Jiří Pazourek MODERNÍ ELEKTROFORETICKÉ ANALYTICKÉ METODY. (přednášky pro magisterské studium) Skripta : Elektroforetické analytické metody 2.6.

Rozměr: px
Začít zobrazení ze stránky:

Download "Jiří Pazourek MODERNÍ ELEKTROFORETICKÉ ANALYTICKÉ METODY. (přednášky pro magisterské studium) Skripta : Elektroforetické analytické metody 2.6."

Transkript

1 Jiří Pazourek MODERNÍ ELEKTROFORETICKÉ ANALYTICKÉ METODY (přednášky pro magisterské studium) 1. ÚVOD Význam kapilární elektroforézy Historický vývoj Různá prostředí pro elektroforézu SDS-Polyakrylamidová Gelová Elektroforéza proteinů (SDS-PAGE) Zpracování gelu po separaci. Vybarvování stříbrem nebo organickými barvivy Blotting (Southern blotting + Nothern blotting + Western blotting) D-elektroforéza (Two-Dimensional Electrophoresis) Elektroforéza v kapiláře = kapilární elektroforéza (capillary elecrophoresis) ANALYTY V KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZE Typy molekul, které lze analyzovat kapilární elektroforézou Proteiny = polypeptidy. Náboj polypeptidů Elektroforetická titrační křivka TEORETICKÝ POPIS ELEKTROFORÉZY Základní fyzikální principy elektroforézy elektroforetická pohyblivost µ ELEKTROOSMOTICKÝ TOK Elektroosmotická pumpa Animace endoosmotického toku. Animace kapilární elektroforézy Modifikátory elektroosmotického toku (EFM) tenzidy neboli surfaktanty ZÁKLADY INSTRUMENTACE Pracovní podmínky Nepřímá detekce v CE SEPARAČNÍ MÓDY V KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZE Kapilární zónová elektroforéza (CZE) Izotachoforéza (ITP) Kapilární gelové elektroforéza (CGE) Micelární elektrokinetická chromatografie (MEKC) Kapilární elektrochromatografie (CEC) Kapilární izoelektrická fokusace (CIEF) Diskontinuální elektroforéza CE v nevodném prostředí (NON-AQUEOUS CE) OMEZENÍ ROZMÝVÁNÍ ZÓN V CE. OPTIMALIZACE Odvod Joulova tepla Elektroosmotický tok On-capillary detekce Molekulární difúze Rozmytí zón způsobené dávkováním VYHODNOCOVÁNÍ DAT KAPILÁRNÍ ZÓNOVÉ ELEKTROFORÉZY Detekční limit Validace v CE KLINICKÉ A FARMACEUTICKÉ APLIKACE Chirální separace - Separace optických izomerů kapilární elektroforézou Spojení CE a laserem indukované fluorescence (LIF). Kompetitivní immunoassay bílkovin SDS-CGE proteinů Separace sacharidů pomocí MEKC s derivatizací CE-MS Sekvenování DNA. PCR Miniaturizace...88 Skripta : Elektroforetické analytické metody

2 1. ÚVOD 1.1. Význam kapilární elektroforézy Pojmem kapilární elektroforéza, resp. vysokoúčinná kapilární elektroforéza (High- Performance Capillary Electrophoresis, HPCE) je dnes označována celá rodina elektromigračních separačních metod realizovaných v kapilárním instrumentálním formátu: zónová elektroforéza (CZE), izotachoforéza (CITP), izoelektrická fokusace (CIEF), elektroforéza v síťovacích prostředích, klasických agarosových i polyakrylamidových gelů (CGE) i v kapalných síťovacích mediích (SDS-elektroforéza bílkovin), bioafinitní elektroforéza a dále též kombinované elektromigrační a chromatografické techniky, elektrokinetická chromatografie (MEKC) a kapilární elektrochromatografie (CEC). Pro svou účinnost dosahující stovek tisíc až miliónů teoretických pater a citlivost na úrovni femtomol-zeptomol ( mol) analytu v nanolitrových objemech analyzovaných vzorků, jsou HPCE techniky považovány za nejúčinnější a nejperspektivnější analytické separační metody. Stávají se stále více uznávaným protějškem, resp. doplňkem dosud nejrozšířenějších separačních metod - různých variant vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC). I když analytické využití HPCE metod výrazně převládá, lze tyto techniky použít též pro mikropreparaci (na úrovni nanomol / pikomol) a fyzikálně chemickou charakterizaci separovaných látek. Podle charakteru vzorku a účelu separace můžeme rozlišit následující typy aplikací: Analýza (kontrola čistoty nebo kvality) syntetických nebo z přirodního materiálu izolovaných preparátů, např. chemikálií, barviv, léčiv, vitamínů, enzymů a hormonů. Analýza komplexních směsí: stanovení biologicky nebo chemicky významných analytů, např. metabolitů, léčiv, jedů, škodlivin, aditiv a polutantů v biologických tekutinách (sérum, plazma, moč), tkáňových extraktech, potravinách, odpadních vodách a reakčních směsích. Sledování biologických a chemických přeměn, např. chemických a enzymatických reakcí a přeměn metabolitů, léčiv a chemikálií. Fyzikálně-chemické charakterizace analytů: stanovení elektroforetických pohyblivostí, relativních molekulových hmotností, efektivních nábojů, disociačních a asociačních konstant, difúzních koeficientů a jiných charakteristik. HPCE nachází široké uplatnění ve výzkumu i v praxi mnoha oblastí chemie, biochemie, molekulární biologie, klinické chemie, biotechnologie, zemědělství, v chemickém, farmaceutickém a potravinářském průmyslu, v ekologii apod. Nejmasovější využití elektroforézy je dnes spojeno s analýzami proteinů a nukleových kyselin (Projekt lidského genomu, medicinské vužití detekce genetického polymorfismu, PCR, DNA čipy). Odkazy Skripta : Elektroforetické analytické metody Skripta : Elektroforetické analytické metody

3 1.2. Historický vývoj Historie elektroforézy vybarvování gelů, immunoelektroforetické techniky, dvourozměrná elektroforéza a různé blotting-techniky. ČASOVÉ MILNÍKY KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZY: Koncept elektroforézy jako techniky využívající elektrického pole, které způsobuje pohyb nabitých částic v matrici, byl vyvíjen ve dvacátém století. První vědecká elektroforetická aparatura byla vyvinuta Tiseliem v roce Tiselius obdržel za svůj příspěvek k analýze proteinů Nobelovu cenu o 11 let později. Tiselius popsal metodu "pohyblivého rozhraní" (moving boundary), která je dnes známá jako zónová elektroforéza, a použil ji k separaci sérových proteinů (1). Elektroforéza se začala vyvíjet až v padesátých letech, kdy byla použita i pro aminokyseliny a dokonce anorganické ionty. Objevily se i další elektroforetické techniky: izoelektrická fokusace a izotachoforéza. Tyto tři metody jsou založeny na poněkud odlišných principech a mohou být pro praktické účely kombinovány. Rozdíl mezi těmito metodami lze vidět i podle prostředí, která se v nich historicky používala: polymerní gel, papír a kapilára. Papír byl používán v začátcích elektroforézy k separaci látek, protože byl levný a lehce použitelný (nemusel se zvláštně připravovat). Smithies použil škrobový gel jako médium pro elektroforézu v roce 1955 (2). O dva roky později Kohn použil pro elektroforézu acetát celulózy jako nosič (3). V roce 1959 Ornstein a Davis (4) a Raymond s Weintraubem (5) použili polyakrylamidový gel. Gelový nosič se stále používá k separaci proteinů (slab-gel electrophoresis), i v kapilárním měřítku (CGE). Kapiláry byly do elektroforézy zavedeny Jorgensonem a Lukacsem (6,7) na začátku devadesátých let dvacátého století. Detekční techniky se v průběhu let také vyvíjely. Většina separovaných složek je prostému oku neviditelná. Proto byly vyvíjeny vizualizační a kvantifikační techniky, jako první experimenty v U trubicích: F. von Reuss (1808), G. Wiedeman (1856), H. Buff (1858), O. Lodge (1886), W. Whetham (1893) 1897F. Kohlrausch odvodil rovnici pro migraci iontů v roztoku elektrolytu 1.pol. 20.stol. gelová elektroforéza a isoelektrické fokusování na gelových deskách 1958 S. Hjertén ZE v rotujících trubicích 1-3 mm 1965 A. Tiselius ZE v 3 mm trubicích 1970 F. Everaerts ITP na vlastním přístroji 1974 R.Virtanen CZE v µm skleněných kap V. Pretorius EOF mobilní fáze sorbentem 1979 F. Mikkers CZE v 200 µm teflonových kapilárách 1981 J. Jorgenson, K. Lukacs CZE v 75 µm kapilárách 1983 S. Hjertén CGE pro biologické látky 1984 S. Terabe MEKC pro neutrální látky 1985 S. Hjertén CIEF pro biologické látky 1987 J. Knox, I. Grant CEC v 50 µm kapilárách s ODS 1987 B. Karger, A. Cohen vysoká účinnost CGE pro DNA 1988 dostupnost prvního komerčního přístroje (Beckman Instruments) Literatura: 1. Tiselius, A., A new apparatus for electrophoretic analysis of colloidal mixtures, Trans. Faraday. Soc., 33, 524, Smithies, O., Zone electrophoresis in starch gels: group variations in the serum proteins of normal human adults, Biochem. J., 61, 629, Kohn, J., A cellulose acetate supporting medium for zone electrophoresis, Clin. Chim. Acta, 2, 297, Ornstein, L. and Davis, B. J., Disc Electrophoresis, Distillation Products Industries (Division of Eastman Kodak Co.), Raymond, S. and Weintraub, L., Acrylamide gel as a supporting medium for zone electrophoresis, Science, 130, 711, Jorgenson, J. W. and Lukacs, K. D., Anal. Chem., 53, 1928, Jorgenson, J. W. and Lukacs, K. D., Science, 222, 266, Skripta : Elektroforetické analytické metody Skripta : Elektroforetické analytické metody

