Teoretický úvod: VODNÍ REŽIM ROSTLINY. Praktikum fyziologie rostlin

Transkript

1 Teoretický úvod: VODNÍ REŽIM ROSTLINY Praktikum fyziologie rostlin

2 Teoretický úvod: VODNÍ REŽIM ROSTLINY Termín vodní režim rostliny (syn. vodní provoz rostliny) zahrnuje píjem vody rostlinou z okolního prostedí, vedení (pohyb) vody v rostlin a výdej vody z rostliny do okolního prostedí. Výdej vody ve form vodní páry se nazývá transpirace. Molekula vody je malá, jako celek je elektroneutrální avšak siln polární. Polarita jí dává schopnost vytváet intermolekulární interakce s jinými polárními molekulami a pojímat je do sebe, tj. rozpouštt je. Voda udržuje stálý objem. Má vysoké specifické teplo, tj. množství energie nutné ke zvýšení teploty 1g vody v kapalném stavu o 1 o K pi zachování stejného tlaku, a výborn teplo vede. Tyto vlastnosti vody minimalizují teplotní zmny uvnit rostliny a udržují teplotní vyváženost (balanci) v rostlin. Voda má vysoké molární teplo fázového pesunu, tj. množství tepla nutné pro pechod 1 molu látky ze skupenství kapalného do plynného pi konstantním tlaku a teplot okolí 25 o C. Pro vodu se uvádí 44 kj. mol -1 pi 25 o C (2,44 MJ. kg -1 ). Díky této vlastnosti vody se rostlina pi transpiraci ochlazuje. Vodní režim rostliny je neoddliteln spjat s dalšími dležitými procesy. Je to pedevším píjem minerálních látek, transport látek v rostlin, fotosyntéza a stabilizace teplotních pomr v rostlin i jejím okolí. Voda celou rostlinu prostupuje (prmrný obsah vody v rostlin je 60-90%) a tvoí nejen prostedí pro pohyb rozpuštných anorganických i organických látek v buce, mezi bukami i v celé rostlin, ale také hydratuje bunnou stnu i cytoplazmu, ovlivuje strukturu molekul protein, nukleových kyselin a polysacharid. Tvoí prostedí, ve kterém probíhá vtšina biochemických reakcí a do mnoha proces vstupuje jako reakní agens (nap. hydrolýza zásobních látek, fotosyntéza). Vnitní pozitivní hydrostatický tlak vody pomáhá udržet tvar rostliny. Rostlina vodu neustále pijímá a vydává. Na dlouhé vzdálenosti se voda v rostlin pohybuje hromadným tokem (tj. konvekcí), pi pohybu na velmi krátké vzdálenosti a v plynné fázi se uplatuje difúze. Pro píjem, udržení a vedení vody v rostlin má základní význam osmóza (Box. 1). Box. 1. Osmóza Osmóza je specifický proces vyrovnávající rozdíl koncentrací rozpuštných látek mezi dvma rzn koncentrovanými roztoky, které jsou oddleny polopropustnou, tj. semipermeabilní membránou. Semipermeabilní membrána propouští jen molekuly rozpouštdla. Molekuly vody spontánn pronikají difundují do roztoku s vyšší koncentrací rozpuštných látek, ímž se jeho objem zvtšuje. Pronikání molekul vody do roztoku s vyšším obsahem rozpuštných látek lze zamezit tím, že je koncentrovanjší roztok vystaven tlaku. Tlak, který psobení rozdílu koncentrací vyrovná a zamezí pronikání vody do koncentrovanjšího roztoku, se nazývá tlak osmotický a obvykle se oznauje. Jeho velikost je závislá na rozdílu koncentrací rozpuštných látek a na teplot. 2

