Charakterizace proteomu piva

Transkript

1 MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Katedra biochemie Charakterizace proteomu piva Brno 2009 Eva Kotlasová

2 Chtěla bych poděkovat vedoucímu své bakalářské práce RNDr. Z. Zdráhalovi, Dr. za pomoc a čas, který mi věnoval a RNDr. H. Konečné za cenné rady a pomoc při vypracování experimentální části. Mé díky patří také všem ostatním členům Oddělení funkční genomiky a proteomiky ÚEB. 2

3 Prohlašuji, že jsem tuto bakalářskou práci vypracovala samostatně pouze za použití uvedené literatury a experimentálních výsledků získaných v Oddělení funkční genomiky a proteomiky Ústavu experimentální biologie. Datum Eva Kotlasová 3

4 Obsah 1 Úvod Pivo Suroviny pro výrobu piva Voda Slad Chmel Kvasnice Proces výroby piva Výroba sladu Vaření piva Proteomika Proteomická analýza Separace a izolace proteinů D elektroforéza Získávání strukturních informací o proteinu Edmanovo odbourávání Hmotnostní spektrometrie (MS) Ionizace vzorku Hmotnostní analyzátory Identifikace a charakterizace proteinu

5 4 Experimentální část Použité chemikálie Přístrojové vybavení Použité vzorky Stanovení koncentrace proteinů Izoelektrická fokusace Příprava vzorku pro IEF Průběh izoelektrické fokusace SDS-PAGE Příprava gelu Vlastní elektroforéza Barvení proteinů a analýza obrazu Proteolytické štěpení proteinu Digesce v gelu MS detekce Zpracování dat Výsledky a diskuse Závěr Seznam zkratek Použitá literatura

6 1 Úvod Proteomika je vědní obor zabývající se studiem proteomu, který vyjadřuje soubor všech proteinů obsažených v organismu, tkáni nebo biologické tekutině. Jedním z hlavních cílů proteomiky je vytvoření proteinové mapy a identifikace jednotlivých proteinů v databázích. Pivo jakožto jeden z nejhojněji vyhledávaných nízkoalkoholických nápojů v České republice, ale i v celé Evropě obsahuje proteiny, které mají vliv na mnoho jeho vlastností, např. typické aroma piva, jeho chuť, ale i stabilita pivní pěny. Proteiny v pivu musí být odolné vůči zvýšeným teplotám, extrémním hodnotám ph a proteolýze vzhledem ke způsobu jeho přípravy. Cílem práce bylo pomocí 2-D elektroforézy a hmotnostní spektrometrie porovnat proteinové složení vzorků dvou různých značek piv (tuzemského a zahraničního). 6

7 2 Pivo Pivo je kvašený slabě alkoholický nápoj s antioxidačními vlastnostmi. Jeho roční produkce v České republice je 18 miliónů hektolitrů a roční spotřeba na osobu činí asi 160 litrů. Jeho hlavními složkami jsou voda, slad, chmel a pivovarské kvasnice. Jedná se o koloidní roztok obsahující velké množství různých makromolekul, jako jsou proteiny, nukleové kyseliny, sacharidy a lipidy. Chemické složení piva se mění v závislosti na způsobu výroby a na kvalitě a charakteru použitých surovin. [1] Obsahuje 2-6% extraktivních látek z čehož 6-9% tvoří dusíkaté sloučeniny. Dalšími chemickými složkami piva jsou anorganické sloučeniny, vitaminy, organické kyseliny, polyfenolové látky, hořké látky z chmele, oxid uhličitý a sekundární produkty fermentace (např. glycerol). [3] 2.1 Suroviny pro výrobu piva Voda Voda je jednou z nejdůležitějších surovin pro výrobu piva, protože ovlivňuje jeho kvalitu, je tudíž důležité použití vody se správnými kvalitativními parametry. Nejdůležitějšími parametry jsou obsah solí, tvrdost vody a v neposlední řadě i ph. [1] Slad Slad je produktem máčení, klíčení a sušení obilných zrn v pivovarnictví zejména ječmene. Kvalitní zrna ječmene mají zlatavou barvu a nízký obsah vody. Slad má vliv na barvu, chuť i aroma piva. Je uchováván v betonových silech. Rozlišujeme dva druhy sladu: světlý a tmavý lišící se teplotou sušení obilek. Světlý slad vzniká za nízkých a tmavý za vysokých teplot. [1, 4] Chmel Chmel dodává pivu typickou nahořklou chuť a chmelové aroma. Vlastnosti chmele jsou odvozeny od chemického složení, oblasti produkce a způsobu posklizňových úprav. Pro výrobu piva se používají převážně samičí chmelové květy, které mají podobu hustých svazečků, které se během dozrávání mění v šištice jasně žlutavého zbarvení. [1] Chmel obsahuje vlákninu, minerální a dusíkaté látky, živice a chmelové silice. 7

8 2.1.4 Kvasnice Pro pivovarské účely se nejčastěji používá kmen kvasinek Saccharomyces cerevisce. Rozdělují se na dvě základní skupiny, kmeny spodního a svrchního kvašení. Spodní kvašení (nejčastěji používané pro výrobu piva v Evropě) probíhá po dobu 7 dnů při teplotách cca 10 C (etanolová tolerance nemusí být vysoká), kvasinky jsou po skončení kvašení sedimentovány. Svrchní kvašení probíhá kratší dobu při teplotě 20 C a na konci jsou vynášeny na povrch tekutiny. [1] Kvasinky se vyrábějí laboratorně izolací jedné buňky, což zajistí geneticky čisté potomstvo. Následně jsou přidávány do mladiny. Podmínkou pro kvašení je přístup k živinám a růstovým faktorům. Komerčně připravené kvasnice obsahují dusíkaté a minerální látky, sacharidy a lipidy, některé biologicky aktivní látky jako enzymy, růstové faktory a vitaminy. 2.2 Proces výroby piva Výroba sladu Výroba sladu je časově náročný proces, po kterém následuje přímá výroba piva. Prvním krokem při výrobě je zvážení, očištění a roztřídění zrn ječmenu. Očištěná zrna o velikosti 2,2 mm a více se nejméně na šest týdnů uskladní v silech, aby došlo k odbourání látek, které brání klíčení. Takto odleželý ječmen se v druhém kroku máčí v namáčecích náduvnících po dobu dvou dnů. Z důvodu dostatečného přísunu vody dochází k naklíčení zrn. Voda v náduvnících je měněna každé dvě hodiny, aby se zabránilo zahnívání. Ve třetím kroku získáme tzv. zelený slad, který vzniká 5-7 dní klíčením zrn uložených asi v 80 cm vysokých vrstvách při teplotě 14 C. Zrna musí být pravidelně dvakrát denně promíchávána, aby byl zajištěn přístup vzduchu a zabránilo se srůstání klíčků. Zelený slad je dopraven na hvozd (sušárna s provzdušňovacím zařízením), kde dochází k odstranění přebytečné vody a tím k ukončení klíčení. Sušení začíná při poměrně nízkých teplotách (30-40 C), později se teplota zvyšuje a v konečné fázi, která trvá 3-4 hodiny je teplota sušení pro světlý slad 80 C a pro slad tmavý až 105 C. Tento krok výroby sladu se nazývá hvozdění. Pro vznik konečného sladu je třeba odstranění přebytečných klíčků, ochlazení a přenesení do sil, kde se nechává po dobu šesti týdnů odležet před vlastním zpracováním. [2] 8

