Klinická analytická chemie. Vladimír Král

Transkript

1 Klinická analytická chemie Vladimír Král

2 Schéma přednášky Jaké analyty chceme stanovit Jaké metody budou použity Jednotlivé příklady analýz Problémově orientovaný přístup Kvalitativní a kvantitativní analýza Metodiky identifikace a stanovení

3 DIAGNOSTICKO-TERAPEUTICKÝ PROCES LÉKAŘ ANAMNÉZA CHEMIK.VYŠ. POMOCNÉ VYŠETŘENÍ PACIENT předběž. posouzení stavu pac. konečné zhodnocení zdrav. stavu pacienta DIAGNÓZA Přístrojové Laboratorní RTG, UZ, MR, hematologie funkční atd cytologie mol.biologie mikrobiologie imunologie histologie cytogenetika BIOCHEMIE Návrh terapie Prognóza

4 Výsledek bioanalytického testu se stává skutečnou informací (zvyšuje míru rozhodování) když je: * adekvátně ordinován * spolehlivý (přesný a správný) * rychlý * správně interpretován

5 Instrumentální metody klinické analýzy Vychází z klasických metod chemické analýzy Uplatňují se zde i speciální metody (bioanalytické)

6 Látkové složení živých organismů

7 Vymezení stanovovaných analytů s vypovídací klinickou a biochemickou hodnotou K vymezení pojmu klinické chemie pro potřeby tohoto kurzu postačí definovat jaké analyty dávají primární informaci o stavu a pacienta, kontaminaci vzorků, životního prostředí a jakých metodik je k jejich stanovení v dnešní klinické praxi užíváno. Protože se často jedná i o stovky vzorků denně, tomu musí odpovídat použité analytické metody.

8 Vymezení stanovovaných analytů s vypovídací klinickou a biochemickou hodnotou Klinické chemie se zabývá analýzou složek s diagnostickým významem. Tyto informace se získávají analýza tělních tekutin. Primární biologický vzorek v klinické chemii je -Krev (celá), srážlivá a nesrážlivá -Sérum po srážení krve -Plazma připravená z nesrážlivé krve -Moč -Mozkomíšní mok -Plodová voda -Sliny -Pot

9

10 Metodiky stanovení diagnosticky významných analytů: Potenciometrické metody stanovení iontů Spektrální metody Elektromigrační metody HPLC Bioanalytické metody, RIA, ELISA Sensorová analýza

11 Problémy se vzorkem Komplexnost Malá množství Labilita

12 Zásady pro práci s biologickým materiálem 1. Teplota 2. ph + iontová síla 3. Koncentrace analytu (např. bílkoviny) 4. Pěnění 5. Lokální přebytky 6. Přítomnost degradujících enzymů (např. proteázy)

13

14 Stanovení analytů bez separace Bioanalytické metody -využití enzymů -imunochemické metody

15 Využití biospecifických interakcí pro analytické účely (molecular recognition, molekulární rozpoznávání)

16

17 Přehled radioaktivních a fluorescenčních značek

18 Katalytická aktivita enzymů závisí na jejich konformaci Prostorové uspořádání vazebného místa pro vazbu substrátu -Katalytické a -vazebné -stabilizační skupiny Změna konformace (denaturace) vede ke ztrátě aktivity

19 Umožňují provádět řadu chemických reakcí rychle a elegantně, vysoce specificky, za velmi šetrných podmínek Analyt je enzymový substrát Př, stanovení glukozy klasicky (o-toluidin, SCHB, versus GOD Stanovení močoviny- oximy enzymové stanovení ureasou

20 Analytická aplikace enzymů Holoenzym: složená bílkovina Apoenzym: bílkovinná část kofaktor, nebílkovinná část (např. NAD, FMN, FAD, ATP, hem) Stanovení přirozených substátů, inhibitorů Glukoza, močovina, cholesterol se stanovuje v klinické praxi pomocí imobilizovaných enzymů

21 Nicotinamide Adenine Dinucleotide (NAD).

22 Enzymy- bílkoviny, jednoduché holoenzym Složené: bílkovinná část apoenzym a nebílkovinný nízkomolekulární kofaktor: koenzym (nekovalentně) Prostetická skupina : kovalentně připojena Kofaktory: Nukleotidy (NADP, FMN, ATP), hem, komplexy kovů

23 Stabilizace enzymů Malá stabilita enzymů, limitující faktor pro využití v analytické chemii (biosensory) Ukotvení na povrch bez ztráty aktivity Zvýšení stability: Přídavek solí, vápenaté, hořečnaté soli, sírany, fosforečnany Polylektrolyty, glycerin, EG, AK, polyaminy Zvýšení stability: Imobilizací

24 Způsoby imobilizace enzymů Adsorpce Enzymy jsou zachyceny fyzikálními silami, uplatňuji se vdw, iontové a H interakce. Sorbenty: sklo, C akt, alumina, bentonit, křemičitany, ionexové pryskyřice Předností je jednoduchost, poměrně malý vliv na konformaci biokatalyzátoru Nevýhodou malá pevnost vazby, Změna ph, teploty, iontové síly, rozpouštědla může vést k desorpci

25 Analýza enzymových aktivit: Význam pro klinickou biochemii diagnostika Liší se aktivita enzymů v orgánech a dále jako důsledek onemocnění Uvolnění enzymů do krve při infarktu myokardu: Roste obsah glutamátu Oxalát transaminázy (GOT) Keratin kinasy (CK) Laktátdehydrogenáza (LDH) Hydroxybutyrátdehydrogenaza (HBDH) a potravinářskou analytiku cizorodé látky Stanovení toxických látek (enzymová aktivita mikroorganizmů) kontrola dostatečnosti pasterizace

