2.2. Aminokyseliny a bílkoviny Aminokyseliny aminoskupina karboxyskupina R-CH(NH2)-COOH in yl

Transkript

1 2.2. Aminokyseliny a bílkoviny Aminokyseliny (AA - Amino Acids) AA jsou pro lidský organismus velmi významné. Představují základní stavební složky bílkovin a mají i své vlastní funkce. V přírodě se vyskytuje asi 300 různých aminokyselin, ale v bílkovinách se vyskytuje jen 20 základních aminokyselin, které jsou geneticky kódovány. V každé molekule AA musí být aminoskupina a karboxyskupina. Kromě amino- a karboxyskupiny obsahují AA různé další funkční skupiny, které mění chemický i fyzikální charakter základního uhlíkatého řetězce. Aminoskupina a karboxyskupina jsou vázány na prvním uhlíku řetězce (tedy α uhlíku), ten je díky 4 různým substituentům opticky aktivní (výjimkou je glycin), otáčí rovinu polarizovaného světla. V živočišných organismech mají AA absolutní konfiguraci L sloučenin (D AA jsou součástí některých antibiotik). Mluvíme o L-α-aminokyselinách. Uhlíkatý řetězec navázaný na C α zapisujeme jako R, pak tedy obecný vzorec AA znázorňujeme R-CH(NH 2 )-COOH. Triviální názvy AA jsou často odvozeny od jejich zdroje nebo vlastnosti a mají koncovku in, pro ionizovanou formu se používá yl (glutamyl-, leucyl-). Pro zápis AA v bílkovinách se používají třípísmenné nebo jednopísmenné zkratky. Přehled aminokyselin, rozdělení podle charakteru R: - s alifatickým R: glycin, alanin, valin, isoleucin - s -OH skupinou v R: serin, threonin, tyrosin - s atomem síry v R: cystein, methionin - s dalšími COOH skupinami v R, nebo jejich amidy: kyselina asparagová asparagin, kyselina glutamová glutamin - s basickými skupinami v R: arginin, lysin, histidin - s aromatickým jádrem v R: fenylalanin, tyrosin, tryptofan - iminokyselina: prolin V závislosti na ph prostředí mohou být karboxyskupina a aminoskupina ionizované, COO -, příp. NH + 3, reagují jako slabé kyseliny a zásady, vytvářejí soli a estery. Funkční skupiny mohou také vstupovat do chemických reakcí, ale ještě častěji se uplatní při vytváření iontových vazeb, které stabilizují konformaci bílkovin (vytváření S S vazeb), nebo zprostředkují chemické chování bílkovin (oxygenace a deoxygenace hemoglobinu, konformace enzymů při katalytické reakci). Při fyziologickém ph existuje AA jako R- CH(NH 3 ) + COO -. Při určitém ph má molekula AA stejný počet kladných jako záporných

2 nábojů a je navenek elektroneutrální, to je její isoelektrické ph (pi). Tato vlastnost je důležitá pro dělení směsi AA. AA můžeme rozdělit také podle polarity postranního řetězce R. Asi polovina AA má nepolární R (např. alanin, valin, leucin), tyto AA zprostředkují hydrofobní interakce. Postranní řetězec R jiných AA má polární charakter, a může vytvářet vodíkové můstky (serin, threonin, tyrosin) a hydrofilní interakce. Podle metabolismu rozdělujeme AA na postradatelné a nepostradatelné (esenciální). Organismus získává AA rozkladem bílkovin, postradatelné AA může sám syntetizovat. Esenciální AA mohou být získány jen z potravy, jsou to hlavně AA s větveným řetězcem nebo aromatickým jádrem (valin, leucin, isoleucin, fenylalanin, tryptofan, threonin, také methionin a lysin), za určitých podmínek histidin (v dospělosti postradatelný) a tyrosin (může vznikat z fenylalaninu). Pro správný metabolismus je nutná nejen přítomnost esenciálních AA, ale i jejich správná koncentrace a poměr. I když je některá AA v nadbytku, organismus ji nemusí využít a navíc může být ovlivněn metabolismus jiných AA. Nejdůležitější vlastností AA je jejich schopnost vytvářet peptidovou vazbu. Zjednodušeně zapsáno spolu reagují aminoskupina jedné AA s karboxyskupinou jiné AA za odštěpení molekuly vody, např.: alanin + valin alanylvalin + H 2 O Řetězením AA pak vznikají peptidy a bílkoviny. Přehled významnějších aminokyselin Glycin je nejjednodušší AA. Protože má malou molekulu, vyskytuje se v místech, kde se molekula ostře ohýbá, často ve strukturních bílkovinách (kolagenu, vlně, hedvábí), je důležitý pro biosyntézu purinů a porfyrinů. Alanin je nejobvyklejší AA, substrát pro ALT, spolu s valinem, leucinem a isoleucinem se podílí na hydrofobních interakcích v molekule bílkovin i mezi molekulami v buňce. Serin svou hydroxyskupinou vytváří vodíkové můstky a také esterové vazby ve fosfoproteinech a glykosidech. Cystein má silně reaktivní SH skupinu, spolu s cystinem tvoří účinný redox systém. Cys SH + HS Cys oxidace redukce Cys S S Cys + 2 H Snadno vytváří S S vazby (disulfidové můstky), např. v imunoglobulinech. Spolu se serinem je také často součástí aktivních center enzymů.