4 Různá prostředí pro elektroforézu Papír Agarosa Polyakrylamid Kapilára Dnes je elektroforéza převážně používána pro biologické a jiné polymerické vzorky (komerčně), např. DNA analýza pro kriminalistické a vědecké účely, dále pro proteinovou a enzymovou analýzu - v těchto případech se nejčastěji jedná o elektroforézu v gelu (Projekt lidského genomu). Gel síťovým efektem zpomaluje pohyb nabitých molekul na základě jejich velikostí resp. velikosti pórů gelu. Elektroforéza na papíře paperelectrophoresis2.swf Papír napuštěný elektrolytem byl používán pro první elektroforetické separace, protože byl levný a laboratorně používaný pro filtrace resp. papírovou chromatografii (Whatman 3MM (0.3 mm) a Whatman No.1 (0.17 mm). Papír také obvykle nenese náboje, které by nežádoucím způsobem interagovaly s analytem. Vzorek se nanáší přímo na plochu papíru, který leží na chladící desce a jehož konce jsou ponořeny do elektrolytových rezervoárů, do nichžjsoutaképonořeny konce elektrod. Ke sledování migrace jsou používány společně se vzorkem ionizovaná barviva a standardy. Aplikovaná napětí jsou větší než v případě gelů, protože elektrický odpor papíru je větší. Nevýhodou papírové elektroforézy je fakt, že póry papíru (velikost, kvalita) nejsou uživatelem přímo kontrolovatelné a tudíž tato technika není příliš citlivá ani reprodukovatelná. Elektroforéza v gelu Efekt omezené difúze : Ačkoli elektroforéza může být prováděna nejjednodušeji ve volném roztoku (CZE), konvekční pohyb kapaliny v důsledku tepla přirozeně uvolňovaného průchodem elektrického proudu může separaci narušit, případně zónu analytu úplně rozmýt. Tato úvaha vedla v elektroforéze k zavedení gelu jako separačního prostředí. Tímto gelem je obvykle agarosa (polysacharid z mořských řas) nebo synteticky připravovaný polyakrylamid (chemicky síťovaný polymer, CH 2 =CHCONH 2 ). Agarosový gel Ředěné agarosové gely jsou dostatečně rigidní a jednoduché pro přípravu v nízkých koncentracích, proto se typicky používají k separaci velkých makromolekul, jako např. velkých bílkovin nebo DNA (až 20 kbp). Polyakrylamidové gely se typicky používají k separaci nukleových kyselin do 2 kbp (ale v určitých modifikacích i pro větší fragmenty). Agar se isoluje z červené řasy rodu Rhodophycae, je tvořen dvěma komponentami - agarosou a agaropektinem. Agarosa je vhodná jako elektroforetická matrice, protože je takřka nenabitá. Agarosa je řetězec opakujících se jednotek D-galaktózy a 3,6-anhydro-L-galaktózy jak je vidět na obrázku s bočním řetězcem 6-methyl-D-galaktózy: Agarosa je schopna utvořit třírozměrnou strukturu šroubovice s trojnásobně zalomenou osou, která vytváří dutinu dostatečně velkou pro přijetí vody (agarosový gel může obsahovat až Skripta : Elektroforetické analytické metody Skripta : Elektroforetické analytické metody

5 1.4. SDS-Polyakrylamidová Gelová Elektroforéza proteinů (SDS-PAGE) SDS, sodium dodecylsulfate, je také známý jako sodium lauryl sulfáte. Hydrofobní konec molekuly SDS silně interaguje s proteinovým řetězcem. Počet molekul SDS, které se váží na protein je úměrný délce proteinu. Neredukované (viz dále) proteiny váží 0,9-1,0 gram SDS na gram proteinu. Každá molekula SDS přispívá negativním nábojem a samozřejmě překrývá případný náboj proteinu. To dovoluje separovat vzorek pouze podle molekulové hmotnosti (velikosti), nikoli podle náboje, protože konečný náboj proteinu po asociaci s SDS je vždy negativní a úměrný VELIKOSTI proteinu (poměr náboj/velikost, který je v zónové elektroforéze klíčový a pro dosažení separace nutně různý, je v SDS-PAGE konstantní). SDS také ruší terciální strukturu proteinů (denaturace). Použijeme-li při přípravě vzorku navíc β-merkaptoethanol, který přerušuje disulfidické vazby v proteinu, vzniknou tzv. redukované proteiny, které pak na sebe váží 1.4 gramu SDS na gram proteinu. SDS-PAGE tedy spojuje výšeuvedený efekt omezené difúze molekul analytu a size exclusion mechanismus (podobný gelové filtraci/permeační chromatografii). Mechanismus Protože elektroforetická mobilita je definovaná jako vzdálenost uražená za určitý čas, vsds-page tedy můžeme psát Nebo použijeme-li tzv. relativní mobilitu Rf definovanou jako elektromigrační dráha neznámé bílkoviny Relativní mobilita (Rf ) = celková délka elektroforézy Skripta : Elektroforetické analytické metody

6 Kalibrační závislost log MW = f (Rf) 1.5. Zpracování gelu po separaci. Vybarvování stříbrem nebo organickými barvivy Po separaci v gelové elektroforéze je obvykle analyt prostým okem neviditelný. Pro kvantifikaci (určení množství analytu v zóně) používáme často metody vybarvování gelu (angl. staining, alternativou je radiografie, pokud byl analyt radioaktivně značen, viz dále): pozn.: vyjímkami v tomto chování jsou velmi hydrofobní (membránové) proteiny a glykosylované proteiny. Závěr (SDS-PAGE): Elektroforéza v přítomnosti SDS = SDS PAGE je jednoduchá a rychlá metoda pro charakterizaci a srovnání bílkovin. Tato metoda separuje bílkoviny na základě rozdílné relativní molekulové hmotnosti. SDS se zde váže na bílkovinný řetězec v poměru 1.4 g SDS na 1g bílkoviny, přičemž délka komplexu SDS + bílkovina je úměrná jeho molekulové hmotnosti. Na základě srovnání relativních mobilit neznámé bílkoviny a standardů je pak možné určit její relativní molekulovou hmotnost. Vybarvování (Staining) Vybarvování proteinů je běžně prováděno třemi možnými reagenciemi: Amido Black, Coomassie Brilliant Blue G-250 nebo stříbrem. Amido black není příliš citlivá, reaguje s proteiny, které jsou snadno přístupné, např. které byly přeneseny z gelu na nitrocelulózový papír. Coomassie Blue a stříbro interagují s více proteiny a jsou více citlivé. Coomassie Blue, používaná pro agarosové a polyakrylamidové gely, je 5x citlivější (0.3 ug/zónu) než Amido black. Vybarvování stříbrem je 100x citlivější (1 ng/zónu) než Coomassie Blue a používá se převážně pro polyakrylamidové gely. Toto vybarvování se používá v případech malého množství proteinu nebo chceme-li detekovat co možná nejvíce zón. příklad: Detekce bílkovin stříbrem krok roztoky čas ml 50 % acetonu, 1.5 ml 50 % TCA, 25 µ l 37 % HCHO 5 min 2. opláchněte 3x deionizovanou vodou 3 x 5 s 3. promytí deionizovanou vodou 5 min 4. opláchněte 3x deionizovanou vodou 3 x 5 s ml 50 % acetonu 5 min µ l 10 % Na 2 S 2 O 3 v 60 ml deionizované vody 1 min 7. opláchněte 3x deionizovanou vodou 3 x 5 s ml 20 % AgNO 3, 0.6 ml 37 % HCHO, 60 ml H 2 O 8 min 9. opláchněte 2x deionizovanou vodou 2 x 5 s ml 2 % Na 2 CO 3,25 µ l 37 % HCHO, 25 µ l 10 % Na 2 S 2 O s % HAc 30 s 12. promytí deionizovanou vodou 10 s Skripta : Elektroforetické analytické metody Skripta : Elektroforetické analytické metody

7 Po té, co byl gel vybarven, mohou být proteiny kvantifikovány densitometricky. Gel může být fotografovány nebo skenovány, intenzita zabarvení je srovnána s kalibrační křivkou standardů. Všechny uváděné procesy vybarvování jsou poměrně dlouhé: např. vybarvování stříbrem může zabrat až několik hodin. Navíc takováto barvení jsou obtížně reverzibilní a většina proteinů nemůže být neporušeně získáná zpět (pro další analýzu). Jinou modifikací detekce je autoradiografie. Radioaktivní vzorek separovaný v gelu je s gelem vysušen na papíře a přenesen na rentgenový film, který je radioktivími atomy exponován. Radioaktivní zóny jsou tedy na výsledném snímku světlé a film je opět densitometricky vyhodnocen. objektivní vyhodnocování: schéma optického densitometru Stupeň zesíťování monomeru určuje velikost pórů gelu, čili rozsah molekulových hmotností, při kterých bude gel účinný. Tento pracovní rozsah nastavíme procentuálním obsahem síťovadla ve směsi. Složení výsledného polymeru můžeme vyjadřovat 2 způsoby: %T nebo %T, %C: %T je hmotnostní procento celkového monomeru (akrylamid + síťovadlo) Např. 15% gel znamená obsah 15% w/v akrylamidu a bisakrylamidu. Platí, že čím větší %T, tím menší póry (propustnost) gelu. U způsobu %T, %C přidáváme ještě informaci o procentuálním zastoupení síťovadla %C. 15%T, 5%C-bis říká, že kromě celkové koncetrace 15% w/v akrylamid + bisakrylamid je bisakrylamidu 5% celkové hmotnosti gelu. Takto lze také nastavovat velikost pórů: pro jakékoli %T, 5% C tvoří nejmenší póry. Zvětšení nebo zmenšení %C zvětší póry gelu. Na rozdíl od agarosového gelu, polymerace akrylamidu vyžaduje aditiva. Běžný iniciátor je peroxodisulfát amonný (NH 4 ) 2 S 2 O 8 a tetramethylendiamin (TEMED) funguje jako katalyzátor. TEMED vytváří z peroxodisulfátu volné radikály, které způsobují vlastní polymeraci. Polyakrylamidový gel je univerzální gel, běžně používaný pro elektroforézu proteinů a nukleových kyselin. Elektroforéza v polyakrylamidu Polyakrylamidový gel separuje většinu proteinů a malých oligonukleotidů, vzorků, které jsou sami menší než v případě agarosového gelu. Polyakrylamidové gely jsou tvořeny z monomeru akrylamidu (CH 2 =CHCONH 2 ), který je polymerizován (síťován) do dlouhých řetězců kovalentně tzv. crosslinkerem. Nejpoužívanější crosslinker je N,N'-methylenbisakrylamid [(CH 2 =CHCONH) 2 CH 2 ] NH 2 O O NH NH O Skripta : Elektroforetické analytické metody Skripta : Elektroforetické analytické metody