3 Obsah vody v rostlin, nebo v její ásti, se obvykle vyjaduje jako vodní sytostní deficit (VSD) nebo relativní obsah vody (RWC). Vodní sytostní deficit (VSD) udává, kolik vody rostlin nebo její ásti chybí do maximálního nasycení. Vyjaduje se v % a vypoítává se podle následujícího vzorce: hmotnost po nasycení vodou - erstvá hmotnost VSD (%) = 100 hmotnost po nasycení vodou hmotnost sušiny Relativní obsah vody (RWC = relative water content) vyjaduje, kolik vody z maximálního možného množství rostlina skuten obsahuje, udává se v % a vypoítává se podle následujícího vzorce: erstvá hmotnost hmotnost sušiny RWC ( %) = 100 hmotnost po nasycení vodou hmotnost sušiny Základním pojmem vodního režimu rostlin je termín vodní potenciál. Tato veliina se používá prakticky jen ve fyziologii rostlin a charakterizuje stav vody v rostlin, v její ásti nebo v jejím nejbližším okolí (v pd, v atmosfée). Symbolem vodního potenciálu je ecké písmeno w (velké psí). Hodnota vodního potenciálu je relativní, srovnávací (referenní) hodnotou je potenciál isté vody, který je konvenn považován za nulový. Vodní potenciál udává rozdíl mezi potenciálem vody, která je složkou urité soustavy a vody isté, na kterou psobí stejný atmosférický tlak, stejná teplota prostedí a stejná síla gravitaního pole jako na vodu v uvažované soustav. Vodní potenciál je chemický potenciál vody vztažený na její molární objem a udává se v jednotkách tlaku, tj. v Pa (obvykle v MPa = megapaskal). w w = V w Pa w chemický potenciál vody V w - molární objem vody ( m 3. mol -1 ) Pa = paskal (jednotka tlaku) = J. m -3 Vodní potenciál má, stejn jako potenciál chemický, nkolik složek, které psobí aditivn. Složky vodního potenciálu jsou potenciál osmotický (koncentraní), tlakový a gravitaní. Vztah lze vyjádit následovn: w = s + p + g Pa 3

4 w vodní potenciál, s osmotický potenciál, p tlakový potenciál, g gravitaní potenciál s osmotický potenciál vody v roztoku (syn. osmotická, koncentraní složka) závisí na koncentraci látek v ní rozpuštných. Osmotický potenciál vody je íseln roven osmotickému tlaku, hodnota osmotického potenciálu je však záporná, nebo rozpuštné látky soluty - potenciál vody snižují. s = - = - R. T. c s Pa R = univerzální plynová konstanta (8,314 J. mol -1. K -1 ), T absolutní teplota v kelvinech (273 + C), c s koncentrace solut (poet mol všech ástic rozpuštných v 1 m 3 roztoku). Osmotický potenciál vody závisí na množství rozpuštných ástic, nikoli na jejich kvalit. Nkdy se initel c s nahrazuje souinem c i, kde c je koncentrace rozpuštné látky (mol. m -3 ) a i je tzv. izotonický koeficient = 1 + (n 1), kde je stupe disociace a n = poet ástí vzniklých disociací (pro NaCl je i = 2, pro sacharózu je i = 1). s 0,1M roztoku NaCl, který je ve vod pln disociován na dv ástice (ionty Na + a Cl - ), je 0,488 MPa, s 0,1M roztoku sacharózy je 0,244 MPa nebo sacharóza se ve vod rozpouští ale nedisociuje a poet ástic se nemní. Je-li koncentrace solut vn protoplastu, tj. v apoplastu, vyšší než uvnit, nachází se protoplast v prostedí, které oznaujeme jako hypertonické. Za tchto podmínek voda protoplast opouští, objem protoplastu se zmenšuje až pestane vyplovat prostor ohraniený bunnou stnou. Tento jev se nazývá plazmolýza (obr. 1). Obr. 1. Plazmolýza 1a) plazmolyzovaná buka mezofylu doušky vodní (Elodea densa) 1b) plazmolyzované buky vnitní pokožky suknice cibule (Allium cepa) Pevzato z Smith et al (obr. 1a) a z Nmec a kol 1949 (obr. 1b) 1a 1b 4

