orientaci proteinu v membráně stabilizuje konformaci proteinu vytváří antigenní determinanty pro rozlišení druhů rozhoduje o vazbě bakterií a virů na povrch buňky usnadňuje specifickou vazbu hormon-receptor 68

69 Hlavní typy glykoproteinů Membránové - integrální, glykokalyx (střevní epitelie) Plazmatické - většina proteinů krevní plazmy Mucinové - součásti sekretů 69

70 Membránové glykoproteiny proteoglykany fibronektin glykolipid kolagen cholesterol glykoprotein fibrilární protein cytoskeletu spektrin 70

71 ligosacharidové značení buněk oligosacharidy vázané na proteiny a lipidy představují rozpoznávací signály na povrchu buněk zodpovídají za specifickou interakci buňky s dalšími buňkami nebo specifickými proteiny systém krevních skupin je jedním z příkladů 71

72 ligosacharidy jako antigeny krevních skupin oligosacharidy vázané na povrchu buněk na proteiny (-glykosidová vazba) nebo lipidy nejznámější systém A-B-0, je však známo kolem 14 geneticky charakterizovaných systémů krevních skupin jsou přítomny i u jiných buněk a tkání 72

73 Fuc Gal Sial GalNAc Fuc Gal Sial GalNAc R Typ 0 Typ A Gal Fuc Gal GalNAc R Sial Typy A a B vznikají připojením GalNAc, resp. Gal Typ B GalNAc R 73

74 Vztahy mezi typy A, B, 0 téměř všichni lidé jsou vybaveni enzymovým systémem pro syntézu oligosacharidu typu 0 pouze někteří jedinci mají enzymové vybavení pro připojení galaktosy (typ B) nebo N-acetylgalaktosy (typ A) heterozygoti mohou tvořit oba typy (typ AB) typ 0 je neantigenní, člověk proti němu netvoří protilátky jedinec netvoří protilátky proti vlastnímu typu jedinec typu A však bude tvořit protilátky proti typu B a naopak, jedinec typu 0 bude tvořit protilátky proti A i B tvorba protilátek vyvolává shlukování a precipitaci buněk 74

75 Význam krevních skupin pro transfuzi Jedinec Tvoří Může získat krev Může darovat s typem protilátky od jedince krev jedinci 0 A, B 0 0, A, B, AB A B 0, A A, AB B A 0, B B, AB AB žádné 0, A, B, AB AB 75

76 Plazmatické glykoproteiny obsahují N-vázané oligosacharidy Typy: vysoce mannosový hybridní Man Man G lc N A c Man komplexní G lc N A c A s n společný základ všech N-vázaných oligosacharidů 76

77 Vysoce mannosový typ Man Man Man Man Man Man Man Man je základním prekursorem při biosyntéze Man GlcNAc u živočichů se vyskytuje málo, nachází se u nižších eukaryontů a u virů GlcNAc Asn 77

78 Komplexní typ mannosové zbytky (označené na předchozím snímku červeně) jsou při další syntéze nahrazeny jinými monosacharidy vzniká komplexní oligosacharid (při pochodu nazývaném processing) terminálním sacharidem komplexních oligosacharidů je často kyselina sialová větvení oligosacharidů připomíná antény (označení bianténové, trianténové, tetraanténové komplexní řetězce) 78

79 Sial Sial Sial Sial Gal Gal Gal Gal GlcNAc GlcNAc GlcNAc GlcNAc Man Man Man GlcNAc Příklad komplexního N-vázaného oligosacharidu, tetraanténový typ GlcNAc Asn 79

80 Příklady plazmatických glykoproteinů Glykoprotein Význam Transferrin transport Fe 3+ Ceruloplazmin transport Cu 2+, oxidace Fe 2+ Fe 3+ Haptoglobin vazba volného Hb Hemopexin α 1 -Antitrypsin vazba volného hemu po rozpadu erytrocytů inhibice proteas Fibrinogen srážení krve α 2 -Makroglobulin CRP indikátor zánětu indikátor zánětu 80

81 Mucinové glykoproteiny -glykosidově vázané, nejčastěji GalNAc na Ser/Thr, na něj další monosacharidy sacharidový podíl poměrně vysoký (až 75 %) obsaženy ve slizničních sekretech ochranná a lubrikační funkce často kys. sialová a sulfatované cukry zvyšují viskozitu sekretu 81

82 !! Rozlišujte!! Charakteristika Glykoprotein Glykovaný protein Proteoglykan bsah sacharidů do 15 % minimální % Vazba sacharidu -/N-glykosid* aldimin -/N-glykosid* Sacharid. složky Man, Gal, GlcNAc glukosa GlcA, GlcNAc Vznik enzymově neenzymově enzymově Hlavní výskyt plazma, membrány erytrocyty** pojivo LCH II str. 151 str. 40 str. 99 * Na Ser, Thr (-), Asn (N-) ** Glykovaný hemoglobin HbA 1c 82