Vznik peptidů Peptidová vazba

Transkript

1 PEPTIDY A BÍLKVINY

2 Peptidová vazba Peptidy bsah Terminologie peptidů harakteristikapeptidů Přírodní peptidy Proteiny Klasifikace proteinů Struktury proteinů Stanovení sekvence aminokyselin Syntéza peptidů

3 Vznik peptidů Peptidová vazba vazba mezi karboxylem jedné aminokyseliny a a aminoskupinou další aminokyseliny 1. aminokyselina 2. aminokyselina peptidová vazba

4 kovalentní chemická vazba obsahuje seskupení atomů N typická např. pro proteiny a polypeptidy vzniká kondenzací jednotlivých aminokyselin kondenzace hydroxylové a primární aminové skupiny Peptidová vazba

5 Vlastnosti peptidové vazby Délka vazby cca 1,32 Å kratší než typická jednoduchá vazba (1,49 Å); delší než dvojná vazba (1,27 Å) (ze 40 % charakter dvojné vazby) (odnota jednoho Ångströmu je rovna 0,1 nm neboli m.) N částečně pozitivní; částečně negativní 6 atomů ve vazbě planární charakter bvykle trans konformace

6 Dvojná vazba mezi a umožňuje volnou rotaci okolo -N vazby Není možná rotace okolo -N vazby, příliš velký náboj na a N Peptidové vazby leží v rovině. Vedlejší řetězce R (zelené) směřují nad nebo pod roviny peptidových vazeb. R a N N a Správná elektronová hustota, udržuje amidovou skupinu planární R

7 Stereochemie peptidové vazby Trans is a sousedících aminoacylů v poloze trans, ta vysoce převažuje nad cis Forma cis je stericky nevýhodná N R a 1.51 A 1.32 A N 1.00 A 1.45 A a 1.24 A R

8 Prolin v peptidové vazbě může existovat v obou formách cis i trans. bě jsou prostorově shodně nevýhodné Trans is

9 N N R N R R (fí) je torzní úhel kolem vazby mez dusíkem a a-uhlíkem (psí) je torzní úhel mezi a-uhlíkem a uhlíkem karbonyl odnoty dihedrálních úhlů jsou omezeny sterickými poměry v okolí. Rotační (torzní, dihedrální = úhly mezi rovinami) úhly kolem vazeb v polypeptidu

10 Terminologie peptidů dle počtu AK ligopeptidy jsou peptidy s molekulou složenou ze dvou až 10 molekul aminokyselin dipeptidy tripeptidy tetrapeptidy Polypeptidy AK Proteiny tvořeny 1 nebo více polypeptidickými řetězci homoprotein stejné polypeptidické řetězce heteroprotein různé polypeptidické řetězce hranice polypeptid / protein není ostrá (~ 50 AMK) dříve platilo: do počtu 50 aminokyselin se jedná o peptid, při vyšším počtu pak o bílkovinu. v současnosti je posuzována poměrná molekulová hmotnost (Mr), kdy do hodnoty Mr= jde o peptid, nad tuto hodnotu bílkovinu. To odpovídá zhruba 100 aminokyselinám.

11 harakterizace peptidů Molekulová hmotnost M r se v biochemii udává se v jednotkách označených jako dalton = zkratka Da (zkratka jména Dalton - po Johnu Daltonovi) Jednotka molekulové hmotnosti, jedna dvanáctina atomové hmotnosti uhlíku 12, 1 Da = 1, kg Voda tedy má molekulovou hmotnost 18 Da (molární hmotnost 18 g/mol a relativní molekulovou hmotnost 18) Jednotka Da (často se užívají násobky kda, kilodalton); nezapadá do systému jednotek SI, ale je běžně používána pro vyjádření molekulové hmotnosti biomakromolekul peptidy do M r = (resp 10 kda) proteiny až daltonů (resp. 10 kda až 220 kda)

12 harakteristika peptidů Počet a druh AK určuje základní vlastnosti: velikost, polaritu, náboje - pi Pořadí aminoacylů určuje sekvenci, primární strukturu determinuje finální vlastnosti Směr sekvence od N k konci koncová skupina může být derivatizována (N-acyl, amid, ester) Názvosloví peptidů acylační od N konce AGK = alanylglycyllysin triviální např. insulin Amino Karboxyl terminální reziduum terminální reziduum