8 1.6. Blotting (Southern blotting + Nothern blotting + Western blotting) Blotting je technika, kdy proteiny jsou z gelu přeneseny do jiné matrice, např. nitrocelulózový papír, protože by síť gelu bránila jiným velkým molekulám, např. bílkovinným protilátkám nebo jiným reagentům s proteiny rychle a kvantitativně reagovat, což je právě proces, který využíváme k citlivé detekci. Po přenesení je papír podroben této inkubační reakci: v Southern blotting je papír inkubován s radioaktivní DNA komplementární k DNA, kterou stanovujeme. Northern blotting používá obdobný postup, ale s RNA. Ješte lze využít immunologickou detekci, kde papír s přeneseným analytem reaguje se specifickou protilátkou (= western blotting), případně k přenosu analytu místo toku kapaliny využít mobilizaci elektroforeticky. Možnost reakce s analytem dává i možnost citlivější detekce densitometricky, případně chemiluminiscenčně nebo fluorescenčně (s fluorescenčně aktivním reagentem). Skripta : Elektroforetické analytické metody

9 ENZYME-ASSISTED IMMUNOELECTROBLOTTING D-elektroforéza (Two-Dimensional Electrophoresis) (IEB neboli WESTERN BLOTTING) Dvourozměrná elektroforéza používá dvě posoběnásledující elektroforetické metody: izoelektrickou fokusaci a SDS-Page elektroforézu. Izoelektrická fokusace je prováděna nejdříve v jednom směru (rozměru), kdy jsou separovány látky dle svých isoelektrických bodů (pi) a následuje SDS-PAGE ve směru kolmém, kdy dělíme podle molekulových hmotností. Takto lze odlišit i proteiny lišící se o jediný náboj. Vzniklé dvourozměrné mapy lze po skenování (snímkování) katalogizovat a použít jako identifikační nástroj. Skripta : Elektroforetické analytické metody Skripta : Elektroforetické analytické metody

10 1.8. Elektroforéza v kapiláře = kapilární elektroforéza (capillary elecrophoresis) Charakteristika, výhody, problémy: Kapilární elektroforéza probíhá v křemenné kapiláře o vnitřním průměru µm a je naplněna elektrolytem nebo gelem. Výhodou provádění elektroforézy v kapiláře je její relativně velký povrch vůči objemu. Proto nutně vznikající Jouleovo teplo, které je omezujícím faktorem u elektroforézy na ploše, může být proto velmi účinně odváděno (okolním vzduchem, případně chladící kapalinou). Na druhé straně kapilární rozměry tohoto separačního systému přináší problémy s dávkováním, čištěním povrchu kapiláry a detekcí. Množství vzorku musí být přizpůsobeno velikosti separační kapiláry: typický objem kapiláry je 1-10 ul, objemy vzorku nepřekračují 0.1-1% této hodnoty. Protože se většinou používá on-line (on-column) detektory, musejí být citlivé, aby takováto malá množství detekovaly. Nejběžnější je detektor optický (UV-VIS nebo fluorescenční), případně vodivostní. Stav povrchu kapiláry (elektroosmotický tok, interakce se vzorkem) představuje stále oříšek bránící kapilární elektroforéze stát se vážným konkurentem HPLC v oblasti kvantitativní analýzy. Protože separační kapilára není určena na jedno použití, po každé analýze musí být její vnitřní povrch vyčištěn, resp. uveden do opakovatelného stavu. Jedním z možných řešení je modifikace vnitřního povrchu (coating) buď dynamicky, adsorbcí nebo kovalentní chemickou vazbou. Tento problém je samozřejmě eliminován u kapilár plněných gelem. Na druhé straně, existenci elektroosmotického toku u nemodifikovaní křemenné kapiláry, který mobilizuje celý objem kapaliny v kapiláře ke katodě, lze výhodně využít i k detekci aniontů, jejichž výsledný pohyb směřuje také ke katodě. Výhodami kapilární elektroforézy je jednoduchost přípravy vzorku i separační aparatury, efektivní chlazení a eliminace off-line densitometrického vyhodnocování na ploše gelu, protože signál získáváme přímo z on-column detektoru. Je důležité pochopit, že kapilára je z taveného křemene. Křemen na rozdíl od skla neobsahuje příměsi kationtů silně absorbující světlo v UV oblasti, je to prakticky čistý oxid křemičitý. Když mluvíme o taveném křemeni, odkazujeme na kapiláru. Z některých obrázků se sice může zdát, že tavený křemen je uvnitř kapiláry, ale tavený křemen je kapilárou. Tavený křemen není nic jiného než křemen zbavený nepravidelností krystalové struktury. Přetavený křemen je lépe propustný pro UV záření. Skripta : Elektroforetické analytické metody Nejjednodušší zařízení pro kapilární elektroforézu Srovnání kapiláry a slab-gelu Souhrn: separace se typicky uskutečňuje v kapiláře z taveného křemene vně pokryté polyimidem (jiná možnost je teflonová kapilára nebo skleněná kapilára) případně plněná gelem Křemenná kapilára je cm dlouhá s vnitřním průměrem µm. hydroxylové skupiny křemene mohou disociovat a nabíjet tak vnitřní stěnu kapiláry negativně malý objem kapiláry vyžaduje malé objemy dávkovaného vzorku (1-10 nl) on-column detekce na kapiláře vyžaduje citlivý detektor Skripta : Elektroforetické analytické metody

11 2. ANALYTY V KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZE Migrace molekul v CE závisí na velikosti a náboji molekuly a na elektroosmotickém toku. Obvykle předpokládáme, že elektroosmotický tok je během experimnetu konstantní Typy molekul, které lze analyzovat kapilární elektroforézou Aplikační možnosti kapilárních elektromigračních metod jsou neobyčejně široké. Lze je využít pro separaci a analýzu všech typů rozpustných ionogenních nízko- i vysokomolekulárních látek, např. anorganických i organických kyselin a bází, kovových iontů, aminokyselin, peptidů, bílkovin, sacharidů, nukleosidů, nukleotidů a nukleových kyselin, syntetických polymerů a též pro separaci nabitých (bio)částic, např. virů, buněk a buněčných organel. Kromě toho v režimu elektrokinetické chromatografie a elektrochromatografie mohou být separovány i látky neionogenní, např. alifatické a aromatické uhlovodíky a jejich deriváty (alkoholy, aldehydy, ketony, aminokyseliny a peptidy s chráněnými ionogenními skupinami aj.). Vysoké separační účinnosti HPCE technik se využívá též při separaci polohových a optických izomerů biologicky aktivních látek. Náboj Typ molekuly Migrační rychlost - malý anion -1 4* - velký anion -1 3 = malý anion -2 2 = velký anion -2 1 o malá molekula 0 6 o velká molekula malý kation velký kation malý kation velký kation +2 9 *největší číslo znamená nejrychlejší molekulu. Molekuly s identickým nábojem migrují podle své velikosti. Detekce separovaných proteinů (podrobněji viz výše): Coomassie blue Fluoreskamine Autoradiografie Immunoblotting (otisk) 2.2. Proteiny = polypeptidy. Náboj polypeptidů Náboj polypeptidu při třech ph Rychlost proteinu při elektroforetickém experimentu je přímo úměrná náboji a nepřímo úměrná velikosti molekuly a viskozitě elektrolytu (viz dále). Typ použitého pufru a jeho ph jsou tedy zásadní, poněvadž určují celkový náboj proteinu. Náboj proteinu závisí na stupni ionizace kyselých (COOH) a zásaditých skupin (NH 2) proteinu, což je právě funkcí ph obklopujícího média. Skripta : Elektroforetické analytické metody Skripta : Elektroforetické analytické metody

12 2.3. Elektroforetická titrační křivka ETK poskytuje informaci o pi (elektroforetické mobilitě) je prováděna na vertikální ploše s použitím velkoporézní gelové matrice, jako např. agarosa nebo nízkosíťovaný polyakrylamid. Na této ploše je předem vytvořen horizontální gradient ph (pomocí patřičných amfolytů (Ampholinů). Na obrázku je vzorek (směs proteinů) po vpravení do středové jamky a aplikaci napětí. Příklad Crotalus viridis (chřestýš zelený) Titrační křivka provedená na IEF 3-9 PhastGelu. Vzorkem byl nasbíraný jeden pík jedu chřestýše oddělený na katexu LC. Pík byl dialyzován, lyofylizován a rozpuštěn ve vodě. Bylo naneseno cca 87.5 µg proteinu. K vybarvování byla použita stříbrná sůl. Náčrt experimentálního stanovení elektroforetické titrační křivky Běhen elektroforézy se pohybují proteiny buď ke atodě nebo k anodě nebo, pokud se ph rovná jejich izoelektrickému bodu, se nepohybují vůbec. Rychlost tohoto pohybu závisí na rozdílu ph-pi. Po proběhnutí elektroforézy je obvykle gel "vybarvován" a posuzuje se vznilá titrační křivka. Typická sada takto získaných křivek je na dalším obrázku. Podle největší vzdálenosti mezi křivkami usoudíme na ph, které je optimální pro separaci např. pro eluci v iontové chromatografii. Elektroforetické titrační křivky isoenzymů laktát dehydrogenasy Skripta : Elektroforetické analytické metody Skripta : Elektroforetické analytické metody