3 Methionin účinkuje jako dárce methylové skupiny, mění se přitom na homocystein, který je považován za rizikový faktor kardiovaskulárních onemocnění. Dodává atom síry. Kyselina asparagová a glutamová mají zásadní význam pro transaminační reakce, přenáší se na ně aminoskupina. Asparagin a glutamin fungují jako zásobárny amoniaku v tkáních a jeho přenos do jater, kde dochází k jeho odbourání. Arginin je nejsilnější bazická AA, největší význam má při tvorbě močoviny. Histidin je významnou součástí bílkovin (hemoglobin), fyziologicky silně účinný je jeho amid histamin. Fenylalanin a tyrosin obsahují aromatické jádro. Při nejčastější dědičné metabolické poruše se v organismu hromadí. Tyrosin, který je prekurzorem adrenalinu, katecholaminů, tyroxinu a melaninů; může při nedostatku vznikat z fenylalaninu. Tryptofan, který má v molekule cyklickou část je nejen důležitou složkou bílkovin, ale i prekurzorem serotoninu a melatoninu. Prolin a hydroxyprolin jsou důležitou složkou kolagenu. Ostatní aminokyseliny Kromě základních 20 AA jsou pro organismus důležité i jiné AA. β-alanin je v molekule vitaminu B 5, ornithin a citrulin jsou součástí močovinového cyklu, fosfoserin (serin s navázanou skupinou kyseliny fosforečné) v kaseinu, pyrrolidin (cyklická forma kyseliny glutamové) v γ-globulinech. Taurin tvoří konjugáty se žlučovými kyselinami a inhibuje přenos nervových signálů. Zvláštní aminokyseliny Rostliny a bakterie obsahují jiné AA, které mají pro člověka svůj význam. Jedovatý muskarin je obsažen v houbách, bestatin, forfenicin a esterastin z bakterií stimulují imunitní systém. Také původní antibiotika byla často odvozena od aminokyselin. Metabolismus aminokyselin Aminokyseliny nejčastěji získáváme metabolismem bílkovin. Přes 90 % AA je vázáno v proteinech, 40 % ve svalech, 20 % v kolagenu; důležitá je intracelulární hotovost AA (pool), která silně závisí na membránovém transportu. Denně je rozloženo více než 100 g AA, asi 30 g je syntetizováno. Rozdíl je dán tím, že syntetizovány mohou být jen některé AA.