13 Přírodní peptidy Zvláštnosti struktury přírodních peptidů: V peptidech mohou být i neproteinogenní aminokyseliny, AK s konfigurací D Peptidy mohou být lineární nebo cyklické (cyklopeptidy - laktamy, disulfidové vazby) Isopetidové vazby (např. g-karboxyl Glu) Větvené struktury Blokování koncových aminokyselin (pyroglutamát, glycinamid)

14 Dipeptidy Karnosin: b-ala-is (běžně se vyskytuje v lidském těle a to zejména v kosterních svalech, srdci, mozečku a velkém mozku - největší koncentrace), antioxidant? Anserin: N-metylkarnosin (N-methylovaná forma karnosinu, látka obsažená ve svalových buňkách ptáků a ryb, lat. anser husa) Aspartam: dipeptid složený ze dvou aminokyselin (L-asparagové a L-fenylalaninu); nejznámější z umělých náhradních sladidel, asi 200krát sladší než sacharóza Tripeptidy Glutathion (GS): g-glu-ys- Gly (kofaktor oxidoreduktas a transferas) Přírodní peptidy

15 Peptidové hormóny xytocin - hormon produkovaný hypotalamem a skladovaný v neurohypofýze, vyvolává stahy děložní svaloviny Vasopresin - antidiuretický peptidický hormon o délce 9 AK. V nejběžnější formě má sekvenci ys-tyr-phe-gln-asn-ys-pro-arg- Gly-amid (ale vyskytuje se i forma s lysinem na pozici 8 místo argininu)

16 Peptidové hormóny Inzulin - hormon produkovaný B buňkami Langerhansových ostrůvků slinivky břišní, který snižuje hladinu cukru v krvi. Skládá se ze dvou polypeptidických řetězců (A, B), které jsou spojeny disulfidickými můstky a které dohromady mají 51 aminokyselin řetězec A obsahuje 21 aminokyselin a řetězec B 30 aminokyselin. Glukagon - je polypeptidický hormon produkovaný alfa buňkami slinivky břišní. Lineární polypeptid tvořený řetězcem 29 AK.

17 Peptidové neuromodulátory Enkefaliny pentapeptidy, patří mezi opioidy (látky schopné vázat se na opioidní receptor nacházející se zejména v centrálním nervovém systému a v menší míře i v trávicí soustavě), přirozeně se vyskytují v nervové soustavě obratlovců Endorfiny - opioidní polypeptidy, obsahující obvykle AK. Vznikají štěpením prekurzorové bílkoviny v mozku, pankreatu, placentě

18 Peptidová antibiotika Penicilin patří mezi beta-laktamová antibiotika, bicyklická organická kyselina, v podstatě se skládá ze dvou spojených aminokyselin, cysteinu a valinu. Gramicidin cyklický dekapeptid izolovaný z půdní bakterie Bacillus brevis, popř. připravený synteticky; působí proti tyfu, paratyfu, úplavici a preventivně proti zánětům Valinomicin peptidové antibiotikum s cyklickou strukturou, se dvěma jednotkami mléčné kyseliny, dvěma jednotkami D-alfa-hydroxyisovalerové kyseliny a dvěma valinovými zbytky

19 Peptidové fyto- a zootoxiny β-amanitin - jedním z toxinů obsažených v muchomůrce zelené a příbuzné muchomůrce bílé, bicyklický oktapeptid, obsahující několik netypických aminokyselin Falloidin - hepatotoxický cyklický heptapeptidický alkaloid, patřící do skupiny falotoxinů, obsažen v některých jedovatých druzích hub rodu muchomůrka (Amanita) Mikrocystiny - toxiny sinic (součást vodního květu) jsou toxické pro jaterní tkáň, cyklické heptapeptidy, hepatotoxiny, identifikováno přibližně 60 různých mikrocystinů Neurotoxiny hadů štírů a včel

20 Proteiny Proteiny z řeckého proteos (prvotní, nejpodstatnější), bílkoviny Proteiny jsou univerzální makromolekuly živých systémů mající klíčové funkce v téměř všech biologických procesech. Klíčové vlastnosti proteinů: Proteiny jsou lineární polymery sestavené z monomerních jednotek aminokyselin. Proteiny obsahují řadu funkčních skupin. Proteiny mohou reagovat spolu vzájemně nebo s jinými biologickými makromolekulami za tvorby vyšších komplexních celků. Některé proteiny jsou silně rigidní, zatímco jiné vykazují omezenou flexibilitu.