9 2.2.2 Vaření piva Odleželý slad se zbaví nečistot a dokonale se promíchá s vystírací vodou za vzniku rmutu. Rmut je postupně zahříván na teploty optimální pro působení enzymů (52, 63 a 75 C). Dojde k rozložení škrobů a proteinů na jednoduché cukry a polypeptidy. Tyto procesy trvají asi 4 hodiny a probíhají ve rmutovystírací pánvi za neustálého míchání. Vzniklá sladina je filtrována na sladinovém filtru. Zbylé nerozpuštěné látky (mláto) tvoří odpad. Chmelovar, proces, při kterém se sladina vaří s chmelovými preparáty, probíhá v nerezové nádobě vyhřívané parou s teploměrnými plochami. V tomto procesu dochází převedení hořkých látek do roztoku a ke zkoncentrování roztoku odpařením vody. Vzniklý produkt, mladina je v průběhu chlazení separována od hořkých kalů vniklých během varu. [2] Kvašení Ochlazená mladina je převedena do kvasných tanků. V průběhu plnění tanků je mladina provzdušňována a jsou do ní přidané pivovarské kvasnice. V procesu kvašení dochází ke vzniku oxidu uhličitého, alkoholu a uvolnění reakčního tepla čímž se mírně zvyšuje teplota. Ta musí být neustále snižována ochlazováním reakční nádoby proudem studené vody. Proces kvašení probíhá po dobu 5-7 dnů za teploty 11 C. Po ukončení kvašení se roztok (mladé pivo) zchladí na teplotu 5 C a je převeden do sudů v ležáckém sklepě. Sedimentované kvasinky se properou vodou a vrátí do výroby. [2] Dokvašování Dokvašování probíhá v sudech v ležáckém sklepě. Sudy jsou chlazeny vzduchem na teplotu 0-1 C. Kvasinky kvasí i při těchto nízkých teplotách a vzniklý oxid uhličitý se váže na proteinové složky piva. Kalící částice klesají na dna sudů, a tím se pivo čeří. Tento proces trvá tři týdny. Po dokvašování následuje filtrace, která má dva kroky. Nejprve je pivo filtrováno přes křemelinový filtr, aby byly odstraněny kvasnice a následně přes stabilizační filtr, který prodlužuje trvanlivost piva. Na závěr se pivo ředí na požadovanou stupňovitost a dosycuje oxidem uhličitým na požadované hodnoty. [2] Stáčení piva Hotové pivo je stáčeno do přepravních sudů, láhví nebo plechovek. 9

10 3 Proteomika Vývoj proteomiky je přímým důsledkem rozsáhlého sekvencování genomové DNA. Bez informace o genomu by nemohly být proteiny jednoduše identifikovány pomocí databázového prohledávání. Běžná identifikace proteinů se totiž spoléhá na přítomnost odpovídající sekvence v některé z dostupných databází. Pouze studiem samotného genomu ale nelze získat kompletní informaci,protože cestaod genů k funkčním proteinům, které zajišťují buněčné procesy, není přímočará. Takto nemohou být objasněny tyto procesy, mechanismy onemocnění, stárnutí či účinky vnějšího prostředí na organismus pouhou analýzou DNA sekvence. Proto je nutné studovat proteom. [5] Výzkum proteomu zahrnuje snahu o identifikaci proteinů produkovaných určitou buňkou, tkání nebo organismem, definici vzájemných interakcí těchto proteinů nezbytných pro určitou biologickou funkci a stanovení přesné trojrozměrné struktury proteinů klíčové pro identifikaci nízkomolekulárních ligandů (například látek, které mohou sloužit jako potencionální léčiva). [5] Expresní proteomika studuje expresi proteinů u vzorků lišících se nějakou proměnnou. Tímto přístupem mohou být srovnávány exprese proteinu, celého proteomu nebo subproteomu mezi vzorky. Funkční proteomika charakterizuje soubor proteinů na základě jejich společné funkce. Pokouší se identifikovat všechny proteinyuvnitř proteinového komplexu a charakterizuje veškeré vzájemné interakce proteinu. Klinická proteomika se pomocí analýzy bílkovinného spektra vzorků (např. moč, sliny, krev) pokouší odhalit nové markery, které by v budoucnosti mohly pomoci při včasné detekci a léčbě konkrétního onemocnění. [5] 3.1 Proteomická analýza Separace a izolace proteinů Jednou z hlavních technik pro separaci proteinů je polyakrylamidová gelová elektroforéza, která zůstává základní součástí proteomiky i přes to, že je manuálně a časově velmi náročná a nelze ji snadno automatizovat. [5] Pro mnoho proteomických aplikací se volí metoda 1-D elektroforéza, ve které jsou proteiny separovány na základě relativní molekulové hmotnosti. Protože jsou proteiny solubilizovány v dodecylsulfátu sodném (SDS), nebývá rozpustnost ve většině případů 10