13 3. TEORETICKÝ POPIS ELEKTROFORÉZY 3.1. Základní fyzikální principy elektroforézy elektroforetická pohyblivost µ Působí-li síla F (např. elektrická) na hmotnost m, bude tato hmota urychlována zrychlením a (Newton, 1667, F = m * a). Zrychlení je definováno jako rychlost změny rychlosti, jak ukazuje rovnice 1: v v0 a = (1) t a = zrychlení, v = rychlost dosažená v čase t, v0 = počáteční rychlost v čase ELEKTROOSMOTICKÝ TOK 4.1. Elektroosmotická pumpa Obrázek: Kapilára = ENDOOSMOTICKÁ PUMPA 1/kapilára z taveného křemene s obnaženými hydroxylovámi skupinami Zrychlení kulové molekuly nesoucí elektrický náboj v kapalině bude nulové, pokud se odporová (zadržovací) síla okolní kapaliny bude rovnat této urychlující síle F(a) (rovnice 2) F a = F d (2) což je případ kapilární zónové elektroforézy (obrázek, ion je zdržován iontovou atmosférou). Pak se bude molekula pohybovat rovnoměrným pohybem s konstantní rychlostí. Urychlující elektrická síle se rovná součinu síly elektrického pole (ve V/m) a náboje molekuly (v Coulombech) (rovnice 3). 2/ Disociace hydroxylových skupin zanechá na vnitřním povrchu negativní náboj F a = E * Q E = U/d (3) U = napětí, d = vzdálenost, Q = náboj Odporová síla F(d) je funkcí velikosti a tvaru molekuly a viskozity okolní kapaliny podle Stokesovy rovnice, která pro kulovou molekulu má tvar F(d) = 6 * π * η * r * v ef (4) r = poloměr molekuly,η = viskosita, v ef = rychlost Protože F(a) = F(d), pak E * Q = 6 * π * η * r * v ef Dostaneme důležitou veličinu zvanou elektroforetické mobilita µ: 3/ Zapnutím napětí se začně kapalina pohybovat ke katodě - je mobilizována endoosmotickým tokem! µ = v ef /E = Q / 6 * π * η * r (5) a rychlost pohybu je tedy v = µ E (6) pozn.: mobilita (µ) např. proteinuje úměrná náboji (Q) a nepřímo úměrná velikosti molekuly a viskozitě elektrolytu. Druh elektrolytu a jeho ph jsou proto důležité, neboť celkový náboj proteinu je dán ph elektrolytu (pufru). Jinými slovy, celkový náboj proteinu závisí na stupni ionizace kyselých a zásaditých skupin na proteinu, který je závislý na ph prostředí. Skripta : Elektroforetické analytické metody Skripta : Elektroforetické analytické metody

14 Jednoduché vysvětlení elektroosmotického toku Povrch křemenné kapiláry obsahuje negativně nabité funkční skupiny, které přitahují pozitivně nabité protiionty. Pozitivně nabité ionty migrují k negativní elektrodě a unáší molekuly rozpouštědla stejným směrem. Tento celkový pohyb kapaliny je nazýván elektroosmotický tok. Během separace se neutrální molekuly pohybují stejným směrem jako elektroosmotický tok (s nepatrnou vzájemnou separací). Positivně nabité ionty jsou elektroosmotickým tokem urychlovány, negativně nabité naopak zpomalovány. Skripta : Elektroforetické analytické metody

15 Stěny taveného křemene obsahují silanolové skupiny, které mohou ionizovat při vyšším ph roztoku elektrolytu. Tato disociace produkuje negativně nabitou stěnu. Vrstva kovových kationtů proto u stěny kompenzuje náboj, aby byla zachována elektroneutralita. Když zapneme napětí, tyto kationty a jejich solvatační obaly vody migrují ke katodě. Tento pohyb je zdrojem pohybu celé kapaliny. Tento toko vlastně pumpuje ionty vzorku ale i celou kapalinu a může být považován za "elektricky-řízenou pumpu". Při nízkém ph jsou silanoly nedisociované a proto elektroosmotický tok je mnohem slabší, při velmi nízkých ph skoro nulový. Jedním z důsledků existence EOF je možnost detekce kationtů aaniontů v jednom experimentu v případěch, kdy velikost EOF je vyšší než elektroforetická mobilita aniontů (např. při ph>7), protože tok kapaliny unáší všechny látky ke katodě, kde je detektor. Disociace silanolových skupin Velikost elektroosmotického toku je závislá na náboji kapiláry, viskozitě elektrolytu a elektrické permitivitě elektrolytu: µ(eo) = ε ζ / η r µ(eo) = "EOF mobilita" (rychlost EOF), η = viskozita, ζ = zeta potenciál (elektrostatický potenciál vzniklý v důsledu náboje na povrchu kapiláry), r = poloměr kapiláry, ε - permitivita elektrolytu. Všimněme si, že ε ζ je náboj (v Coulombech) podobně jako µ=q/6πηr. Obrázek 4: Pohyb aniontů a kationtů v kapiláře z taveného křemene po aplikaci elektrického pole.dva (+) resp.( ) označují větší náboj, krychle a kužele neutrální látky. Velikost EOF je značně závislá na ph elektrolytu, poněvadž zeta potenciál je řízen ionizací silanolových skupin. Do ph=4 je ionizace malá, a nad ph=9 jsou již prakticky všechny skupiny ionizované (horní modrá křivka v obrázku). Nejdůležitější praktické důsledky: Pozitivní a negativní i neutrální molekuly se budou pohybovat amohou být detekovány, tedy i separovány!!! elektrolyt je pumpován od anody ke katodě (situaci lze analogicky obrátit, je-li povrch kapiláry nabitý pozitivně) Skripta : Elektroforetické analytické metody Skripta : Elektroforetické analytické metody

16 Pohyb (migrace) závisí na elektroforetickém pohybu nabitých molekul. V některých případech elektroforézy s nemodifikovanou kapilárou, je endoosmotický tok větší než elektroforetický pohyb. Proto se jak kationty, tak anionty pohybují směrem ke katodě. JAK VZNIKÁ ELEKTROFEROGRAM rychlost zóny : POČÍTÁNÍ POHYBLIVOSTÍ t mig,i, t eof l d, l c, U Čas t, který potřebuje analyt, aby přemigroval délkou kapiláry L, je nepřímo úměrný jeho celkové rychlosti, která je (vektorovým) součtem rychlosti elektroforetické a té, kterou přispívá EOF: L r v EO v ef t = ( r + ) znamená to, že při výpočtu skutečné elektroforetické mobility z experimentálně změřeného času, musíme příspěvek elektroosmotického toku vektorově odečítat. m ef,i > 0 pro kationty m ef,i < 0 pro anionty m poz,i > 0 pro oboje, pokud Skripta : Elektroforetické analytické metody Skripta : Elektroforetické analytické metody

17 4.3. Modifikátory elektroosmotického toku (EFM) tenzidy neboli surfaktanty 5. ZÁKLADY INSTRUMENTACE Bližší pohled na surfaktanty Surfaktanty jsou známé povrchově aktivní látky, např. mýdla. Molekula surfaktantu má oddělenou polární a nepolární část. Při malých koncentracích tvoří běžné (pravé) roztoky, při vysokých však již nejsou v kapalině homogeně rozptýlené. Zásadní vlastností surfaktantů je jejich zakoncentrovávání se na mezifázích. Vpřípadě systému křemenná kapilára roztok může dojít k navázání surfaktantů nejen adsorpcí, ale i elektrostatickými silami. V případě kationogenních tenzidů lze tímto způsobem elektroosmotický tok zmenšit, dokonce i obrátit jeho směr, jak je znázorněno na obrázku. MEKC Je-li koncentrace surfaktantu vyšší než tzv. kritická micelární koncentrace, vytvoří se micely. Micely jsou shluky, které mají (ve vodném prostředí) hydrofobní jádro a navenek obnaženy hydrofilní části molekul (micelární fáze). Analyty tak při pohybu v elektrolytu, kde se vyskytuje micelární fáze, mohou být distribuovány mezi elektrolyt a micely (podle své chemické afinity k micele) a tím měnit svoji celkovou rychlost pohybu kapilárou. Tato změna rychlosti je obvykle zvýšena tím, že sama micela nese náboj a proto se v elektrickém poli sama pohybuje. Surfaktanty jsou používány k separaci malých velmi málo nabitých nebo nulově nabitých molekul surfaktant v nadkritické micelární koncentraci tvoří micely a tomuto módu elektroforézy se říká Micelární elektrokinetická chromatografie (MECC nebo MEKC) 5.1. Pracovní podmínky Křemenná kapilára (I.D um) Řada známých elektrolytů s tlumícími schopnostmi Vysoké napětí (5-30 kv) Proud (1-200 ua) 5.2. Dávkování vzorku Elektrokinetické Hydrostatické Hydrodynamické (pneumatické) 5.3. Módy detekce UV/Vis detektor Fluorescenční detektor Vodivostní detektor Elektrochemický detektor Hmotnostní (MS, Mass spectrometry) Radioaktivní detektor (s beta zářičem) Post column dervatizační detekce Skripta : Elektroforetické analytické metody Skripta : Elektroforetické analytické metody