21 Klasifikace proteinů 1. podle lokalizace v organismu intracelulární extracelulární 2. podle funkce strukturní biologicky aktivní 3. podle tvaru molekuly globulární fibrilární 4. podle chemického složení jednoduché složené

22 Klasifikace proteinů podle funkce becné funkce proteinů: zdroj energie a dusíku, účinné ústoje (krev, cytosol), významný příspěvek k udržení osmotického tlaku vně i uvnitř buněk. Specifické funkce proteinů Typ proteinu Příklad Výskyt a funkce Katalytické (enzymy) Trypsin ydrolýza peptidové vazby Regulační (hormony) Insulin Stimulace metabolismu glukosy chranné Protilátky Vazba na cizorodé látky Skladovací Kasein Mléčný protein Transportní emoglobin Transport 2 a 2 krví (Polární prostředí přenos nepolárních látek b Nepolární prostředí membrány přenos polárních látek) Strukturní Kolagen Vláknité pojivové tkáně, zejména fibrilární, ale i globulární Kontraktilní Myosin, aktin Svalová vlákna Genetické funkční istony Asociace s DNA (chromosomy), organisace sbalování DNA,řídí transkripci Toxické Ricin Toxický protein z Ricinus communis (skočec obecný)

23 Klasifikace proteinů podle chemické složení Jednoduché pouze polypeptidový řetězec Složené - polypeptidová část + neproteinová část Apoprotein - bílkovinná součást základ Prostetická skupina nebílkovinná součást pevně (většinou kovalentně) vázaná Název Metaloproteiny Fosfoproteiny Glykoproteiny harakteristika obsahující kovový iont (patří sem i hemoproteiny) obsahující fosfáty obsahující sacharidovou složku Lipoproteiny Nukleoproteiny obsahující lipidovou složku obsahující nukleové kyseliny

24 Postranslační modifikace proteinů Glykosylace především extracelulární proteiny, nezbytné pro správné sbalení bílkovin v endoplasmatickém retikulu, g g-karboxylace (glu) modifikace glutamátových zbytků, př. faktory krevního srážení Fosforylace (ser, tyr, asp, his) ústřední mechanismus řízení látkové výměny Acetylace (lys) - mechanismus řízení genové aktivity, koenzymy, kofaktory (biotin, kyselina listová) ydroxylace (lys, pro), stabilitafibril Prenylace vazba S skupiny s isoprenoidy fanesol, gernylgereranol zakotvení proteinů v membráně

25 Postranslační modifikace proteinů

26

27 Klasifikace proteinů podle tvaru Globulární tvar koule, obvykle ve vodě rozpustné Fibrilární ve tvaru vláken, ve vodě nerozpustné Membránové součást biologických membrán Kolagen (fibrilární) Myoglobin (globulární) Bakteriorhodopsin (membránový)

28 ierarchie struktur Primární Sekvence aminoacylů kolik a jak seřazeny (čte se od N konce) omologie bílkovin Sekundární Uspořádání vztah sousedních monomerů Terciární Tvar molekuly v prostoru, uspořádání řetězce jako tělesa Kvarterní Agregační stav funkční jednotky, nadmolekulární úroveň

29

30 Primární struktura Primární strukturou peptidů rozumíme pořadí aminokyselin v peptidovém řetězci. Čteme od N konce Typ AK Počet AK Sekvence AK

31 Sekundární struktura Úseky polypeptidového řetězce s definovanou konformací stabilizované vodíkovými můstky Řetězec není lineární Atomy a N peptidové vazby sp2 planární 2 (a) sp3 - tetraedr

32 Sekundární struktura Znázornění vzájemného vztahu rovin dvou sousedních peptidických vazeb v tripeptidu Roviny peptidových vazeb otočné kolem vazeb a N a a -

33 Pravidelné (typické hodnoty a ) helikální struktury pravotočivá a-šroubovice helix (-56, -47) b-skládaný list paralelní (-139, +135) antiparalelní (-119, +113) hybové b-ohyb Nepravidelné Sekundární struktura - formy