4 Nejdůležitější je metabolismus dusíku z aminoskupiny, ten je vylučován ve formě močoviny, jako amonný iont (NH 4 + ) vzniká v ledvinách (viz kapitola 2.3.). Mechanismy přeměny aminokyselin AA jsou v organismu přeměňovány několika mechanismy: dekarboxylací, transaminací a oxidační deaminací. Dekarboxylací vznikají z AA aminy, skupina COOH se uvolňuje jako oxid uhličitý. Příkladem je vznik ethanolaminu (následně cholinu ze Ser), histaminu (His), dopaminu (derivát Phe) a serotoninu (derivát Trp). Při transaminaci působí enzymy transaminasy (nejdůležitější ALT, AST), které přenášejí aminoskupinu AA na α-ketokyseliny. Z nich se pak aminoskupina přenáší nejčastěji na kyselinu glutamovou a přes další sloučeniny do močovinového cyklu. Jinou možností je přenos aminoskupiny do nově syntetizované AA. Při oxidační deaminaci vzniká α-ketokyselina. Nejdůležitější je oxidační deaminace glutamátu, pokud organismus potřebuje kyselinu 2-oxoglutarovou pro transaminační reakce. Podle momentálních potřeb organismu jsou nedusíkaté skelety AA zapojovány do různých metabolických drah. Může z nich v případě nedostatku vznikat glukosa pro potřeby nervové soustavy, AA poskytují jednouhlíkaté zbytky pro syntézu purinů, nebo přes acetylkoenzym A se z nich získá energie v citrátovém cyklu. Při nadbytku se z nich tvoří i lipidy. Stanovení aminokyselin Stanovení jednotlivých AA i spektra AA ve směsi je možné elektroforeticky a chromatograficky, dnes se většinou používá HPLC. Důležité je to především u nemocných s těžkým onemocněním při umělé výživě a pro diagnostiku dědičných metabolických onemocnění (viz kapitola 3.9.). Peptidy Spojením dvou AA pomocí peptidové vazby vzniká dipeptid, tři AA tvoří tripeptid; peptidy až do 10 AA se nazývají oligopeptidy, peptidy s vyšším počtem AA (přibližně do 100) jsou polypeptidy (M r obvykle nižší než 10000). Pak už mluvíme spíše o bílkovinách. Peptidy vznikají v organismu syntézou z AA, nebo při rozkladu bílkovin. Některé z nich mají pro lidský organismus zvláštní význam. Nejdůležitější polypeptid je insulin (často označovaný za nejmenší bílkovinu M r 6000); také některá antibiotika a kancerostatika mají polypeptidovou povahu. Tripeptid glutathion má silné antioxidační účinky, intracelulárně se

5 podílí na likvidaci volných radikálů. Oligopeptidy oxytocin a vasopresin jsou důležité hormony neurohypofýzy. Biologický významný polypeptid kortikotropin (ACTH) reguluje růst a funkci nadledvinek. Silně bazické protaminy se vyskytují v jádře, navázané na nukleové kyseliny. Jedovaté houby obsahují jedovaté polypeptidy amanitin a faloidin. Metabolismus polypeptidů probíhá stejně jako metabolismus bílkovin (viz dále). Bílkoviny Bílkoviny (proteiny z řeckého slova proteo prvořadý) jsou nejsložitější a funkčně nejdůležitější molekuly v organismu. Tvoří podstatnou část každé buňky. Aminokyseliny se v nich peptidovou vazbou řetězí až v počtu několika tisíc, vytvářejí tak makromolekuly o M r až několik milionů. K opakujícím se atomům C a N, které tvoří základní lineární strukturu (polypeptidová kostra), jsou připojeny postranní řetězce (R-) AA, které utvářejí prostorovou strukturu a charakter každé bílkoviny. Skládají se z C (asi 55 %), O (21 %), N (17 %), H (7 %); dále bílkoviny obsahují S, P, omezeně Fe, I, Cu, stopově Co, Zn, Mn, Mg a další prvky. Složitá je struktura bílkovin. Primární struktura je dána pořadím AA v polypeptidové kostře a vazbami S S. Sekundární struktura je dána uspořádáním řetězce AA v prostoru. Atomy peptidové vazby CO-NH leží v podstatě v rovině, řetězec se může natočit jen kolem C α. Základní pozice je cis-konfigurace (řetězce jsou na jedné straně roviny) a transkonfigurace (řetězce jsou na odlišných stranách). Odtud vyplývají struktury α-šroubovice (αhelix), tvořená cis tvary, a skládaný list ( β-sheet). Obě základní formy jsou udržovány především vodíkovými můstky a iontovými interakcemi mezi atomy v postranních řetězcích AA. α-šroubovice má pevně dané rozměry závitu, ve skládaném listu mohou jít polypeptidové řetězce paralelně nebo antiparalelně. Vyšší struktury řetězců charakterizují terciární strukturu. Vytvářejí ji postranní řetězce, S S vazby; na povrchu molekuly jsou spíše iontové vazby, uvnitř hydrofobní vztahy mezi nepolárními postranními řetězci AA. V terciární struktuře jsou vytvořeny domény, které často představují v molekule biologicky aktivní místo (Ig doména, kofaktor enzymů). Spojením několika řetězců vznikají makromolekuly s kvarterní strukturou. V ní může být držen u sebe různý počet podjednotek vodíkovými můstky a iontovými vazbami, s různými orientacemi a polohami v prostoru (insulin - hexamer, hemoglobin - dimer, IgM - pentamer), které zajišťují různou biologickou aktivitu komplexu. Zkráceně se může prostorová struktura bílkoviny shrnout pod pojmem konformace bílkoviny (zahrnuje sekundární, terciární a kvarterní strukturu).