18 5.1. Pracovní podmínky Typická napětí jsou v rozsahu 5-30 kv, aby produkovaly proudy v rozsahu µa. Vyšší proudy mohou způsobovat nadměrný ohřev uvnitř kapiláry, který už nelze efektivně odvádět, což má za následek rozmývání zón a ztrátu rozlišeni (separace). kapiláry Kapiláry jsou obvykle z taveného křemene, na vnějším povrchu chráněné polyimidovým potahem, protože tavený křemen je velmi křehký (existují ale i kapiláry z UV propustného polymeru). Kvůli optické detekci, část ochraného potahu je sejmuta a toto okénko je centrováno do detektoru mezi dvě kulové čočky. Délka kapiláry je typicky cm, vnitřní průměr 50 nebo 75 mikrometrů. Na komerčních zařízeních bývá kapilára upevněna v kazetě, aby se zabránilo přelomení případně pohybu kapiláry v optickém okénku. Vnitřní povrch kapiláry může být modifikován dynamicky (EFM, např. surfaktantem v základním elektrolytu) nebo chemicky kovalentní (např. PVA). regulace teploty Regulace teploty kapiláry je nutná pro zajištění dobrého rozlišení a reprodukovatelnosti. Uživatelem sestavované přístroje nebyly vybaveny termostatem (spoléhají na přirozené chlazení vzduchem), komerční přístroje jsou vybaveny chlazením kapiláry nucenou ventilací chlazeného bloku, ale např. fa Beckman má kazety s kapilárou neprodyšně uzavřenou a chlazenou chladící kapalinou. detektory Většina přístrojů CE používá optický UV detektor, případně vybavený diodovým polem, díky kterému je přístroj schopen velmi rychle (v průběhu analýzy) snímat celá spektra. Možností jsou i fluorescenční detektory s laserovou indukcí záření, které jsou vysoce citlivé, ale omezeny na fluoreskující látky. Třetí nejpoužívanější detektor je vodivostní, který má buď elektrody přímo v elektrolytu nebo je bezkontaktní, nasunut kolem kapiláry. Při napojení MS za kapiláru (vyžaduje speciální interface) lze hovořit o detektoru hmotnostním (CE-MS), který dává strukturní informace o separovaných zónách. Pro zvýšení citlivosti, což je jeden z problému CE, byly zkonstruovány tzv. bubble cells, kde je lokálně zvětšen vnitřní průměr kapiláry, nebo Z-cely, kde je kapilára přerušena, radiálně posunuta a optická dráha měrného paprsku je tak několikanásobně prodloužena (podobný princip jako u UV detektorů vlc). Skripta : Elektroforetické analytické metody Skripta : Elektroforetické analytické metody

19 Z-cela Detektory jsou běžně spojeny s počítačem, který řídí sběr dat a umožňuje pohodlnou kvantitativní analýzu. dávkování vzorku Roztok vzorku nuceně vniká do jednoho konce kapiláry, typicky vzdálenějšího od detektoru. Typické dávkované objemy jsou mezi nl (objemy kapiláry jsou 1-2 µl). Je-li kapilára volně v prostoru, lze použít hydrostatické dávkování zvednutím dávkovacího konce kapiláry nad úroveň druhého konce (sifonový efekt). Většinou se ale používá aplikace přetlaku na nádobku u injekčního konce kapiláry nebo podtlaku na nádobku u detektorového konce. To samozřejmě vyžaduje pneumaticky uzavřený systém nádobky-kapilára. Třetí možností je dávkování aplikovaným napětím, kdy na dávkovacím konci kapiláry je nádobka se vzorkem. Tento poslední způsob je např. jediný možný u gelové kapilární elektroforézy, ale má nevýhodu, že dávkuje přednostně mobilnější ionty na úkor méně mobilních či neutrálních (nedávkujeme reprezentativní vzorek) 5.2. Nepřímá detekce v CE Nepřímá detekce představuje možnost, jak získat nejběžnějším UV-VIS detektorem signál analytů, které samy v této oblasti neabsorbují (tzn. nemají vhodný chromofor, což je celé řada malých anorganických kationtů i aniontů). Principem nepřímé detekce je použití elektrolytu, který sám absorbuje; putující zóny představují pro optický detektor zóny zředění, čili poklesu signálu (viz obrázek). Při výběru absorbujícího elektrolytu musíme mimo optické vlastnosti zvažovat i znaménko a velikost elektroforetické pohyblivosti absorbujících iontů. Dávkování vzorku v CE - + Skripta : Elektroforetické analytické metody Skripta : Elektroforetické analytické metody

20 6. SEPARAČNÍ MÓDY V KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZE CZE (FSCE) CGE CIEF CITP CEC MEKC (MECC) Diskontinuální elektroforéze (Discontinous Electrophoresis) CE v nevodném prostředí Capillary Zone Electrophoresis Capillary IsoElectric Focusing Capillary IsoTachoPhoresis CZE CIEF CITP Skripta : Elektroforetické analytické metody Skripta : Elektroforetické analytické metody

Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti ELEKTROMIGRAČNÍ METODY

Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti ELEKTROMIGRAČNÍ METODY Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti ELEKTROMIGRAČNÍ METODY ELEKTROFORÉZA K čemu to je? kritérium čistoty preparátu stanovení molekulové hmotnosti makromolekul stanovení izoelektrického

Více

IZOTACHOFORÉZA. Teoretická část

IZOTACHOFORÉZA. Teoretická část IZOTACHOFORÉZA Teoretická část Izotachoforéza se liší od ostatních elektroforetických metod tím, že vzorek je vnášen mezi dva různé elektrolyty - vedoucí (leading L) a koncový (terminating T). Ty musí

Více

APLIKOVANÉ ELEKTROMIGRAČNÍ METODY

APLIKOVANÉ ELEKTROMIGRAČNÍ METODY APLIKOVANÉ ELEKTROMIGRAČNÍ METODY Princip: migrace elektricky nabitých částic v elektrickém poli Druhy iontů: +, -, obojaký (zwitterion), vícenásobný Typy migrace: a) přímá migrují ionty analytů b) nepřímá

Více

Elektromigrační metody

Elektromigrační metody Elektromigrační metody Princip: molekuly nesoucí náboj se pohybují ve stejnosměrném elektrickém Arne Tiselius rozdělil proteiny krevního séra na základě jejich rozdílných rychlostí pohybu v elektrickém

Více

laktoferin BSA α S2 -CN α S1 -CN Popis: BSA bovinní sérový albumin, CN kasein, LG- laktoglobulin, LA- laktalbumin

laktoferin BSA α S2 -CN α S1 -CN Popis: BSA bovinní sérový albumin, CN kasein, LG- laktoglobulin, LA- laktalbumin Aktivita KA 2340/4-8up Stanovení bílkovin v mléce pomocí SDS PAGE (elektroforéza na polyakrylamidovém gelu s přídavkem dodecyl sulfátu sodného) vypracovala: MVDr. Michaela Králová, Ph.D. Princip: Metoda

Více

Vizualizace DNA ETHIDIUM BROMID. fluorescenční barva interkalační činidlo. do gelu do pufru barvení po elfu SYBR GREEN

Vizualizace DNA ETHIDIUM BROMID. fluorescenční barva interkalační činidlo. do gelu do pufru barvení po elfu SYBR GREEN ETHIDIUM BROMID fluorescenční barva interkalační činidlo do gelu do pufru barvení po elfu Vizualizace DNA SYBR GREEN Barvení proteinů Coommassie Brilliant Blue Coomassie Blue x barvení stříbrem Porovnání

Více

Analýza aniontových tenzidů v čisticích prostředcích kapilární elektroforézou

Analýza aniontových tenzidů v čisticích prostředcích kapilární elektroforézou Analýza aniontových tenzidů v čisticích prostředcích kapilární elektroforézou Úkol: Pomocí kapilární elektroforézy v nevodném prostředí semikvantitativně stanovte vybrané aniontové tenzidy v čisticím prostředku.

Více

Příprava materiálu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253

Příprava materiálu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253 Příprava materiálu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253 Část 16 Iontová chromatografie Iontová chromatografie je speciální technika vyvinutá pro separaci anorganických iontů a organických

Více

Separační metody v analytické chemii. Plynová chromatografie (GC) - princip

Separační metody v analytické chemii. Plynová chromatografie (GC) - princip Plynová chromatografie (GC) - princip Plynová chromatografie (Gas chromatography, zkratka GC) je typ separační metody, kdy se od sebe oddělují složky obsažené ve vzorku a které mohou být převedeny do plynné

Více

Identifikace a stanovení chininu v toniku pomocí CE-MS

Identifikace a stanovení chininu v toniku pomocí CE-MS Identifikace a stanovení chininu v toniku pomocí CE-MS Úkol: Stanovte množství chininu v nealkoholickém nápoji (tonik) pomocí kapilární zónové elektroforézy ve spojení s hmotnostní spektrometrií Teoretická

Více

4. Elektromigrační separační metody

4. Elektromigrační separační metody 4. Elektromigrační separační metody Elektromigrační separační metody využívají dvou elektrokinetických jevů elektroforézy a elektroosmózy. V prostředí obsahujícím roztok s nabitými částicemi a pevné povrchy

Více

Průtokové metody (Kontinuální měření v proudu kapaliny)

Průtokové metody (Kontinuální měření v proudu kapaliny) Průtokové metody (Kontinuální měření v proudu kapaliny) 1. Přímé měření: analyzovaná kapalina většinou odvětvena + vhodný detektor 2. Kapalinová chromatografie (HPLC) Stanovení po předchozí separaci 3.

Více

Stanovení paracetamolu, kofeinu a propyfenazonu v tabletách Valetol

Stanovení paracetamolu, kofeinu a propyfenazonu v tabletách Valetol Úkol: Stanovení paracetamolu, kofeinu a propyfenazonu v tabletách Valetol pomocí CE-LIF Proveďte separaci a následné stanovení účinných látek (paracetamol, propyfenazon, kofein) v přípravku Valetol pomocí

Více

Elektroforéza v přítomnosti SDS SDS PAGE

Elektroforéza v přítomnosti SDS SDS PAGE Elektroforéza v přítomnosti SDS SDS PAGE Elektroforéza v přítomnosti SDS SDS PAGE je jednoduchá, rychlá a reprodukovatelná metoda pro kvalifikovanou charakterizaci a srovnání bílkovin.tato metoda separuje

Více

Typy molekul, látek a jejich vazeb v organismech

Typy molekul, látek a jejich vazeb v organismech Typy molekul, látek a jejich vazeb v organismech Typy molekul, látek a jejich vazeb v organismech Organismy se skládají z molekul rozličných látek Jednotlivé látky si organismus vytváří sám z jiných látek,

Více

IONOSEP v analýze vody. Využití analyzátorů IONOSEP pro analýzu vod. Doc. Ing. František KVASNIČKA, CSc.