34 a-helix Struktura popsaná jako první, proto označení a Pauling Linus (Kalifornie) a orey Robert (UK) postulovali v roce 1951 dvě periodické struktury a-helix a b-skládaný list. Je kompaktnější než b-skládaný list - a-a je 1,5 Å, u b-listu je 3,5 Å - 3,6 AK/závit, výška závitu 0,54 mm - 13 atomů na jeden závit (a-helix 3,6 13 ) - Zbytky R vně helixu Vodíkové vazby mezi = a N o 4 AK vzdálené Souběžné s osou helixu, ne rovnoběžné = - 57 o ; v rozmezí 45 o až - 50 o Při pohledu shora na šroubovici je směr vinutí shodný se směrem chodu hodinových ručiček a-helix pravotočivá Existence jiných typů helikální struktury

35 Existence jiných typů helikální struktury a-helix (3,6 13 ) 3 10 helix (vyskytuje se jako spoj o jedné otáčce mezi koncem a- helixu a další částí polypeptidového řetězce

36 Modely a-helix struktury A) Stužkové znázornění s a-uhlíky a vedlejšími skupinami AK. B) Boční kuličkový model znázorňuje vodíkové vazby. ) Pohled shora. D) Kalotový model.

37 Vodíkové vazby v a-helixu. Skupina n-té aminokyseliny tvoří vodíkovou vazbu s N skupinou aminokyseliny n + 4. Vodíkový můstek s optimální vzdáleností 0,28 nm. R i N N R i+1 R i+2 R i+4 N N N N R i+3 R i+5 Průměrná délka 11 AK zbytků = 3 obrátky helixu, délka 1,7 nm Existence i delších např. 53 AK

38 b-skládaný list Vodíkové vazby mezi (anti)paralelními úseky nebo sousedními peptidy Volnější struktura než a-helix Vzdálenost mezi sousedními aminokyselinami je 3,5 Å, zatímco u helixu jen 1,5Å. Vedlejší řetězce sousedních aminokyselin směřují na opačné strany.

39 b-skládaný list Beta list je tvořen spojením dvou nebo více beta řetězců vodíkovými vazbami. Sousední řetězce mohou jít proti sobě antiparalelní, nebo souběžně paralelní. Antiparalelní: jsou N a skupiny každé aminokyseliny spojeny vodíkovou vazbou s a N skupinami partnerského řetězce přímo. Jsou stabilnější. Paralelní: vazba N skupiny aminokyseliny jednoho řetězce na skupinu aminokyseliny sousedního řetězce je posunuta. Paralelní skládané listy s méně než 5 vlákny jsou vzácné, méně stabilní

40 b-skládaný list V globulárních proteinech 2-15 polypeptidových vláken (průměrně 6) šířka 2,5 nm polypeptid ve struktuře maximálně 15 AK (průměr 6 AK, tj. délka 2,1 nm

41 b-ohyb, vlásenka Tvoří 4 AK Stabilizace vodíkovou vazbou: skupina i-té aminokyseliny vázána vodíkovou vazbou s aminokyselinou i + 3. Zdeformovaný 3 10 helix Nazývají se také omega smyčka. Výhodný u glycinu a prolinu Proteiny s více než 60AK obsahují 1- více smyček s 6-16 AK (tzv. omega smyčky Umístněny na povrchu proteinu Možná rozpoznávací funkce proteinu

42 Schematický model a-helix a b-listu Pravotočivý zkrut skládaného listu Důležité stavební rysy globulárních proteinů, často tvoří jejich centrální část

43 omopolypeptidy Polyprolin netvoří běžnou sekundární strukturu sterické zábrany cyklických pyrrolidinových zbytků precipituje ve formě helixu 3 AK na otáčku výška závitu 0,94 nm (protáhlá struktura) Polyglycin precipituje ve formě helixu (podoba polyprolinu šroubovice může být pravo i levotočivá Polyprolin i polyglycin jsou základním strukturním motivem kolagenu

44 Predikce sekundární struktury Primární struktura ovlivňuje sekundární Preference struktur v úsecích s převahou aminoacylů