6 Složitá prostorová struktura může být snadno porušena. Denaturace bílkovin rozloží konformaci molekuly. Může k ní dojít fyzikálními vlivy (teplota var, rozptyl pěnění, ultrazvuk vibrace) nebo chemickými vlivy (ph zrušení vodíkových můstků a iontových vazeb, organická rozpouštědla rozruší hydrofobní interakce, působí také tenzidy a chemikálie). Primární struktura zůstává zachována. Některá denaturace může být vratná. Šetrná denaturace vysolením se využívá k izolaci bílkovin. Při ní se přidáním síranu zvýší iontová síla, dojde k vysrážení bílkoviny, sraženina se oddělí, promytím se odstraní síran a bílkovina se rozpustí a zregeneruje se i její konformace. Důležitou charakteristikou bílkovin je jejich izoelektrický bod pi. Na povrchu bílkovin jsou díky různým funkčním skupinám kladné a záporné elektrické náboje, jejich počet se mění podle vnějšího ph. Při pi je elektrický náboj molekuly bílkoviny navenek elektroneutrální. Této vlastnosti se využívá při izoelektrické fokusaci k určení bílkovin. Bílkoviny můžeme třídit podle tvaru na globulární (globuliny) a fibrilární (kolagen), podle složení na jednoduché, které tvoří jen bílkovinná část (albumin, fibrinogen) a složené, které mají i nebílkovinnou část: glykoproteiny mají kromě bílkovinné části v molekule cukernou složku, nukleoproteiny nukleovou kyselinu (viry), chromoproteiny část s atomem kovu (hemoglobin, ceruloplasmin), fosfoproteiny kyselinu fosforečnou (kasein), lipoproteiny lipidovou část. Podle výskytu můžeme rozdělit bílkoviny na krevní, svalové, mléčné, rostlinné, bakteriální (a další), podle rozpustnosti dělíme bílkoviny na rozpustné ve vodných roztocích solí (proteiny séra, bílkovinné hormony) a nerozpustné ve vodných roztocích solí (kolagen, elastin). Podle funkce je rozlišujeme na bílkoviny základního metabolismu, které mají přímý význam pro existenci buňky (např. enzymy, strukturní a transportní bílkoviny) a bílkoviny specializovaných buněk (hemoglobin, bílkoviny srážení krve, antigeny a protilátky). Význam bílkovin pro lidský organismus Pro svou vysokou rozmanitost a specifitu získaly bílkoviny mnoho funkcí, pro které jsou nenahraditelné: - enzymy katalyzují většinu chemických reakcí, které v buňce probíhají, viz kap složky výživy Bílkoviny jsou nezbytnou součástí výživy, zdrojem esenciálních AA. - přenos a ukládání látek Mnoho nízkomolekulárních látek i iontů je přenášeno speciálními bílkovinami (hemoglobin O 2 v erytrocytech, albumin bilirubin, transferin přenos Fe, ferritin ukládání Fe). Také léky se váží na bílkoviny a jejich distribuce může váznout při malnutrici.