IONOSEP v analýze vody. Využití analyzátorů IONOSEP pro analýzu vod. Doc. Ing. František KVASNIČKA, CSc. Využití analyzátorů IONOSEP pro analýzu vod Doc. Ing. František KVASNIČKA, CSc. IONOSEP v analýze vody Kapilární isotachoforesa nebo její kombinace se zónovou elektroforesou je svými vlastnostmi velmi

Více

IMUNOANALÝZA elektroforetické separační metody. 3. ročník Klinická biologie a chemie

IMUNOANALÝZA elektroforetické separační metody. 3. ročník Klinická biologie a chemie IMUNOANALÝZA elektroforetické separační metody 3. ročník Klinická biologie a chemie Princip elektroforézy I. Separační metoda využívající různé pohyblivosti různých iontů (složek směsi) ve stejnosměrném

Více

Obr. 1. Stuktura glukózy, fruktózy a sacharózy.

Obr. 1. Stuktura glukózy, fruktózy a sacharózy. 1. Analýza sacharidů v medu pomocí kapilární elektroforézy Med je přírodní produkt, který vyrábí včely z nektaru různých rostlin. Jedná se o vodný přesycený roztok sacharidů, který obsahuje také komplexní

Více

Trendy v moderní HPLC

Trendy v moderní HPLC Trendy v moderní HPLC Josef Cvačka, 5.1.2011 CHROMATOGRAFIE NA ČIPECH Miniaturizace separačních systémů Mikrofluidní čipy Mikrofabrikace Chromatografické mikrofluidní čipy s MS detekcí Praktické využití

Více

IZOLACE, SEPARACE A DETEKCE PROTEINŮ I. Vlasta Němcová, Michael Jelínek, Jan Šrámek

IZOLACE, SEPARACE A DETEKCE PROTEINŮ I. Vlasta Němcová, Michael Jelínek, Jan Šrámek IZOLACE, SEPARACE A DETEKCE PROTEINŮ I Vlasta Němcová, Michael Jelínek, Jan Šrámek Studium aktinu, mikrofilamentární složky cytoskeletu pomocí dvou metod: detekce přímo v buňkách - fluorescenční barvení

Více

THE USING OF CARRIER AMPHOLYTE-FREE ISOELECTRIC FOCUSING (CAF-IEF) FOR ANALYSIS OF STRESS PROTEINS

THE USING OF CARRIER AMPHOLYTE-FREE ISOELECTRIC FOCUSING (CAF-IEF) FOR ANALYSIS OF STRESS PROTEINS THE USING OF CARRIER AMPHOLYTE-FREE ISOELECTRIC FOCUSING (CAF-IEF) FOR ANALYSIS OF STRESS PROTEINS VYUŽITÍ ISOELEKTRICKÉ FOKUSACE BEZ NOSNÝCH AMFOLYTŮ (CAF IEF) PRO ANALÝZU STRESOVÝCH PROTEINŮ Procházková

Více

ELEKTROFORETICKÁ SEPARACE NUKLEOVÝCH KYSELIN

ELEKTROFORETICKÁ SEPARACE NUKLEOVÝCH KYSELIN ELEKTROFORETICKÁ SEPARACE NUKLEOVÝCH KYSELIN Fragmenty nukleových kyselin lze dle jejich velikosti rozdělit elektroforézou. Elektroforéza využívá rozdílné pohyblivosti jednotlivých fragmentů, danou právě

Více

Opakování

Opakování Slabé vazebné interakce Opakování Co je to atom? Opakování Opakování Co je to atom? Atom je nejmenší částice hmoty, chemicky dále nedělitelná. Skládá se z atomového jádra obsahujícího protony a neutrony

Více

Analýza kofeinu v kávě pomocí kapalinové chromatografie

Analýza kofeinu v kávě pomocí kapalinové chromatografie Analýza kofeinu v kávě pomocí kapalinové chromatografie Kofein (obr.1) se jako přírodní alkaloid vyskytuje v mnoha rostlinách (např. fazolích, kakaových bobech, černém čaji apod.) avšak nejvíce je spojován

Více

Hmotnostní spektrometrie

Hmotnostní spektrometrie Hmotnostní spektrometrie Princip: 1. Ze vzorku jsou tvořeny ionty na úrovni molekul, nebo jejich zlomků (fragmentů), nebo až volných atomů dodáváním energie, např. uvolnění atomů ze vzorku nebo přímo rozštěpení

Více

Stanovení biochemicky významných flavinů pomocí kapilární elektroforézy s fluorescenční detekcí

Stanovení biochemicky významných flavinů pomocí kapilární elektroforézy s fluorescenční detekcí Teoretická část Stanovení biochemicky významných flavinů pomocí kapilární elektroforézy s fluorescenční detekcí Mezi biochemicky významné flaviny patří kofaktory flavinmononukleotid (FMN) a flavinadenindinukleotid

Více

DETEKTORY pro kapalinovou chromatografii. Izolační a separační metody, 2018

DETEKTORY pro kapalinovou chromatografii. Izolační a separační metody, 2018 DETEKTORY pro kapalinovou chromatografii Izolační a separační metody, 2018 Detektory v kapalinové chromatografii Typ detektoru Zkratka Měřená veličina Refraktometrický detektor RID index lomu Spektrofotometrický

Více

Izolace nukleových kyselin

Izolace nukleových kyselin Izolace nukleových kyselin Požadavky na izolaci nukleových kyselin V nativním stavu z přirozeného materiálu v dostatečném množství požadované čistotě. Nukleové kyseliny je třeba zbavit všech látek, které

Více

Elektroforéza - II (v klasickém provedení) Příprava předmětu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253

Elektroforéza - II (v klasickém provedení) Příprava předmětu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253 Elektroforéza - II (v klasickém provedení) Příprava předmětu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253 Imunoelektroforéza Obvykle dvourozměrná elektroforéza na agarózových gelech V prvním rozměru

Více

Inovace bakalářského studijního oboru Aplikovaná chemie CZ.1.07/2.2.00/

Inovace bakalářského studijního oboru Aplikovaná chemie CZ.1.07/2.2.00/ Dělení bílkovin pomocí diskontinuální elektroforézy v polyakrylamidovém gelu (PAGE) Při elektroforéze dochází k pohybu (migraci) iontů v elektrickém poli. Elektroforetické metody se tedy používají k separaci

Více

PREKONCENTRAČNÍ TECHNIKY V KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZE

PREKONCENTRAČNÍ TECHNIKY V KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZE MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Ústav biochemie Návod do cvičení PREKONCENTRAČNÍ TECHNIKY V KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZE LABORATORNÍ CVIČENÍ Mgr. Aleš Mádr 2012 Vzniklo díky finanční podpoře Ministerstva

Více

SDS polyakrylamidová gelová elektroforéza (SDS PAGE)

SDS polyakrylamidová gelová elektroforéza (SDS PAGE) SDS polyakrylamidová gelová elektroforéza (SDS PAGE) Princip SDS polyakrylamidová gelová elektroforéza slouží k separaci proteinů na základě jejich velikosti (molekulové hmotnosti). Zahřátím vzorku za

Více

12. Elektrochemie základní pojmy

12. Elektrochemie základní pojmy Důležité veličiny Elektroda, článek Potenciometrie Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti Důležité veličiny proud I (ampér - A) náboj Q (coulomb - C) Q t 0 I dt napětí, potenciál

Více

Vícefázové reaktory. Probublávaný reaktor plyn kapalina katalyzátor. Zuzana Tomešová

Vícefázové reaktory. Probublávaný reaktor plyn kapalina katalyzátor. Zuzana Tomešová Vícefázové reaktory Probublávaný reaktor plyn kapalina katalyzátor Zuzana Tomešová 2008 Probublávaný reaktor plyn - kapalina - katalyzátor Hydrogenace méně těkavých látek za vyššího tlaku Kolony naplněné

Více

PLYNOVÁ CHROMATOGRAFIE (GC)

PLYNOVÁ CHROMATOGRAFIE (GC) PLYNOVÁ CHROMATOGRAFIE (GC) Dělení látek mezi stacionární a mobilní fázi na základě rozdílů v těkavosti a struktuře (separované látky vykazují rozdílnou chromatografickou afinitu) Metoda vhodná pro látky:

Více

VYUŽITÍ BEZKONTAKTNÍ VODIVOSTNÍ DETEKCE PRO HPLC SEPARACI POLYKARBOXYLÁTOVÝCH DERIVÁTŮ CYKLENU. Anna Hamplová

VYUŽITÍ BEZKONTAKTNÍ VODIVOSTNÍ DETEKCE PRO HPLC SEPARACI POLYKARBOXYLÁTOVÝCH DERIVÁTŮ CYKLENU. Anna Hamplová VYUŽITÍ BEZKOTAKTÍ VODIVOSTÍ DETEKCE PRO HPLC SEPARACI POLYKARBOXYLÁTOVÝCH DERIVÁTŮ CYKLEU Anna Hamplová Univerzita Karlova v Praze, Přírodovědecká fakulta, Katedra analytické chemie Albertov 6, 128 43

Více

Elektromigrační metody

Elektromigrační metody Elektromigrační metody Separační techniky Separace je selektivní převod látek mezi fázemi systému, nebo jejich rozdělení v jedné fázi v určitém směru. Separační techniky Rovnovážné techniky Nerovnovážné

Více

Chromatofokusace. separace proteinů na základě jejich pi vysoké rozlišení. není potřeba připravovat ph gradient zaostřovací efekt jednoduchost

Chromatofokusace. separace proteinů na základě jejich pi vysoké rozlišení. není potřeba připravovat ph gradient zaostřovací efekt jednoduchost Chromatofokusace separace proteinů na základě jejich pi vysoké rozlišení není potřeba připravovat ph gradient zaostřovací efekt jednoduchost Polypufry - amfolyty Stacionární fáze Polybuffer 96 - ph 9-6

Více

Stanovení organofosforových pesticidů ve vodě a půdě micelární elektrokinetickou chromatografií

Stanovení organofosforových pesticidů ve vodě a půdě micelární elektrokinetickou chromatografií Stanovení organofosforových pesticidů ve vodě a půdě micelární elektrokinetickou chromatografií Úkol: Proveďte extrakci organofosforových pesticidů z reálných vzorků vody a půdy. Dále proveďte jejich separaci