45 Srovnání zjištěných struktur s předpovězenými

46 Terciární struktura Popisuje uspořádání jednotlivých sekundárních struktur a neuspořádaných úseků v prostoru Vodíková Iontové interakce Stabilizace struktury tvorbou Kovalentní vazby (disulfidické můstky) Iontové interakce Dipolové interakce Vodíkové můstky ydrofobní interakce Strukturní motivy domény moduly Disulfidická ydrofóbní ydrofobní interakce Flexibilita struktury vývojově preferovaná

47 Uspořádání úseků sekundárních struktur Strukturní motivy b-a-b motiv (TIM 8x) řecký klíč b-meandr další struktury domény funkční jednotky

48 Stabilizace terciární struktury Účast kovalentních disulfidových vazeb na formování terciární struktury - RNasa ribonukleasa

49 Typy terciární struktury fibrilární (vláknitý tvar) - skleroproteiny převládá jedna sekundární struktura; př. a-keratin, b-keratin globulární (kulovitý tvar) - sferoproteiny rovnoměrné zastoupení obou sekundárních struktur membránové rientace zbytků AK Vodné prostředí - polární ven hydrofobní dovnitř rientace zbytků AK u membránových proteinů je opačná

50 Myoglobin pouze a-helix propojené neuspořádanými úseky Konkavalin - pouze b-struktury Karbonátdehydratasa 27 % a-helix, 23 % b-struktury

51 Terciární struktura strukturní domény Relativně samostatné kompaktní globulární oblasti dděleny obvykle neuspořádaným úsekem Flexibilita struktury Často charakteristické supersekundární struktury Často nositeli specifických vlastností funkcí v rámci proteinu Domény lehkých a těžkých řetězců imunoglobulinů

52 funkce vychází z prostorové struktury a ZÁVISÍ NA AMINKYSELINVÉM SLŽENÍ funkční domény

53 Kvartérní struktura Tvoří 2 nebo více asociovaných samostatných polypetidových řetězců (podjednotek) Agregát z více samostatných řetězců Podjednotky stejné homo Různé hetero Smysl agregace rganizační multienzymové systémy Regulační - kooperativita Stabilizační

54 Podjednotky vázány kovalentně Ig nekovalentně b Kvartérní struktura

55 hování bílkovin in vitro Bílkovina v roztoku Solvatační obal, interakce s prostředím (voda, ionty - p) vlivnění rozpustnosti srážecí metody Denaturace Změna (terciární) struktury, rušení nativních interakcí Reverzibilní denaturace není vhodné označení Ireverzibilní denaturace v pravém slova smyslu fyzikální faktory - T, záření, tlak mechanické vlivy chemické faktory - p, organická rozpouštědla, detergenty, těžké kovy, močovina,

56 Reverzibilní děj Ireverzibilní děj drastičtější působení (T, kyseliny apod.)

57 Metody studia bílkovin - izolace Izolace metody více či méně komplikované podle účelu čisté nativní bílkoviny pro studium vlastností event. farmakologii, hrubé isolace pro průmysl apod Podle potřeby a účelu isolace do potřebné čistoty studium in situ Studium struktury molekulární vlastnosti funkce (katalytické aj. vlastnosti) Isolační postupy separační metody

58 becné kroky při izolaci bílkovin bílkovin Izolace přehled metod desintegrace materiálu preparativní centrifugace srážecí metody, jsou založeny na změně rozpustnosti membránové separace chromatografie (preparativní elektromigrační metody elektroforéza) krystalisace Analytické postupy včetně metod separačních elektroforéza a chromatografie v analytickém měřítku, spektrální metody -absorpční -NMR -rentgenostrukturní analýza, MS moderní metoda umožňující i štěpení řetězce další speciální metody

59 Určení primární struktury Analýza aminokyselinového složení. Bílkovina se hydrolyzuje totálně (silně kyselé či zásadité prostředí, zatavená ampule, autokláv) Směs aminokyselin se analyzuje standartními metodami iontoměničovou chromatografií (analytické provedení) nověji hydrofobní chromatografie nebo kapilární zonová elektroforéza. Kvantitativní analýza Derivatizace činidlem poskytujícím barevný či fluoreskující Téměř univerzální ninhydrinová reakce modrofialové zbarvení se všemi aminokyselinami s výjimkou Pro (a ypro), kdy vzniká žluté zbarvení. Další způsoby derivatizace (dansylace, fluorescamin aj.)