5 Je-li v apoplastu koncentrace solut stejná jako v protoplastu, nachází se protoplast v prostedí izotonickém. Za tchto podmínek je píjem vody z apoplastu do protoplastu stejný jako výdej vody z protoplastu do apoplastu a objem protoplastu se nemní. Je-li v apoplastu koncentrace solut nižší než v protoplastu prostedí se oznauje jako hypotonické a voda osmoticky vstupuje do protoplastu, protoplast zvtšuje objem a tlaí na bunnou stnu. Tlaku protoplastu na bunnou stnu se íká tlak turgorový neboli turgor. Turgor je vyrovnáván pevností bunné stny a tlakem okolních pletiv. Je-li turgor vtší než síly, které ho vyrovnávají, dojde k plazmoptýze, tj. k narušení celistvosti bunné stny a desintegraci protoplastu. p je tlakový potenciál vody v roztoku (syn. složka tlaková, hydrostatický tlak; asto se znaí P). Udává rozdíl mezi tlakem vody v soustav a tlakem atmosférickým a mže být kladný, nulový nebo záporný. Kladný tlakový potenciál mže mít nap. voda v protoplastech, které se nacházejí hypotonickém v prostedí. Kladný tlakový potenciál mže mít také voda v apoplastu, nap. ve vodivých elementech xylému koene pi vysoké koncentraci solut a dostateném množství dostupné vody. Kladný tlakový potenciál vody v xylému koene tlaí vodu do nadzemní ásti rostliny. Tato síla se nazývá koenový vztlak. Pi nedostatku vody mže být hydrostatický tlak v buce nižší než tlak atmosférický, tedy záporný. Pi záporném hydrostatickém tlaku mže docházet ke smrš ování protoplastu, který pestane na bunnou stnu vyvíjet tlak. Záporný tlakový potenciál mže mít pi vysoké transpiraci a nedostateném zásobení rostliny vodou z pdy i voda v apoplastu v xylému, v mezibunných prostorech nebo v bunných stnách. Voda je za tchto podmínek ve stavu tenze (naptí, podtlaku). Vn se tento stav projevuje ochablostí vadnutím. g - gravitaní potenciál (syn. gravitaní složka) je dán psobením gravitace a polohou vody v gravitaním poli vzhledem k poloze, která je považována za referenní. Je roven souinu vzdálenosti od referenní úrovn (h v m), hustoty vody ( = specifická hmotnost vody = 10 3 kg. m -3 ) a gravitaního zrychlení g (gravitaní konstanta 9,806 m. s -2 ). g = h.. g Pa Vertikální zmna polohy o 10 m psobí zmnu gravitaního potenciálu pibližn o 0,1 MPa (v absolutní hodnot). Nkdy se uvádí další složka vodního potenciálu m matriní potenciál. Matriní potenciál snižuje vodní potenciál tenké vrstvy vody (1 až 2 molekuly vysoké), která se udržuje v kapilárních prostorech bunných stn, suché pdy a suchých semen nebo pevn 5

6 lne k povrchm bobtnajících koloid. U hydratovaných pletiv je matriní potenciál zahrnut v potenciálu osmotickém a tlakovém a zanedbává se. Pi bobtnání koloid, nap. pi klíení semen, je však matriní potenciál významný. Vodní potenciál v rostlin, w, má negativní hodnotu (je záporný). Voda se pohybuje z míst s vyšším, tj. mén negativním, vodním potenciálem do míst s nižším, tj. negativnjším, vodním potenciálem. Rychlost pohybu vody je vedle rozdílu vodního potenciálu, tj. hybné síly, závislá na propustností prostedí (pdy, pletiva, buky nebo membrány). Hodnoty vodního potenciálu v rzných ástech systému pda rostlina atmosféra uvádí tabulka 1. Tab. 1. Hodnoty vodního potenciálu v rzných ástech systému pda rostlina atmosféra (Nobel 1991, obrázek pevzat z Taiz a Zeiger 2002) atmosféra rostlina pda ást systému vzduch hned za hraniní vrstvou pi relativní vlhkosti 50% vzduch v okolí prduch pi relativní vlhkosti 60 % vzduch v prduchové štrbin 95% relativní vlhkosti bunná stna mezofylové buky ve výšce 10 m vakuola mezofylové buky 10 m nad povrchem pdy xylém v listech 10m nad povrchem pdy xylém v koenech na úrovni povrchu pdy Rostliny jsou schopné pijímat vodu celým povrchem tla. Suchozemské rostliny však pijímají naprostou vtšinu vody koeny z pdy. Od povrchu koene je voda vedena radiáln živými pletivy pes rhizodermis, primární kru a endodermis do parenchymu stedního válce. Parenchymem stedního válce je voda transportována k vodivým pletivm radiálního cévního svazku koene, kde vstupuje do xylému. Xylémem je voda vedena axiáln do prýtu. V nadzemní ásti rostliny je voda transportována xylémem k apikálnímu vzrostnému vrcholu stonku a xylémem stop, které z vodivých pletiv stonku odboují, do 6 vodní potenciál w (MPa) osmotický potenciál s (MPa) tlakový potenciál p (MPa) gravitaní potenciál g (MPa) -95, ,1-70, ,1-6, ,1-0,8-0,5-0,4 0,1-0,8-1,1 0,2 0,1-0,8-0,1-0, ,6-0,1-0,5 0 pda v blízkosti koen -0,5-0,1-0,4 0 pda 10 cm pod povrchem 1 cm od koene -0,3-0,1-0,2 0