Více

Klinická a farmaceutická analýza. Petr Kozlík Katedra analytické chemie

Klinická a farmaceutická analýza. Petr Kozlík Katedra analytické chemie Klinická a farmaceutická analýza Petr Kozlík Katedra analytické chemie e-mail: kozlik@natur.cuni.cz http://web.natur.cuni.cz/~kozlik/ 1 Spojení separačních technik s hmotnostní spektrometrem Separační

Více

Afinitní kapilární elektroforéza

Afinitní kapilární elektroforéza Pražské analytické centrum inovací Projekt CZ.04.3.07/4.2.01.1/0002 spolufinancovaný ESF a Státním rozpočtem ČR Afinitní kapilární elektroforéza Věra Pacáková a Tereza Vařilová PřF UK Praha Obsah 1. Úvod

Více

Superkritická fluidní extrakce (SFE) Superkritická fluidní extrakce

Superkritická fluidní extrakce (SFE) Superkritická fluidní extrakce Superkritická fluidní extrakce (zkráceně SFE, z angl. Supercritical Fluid Extraction) = extrakce, kde extrakčním činidlem je tekutina v superkritickém stavu, tzv. superkritická (nadkritická) tekutina (zkráceně

Více

Molekulová spektroskopie 1. Chemická vazba, UV/VIS

Molekulová spektroskopie 1. Chemická vazba, UV/VIS Molekulová spektroskopie 1 Chemická vazba, UV/VIS 1 Chemická vazba Silová interakce mezi dvěma atomy. Chemické vazby jsou soudržné síly působící mezi jednotlivými atomy nebo ionty v molekulách. Chemická

Více

CHROMATOGRAFIE ÚVOD Společný rys působením nemísících fází: jedna fáze je nepohyblivá (stacionární), druhá pohyblivá (mobilní).

CHROMATOGRAFIE ÚVOD Společný rys působením nemísících fází: jedna fáze je nepohyblivá (stacionární), druhá pohyblivá (mobilní). CHROMATOGRAFIE ÚOD Existují různé chromatografické metody, viz rozdělení metod níže. Společný rys chromatografických dělení: vzorek jako směs látek - složek se dělí na jednotlivé složky působením dvou

Více

Obsah Protein Gel Electrophoresis Kitu a jeho skladování

Obsah Protein Gel Electrophoresis Kitu a jeho skladování Obsah Protein Gel Electrophoresis Kitu a jeho skladování Protein Gel Electrophoresis Kit obsahuje veškerý potřebný materiál provádění vertikální polyakrilamidové gelové elektroforézy. Experiment provádějí

Více

Chirální separace v CE

Chirální separace v CE Chirální separace v CE Chiralitu vykazují jak organické sloučeniny tak anorganické sloučeniny. Projevuje se existencí dvou konstitučně identických molekul (enantiomerů), které se liší pouze ve vzájemném

Více

Pražské analytické centrum inovací Projekt CZ / /0002 spolufinancovaný ESF a Státním rozpočtem ČR

Pražské analytické centrum inovací Projekt CZ / /0002 spolufinancovaný ESF a Státním rozpočtem ČR Pražské analytické centrum inovací Projekt CZ.04.3.07/4.2.01.1/0002 spolufinancovaný ESF a Státním rozpočtem ČR SEPARACE PROTEINŮ Preparativní x analytická /měřítko, účel/ Zvláštnosti dané povahou materiálu

Více

HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE

HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE MASS SPECTROMETRY (MS) Alternativní názvy (spojení s GC, LC, CZE, ITP): Hmotnostně spektrometrický (selektivní) detektor Mass spectrometric (selective) detector (MSD) Spektrometrie

Více

ÚPRAVA VODY V ENERGETICE. Ing. Jiří Tomčala

ÚPRAVA VODY V ENERGETICE. Ing. Jiří Tomčala ÚPRAVA VODY V ENERGETICE Ing. Jiří Tomčala Úvod Voda je v elektrárnách po palivu nejdůležitější surovinou Její množství v provozních systémech elektráren je mnohonásobně větší než množství spotřebovaného

Více

Seminář izolačních technologií

Seminář izolačních technologií Seminář izolačních technologií Zpracoval: Karel Bílek a Kateřina Svobodová Podpořeno FRVŠ 2385/2007 a 1305/2009 Úpravy a aktualizace: Pavla Chalupová ÚMFGZ MZLU v Brně 1 Lokalizace jaderné DNA 2 http://www.paternityexperts.com/basicgenetics.html

Více

Stanovení cholesterolu ve vaječném žloutku a mléce kapilární elektroforézou

Stanovení cholesterolu ve vaječném žloutku a mléce kapilární elektroforézou Stanovení cholesterolu ve vaječném žloutku a mléce kapilární elektroforézou Úkol Stanovte obsah cholesterolu ve vaječném žloutku a mléce pomocí kapilární elektroforézy. Teoretická část Cholesterol je steroidní

Více

Při reálném chromatografickém ději nikdy nedojde k ustavení rovnováhy mezi oběma fázemi První ucelená teorie respektující uvedenou skutečnost byla

Při reálném chromatografickém ději nikdy nedojde k ustavení rovnováhy mezi oběma fázemi První ucelená teorie respektující uvedenou skutečnost byla Teorie chromatografie - III Příprava předmětu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253 4.3.3 Teorie dynamická Při reálném chromatografickém ději nikdy nedojde k ustavení rovnováhy mezi oběma

Více

SPE je metoda vhodná pro rychlou přípravu vzorků, která užívá

SPE je metoda vhodná pro rychlou přípravu vzorků, která užívá Extrakce na pevné fázi (SPE) Příprava předmětu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253 Extrakce na pevné fázi (SPE) (Solid Phase Extraction) SPE je metoda vhodná pro rychlou přípravu vzorků,

Více

Skupenské stavy látek. Mezimolekulární síly

Skupenské stavy látek. Mezimolekulární síly Skupenské stavy látek Mezimolekulární síly 1 Interakce iont-dipól Např. hydratační (solvatační) interakce mezi Na + (iont) a molekulou vody (dipól). Jde o nejsilnější mezimolekulární (nevazebnou) interakci.

Více

Aplikační rozsah chromatografie

Aplikační rozsah chromatografie Chromatografické metody II. Aplikační rozsah chromatografie Chromatografie Kapalinová chromatografie rozdělení Nízkotlaká (atmosferický tlak) LPC Střednětlaká (4 Mpa) FPLC Vysokotlaká (40 Mpa) HPLC Ultravysokotlaká

Více

Aplikace elektromigračních technik

Aplikace elektromigračních technik Aplikace elektromigračních technik Capillary electrophoresis D.L.Barker High Performance Capillary electrophoresis M.G. Khaledi Analysis and detection by capillary electrophoresis M.L.Marina (ed.) Electrophoresis

Více

Gelová permeační chromatografie

Gelová permeační chromatografie Gelová permeační chromatografie (Gel Permeation Chromatography - GPC) - separační a čisticí metoda - umožňuje separaci skupin sloučenin s podobnou molekulovou hmotností (frakcionace) - analyty jsou po

Více

ZÁKLADY OBECNÉ A KLINICKÉ BIOCHEMIE

ZÁKLADY OBECNÉ A KLINICKÉ BIOCHEMIE ZÁKLADY OBECNÉ A KLINICKÉ BIOCHEMIE 2004 Technologie kvantitativních metod Petr Štern kapitola ve skriptech - 4.2.2 Optické zdroje U V V I S I R Spektrální distribuční křivky W žárovky b.t. W ~ 3600 C

Více

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) Příprava předmětu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253 Kapalinová chromatografie (LC) 1.1. Teorie kapalinové

Více

U = E a - E k + IR Znamená to, že vložené napětí je vyrovnáváno

U = E a - E k + IR Znamená to, že vložené napětí je vyrovnáváno Voltametrie a polarografie Princip. Do roztoku vzorku (elektrolytu) jsou ponořeny dvě elektrody (na rozdíl od potenciometrie prochází obvodem el. proud) - je vytvořen elektrochemický článek. Na elektrody

Více

Stanovení kritické micelární koncentrace

Stanovení kritické micelární koncentrace Stanovení kritické micelární koncentrace TEORIE KONDUKTOMETRIE Měrná elektrická vodivost neboli konduktivita je fyzikální veličinou, která popisuje schopnost látek vést elektrický proud. Látky snadno vedoucí

Více

Kurz 1 Úvod k biochemickému praktiku

Kurz 1 Úvod k biochemickému praktiku Kurz 1 Úvod k biochemickému praktiku Pavla Balínová http://vyuka.lf3.cuni.cz/ Důležité informace Kroužkový asistent: RNDr. Pavla Balínová e-mailová adresa: pavla.balinova@lf3.cuni.cz místnost: 410 studijní

Více

Univerzita Karlova v Praze

Univerzita Karlova v Praze Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta Klinická a toxikologická analýza Bc. Tereza Kadlecová Kapilární elektroforéza s duální optickou a bezkontaktní vodivostní detekcí Capillary electrophoresis

Více

Teorie kyselin a zásad poznámky 5.A GVN

Teorie kyselin a zásad poznámky 5.A GVN Teorie kyselin a zásad poznámky 5A GVN 13 června 2007 Arrheniova teorie platná pouze pro vodní roztoky kyseliny jsou látky schopné ve vodném roztoku odštěpit vodíkový kation H + HCl H + + Cl - CH 3 COOH

Více

1. Příloha 1 Návod úlohy pro Pokročilé praktikum z biochemie I

1. Příloha 1 Návod úlohy pro Pokročilé praktikum z biochemie I 1. Příloha 1 Návod úlohy pro Pokročilé praktikum z biochemie I Vazba bromfenolové modři na sérový albumin Princip úlohy Albumin má unikátní vlastnost vázat menší molekuly mnoha typů. Díky struktuře, tvořené

Více

Hewlett-Packard - David N. Heiger High Performance Capillary Electrophoresis,1992, Publication Number E

Hewlett-Packard - David N. Heiger High Performance Capillary Electrophoresis,1992, Publication Number E Kapilární elektroforéza, CE I Capillary electrophoresis Příprava předmětu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253 Kapilární elektroforéza Hewlett-Packard - David N. Heiger High Performance