60 Ninhydrinová reakce Schéma ninhydrinové reakce obecně

61 Ninhydrinová reakce *Ninhydrinová reakce s prolinem, λ = 440 nm

62 Iontoměničová chromatografie aminokyselin Eluční profil aminokyselin Kvalitativní a kvantitativní vyhodnocení

63 Stanovení primární struktury sekvence peptidů (sekvencování) Frederick Sanger britský biochemik dvojnásobný nositele Nobelovy ceny z roku 1958 za určení struktury inzulínu a z roku 1980 za metodu zjišťování struktury bílkovin, nukleových kyselin a virů jako první v roce 1953 osekvenoval dva řetězce inzulinu Dvě cesty sekvencování Reálná AK sekvence Sekvence odpovídající genové DNA

64 Proč sekvencujeme peptidy a proteiny? 1. Sekvence se porovnává se známými sekvencemi. Z analogie je možné usoudit např. na katalytický mechanismus enzymu nebo příslušnost nově získaného peptidu do určité rodiny peptidů. 2. Srovnávají se sekvence stejného polypeptidu z různých zdrojů a sleduje se evoluční mapa. 3. Sekvenční data se využívají jako podklad k syntéze protilátek a peptidů nebo proteinů s významným účinkem. 4. Aminokyselinová sekvence je podstatná pro tvorbu DNA sond specifických pro geny kódující odpovídající proteiny. 5. Mnohé proteiny obsahují signální aminokyselinové sekvence sloužící k ke kontrole určitého procesu. Sekvence mohou např. obsahovat signál pro umístění proteinu.

65 Stanovení primární struktury sekvence peptidů (sekvencování) Taktika sekvencování (lineární peptidy): Určení počtu podjednotek ddělení řetězců např. odstranění disulfidových vazeb Stanovení N- a - terminálních residuí Štěpení peptidů chemickými a enzymovými metodami na kratší řetězce a jejich rozdělení Vlastní sekvencování Rekonstrukce peptidu z přesahujících fragmentů Lokalizace pozice disulfidových vazeb

66 Protein (dva různé polypeptidové řetězce spojené disulfidovými vazbami) S S + Redukce disulfidové vazby a následné oddělení řetězců hemickými a enzymovými metodami se štěpí každý polypeptid na kratší peptidy Jinými chemickými a enzymovými metodami se štěpí každý polypeptid na jiné kratší peptidy Určí se sekvence každého peptidového fragmentu Určí se sekvence každého peptidového fragmentu TDI SGE Y F FYK NYFR KTDI NY GVAGR GVAGRF RSGE K rekonstrukci každého polypeptidu se použijí soubory překrývajících se peptidových sekvencí GVAGRFYKTDI NYFRSGE pakuje se fragmentace při zachování disulfidových vazeb za účelem identifikace ys sekvencí disulfidové vazby GVAGRFYKTDI S S NYFRSGE

67 Redukce disulfidové vazby mezi polypeptidovými řetězci nebo uvnitř řetězce 2-merkaptoethanolem N N 2 S S 2 N + 2 S S + S 2 + S S N disulfidová vazba 2-Merkaptoethanol volné S skupiny ysteinu

68 Reakcí jodacetátu s volnou S skupinou na polypetidovém řetězci se zabrání její reoxidaci - - ys 2 S + I 2 ys 2 S 2 + I ystein Jodacetamid S-Karboxymethylcystein (M-ys)

69 Pro stanovení přesné pozice disulfidové vazby se používá diagonální elektroforéza při které se oxiduje disulfidová vazba permravenčí kyselinou N 2 S S 2 ystin N N 2 Permravenčí kyselina - S S 3 2 N ysteová kyselina

70 Diagonální elektroforéza (ELF). Po oxidaci peptidů se v druhém směru elektroforézy původní peptidy zastaví na diagonále, kdežto peptidy obsahující disulfidové vazby (jsou kyselejší) se objeví mimo diagonálu. ELF po působení permravenčí kyseliny R 2 S 3 - R - 2 S 3 Směr první ELF