11 problém. Navíc se dá 1-D elektroforéza snadno reprodukovat a může být běžně užívána pro stanovení proteinů s molekulovými hmotnostmi od 10 do 300 kda. Pro komplexnější směsi proteinů se obvykle používá 2-D elektroforéza. Ve 2-D elektroforéze jsou proteiny separovány podle izoelektrického bodu (pi) v první dimenzi a podle relativní molekulové hmotnosti v dimenzi druhé. Výhodou 2-D elektroforézy je schopnost separovat proteiny, ve kterých se vyskytla nějaká varianta posttranslační modifikace. Mnohé modifikace proteinu jsou totiž rozdílné v pi i v molekulové hmotnosti. Primární aplikací 2-D elektroforézy je stále profilování exprese proteinu. V tomto přístupu může být kvalitativně i kvantitativně srovnáváno několik vzorků. Objevení nebo ztráta skvrn na gelu, může poskytnout informaci o rozdílné expresi proteinu, zatímco intenzita těchto skvrn poskytuje kvantitativní informaci o úrovni exprese proteinu. [5, 6] Další aplikací 2-D elektroforézy je proteomické mapování buňky. Tato metoda je používaná pro mapování proteinů z mikroorganismů, buněčných organel a proteinových komplexů. Může být také použita k separaci a charakterizaci proteinů v subproteomu, který byl získaný určitou purifikací proteomu. To že na jednom 2-D gelu můžeme separovat tisíce proteinů, zůstává významným nástrojem ke katalogizaci. Bylo vytvořeno mnoho 2-D elektroforetických databází, které jsou dostupné na webu. Jako alternativa k separaci proteinů pomocí elektroforézy, se v současné době stále více používají metody jako kapalinová chromatografie, kapilární elektroforéza či kombinace technik s gelovou elektroforézou D elektroforéza Příprava vzorku Tento krok je klíčový, protože může ovlivňovat výsledný obraz proteinové mapy. Jde především o solubilizaci a disagregaci proteinů. Solubilizace (převedení do rozpustného stavu) je dosahováno lyzačním pufrem, který obvykle obsahuje směs chaotropních činidel, detergentů, redukčních činidel, pufrů a amfolytů. Žádné z činidel nesmí ovlivňovat izoelektrickou fokusaci IEF (nesmí zvyšovat iontovou sílu roztoku). [6, 7] Chaotropní činidla především močovina popřípadě ve směsi s thiomočovinou způsobují rozrušení vodíkových můstků a hydrofobních interakcí. Takto zabraňují vzniku nežádoucích struktur, které ovlivňují mobilitu proteinu. 11

12 Detergenty rozrušují hydrofobní interakce a minimalizují agregaci proteinů. Detergenty musí mít nulový náboj, a proto se používají neiontové nebo zwitteriontové jako je CHAPS, Triton X-100 nebo NP-40 obvykle používané v koncentraci 0,5-4%. Redukční činidla, z nichž nejběžnější jsou DTT (dithiotreitol) nebo TBP (tributylfosfin) štěpí disulfidické můstky a tím uvolňují jednotlivé složky proteinů. Amfolyty umožňují separovat větší množství vzorku. Mohou zabraňovat precipitaci vzorku, ke které může docházet po dosažení ph odpovídajícímu jejich izoelektrickému bodu. Barvivo (bromfenolová modř) umožňuje monitorovat průběh IEF. Při správném průběhu IEF putuje barvivo k anodě. [14] Izoelektrická fokusace První rozměr 2-D separace zahrnuje dva kroky. Nejprve je nutné nanést vzorek na strip tj. rehydratovat IPG strip (proužek s imobilizovaným ph gradientem). Rehydratace může být pasivní za přítomnosti vzorku, aktivní (přímo na fokusátoru) za přítomnosti vzorku nebo cup loading po rehydrataci stripu. [7] Druhým krokem je samotná izoelektrická fokusace, při které jsou proteiny separovány podle svého izoelektrického bodu (pi). Proteiny migrují v elektrickém poli k oblasti ph, které je shodné s jejich pi, ztrácí náboj a na tomto místě se zakoncentrovávají. Obr 1: Aparatura pro IEF [12] SDS-PAGE Druhým krokem je polyakrylamidová gelová elektroforéza za přítomnosti dodecylsulfátu sodného, ve které jsou proteiny separovány podle svých relativních molekulových hmotností (MW). IPG stripy jsou nejprve ekvilibrovány v SDS pufru a poté naneseny na gel a zality agarózou, čímž je zajištěno spojení stripu s gelem. Obvykle se 12

13 používají gely o koncentraci 7,5-15% akrylamidu nebo gradientové s obsahem SDS, který uděluje proteinům identickou hustotu náboje (náboj vztažený na jednotku jejich relativní molekulové hmotnosti), takže jsou separovány podle svých velikostí a ne podle náboje. [5, 6] Vizualizace a analýza obrazu Po proběhnutí SDS-PAGE je potřeba proteiny v gelu zafixovat. Tento krok těsně předchází obarvení. Jednou z nejběžněji používaných metod je barvení Coomassie Brilliant Blue G-250 nebo R-250, které je kvantitativní a kompatibilní s hmotnostní spektrometrií. Citlivější metodou barvení je barvení stříbrem, které ovšem není plně kvantitativní, vzhledem k úzkému lineárnímu koncentračnímu rozsahu. Fluorescenční barviva typu SyproRuby, která spojují výhody barvení stříbrem i Coomassie Brilliant Blue, jsou kvantitativní, velmi citlivá a kompatibilní s hmotnostní spektrometrií. Jejich nevýhodou je vysoká cena a dostupnost fluorescenčního detekčního zařízení. [5] Takto obarvené gely jsou nasnímány pomocí denzitometrů a obraz je převeden do digitální podoby. Analýza obrazu je prováděna pomocí speciálních počítačových programů, které jsou schopny srovnávat široké spektrum gelů. Pomocí softwaru porovnáváme pozici a intenzitu skvrn, která je přímo úměrná množství proteinu. Takto získaná data vypovídají o relativní molekulové hmotnosti a isoelektrickém bodu každé skvrny a poskytují základní informaci důležitou pro další analýzu. [7] Obr 2: Zleva gel barvený stříbrem, Coomassie Brilliant Blue a Sypro Ruby [12] Získávání strukturních informací o proteinu Edmanovo odbourávání Edmanovo odbourávání spočívá v odbourávání aminokyselin z N-konce molekuly proteinu, které umožňuje identifikovat odbourané aminokyseliny pomocí HPLC-UV a zjišťovat tak jejich sekvenci v molekule proteinu. Je to jedna z nejdříve používaných metod 13