7 vtví a list. V epeli listu se cévní svazek vtví a vytváí hustou, morfologicky druhov specifickou, sí tenkých cévních svazk listovou žilnatinu. Zárove je voda z xylému vedena také radiáln živými pletivy do bunk stonku, list a dalších orgán. Na vnjším i vnitním povrchu nadzemní ásti rostliny voda mní skupenství kapalné v plynné a ve form vodní páry pechází do atmosféry (obr. 2). Stny bunk xylému jsou zpevnny ligninem. Lignin po celulóze druhá nejrozšíenjší organická látka na naší planet, je amorfní, vtvený heteropolymer, jehož základními stavebními jednotkami jsou vícesytné aromatické alkoholy. Lignin se mže ukládat do všech vrstev bunné stny tj. do stední lamely, primární i sekundární bunné stny. Ukládání ligninu (lignifikace) omezuje transport látek bunnou stnou a výrazn zvyšuje pevnost bunné stny. Tvoí se nejen v xylému ale i v jiných pletivech (nap. ve sklerenchymu). Živá pletiva mají obecn daleko nižší hydraulickou vodivost než specializované transportní elementy xylému a voda je v nich transportována pouze na krátké vzdálenosti. V živých pletivech je voda vedena apoplastem, tj. bunnými stnami a mezibunnými prostory, nebo bukami. Transport cévními Obr. 2 Hlavní hnací síly transportu vody v kontinuu pda, rostlina, atmosféra (pevzato z Taiz a Zeiger 2002, upraveno) elementy xylému je transport apoplastem.bunná cesta zahrnuje symplast a transmembránový transport. Symplast je cytoplazmatické kontinuum, vzniká neúplným 7

8 oddlením protoplast pi dlení bunk, které spolu zstávají propojeny specifickými strukturami plazmodezmy. Pi transmembránovém transportu voda opakovan pechází pes membrány, z protoplastu do apoplastu a z apoplastu do protoplastu jiné buky. Voda pekonává membrány (nejen plazmalemu a tonoplast ale i membránu endoplazmatického retikula) vysoce specifickými transportními kanály, které se nazývají akvaporiny (obr. 3). Mezofylové buky a také nkteré parenchymatické buky stonku, jsou vtší nebo menší ástí svého povrchu v kontaktu s plynnou fází, která vypluje mezibunné prostory. Na tomto vnitním fázovém rozhraní a na vnjším povrchu bunk pokožky voda pechází do plynné fáze a difunduje do atmosféry.tím se rostlina ochlazuje. Z vnitního povrchu rostliny vodní pára difunduje mezibunnými prostory do podprduchových dutin a odtud prduchovými štrbinami pes hraniní vrstvu nehybného vzduchu do atmosféry. Voda vydaná touto cestou se nazývá transpirace stomatární. Z vnjšího povrchu epidermálních bunk voda difunduje do atmosféry pes kutikulu a hraniní vrstvu nehybného vzduchu. Výdej vody touto cestou (tj. pes kutikulu) se nazývá transpirace kutikulární. Charakter kutikuly (složení a výška vrstvy) odpovídá druhu rostliny a dlouhodobým vlhkostním pomrm na stanovišti. Transpirace, vstup vody do protoplast bunk živých pletiv a koenový vztlak jsou hlavní initelé psobící pohyb vody v rostlin. Transpirace (kutikulární i stomatární) se charakterizuje její rychlostí a vyjaduje se jako množství vody (mol, g nebo l), které se vypaí z jednotkové listové plochy (m 2 ) za jednotku asu (s). Rychlost transpirace je díky prduchm promnlivá, závisí na mnoha komplexn psobících vnjších i vnitních faktorech. Patí mezi n pedevším dostupnost vody v pd, poteba a dostupnost CO 2 pro fotosyntézu, teplota, vlhkost a proudní vzduchu v atmosfée. Otvírání a zavírání prduch je proces velmi komplexní, který v sob psobení tchto faktor integruje. Faktory psobí rznými signálními cestami, významnou úlohu hraje fytohormon kyselina abscisová. Prduchová štrbina, hlavní cesta, kterou voda opouští rostlinu je souasn hlavní cestou pro vstup CO 2 z prostedí do rostliny (obr. 4). Dostupnost CO 2 8 Obr.3 Akvaporiny (pevzato z Taiz a Zeiger 2002)