7 - pohyb Kontraktilní bílkoviny umožňují pohyb svalů, přesun organel v rámci buňky (aktin, myosin) i např. pohyb řasinek epitelu a spermií. - podpůrné funkce Bílkoviny zajišťují pevnost a odolnost tkání (kůže, kosti, vazivo). Kolagen má vláknitou molekulu, která může být různě uspořádána: kolagen šlach je pevný v tahu, kolagen kůže je pružný a ohebný, kolagen v kostech a zubech obsahuje fosforečnan vápenatý, kolagen v rohovce je průhledný. - obrana proti infekci Imunoglobuliny jsou specifické bílkoviny (protilátky), které rozpoznají cizorodou látku a zneškodní ji; na tom se podílejí i složky komplementu. - hemokoagulace a fibrinolysa Bílkoviny zajišťují vytvoření i rozpuštění trombu. - transformace energie Bílkoviny umožňují přeměnu jedné formy energie na jinou. Rhodopsin ze světelné na elektrický potenciál nervového vzruchu, svalové bílkoviny přeměňují chemickou energii ATP na mechanickou práci, v rostlinách chloroplasty využívají světelnou energii na tvorbu chemických látek. - regulační funkce - Některé hormony mají povahu polypeptidů, na membránách buněk bílkoviny fungují jako receptory hormonů. - vznik a přenos nervového signálu Na synapsích nervových buněk zprostředkují receptorové bílkoviny přenos nervového vzruchu, jsou podstatou sodno-draselné pumpy i v membránách nervových buněk. - kontrola růstu a diferenciace Bílkoviny kontrolují expresi genetické informace z DNA a blokují ji na místech, kde právě není funkční. Jako enzymy se účastní při transkripci a translaci informace do nově syntetizované bílkoviny. Metabolismus bílkovin Bílkoviny tvoří asi 20 % celkové tělesné hmotnosti člověka a jsou jednou ze tří základních složek potravy. Bílkoviny v organismu jsou v neustálém koloběhu. Liší se jejich poločas, jak rychle jsou odbourávány (insulin během minut, bílkoviny ze svalu za 180 dní). Proteolýza probíhá působením enzymů obecně zvaných proteasy. Ty mohou působit uvnitř molekuly bílkoviny - endopeptidasy (pepsin, chymotrypsin, trypsin) nebo postupně od konců exopeptidasy, které se navíc rozlišují podle konců peptidového řetězce: karboxypeptidasy štěpí od konce, kde je karboxylová skupina, aminopeptidasy od skupiny aminové. Endopeptidasy jsou především v žaludku a dvanáctníku, endopeptidasy a dipeptidasy (štěpí dipeptidové zbytky) v tenkém střevě. Takto je molekula bílkoviny rozštěpena až na jednotlivé AA, které pak podléhají vlastnímu metabolismu. V buňce jsou proteolytické enzymy soustředěny v lysozomech. Obecně nejsou tyto enzymy substrátově

8 specifické, štěpí všechny bílkoviny bez rozdílu, syntetizovány jsou většinou ve formě proenzymu neaktivní formě, která musí být aktivována odštěpením části molekuly. Stanovení bílkovin Celková proteinémie (obsah bílkovin v séru nebo plazmě) se stanoví fotometricky barevnou biuretovou reakcí, referenční hodnoty v séru jsou g/l. Jednotlivé frakce bílkovin se stanoví elektroforeticky: směs plazmatických bílkovin se rozdělí na 5 frakcí, albumin, α 1 -globulin, α 2 -globulin, β- a γ-globuliny; jejich poměr se obvykle vyjadřuje v procentech. Imunochemicky se stanoví jednotlivé bílkoviny kvantitativně, bílkoviny vystupují jako antigeny. Stanoví se tak např. jednotlivé podtřídy imunoglobulinů, α 1 - antitrypsin, různé protilátky. Zvýšená proteinémie může nastat při ztrátě tekutin zahuštěním plazmy a při jaterních cirhózách; snížení nastává po dlouhodobém hladovění, při metabolických poruchách, při těžkých onemocněních jater, kdy je v játrech snížená syntéza bílkovin. Můžeme také sledovat změny ve složení bílkovin, které se vyskytují při různých onemocněních, případně změny globulinových frakcí. Nejjednodušší informace o změnách plazmatických bílkovin poskytuje sedimentace erytrocytů. V moči se stanoví proteinurie kvalitativně pomocí proužků, případně srážením kyselinou salicylovou, používá se nejlépe čerstvá ranní moč, kvantitativní stanovení se provádí ve sbírané moči fotometricky. Proteinurie může být zvýšená i z fyziologických příčin po vysoké tělesné námaze, patologickými příčinami jsou choroby ledvin. Pak můžeme rozlišit několik typů proteinurií: glomerulární, tubulární, smíšená, postrenální a prerenální (podle části ledvin, která je chorobou zasažena). Citlivými metodami stanovujeme bílkovinu i v likvoru. Jednotlivé významné bílkoviny Albumin Je hlavní plazmatickou bílkovinou. Jeho molekula je relativně malá (M r 69000), elipsovitého tvaru. V játrech je syntetizováno asi 12 g za den, poločas molekuly albuminu je dní, pak je odbouráván stejným způsobem jako jiné bílkoviny na jednotlivé AA. Hlavní úlohou albuminu je udržování koloidně-osmotického tlaku v těle. Na albumin se váží volné řetězce mastných kyselin, velmi důležitá je vazba Ca 2+, která je ovšem ovlivněna ph. Také hormony štítné žlázy T 3 a T 4 se váží na albumin. Pro bilirubin existují na molekule