71 Identifikace N- a -terminalních residuí N-terminální analýza Původní Sangerova metoda 2,4-dinitrofluorbenzenem (DNP) nebo 1 dimethylaminonaftalen-5-sulfonylchlorid (dansylchlorid) DNP polypeptidy nebo dansylované polypeptidy, kyselou hydrolýzou se uvolní dansylovaná kyselina (rozpad peptidu) Edmanovy reagencie fenylisothiokyanat fenylthiohydantiony nebo PT deriváty (možnost postupného stanovení N-koncových AK!) -terminální analýza Analýza využívající karboxypeptidasy Karboxypeptidasa A neodštěpuje Pro, Arg, a Lys Karboxypeptidasa B - neodštěpuje Arg a Lys

72 Původní Sangerova metoda založená na sekvenaci polypeptidu (insulin) od N-konce 2,4-dinitrofluorbenzenem. Nevýhodou bylo, že se při stanovení jedné aminokyseliny se hydrolyzoval celý peptid. N 2 N 2 N 2 N 2 N + R 1 R 1 F N 2 F 2,4-Dinitrofluorobenzen (DNFB) DNP Polypeptid

73 Při použití dansyl chloridu (fluorescence) došlo k výraznému zvýšení citlivosti Sangerovy metody. Stanovuje se 1 nm.l -1 aminokyseliny. N( 3 ) 2 R 1 R 2 R N N N S l 5-Dimethylamino-1-naftalensulfonylchlorid (Dansylchlorid) - N( 3 ) 2 l Polypeptid 2 S R 1 R 2 R 3 N N N( 3 ) 2 N Dansylpolypeptid S R 1 N Dansylaminokyselina (fluorescentní) R 2 R N N N Volné aminokyseliny

74 Edmanova metoda sekvenace peptidu od N-konce: R 1 R 2 R 3 N S + 2 N N N Fenylisothiokyanát (PIT) - Polypeptid R 1 R 2 R 3 N N N N S PT Polypeptid Polypeptid je navázán -koncem na polymerní nosič. Postupně se oddělují fenylthiohydantoinové (PT) deriváty aminokyselin. R 1 N N Bezvodá F 3 S Derivát thiazolonu R R N N R 3 Původní polypeptid bez N-koncové aminokyseliny Činidlem je fenylisothiokyanát (PIT). N S N PT-aminokyselina

75 Enzymové štěpení polypeptidů endopeptidasami Endopeptidasy, proteinasy, jsou hydrolytické enzymy štěpící specificky určité peptidové vazby. Trypsin štěpí na místě karboxylu Arg a Lys. hymotrypsin štěpí na místě karboxylu hydrofobních aminokyselin Phe, Tyr a Trp. Elastasa štěpí na místě karboxylu malých neutrálních aminokyselin Ala, Gly, Ser a Val. Ve všech případech se vazba neštěpí, pokud je následující aminokyselinou Pro. Uvedené enzymy pochází z hovězího pankreatu. Štěpením polypeptidu různými enzymy získáme řadu peptidových fragmentů

76 Enzymové štěpení polypeptidového řetězce trypsinem na místě karboxylu Arg nebo Lys N Lysin nebo Arginin N R R N N Trypsin N N Kterákoliv aminokyselina kromě Prolinu

77 Příklad chemického štěpení peptidové vazby. Bromkyan štěpí specificky na místě karboxylu Met. 3 N 3 S Br Bromkyan S + N N Br - N N N R R 3 S + N N N 2 2 Peptidyl homoserinlakton N R + 2 N R

78 Identifikace AK 1. motnostní spektrometrie 2. Retenční časy PL

79

80 Vznik různých fragmentů z polypeptidu enzymovým a chemickým štěpením peptidových vazeb. V tomto příkladu (chemické štěpení peptidové vazby metodou s bromkyanem) se získalo šest překrývajících se fragmentů Fragmenty NBr NBr NBr Phe Trp Met Gly Ala Lys Leu Pro Met Asp Gly Arg ys Ala Gln Trypsin Trypsin Trypsinové fragmenty