14 k určení primární struktury proteinů. Edmanovo odbourávání je používané k získání N- terminálních sekvencí proteinu k určení jeho pravého začátku. Ačkoliv se od použití Edmanova odbourávání v proteomice ustupuje, stále je to velmi užitečná alternativa k MS. Nevýhodou je blokace N-terminálních konců. [5] Hmotnostní spektrometrie (MS) Hmotnostní spektrometrie je fyzikálně-chemická metoda, která stanovuje hmotnosti atomů, molekul a molekulových fragmentů, které byli převedeny na ionty. MS vypovídá o primární struktuře analyzované látky, odhaluje post translační modifikace proteinů a může určit, kde k modifikaci došlo. Umožňuje analýzu komplexních směsí a odhaluje mutace a chyby v DNA sekvencích. [9] Hmotnostně spektrometrická analýza může být rozdělena do tří kroků: Ionizace vzorku; Separace iontů; Detekce iontů. Obr 3: Schéma hmotnostního spektrometru [13 upraveno] Ionizace vzorku Pro MS analýzu biologických vzorků musí být molekuly nabité a suché. Toho je dosaženo převedením analytu na ionty a jejich desolvatací. Dvě nejběžněji používané metodiky jsou ionizace elektrosprejem (ESI) a ionizace laserem za přítomnosti matrice (matrix-assisted laser desorption/ionization - MALDI). V obou metodikách jsou peptidy převedeny na ionty přidáním nebo odevzdáním jednoho nebo více protonů. ESI a MALDI 14

15 jsou jemné ionizační techniky, které umožňují vytváření iontů bez významné ztráty integrity vzorku. To je důležité, protože to umožňuje získat přesnou informaci o molekulové hmotnosti proteinů a peptidů. [9] Ionizace elektrosprejem V ESI kapalný vzorek vstupuje do kapiláry iontového zdroje hmotnostního spektrometru, kde má rozdíl potenciálů mezi touto kapilárou a vstupním otvorem do vakuové části hmotnostního spektrometru za následek generování mlhy nabitých kapének. Jak se rozpouštědlo vypařuje, velikost kapének se snižuje a to má za následek tvorbu desolvatovaných iontů. Díky skutečnosti, že vlastní ionizace probíhá za atmosférického tlaku je tato ionizační technika vhodná pro on-line spojení MS a separačních technik jako je kapalinová chromatografie či kapalinová elektroforéza. Obr 4: Zdroj ESI [13 upraveno] Ionizace laserem za přítomnosti matrice Na rozdíl od ionizace elektrosprejem, je analyt při MALDI v pevném stavu, kokrystalizován s nadbytkem matrice na povrchu vzorkovací destičky. Matrice je typicky malá energii poutající molekula jako např. kyselina 2,5 dihydroxybenzoová (v případě použití UV laseru). K vlastní ionizaci pak dochází krátkým pulzem laseru, při kterém dochází jednak k vytržení molekul matrice a vzorku z povrchu a k dodání energie k ionizaci. Dodanou 15

16 energii převážně pojme matrice, takže nedochází k nekontrolované degradaci analytu. Výsledkem je tvorba zejména jednonásobně nabitých molekulových iontů analytu. Výhodou techniky je jednak rychlost analýzy, snadná automatizace a možnost archivace resp. opakovaná analýza vzorků. Obr 5: MALDI ionizace [13 upraveno] Hmotnostní analyzátory Druhým krokem MS analýzy je separace vzniklých iontů podle jejich m/z (poměru hmotnosti ku náboji). K tomuto účelu jsou v současné době k dispozici různé typy hmotnostních analyzátorů. Pro analýzy peptidů/proteinů jsou nejčastěji používány kvadrupólový analyzátor, průletový analyzátor nebo iontová past, případně jejich kombinace. V současné době se také stále více uplatňují vysokorozlišovací analyzátory založené na principu iontové cyklotronové rezonance a hmotnostní analyzátor orbitrap. [9] Kvadrupólový hmotnostní analyzátor Jeden z nejběžnějších hmotnostních analyzátorů. Ionty jsou přeneseny skrz elektrické pole vytvořené sadou čtyř paralelních kovových tyček (kvadrupól). Kvadrupól pracuje jako hmotnostní filtr, tedy v daný okamžik propustí pouze ionty o určitém m/z. Kvadrupól může pracovat jednak v tzv. sken modu, kdy změnou napětí vložených na tyče postupně propouští na detektor ionty se vzrůstajícím m/z v daném rozmezí m/z, výsledkem je hmotnostní spektrumanalyzované látky nebo může být nastaven pouze na určitou hodnotu m/z (tzv. SIM 16

17 mod, single ion monitoring), tento mod je vhodný především pro kvantifikaci látek. Jednoduchý kvadrupól neumožňuje kontrolovanou fragmentaci látek (MS/MS), avšak jsou-li kvadrupóly kombinovány mohou být použity k získání informací o sekvenci aminokyselin. Obr 6: Schéma kvadrupólového analyzátoru [13 upraveno] Průletový analyzátor (Time of flight TOF) Jedním z nejjednodušších hmotnostních analyzátorů je TOF měřící dobu letu iontů. Stanovuje poměr m/z iontů měřením času požadovaného pro překročení délky letové trubice. Některé TOF hmotnostní analyzátory odrážejí ionty zpět skrz letovou trubici k detektoru pomocí reflektronu. Tímto způsobem dochází ke zvětšení délky letové trubice. Odraz také opravuje malé rozdíly v kinetické energii mezi ionty. Oba tyto faktory přispívají ke zvýšení hmotnostního rozlišení. Obr 7: Schéma hmotnostního spektrometru TOF [13 upraveno] 17