Více

Metody separace. přírodních látek

Metody separace. přírodních látek Metody separace přírodních látek (5) Chromatografie; základní definice a klasifikace ruzných metod; kapalinová chromatografie, plynová chromatografie, přístrojová technika. Chromatografie «F(+)d» 1897

Více

ELEKTRICKÝ PROUD ELEKTRICKÝ ODPOR (REZISTANCE) REZISTIVITA

ELEKTRICKÝ PROUD ELEKTRICKÝ ODPOR (REZISTANCE) REZISTIVITA ELEKTRICKÝ PROD ELEKTRICKÝ ODPOR (REZISTANCE) REZISTIVITA 1 ELEKTRICKÝ PROD Jevem Elektrický proud nazveme usměrněný pohyb elektrických nábojů. Např.:- proud vodivostních elektronů v kovech - pohyb nabitých

Více

Stanovení izoelektrického bodu kaseinu

Stanovení izoelektrického bodu kaseinu Stanovení izoelektrického bodu kaseinu Shlukování koloidních částic do větších celků makroskopických rozměrů nazýváme koagulací. Ke koagulaci koloidních roztoků bílkovin dochází porušením solvatačního

Více

Netkané textilie. Materiály 2

Netkané textilie. Materiály 2 Materiály 2 1 Pojiva pro výrobu netkaných textilií Pojivo je jednou ze dvou základních složek pojených textilií. Forma pojiva a jeho vlastnosti předurčují technologii a podmínky procesu pojení způsob rozmístění

Více

KAPILÁRNÍ ZÓNOVÁ ELEKTROFORÉZA

KAPILÁRNÍ ZÓNOVÁ ELEKTROFORÉZA KPILÁRNÍ ZÓNOVÁ ELEKTROFORÉZ Zadání úlohy Metodou kapilární zónové elektroforézy stanovte disociační konstantu p-nitrofenolu. Teoretický úvod Kapilární zónová elektroforéza (CZE capillary zone electrophoresis)

Více

Chromatografie polymerů III.: IC+LC CC+LC LC. FFF-Field flow fractionation (Frakcionace tokem v silovém poli)

Chromatografie polymerů III.: IC+LC CC+LC LC. FFF-Field flow fractionation (Frakcionace tokem v silovém poli) Přednáška 3 Chromatografie polymerů III.: IC+LC CC+LC LC FFF-Field flow fractionation (Frakcionace tokem v silovém poli) Studijní opora pro studenty registrované v akademickém roce 2013/2014 na předmět:

Více

LABORATOŘ OBORU I ÚSTAV ORGANICKÉ TECHNOLOGIE (111) Použití GC-MS spektrometrie

LABORATOŘ OBORU I ÚSTAV ORGANICKÉ TECHNOLOGIE (111) Použití GC-MS spektrometrie LABORATOŘ OBORU I ÚSTAV ORGANICKÉ TECHNOLOGIE (111) C Použití GC-MS spektrometrie Vedoucí práce: Doc. Ing. Petr Kačer, Ph.D., Ing. Kamila Syslová Umístění práce: laboratoř 79 Použití GC-MS spektrometrie

Více

Kapaliny Molekulové vdw síly, vodíkové můstky

Kapaliny Molekulové vdw síly, vodíkové můstky Kapaliny Molekulové vdw síly, vodíkové můstky Metalické roztavené kovy, ionty + elektrony, elektrostatické síly Iontové roztavené soli, FLINAK (LiF + NaF + KF), volně pohyblivé anionty a kationty, iontová

Více

No. 1- určete MW, vysvětlení izotopů

No. 1- určete MW, vysvětlení izotopů No. 1- určete MW, vysvětlení izotopů ESI/APCI + 325 () 102 (35) 327 (33) 326 (15) 328 (5) 150 200 250 300 350 400 450 500 ESI/APCI - 323 () 97 (51) 325 (32) 324 (13) 326 (6) 150 200 250 300 350 400 450

Více

Odměrná analýza, volumetrie

Odměrná analýza, volumetrie Odměrná analýza, volumetrie metoda založená na měření objemu metoda absolutní: stanovení analytu ze změřeného objemu roztoku činidla o přesně známé koncentraci, který je zapotřebí k úplné a stechiometricky

Více

HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE

HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE A MOŽNOSTI JEJÍHO SPOJENÍ SE SEPARAČNÍMI METODAMI SEPARACE chromatografie CGC, GC x GC HPLC, UPLC, UHPLC, CHIP-LC elektromigrační m. CZE, CITP INTERFACE SPOJENÍ x ROZHRANÍ GC vyhřívaná

Více

Plazmové metody. Základní vlastnosti a parametry plazmatu

Plazmové metody. Základní vlastnosti a parametry plazmatu Plazmové metody Základní vlastnosti a parametry plazmatu Atom je základní částice běžné hmoty. Částice, kterou již chemickými prostředky dále nelze dělit a která definuje vlastnosti daného chemického prvku.

Více

Dynamika tekutin popisuje kinematiku (pohyb částice v času a prostoru) a silové působení v tekutině.

Dynamika tekutin popisuje kinematiku (pohyb částice v času a prostoru) a silové působení v tekutině. Dynamika tekutin popisuje kinematiku (pohyb částice v času a prostoru) a silové působení v tekutině. Přehled proudění Vazkost - nevazké - vazké (newtonské, nenewtonské) Stlačitelnost - nestlačitelné (kapaliny

Více

KAPILÁRNÍ ZÓNOVÁ ELEKTROFORÉZA: SIMULACE A EXPERIMENT

KAPILÁRNÍ ZÓNOVÁ ELEKTROFORÉZA: SIMULACE A EXPERIMENT KPILÁRNÍ ZÓNOVÁ ELEKTROFORÉZ: SIMULCE EXPERIMENT ZDÁNÍ ÚLOHY Navrhněte vhodný separační systém pro sadu analytů pomocí programu PeakMaster 5.1. Metodou kapilární zónové elektroforézy stanovte disociační

Více

Struktura. Velikost ionexových perliček Katex. Iontová výměna. Ionex (ion exchanger) Iontoměnič Měnič iontů. Katex (cation exchanger) Měnič kationtů

Struktura. Velikost ionexových perliček Katex. Iontová výměna. Ionex (ion exchanger) Iontoměnič Měnič iontů. Katex (cation exchanger) Měnič kationtů Ionex (ion exchanger) Iontoměnič Měnič iontů gelová Struktura makroporézní Katex (cation exchanger) Měnič kationtů Anex (anion exchanger) Měnič aniontů Velikost ionexových perliček Katex Silně kyselý katex

Více

Derivační spektrofotometrie a rozklad absorpčního spektra

Derivační spektrofotometrie a rozklad absorpčního spektra Derivační spektrofotometrie a rozklad absorpčního spektra Teorie: Derivační spektrofotometrie, využívající derivace absorpční křivky, je obecně používanou metodou pro zvýraznění detailů průběhu záznamu,

Více

Základy fotometrie, využití v klinické biochemii

Základy fotometrie, využití v klinické biochemii Základy fotometrie, využití v klinické biochemii Základní vztahy ve fotometrii transmitance (propustnost): T = I / I 0 absorbance: A = log (I 0 / I) = log (1 / T) = log T Lambertův-Beerův zákon A l = e

Více

Automatická potenciometrická titrace Klinická a toxikologická analýza Chemie životního prostředí Geologické obory

Automatická potenciometrická titrace Klinická a toxikologická analýza Chemie životního prostředí Geologické obory Automatická potenciometrická titrace Klinická a toxikologická analýza Chemie životního prostředí Geologické obory Titrace je spolehlivý a celkem nenáročný postup, jak zjistit koncentraci analytu, její

Více

STANOVENÍ SIŘIČITANŮ VE VÍNĚ

STANOVENÍ SIŘIČITANŮ VE VÍNĚ STANOVENÍ SIŘIČITANŮ VE VÍNĚ CÍLE ÚLOHY: seznámit se s principy izotachoforézy a jodometrické titrace kvantitativně stanovit siřičitany v bílém víně oběma metodami POUŽITÉ VYBAVENÍ: Chemikálie: ITP 10mM

Více

OPTIMALIZACE METODY ANODICKÉ ROZPOUŠTĚCÍ VOLTAMETRIE PRO ANALÝZU BIOLOGICKÝCH VZORKŮ S OBSAHEM RTUTI

OPTIMALIZACE METODY ANODICKÉ ROZPOUŠTĚCÍ VOLTAMETRIE PRO ANALÝZU BIOLOGICKÝCH VZORKŮ S OBSAHEM RTUTI Středoškolská technika 212 Setkání a prezentace prací středoškolských studentů na ČVUT OPTIMALIZACE METODY ANODICKÉ ROZPOUŠTĚCÍ VOLTAMETRIE PRO ANALÝZU BIOLOGICKÝCH VZORKŮ S OBSAHEM RTUTI Eliška Marková

Více

Chromatografie. Petr Breinek

Chromatografie. Petr Breinek Chromatografie Petr Breinek Chromatografie-I 2012 Společným znakem všech chromatografických metod je kontinuální dělení složek analyzované směsi mezi dvěma fázemi. Pohyblivá fáze (mobilní), eluent Nepohyblivá

Více

Principy a instrumentace

Principy a instrumentace Průtoková cytometrie Principy a instrumentace Ing. Antonín Hlaváček Úvod Průtoková cytometrie je moderní laboratorní metoda měření a analýza fyzikálních -chemických vlastností buňky během průchodu laserovým

Více

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU SELENU METODOU ICP-OES

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU SELENU METODOU ICP-OES Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU SELENU METODOU ICP-OES 1 Rozsah a účel Postup specifikuje podmínky pro stanovení celkového obsahu selenu v minerálních krmivech a premixech metodou optické emisní spektrometrie

Více

Elektroforéza - I (v klasickém provedení)

Elektroforéza - I (v klasickém provedení) Elektroforéza - I (v klasickém provedení) Příprava předmětu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253 Elektroforéza B.D.Hames, D.Rickwood - Gel electrophoresis of proteins, Practical approach,

Více