9 z prostedí je rozhodující pro istou fotosyntézu (P N ) a tedy rst rostliny. Rostlina udržuje optimální pomry mezi ztrátou vody, dostupností CO 2 a regulací teploty neustále a velmi dynamicky. Stav prduch je charakterizován jejich vodivostí neboli konduktancí, která udává, kolik vody nebo CO 2 (v mmolech) projde jednotkovou plochou prduchové štrbiny (m 2 ) za jednotku asu (s). Vyjaduje se nejastji v mmolech H 2 O. m -2 prduchové štrbiny. s -1. Obr. 4 Schéma pohybu vody a CO 2 mezi listem a atmosférou (pevzato z Taiz a Zeiger 2002) Literatura: Buchanan, B., Gruissem, W. and Jones, R. (Eds.) - Biochemistry and Molecular Biology of Plants. American Society of Plant Physiologist Nmec B., Prát S., Koínek J. Uebnice anatomie a fyziologie rostlin. LKN Praha Nobel P.S. Physicochemical and Environmental Plant Physiology. Academic Press, Inc. San Diego, California Procházka a kol. Fyziologie rostlin. Academia Praha 1998 (kapitola Vodní provoz, autor J. Šantrek) Smith G.M. et al. Textbook of General Botany. The Macmillan Comp. New York, Taiz, L. and Zeiger, E. Plant Physiology. Sinauer Associates, Inc., Publichers

10 Zadání praktických úloh k tématu: VODNÍ REŽIM Pehled úloh k vypracování: Úkol 1: Transport vody v rostlin 1a) Pomocí barevných inkoust modelujte transport vody cévními svazky rostliny, sledujte asový prbh a lokalizaci transportu. 1b) Zhotovte píné ezy stonkem a apíkem, na mikroskopických preparátech pozorujte vodivá pletiva, detekujte lignin 10

11 Úkol 1: Transport vody v rostlin Cíl: Kudy se voda v rostlin pohybuje a pro? Hypotéza, kterou bhem práce ovíme: Voda se pohybuje prostednictvím vodivých pletiv. Hnací silou je transpirace list. Dílí úlohy: 1a) Pomocí barevných inkoust modelujte transport vody cévními svazky rostliny, sledujte asový prbh a lokalizaci transportu 1b) Zhotovte píné ezy stonkem a apíkem, na mikroskopických preparátech pozorujte vodivá pletiva, detekujte lignin Úloha 1a: Pomocí barevných inkoust modelujte transport vody cévními svazky rostliny, sledujte asový prbh a lokalizaci transportu Princip: Voda a v ní rozpuštné látky je vedena ze substrátu bukami primární kry koene až do devní ásti cévních svazk, odkud je vedena cévami do stonku a odtud dále do list a ostatních ástí rostliny. Prokážeme to, dáme-li rostlinu do vody obarvené vhodným barvivem a necháme ji transpirovat. Budeme moci sledovat postupný transport barviva stonkem vzhru nejen zvení, ale na píných runích ezech i ovíme, jakým pletivem transport probíhá. Detekce ligninu v bunných stnách cév nám pomže lépe lokalizovat vodivá pletiva, kterými transport probíhá. Lignin lze detekovat reakcí s polyfenoly, nap. s floroglucinolem v prostedí silných kyselin. Výsledkem je ervené zbarvení. Laboratorní postup: Poteby pro úlohu 1a: rukavice pláš žiletka štteek podélná nádoba s vodou 2 zkumavky s rovným zakonením stn u ústí stojan na zkumavky inkoust (2 barvy) 11