18 Iontová past Tyto hmotnostní analyzátory zachycují ionty v cele iontové pasti kombinací radiofrekvenčního a dalších elektrických polí. Tento hmotnostní analyzátor je schopen nechat ionty uložené a potom je selektivně vypudit dle jejich m/z z iontové pasti detektor MS mod. Iontové pasti umožňují vícenásobnou MS/MS analýzu, kdy iontová past je schhopna izolovat ionty o určitém m/z, tyto ionty následně kontrolovaně fragmentovat, obvykle kolizně indukovanou disociací a vzniklé fragmenty nesoucí strukturní informaci postupně vypudit dle jejich m/z na detektor (MS/MS spektrum) Identifikace a charakterizace proteinu Analýza proteinů pomocí MS může být rozdělena na dvě kategorie: Vlastní hmotnostně spektrometrická analýza peptidů a vyhodnocení získaných MS dat. Nejčastěji používané přístupy identifikace proteinů jsou založeny na hmotnostně spektrometrické analýze enzymaticky naštěpených peptidů. K vlastní identifikaci je buď použit soubor molekulových hmotností peptidů vzniklých výše uvedeným štěpením, nebo jsou peptidy dále fragmentovány tandemové hmotnostní spektrometrie (MS/MS) a identifikace se opírá o soubory fragmentů jednotlivých peptidů. MS/MS dat lze využít i k charakterizaci peptidů resp. proteinů s neznámou sekvencí. Fragmentace peptidu v MS/MS Peptidy jako polymer složený z aminokyselin spojených peptidovými vazbami, které tvoří nejslabší místa, jsou nejčastěji fragmentovány pomocí kolizemi indukované disociace (CID). Takto vznikají série iontů, lišících se o jednu aminokyselinu, které lze využít k charakterizaci primární struktury peptidů. Při fragmentaci nejčastěji vznikají ionty série b a y. Jestliže po rozštěpení peptidu náboj zůstává na N-konci iontu, vzniká ion b série, zatímco když je náboj na C-konci vzniká ion série y. Rozdíl hmotnosti mezi sousedními y nebo b ionty odpovídá určité aminokyselině. To může být použito k identifikaci aminokyseliny a tak sekvence peptidu s výjimkou izoleucinu a leucinu, resp. lysinu a glutaminu, které jsou identické hmotností a proto běžnou MS/MS analýzou nerozeznatelné. Oba typy y a b iontů mohou také eliminovat amoniak, vodu a oxid uhelnatý což má za následek vznik dalších sérií iontů v hmotnostním spektru. [10] 18

19 Databázové prohledávání Cílem databázového hledání je rychle a přesně identifikovat velká množství proteinů. Úspěch databázového hledání závisí na kvalitě dat získaných hmotnostním spektrometrem, kvalitě databázového hledání a metodě použité pro prohledávání v proteinové databázi. Proteiny v MS mohou být identifikovány dvěma způsoby: Peptidové mapování (Peptide mass fingerprinting, peptide maping) Protein rozdělený nejčastěji 2-D elektroforézou je enzymaticky štěpen látkou která definovaně štěpí polypeptidový řetězec. Nejčastěji používaným enzymem je trypsin, který v mírně alkalickém prostředí specificky štěpí peptidové vazby na C-konci argininu a lysinu, pokud nenásleduje prolin. Takto naštěpený protein je poté podroben MS analýze, nejčastěji pomocí MALDI-TOF MS nebo LC-ESI MS. Výsledkem je spektrum peptidů (tzv. peptidová mapa), které je porovnáváno s databázemi proteinů. [7] Peptide fragment sequencing V tomto přístupu jsou proteiny štěpeny stejně jako v předchozím případě, ale jsou pak podrobeny kapalinové chromatografii na reverzní fázi, kde jsou rozděleny na základě jejich retence. Rozdělené peptidy vstupují do hmotnostního spektrometru, kde jsou peptidy a následně detekovány (MS/MS spektra). MS/MS data jednotlivých peptidů jsou pak porovnávána speciálními programy (např. Mascot) s proteinovými databázemi. [7] 19

20 4 Experimentální část Cílem experimentální části bylo porovnat vzorky dvou různých značek piv. Pomocí 2-D elektroforézy separovat a izolovat proteiny podle pi a relativní molekulové hmotnosti. Vizualizovat gely a porovnat proteinové zastoupení u obou značek piv. Rozdílné proteiny vyříznout a pomocí hmotnostní spektrometrie identifikovat jednotlivé proteiny. 4.1 Použité chemikálie Redestilovaná voda deionizovaná systémem MILLI-Q Reagent Watter System. Bradford Reagent (Coomassie brilliant blue G-250) (Sigma-Aldrich) urea (Sigma-Aldrich) thiourea (Sigma-Aldrich) CHAPS (Sigma-Aldrich) DTT dithiotreitol (Sigma-Aldrich) Amfolyt (Bio-Rad) BPB bromfenolová modř (Sigma-Aldrich) Tris Base (Serva) Akrylamid (Roth) SDS dodecylsulfát sodný (Sigma-Aldrich) APS persulfát amonný (Sigma-Aldrich) TEMED (Sigma-Aldrich) jodacetamidu (Sigma-Aldrich) Sypro Ruby (Invitrogen) kyselina octová (Lachner) metanol (Lachner) trypsin (Promega) acetonitril (Merck) 4.2 Přístrojové vybavení Vakuový koncentrátor SpeedVac Spektrofotometr SmartSpec TM Plus (Bio-Rad) ReadyStrip IPG strip ph 3 10NL, 17 cm (Bio-Rad) Zařízení na fokusaci Protean IEF Cell (Bio-Rad) Zařízení pro 2-D elektroforézu Protean II Cell (Bio-Rad) 20