9 albuminu 2 vazebná místa. Mnohé látky jsou albuminem přenášeny. Mezi nejvýznamnější patří měď, léky (antibiotika, ale i warfarin), vitaminy i zmíněný bilirubin, který se transportuje do jater. Referenční hodnota albuminu je g/l, pokud pacient trpí hypoalbuminémií, mohou být ovlivněny i jiné funkce v organismu. Díky malé molekule může albumin projít i glomerulární membránou, čemuž za normálních okolností brání záporný náboj molekuly. U diabetiků a u onemocnění ledvin dochází k porušení těchto poměrů a v moči lze zjistit mikroalbuminurii. Stanoví se lépe ve sbírané moči a často se vztahuje ke koncentraci kreatininu. Snížená koncentrace může být následkem snížené syntézy bílkovin v játrech při cirhóze a dalších nemocech, také při chorobách ledvin, při diabetu mellites i při hladovění. Úlohu může hrát i zvýšený katabolismus a přesun do intersticia. Hodnoty pod 20 g/l signalizují otoky; koncentrace albuminu koreluje s prognózou pacienta. γ-globuliny Tvoří heterogenní směs bílkovin, která se v ELFO projeví jako jedna zóna, jednotlivé typy se stanoví pomocí monoklonálních protilátek. Vesměs se jedná o složené bílkoviny, glykoproteiny a lipoproteiny, které zajišťují mnoho úkolů a podílejí se na mnoha funkcích organismu: hemokoagulaci, fibrinolýze, zajišťují imunologickou funkci (jako protilátky i komplement), vážou se na ně ionty kovů, transportují hemoglobin, steroidy i enzymy. Transferin a ferritin jsou dvě nejdůležitější bílkoviny pro metabolismus železa. Transferin přenáší železo v krvi, ferritin Fe váže a skladuje. Jeho molekula se skládá z 24 podjednotek a může vázat až 4000 atomů Fe. Ceruloplasmin má modrou barvu a je zásobní bílkovina pro měď. Na jednu molekulu bílkoviny váže 6 atomů, což celkem představuje necelých 0,5 % množství mědi, 90 % je volně v plazmě. Transport mědi se uskutečňuje na albuminu. Nedostatek ceruloplasminu nebo jeho porucha se projeví jako Wilsonova choroba. CRP je marker zánětu, podobně jako třeba α 1 -antitrypsin, α 1 kyselý glykoprotein a haptoglobin. CRP se zvyšuje nejrychleji a specificky při bakteriálním zánětu, což v diagnostice slouží k odlišení od virového zánětu. Nově studované markery zánětu jsou elastasa z granulocytů, prokalcitonin a neopterin. Literatura 1. Alberts, B., Bray, D., Johnson, A., Lewis, J. Základy buněčné biologie. Ústí nad Labem : Espero Publishing, 2000, 630 s., ISBN

10 2. Ferenčík, M., Škárka, B., Novák, M., Turecký, L. Biochémia. Bratislava : Slovak Academic press, 2000, 924 s., ISBN Masopust, J. Klinická Biochemie - požadování a hodnocení biochemických vyšetření část I. Praha : Karolinum, 1998, 429 s., ISBN Murray, R.K., Granner, D.K., Mayes, P.A., Rodwell, V.W. Harperova biochemie. 2.vydání, Jinočany : H+H, 2001, 872 s., ISBN Racek, J., Eiselt, J., Friedecký, B. et al. Klinická biochemie. Praha : Galén - Karolinum, 1999, 317 s., ISBN Zima, T., Kazda, A., Průša, R. et al. Laboratorní diagnostika. Praha : Galén, 2002, 728 s., ISBN