12 stojan svorky lampika podložní a krycí sklíko Pasteurova pipeta mikroskop Provedení úlohy 1a: 1. Do stojanu umístte zkumavky tak, aby se jejich ústí dotýkala. 2. Do každé zkumavky nalijte inkoust jedné barvy. Barvu je možné nepatrn zedit vodou. 3. Rostlinu v kvtinái uíznte žiletkou cca 5cm nad zemí a co nejrychleji ji peneste do podélné nádoby s vodou tak, aby byla ponoena ezná plocha. 4. Nyní pracujte pod vodní hladinou! Vete minimáln 5cm dlouhý ez Husáková) stedem stonku (rovnobžn s povrchem). O orientaci žiletky se porate s vedoucím cviení. 5. Každou polovinu stonku vložte do jedné kádinky a rostlinu pipevnte svorkou ke stojanu. 6. Nad rostlinu pipevnte lampiku. Takto nechte rostlinu 60 minut. Uspoádání experimentu ukazuje obr Sledujte pohyb barviva prýtem a slovn okomentujte rychlost pohybu (za jak dlouho se zbarvily jednotlivé ásti rostliny od poátku mení?). Obr. 1: Umístní rostliny v nádobkách s inkoustem (foto: E. Úloha 1b: Zhotovte píné ezy stonkem a apíkem, na mikroskopických preparátech pozorujte vodivá pletiva, detekujte lignin Poteby pro úlohu 1b: mikroskop podložní a krycí sklíka žiletka jehla koen mrkve nebo bezová duše hodinové sklíko štteek roztok HCl-floroglucinolu (Wiesnerovo inidlo; 1% floroglucinol v 12% HCl) roztok okyseleného glycerolu (50% glycerol + konc. H 2 SO 4 v pomru 10:1) 12

13 Provedení úlohy 1b: 1. P ed uplynutím doby pokusu si vezm te kontrolní neobarvenou rostlinu a prove te p í né ru ní ezy. Ty Vám budou sloužit jako kontrolní p i porovnání s obarvenými ezy. ve te v míst internodia stonkového nodu a stonku, ezy v míst apíkem listu (viz. obr. 2A,B,C). 2. ezy okamžit A B C Obr. 2: Schéma umíst ní p í ných ez (foto: E. Husáková) št te kem p enášejte do kapky HCl-floroglucinolu na hodinovém sklí ku (aby nezaschly). Barvit asi 5 minut, poté ezy št te kem p eneste na podložní sklí ko do kapky okyseleného glycerolu (montovací médium) a opatrn p ikryjte krycím sklí kem. Nadbyte né montovací médium odsajte buni itou vatou - dbejte, abyste nem li krycí sklí ko svrchu pot ísn né, hrozí nebezpe í poškození objektiv mikroskopu kyselinou. 3. Preparát pozorujte v mikroskopu. T eš ov ervené zabarvení ukazuje na p ítomnost ligninu v bun ných st nách. Do protokol zhotovte jednoduchý nákres. Popište jaká pletiva se obarvila. 4. Stejným zp sobem zpracujte rostlinu obarvenou inkousty. Po uplynutí doby pokusu vyjm te rostlinu z barvícího roztoku a p í n ji roz ízn te na stejných místech jako rostlinu kontrolní. 5. V tomto p ípad ezy nebarv te floroglucinolem, pouze je prohlédn te pod mikroskopem. 6. Zakreslete anatomickou stavbu ezu v jedné vybrané ásti rostliny a popište jednotlivé ásti (epidermis, primární k ra, parenchym, sklerenchym, cévní svazky, floém, xylém). Zapište, která ást pletiv se obarvila a srovnejte ji s neobarvenými (kontrolními) ezy. Nezapome te uvést celkové zv tšení mikroskopu. 13

14 Vyhodnocení experimentu: Vypracujte protokol, do kterého podrobn popíšete pohyb barviva rostlinou (vetn asového prbhu). Zakreslete ez vybrané ásti kontrolní a obarvené rostliny. Na obrázku naznate místa uložení ligninu u kontrolní rostliny. U rostliny inkubované v barevných inkoustech zakreslete distribuci barvy na ezu. Nákres slovn okomentuje (uvete, v jakých ástech vodivých pletiv se barvivo nachází a pro). Zkuste formulovat odpovdi na následující otázky. Jakým smrem se voda pohybovala a pro? Co by se stalo, pokud by podélný ez bází stonku nebyl proveden pod vodní hladinou? Došlo ke smísení barevných inkoust? 14