21 termomixér (Eppendorf) hmotnostní spektrometr Ultraflex III (Bruker DaltoniK, Brémy, Německo) 4.3 Použité vzorky Pivo české výroby (pivo výčepní světlé) Pivo zahraniční výroby (ležák výčepní světlý) Pro analýzu bylo použito 20 ml z každého vzorku. 4.4 Stanovení koncentrace proteinů Ze vzorků piv byly pomocí vakua odstraněny plynné složky, zejména CO 2. V takto upraveném vzorku byla stanovena koncentrace proteinů metodou podle Bradfordové. Bylo smícháno 800µl vody s 200µl Bradford Reagent (Coomassie brilliant blue G-250) a 20µl vzorku. Po 15 minutách stání za laboratorní teploty byla změřena absorbance při vlnové délce 595nm proti slepému vzorku. Koncentrace proteinů byla získána z kalibrační křivky získané ředěním γ-globulinů. 4.5 Izoelektrická fokusace Příprava vzorku pro IEF Vzorky byly odsoleny pomocí odsolovacích kolon NAP-25 promytých 25ml vody. Pivo v nich bylo promyto 3,5ml deionizované vody a opět byla stanovena koncentrace proteinů. Poté byly vzorky vysoušeny ve SpeedVacu po dobu asi 3,5 hodin. Vysušené vzorky byly rozpuštěny v 600µl pufru IPG7 o složení: 7M urea 2M thiourea 2% CHAPS 60mM DTT (dithiotreitol) 0,8% amfolyt 0,003% BPB (bromfenolová modř) Takto připravené vzorky byly naneseny na nelineární IPG stripy 17cm dlouhé. Pasivní rehydratace probíhala přibližně 16 hodin, stripy byly zality minerálním olejem, aby se zabránilo odpařování vzorku. 21

22 4.5.2 Průběh izoelektrické fokusace Hydratované stripy byly přeneseny do fokusační vaničky (gelem k elektrodám), převrstveny minerálním olejem a celá vanička byla vložena do fokusátoru. Fokusace probíhala na fokusátoru Protean IEF Cell (Biorad), dle zvoleného programu PLAZMA 17 v pěti krocích. Krok Napětí (V) Čas S1/ minut S2/ hodiny S3/ hodiny S4/ VH S5/ hodin Tabulka 1: Průběh IEF Po ukončení fokusace byly stripy přeneseny do hydratační vaničky gelem vzhůru, zaparafinovány a zmraženy. 4.6 SDS-PAGE Příprava gelu Vertikální elektroforéza proběhla na aparatuře Protean II (Bio-Rad) v 15 % gelu za konstantního proudu. Rozměry gelu byly cm a tloušťce 1 mm. Pro přípravu gelu byly použity následující roztoky: d.d.voda 9,6 ml akrylamid 20,0 ml ressolving buffer 10,0 ml 10% SDS 400 µl 10% APS (čerstvý) 200 µl TEMED 20 µl Všechny složky byly dobře promíchány a gel byl aplikován mezi skla asi 0,5 cm pod okraj a převrstven 1 ml vodou syceného izobutanolu. Polymerace probíhala při laboratorní teplotě přibližně 45 minut. Poté byl odstraněn zbytek izobutanolu gel byl opláchnut vodou a uchován v lednici. 22

23 4.6.2 Vlastní elektroforéza Před zahájením elektroforézy byly gely i stripy ponechány asi 15 minut při pokojové teplotě. Následně musely být stripy ekvilibrovány v ekvilibračním pufru, nejprve s obsahem 2 % DTT a poté 2,5 % jodacetamidu. Takto připravené stripy byly naneseny na horní okraj gelu a zality 0,8 % agarosou. Po ztuhnutí agarosy byly gely podrobeny elektroforéze. Nejprve byla nastavena hodnota proudu na 15 ma/gel a poté co čelo vizualizované bromfenolovou modří doputovalo k separačnímu gelu, byla hodnota proudu zvýšena na 30 ma/gel. Poté co se čelo dostalo na konec separačního gelu, byla elektroforéza ukončena. V průběhu elektroforézy byly gely ochlazovány na 10 C aby nedocházelo k zahřívání gelů Joulovým teplem. Celkový čas elektroforézy byl přibližně pět hodin. 4.7 Barvení proteinů a analýza obrazu Gely byly po dokončení elektroforézy přeneseny do fixačního roztoku (7% kyselina octová a 10% metanol) a proteiny byly fixovány 2x 30 minut (200 ml roztoku). Následovalo barvení fluorescenčním barvivem Sypro Ruby přes noc (16 hodin). Poté proběhla opět fixace a takto připravené gely byly uchovány ve vodě. Skenování gelů proběhlo na denzitometru (FLA 5000, Fuji) a obrazy gelů byly převedeny do digitální podoby. A pomocí počítačového programu PDQuest byly tyto obrazy podrobeny image analýze. 4.8 Proteolytické štěpení proteinu Digesce v gelu Na gelech byly vybrány rozdílné spoty, označeny E1 - E16 a následně manuálně vyřezány na UV transluminátoru. Vybrané spoty jsou vyznačeny na obrázcích Obrázky 8 a 9 jsou skeny gelů vzorku domácího piva (G1, G2) a obrázky 10 a 11 zobrazují gely vzorku piva zahraničního (H1, H2). Před MS analýzou byly vybrané proteiny, resp. jejich spoty v gelu vyříznuty, odbarveny a štěpeny. Odbarvení bylo provedeno promýváním spotů na termomixeru roztocích uvedených v tabulce 2. 23

24 Před každým krokem byl odpipetován předchozí roztok. roztok V (µl) T ( C) t (min) Voda Voda Voda mM AB pufr + ACN (1:1) ACN Tabulka 2: Roztoky na promývání spotů na termomixeru Následující kroky probíhaly v sonikátoru. roztok V (µl) t (min) poznámka 50mM AB pufr 20 5 neodsávat ACN 20 5 stočit a odsát ACN 20 5 odsát Tabulka 3: Roztoky na promývání spotů v sonikátoru Poté byly odbarvené gely vysoušeny ve SpeedVacu po dobu 4 minut. Štěpení probíhalo pomocí trypsinu ředěného 25mM AB pufrem (1:9). Ke každému vysušenému spotu jsme přidali 25 µl tohoto roztoku trypsinu a inkubovali jsme při -20 C po dobu 45 minut. Poté následovalo proteolytické štěpení za stálého třepání na termomixeru po dobu 2 hodin při 40 C. Takto připravené vzorky byly předány na MS analýzu. 4.9 MS detekce Analýza MALDI-MS/MS byla provedena na hmotnostním spektrometru Ultraflex III. Jako matrice byla použita CHCA připravená podle Havlise (Havlis et al., 2003). Vzorky byly naneseny na vzorkovací destičku (1 µl), překryty roztokem matrice (1 µl) a ponechány za laboratorní teploty do úplného zaschnutí. Hmotnostní spektra byla měřena v pozitivním modu. Produkty autoproteolýzy trypsinu byly použity k interní kalibraci digestovaných peptidů Zpracování dat Pro zpracování MS/MS dat byl použit vyhledávací program MASCOT 2.2 (MatrixScience, Londýn, UK). K databázovému vyhledávání byla použita NCBI proteinová databáze (verze ). Povolená hmotnostní tolerance byla pro MS/MS data 0,6 Da. 24