81 Sestavení původního polypeptidu z fragmentů získaných enzymovou hydrolýzou Původní polypeptid Trypsinové peptidy Trypsin Enzymová hydrolýza hymotrypsin hymotrypsinové peptidy Trp Gly Gly is Met Arg Leu Val Phe Ser Phe Thr Lys Asp Lys Glu Tyr ys Pro Ala Trp Lys Lys is Met Arg Trp Glu Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Arg Ser Phe Leu Val Phe Asp Lys Thr Lys ys Pro Ala Trp Gly Ile Arg Ser Phe Trp Gly Leu Val Phe Glu Tyr Gly Ile Arg Thr Lys ys Pro Ala Trp is Met Arg Asp Lys Glu Tyr ys Pro Ala Trp Lys Gly Leu Val Phe Asp Lys Ser Phe Thr Lys Lys is Met Arg Trp N-Leu-Val-Phe-Asp-Lys-Glu-Tyr-Gly-Ile-Arg-Ser-Phe-Thr-Lys-ys-Pro-Ala-Trp-Lys-is-Met-Arg-Trp-Gly-

82 Využití technologie rekombinantní DNA k sekvenaci velkých proteinů. Řetězce DNA jsou klonovány a poté sekvencovány. Sekvence nukleotidů udávají sekvenci aminokyselin v proteinu. Nevýhodou je, že nepostihuje posttranslační úpravy polypeptidů. Sekvence DNA GGG TT TTG GGA GA GA GGA AG AT ATG GG GA Sekvence aminokyselin Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly Ala

83 Proč syntetizovat peptidy? 1. Syntetické peptidy slouží jako antigeny stimulující tvorbu specifických protilátek. 2. Syntetické peptidy mohou být využity k izolaci receptorů hormonů a jiných signálních molekul. Také jako afinanty při afinitní chromatografii. 3. Syntetické peptidy mohou být využity jako léky. Např. analog vasopresinu, hormonu stimulujícícm reabsorpci vody, 1-desamino- 8-D-argininvasopresin se odbourává pomaleji a slouží jako náhrada vasopresinu. 4. Peptidy mohou sloužit jako pomocná strukturu při studiu složitějších proteinů (třírozměrná struktura).

84 - Taktika peptidových syntéz 1. Aktivace karboxylu 2. hránění skupin, které nevstupují do peptidové vazby 3 R Syntézy peptidů jsou zautomatizovány. 3 První AK s chráněnou skupinou Nse naváže -koncem na 3 makromolekulární pryskyřici a postupně se přidávají na N-konec další s chráněnými skupinami. t-butyloxykarbonylaminokyselina Reakcí karboxylu a (t-boc aminoskupiny aminokyselina) s N, N - dicyklohexylkarbodiimidem (D) za odštěpení vody a uvolnění N, N - dicyklohexylmočoviny, se tvoří peptidová vazba. N N Dicyklohexylkarbodiimid (D)

85 - 3 3 R 3 N t-butyloxykarbonylaminokyselina (t-boc aminokyselina) Skupiny, které nemají vstoupit do peptidové vazby se chrání činidly N N jako např. t-butyloxykarbonyl, t-boc nebo benzyloxakarbonyl (dříve Dicyklohexylkarbodiimid (D) karbobenzoxy nebo karbobenzyloxy) symbol Z nebo bz. bě skupiny se po skončení syntézy lehce odštěpují.

86 Vstup chráněné aminokyseliny (t-boc) do peptidové vazby za účasti D t-butyloxykarbonylaminokyselina N, N -dicyklohexylkarbodiimidem (D) t-boc aminokyselina n-1 D chránění aktivace t-boc N N N R Aktivovaná aminokyselina R n N 2 Polymer t-boc N R Dipeptid vázaný na polymer + N Aminokyselina n vázaná na polymer R n N N Dicyklohexylmočovina Polymer

87 - elkový postup syntézy peptidu na polymerním nosiči. Syntéza peptidů v pevné fázi Merrifieldova metoda (SPPS). R n Polymer t-boc N + l hráněná aminoskupina n Reaktivní polymer 1 Ukotvení Polymer R n t-boc N

88 Polymer R n t-boc N 2 dstranění chránící skupiny pomocí F 3 - Polymer R n N 2

89 Polymer R n N 2 3 Tvorba peptidové vazby s chráněnou aminokyselinou n-1 + D Polymer t-boc N R n-1 R n N

90 Polymer t-boc N R n-1 R n N Další odstranění chránících skupin a syntetické cykly 4 dštěpení peptidu pomocí F Polymer N 2 R 1 N R n-1 R n N