25 4.11 Výsledky a diskuse Vzorky piv byly separovány pomocí 2-D elektroforézy (každý vzorek ve dvou provedeních) a obarveny fluorescenčním barvivem (Sypro Ruby). Na gelech (obrázky 8 11) jsou patrné skupiny proteinů, které již byly identifikovány a jsou pro pivo typické. Jde zejména o protein Z, LTP (lipidy transferující proteiny) a LBP (lipidy vázající proteiny). Byly vybrány spoty (označené E1- E16), které se vyskytovaly pouze na gelech jednoho vzorku, vyřezány, vystaveny působení trypsinu a podrobeny MS analýze. Obr 8: Vzorek piva G1 25

26 Obr 9: Vzorek piva G2 26

27 Obr 10: Vzorek piva H1 27

28 Obr 11: Vzorek piva H2 V tabulce 4 jsou uvedeny výsledky MALDI MS/MS analýzy 16 vybraných vzorků (označených na obrázcích 9 11). Z těchto vzorků se podařilo identifikovat jedenáct proteinů, které většinou pocházejí z kvasinek (Saccharomyces cerevisiae) nebo z ječmene (Hordeum vulgare). Ve zbylých pěti vzorcích nebyla možná identifikace z důvodu slabých signálů. V tabulce jsou uváděny názvy identifikovaných proteinů, identifikační číslo, hmotnost (Da), score, izoelektrický bod a číslo udávající z kolika procent je sekvence analyzovaného proteinu shodná se sekvencí databázového proteinu. 28

29 vz. E1 No results MALDI MS/MS databáze NCBI E2 1. gi Mass: Score: 251 Queries matched: 4 pi = 6,2 19 % Enolase 1 [Saccharomyces cerevisiae] E3 E4 1. gi Mass: Score: 283 Queries matched: 4 pi = 6,7 16 % glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase [Saccharomyces pastorianus] 1. gi Mass: Score: 459 Queries matched: 3 pi = 5,8 14 % Chain A, Structure Of Yeast Triosephosphate Isomerase [Saccharomyces cerevisiae] E5 1. gi Mass: Score: 323 Queries matched: 5 pi = 9,1 18 % mutase,phosphoglycerate [Saccharomyces cerevisiae] E6 1. gi Mass: Score: 107 Queries matched: 1 pi = 5,0 19 % Thiol-specific peroxiredoxin [Saccharomyces cerevisiae] E7 1. gi Mass: Score: 109 Queries matched: 2 pi = 6,9 22 % Cytoplasmic peptidyl-prolyl cis-trans isomerase (cyclophilin) [Saccharomyces cerevisiae] E8 1. gi Mass: Score: 66 Queries matched: 2 pi = 5,4 14 % Alpha-amylase inhibitor BDAI-1 [Hordeum vulgare] E9 1. gi Mass: Score: 89 Queries matched: 1 pi = 4,8 23 % Cytoplasmic thioredoxin isoenzyme Trx2p [Saccharomyces cerevisiae] E10 No results E11 1. gi Mass: Score: 67 Queries matched: 1 pi = 8,9 12 % LTP 1 [Hordeum vulgare] E12 1. gi Mass: Score: 40 Queries matched: 1 pi = 8,9 12 % LTP 1 [Hordeum vulgare] E13 No results E14 1. gi Mass: Score: 46 Queries matched: 1 pi = 8,9 12 % LTP 1 [Hordeum vulgare] E15 No results E16 No results Tabulka 4: Výsledky MALDI MS/MS databáze NCBI 29

30 5 Závěr Teoretická část této práce shrnuje metody proteomické analýzy zejména 2-D elektroforézu a hmotnostní spektrometrii. Jedna část je zaměřena na obecnou charakterizaci piva, jeho složení a proces výroby. Experimentální část je věnována postupům zpracování zkoumaných piv. Popisuje separaci proteinů ze vzorků piva, nalezení rozdílných proteinů (spotů) a identifikaci těchto vybraných proteinů. Na obrázcích v kapitole výsledky jsou zřejmé rozdíly mezi stanovovanými vzorky. Podařilo se identifikovat 11 z 16 vybraných spotů. Identifikované proteiny pocházely především z kmene kvasinek Saccharomyces cerevisiae a z ječmene Hordeum vulgare. Všechny tyto proteiny pocházely ze vzorku zahraničního piva, na gelech se vzorkem piva českého nalezeny nebyly. 30

31 6 Seznam zkratek CHAPS 3 - [(3 - cholamidopropyl)dimethylamonio] propan - 1-sulfonát CHCA 4 hydroxy α kyan - skořicová kyselina CID collision- induced dissociation DTT dithiothreitol ESI electrospray- ionisation HLPC vysoce účinná kapalinová chromatografie ICAT isotope-coded affinity tags IEF isolektrická fokusace IPG imobilizovaný ph gradient LBP lipidy vázající proteiny LC MS/MS tandemová hmotnostní spektrometrie s ionizací electrosprajem online spojená s kapalinovou chromatografií LTP lipidy transferující proteiny MALDI-TOF ionizace laserem za přítomnosti matrice průletový analyzátor (matrix- assisted laser desorption/ionisation time of flight) MS hmotnostní spektrometrie MS/MS tandemová hmotnostní spektrometrie NCBI National Center for Biotechnology Information PFS peptide fragment sequencing pi isoelektrický bod PMF peptidové mapování (peptide mass fingerprinting) SDS dodecyl-sulfát sodný SDS PAGE polyakrylamidová gelová elektroforéza v přítomnosti dodecyl-sulfátu sodného TRIS tris(hydroxymethyl)aminomethan 2-DE dvourozměrná gelová elektroforéza 31

32 7 Použitá literatura Kellner V.: Pivo, vitaminy a další důležité látky pro výživu a zdraví člověka, Pivovarský ústav Praha 4. Čížková H., Dostálek P., Fiala J., Kolouchová I.: Význam bílkovin z hlediska pěnivosti a stability pěny piva, Chemické listy 100 (2006) Graves P.R., Haystead T.A.J.: Molecular Biologist s Guide to Proteomics, MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY REVIEWS, Mar. 2002, p Váňa P., Šmarda J.: Optimalizace vzorku pro dvourozměrnou elektroforézu, Chemické Listy 98 (2004) Bouchal P., Kučera I.: Dvourozměrná elektroforéza v proteomice: principy a aplikace, Chemické listy 97 (2003) Chmelík J.: Proteomický průvodce, Chemické Listy 99 (2005) M. Kinter, N.E. Sherman: Protein Sequencing and Identification Using Tandem Mass Spectrometry, Wiley-Interscience, 2000, ISBN Granvogl B., Plöscher M., Eichacker L.A.: Sample preparation by in-gel digestion for mass spectrometry-based proteomics, Anal Bioanal Chem 389 (2007) Podklady k přednášce elektromigrační metody: Podklady k přednášce biochemické metody: Manuál: 2-D elektroforesis Principles a methods, amersham pharmacia biotech AC 15. Kovářová H.: Proteomika v postgenomové době, Chemické listy 99 (2005)

33 Příloha Vzorky: Pivo Eva Kotlasová Gel: 2-D (15 %), Sypro Ruby In-gel digesce (trypsin, 40 C, 2 hod, R+A, soak 45 min, V) Analýza: MALDI MS databáze NCBI, taxonomie all entries MALDI MS/MS databáze NCBI, taxonomie all entries Vz. E1 Slabé píky, no results. No results. Vz. E2 1. gi Mass: Score: 127 Expect: 1.6e-006 Queries matched: 11 pi = 6,2 40 % RecName: Full=Enolase 1; AltName: Full=2-phosphoglycerate dehydratase 1; AltName: Full=2-phospho-D-glycerate hydro-lyase 1 1. gi Mass: Score: 251 Queries matched: 4 pi = 6,2 19 % RecName: Full=Enolase 1; AltName: Full=2-phosphoglycerate dehydratase 1; AltName: Full=2-phospho-D-glycerate hydro-lyase 1 Odpovídá několika formám proteinu. Vz. E3 Píky, no results. 1. gi Mass: Score: 283 Queries matched: 4 pi = 6,7 16 % glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase [Saccharomyces pastorianus] Vz. E4 1. gi Mass: Score: 98 Expect: Queries matched: 8 pi = 5,8 34 % Chain A, Structure Of Yeast Triosephosphate Isomerase At 1.9- Angstroms Resolution 1. gi Mass: Score: 459 Queries matched: 3 pi = 5,8 14 % Chain A, Structure Of Yeast Triosephosphate Isomerase At 1.9- Angstroms Resolution Odpovídá několika formám proteinu. Vz. E5 1. gi Mass: Score: 114 Expect: 3.1e-005 Queries matched: 10 pi = 8,3 42 % Chain E, Saccharomyces Cerevisiae Phosphoglycerate Mutase 33

34 1. gi Mass: Score: 323 Queries matched: 5 pi = 9,1 18 % mutase,phosphoglycerate Odpovídá několika formám proteinu. Vz. E6 Píky, no results. 1. gi Mass: Score: 107 Queries matched: 1 pi = 5,0 19 % Thiol-specific peroxiredoxin, reduces hydroperoxides to protect against oxidative damage; function in vivo requires covalent conjugation to Urm1p; Ahp1p [Saccharomyces cerevisiae] Identifikace na 1 /signifikantní/ peptid. Vz. E7 Keratiny, píky, no results. 1. gi Mass: Score: 109 Queries matched: 2 pi = 6,9 22 % Cytoplasmic peptidyl-prolyl cis-trans isomerase (cyclophilin), catalyzes the cis-trans isomerization of peptide bonds N-terminal to proline residues; binds the drug cyclosporin A; Cpr1p [Saccharomyces cerevisiae] Identifikace na 1 signifikantní peptid. Vz. E8 Slabé píky, no results. 1. gi Mass: Score: 66 Queries matched: 2 pi = 5,4 14 % RecName: Full=Alpha-amylase inhibitor BDAI-1; Flags: Precursor Identifikace na 1 signifikantní peptid. Vz. E9 Slabé píky, no results. 1. gi Mass: Score: 89 Queries matched: 1 pi = 4,8 23 % Cytoplasmic thioredoxin isoenzyme of the thioredoxin system which protects cells against oxidative and reductive stress, forms LMA1 complex with Pbi2p, acts as a cofactor for Tsa1p, required for ER-Golgi transport and vacuole inheritance; Trx2p [Saccharomyces cerevisiae] Identifikace na 1 /signifikantní/ peptid. Vz. E10 Slabé píky, no results. No results. 34

35 Vz. E11 Zvláštní píky (mnoho signálů kolem 2 kda), no results. 1. gi Mass: Score: 67 Queries matched: 1 pi = 8,9 12 % LTP 1 [Hordeum vulgare] Identifikace na 1 /signifikantní/ peptid. Vz. E12 Zvláštní píky (mnoho signálů kolem 2 kda), no results. 1. gi Mass: Score: 40 Queries matched: 1 pi = 8,9 12 % LTP 1 [Hordeum vulgare] Nízká kvalita MS/MS dat. Vz. E13 Zvláštní píky (mnoho signálů kolem 2 kda), no results. No results. Vz. E14 Zvláštní píky (mnoho signálů kolem 2 kda), no results. 1. gi Mass: Score: 46 Queries matched: 1 pi = 8,9 12 % LTP 1 [Hordeum vulgare] Nízká kvalita MS/MS dat. Vz. E15 Zvláštní píky (mnoho signálů kolem 2 kda), no results. No results. Vz. E16 Slabé píky, no results. No results. 35