26 Použití syntetických substrátů: vazba štěpitelná stanovovaným enzymem: uvolnění barevné látkyzbarvení je úměrné aktivitě stanovovaného enzymu -aktivita glykoláz -peptidohydroláz -stanovení efektivity inhibice

27 Imunochemické metody Antigen a protilátka

28 Antigen a Imunogen Antigen - specifická reakce s protilátkou, buněčným receptorem Imunogen Imunitní odpověd Antigen- kompetivní - nekompetitivní ( nevyvolávají imunitní odpověd (hapten)

29 Protilátky Specifická interakce s antigeny Globulární proteiny (Ig)

30 RIA Radioimunoesej Ag (antigen) značen, stanovení Ab (protilatka), silný komplex Ag-Ab Zhodnoceni distribuce radioaktivity mezi frakci vazanou a frakci volnou Imobilizace činidla, stanovení IMUNO-partnera

31 Stanovení vybraného analytu: Albumin Albumin % bílkovin plazmy, transport bilirubinu, volných mastných kyselin, hormonů, minerálů, léků Referenční interval je g/l (krev) V kyselém prostředí kation, váže aniontová barviva (se sulfoskupinou) Spektroskopicky: komplex Albumin-barvivo Stanovení: Bromkrezolovu zelení (BCG): 630 nm, ph 4.2 Bromkresolovým purpurem (BCP): 605 nm, ph 5.2 Neruší hemoglobin a bilirubin.

32 Stanovení v moči Poškození ledvin (diabetici), alkohol Stanovení stop albuminu v moči Referenční hodnoty do 20 mg/l, 15 mg/24h stanovení protilátkami proti lidskému albuminu metodou RIA metodou ELISA

33 Enzymové metody Enzym je chemicky (kovalentně) vázán (konjugován) na reaktant (AG nebo Ab). V takto připraveném enzymovém konjugátu musí mít použitý imunoreaktant zachovány své původní imunospecifické vlastnosti: Ag své determinanty a Ab svá vazebná místa.

34

35 Partially purified, inactivated HIV antigens pre-coated onto an ELISA plate Patient serum which contains antibodies. If the patient is HIV+, then this serum will contain antibodies to HIV, and those antibodies will bind to the HIV antigens on the plate. Anti-human immunoglobulin coupled to an enzyme. This is the second antibody, and it binds to human antibodies. Chromogen or substrate which changes color when cleaved by the enzyme attached to the second antibody.

36 Positive ELISA Test animation! Negative ELISA Test

37 Separace studovaných analytů Chromatografické, elektromigrační metody

38 Obecné schéma analýzy biol. materiálu Získání vstupního materiálu Rozrušení buněk Separace

39 Manipulace s biologickým materiálem Pokud možno zpracovat co nejdříve Zmražení při o C Rozmrazování co nejrychleji

40 CHROMATOGRAFICKÉ A ELEKTROMIGRAČNÍ METODY VYUŽITÍ HPLC, EC, KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZY

41 Podstata Pohyb elektricky nabitých částic v elektrickém poli

42 Migrace částic v elektrickém poli

43 Elektromigrační metody Elektroforetickou migrací iontů rozumíme pohyb iontů v elektrickém poli vlivem elektrostatického přitahování elektrického náboje k opačně nabité elektrodě. Ionty různých poloměrů nesoucí různé náboje se v homogenním elektrickém poli pohybují konstantní elektroforetickou rychlostí, která je přímo úměrná intenzitě elektrického pole a velikosti náboje iontu a nepřímo úměrná jeho poloměru.

44

45 Kapilární zónová elektroforéza (CZE) je vhodná pro separaci molekul s nábojem (iontů) lišících se svou molekulovou hmotností, tvarem a nábojem. Kapilární gelová elektroforéza (CGE) umožňuje dělení vysokomolekulárních biologicky aktivních látek, jako peptidů, bílkovin, štěpů DNA a RNA. Micelární elektrokinetická kapilární chromatografie (MECC, MEKC) využívající micel vytvářených povrchově aktivními látkami (detergenty), se s výhodou používá pro separaci neutrálních molekul i iontů. Elektrochromatografie v naplněných kapilárách (EC, CEC) kombinuje elektroforetický a chromatografický separační mechanismus a umožňuje dělení neutrálních i nabitých molekul.

46 Kapilární izoelektrické fokusování (CIEF, IEF) dělí látky amfolytické povahy (tj. látky, které mohou nést kladný, záporný nebo žádný náboj podle ph okolního prostředí) v lineárním ph gradientu. Kapilární izotachoforéza (CITP, ITP) separuje ionty podle rozdílných elektroforetických mobilit. Elektromigrační separační metody využívají dvou transportních jevů, elektroforetické migrace iontů v elektrickém poli a elektroosmotického toku kapaliny kapilárou.

47 Původ elektroosmotického toku

48 Elektroosmotický tok (elektroosmóza, EOF) je tok kapaliny kapilárou, v níž je vytvořeno elektrické pole vložením napětí desítek kilovoltů mezi elektrody na koncích kapiláry. Naplníme-li kapiláru z taveného křemene roztokem nějakého elektrolytu, dochází k disociaci křemičitanových skupin na vnitřní stěně kapiláry. Vnitřní povrch kapiláry tak získává negativní náboj a uvolňované vodíkové protony vytvářejí pozitivně nabitou vrstvu v roztoku přilehlém k vnitřní stěně kapiláry. Po vložení elektrického napětí mezi elektrody na koncích kapiláry dochází k pohybu hydratovaných vodíkových protonů ve vzniklém elektrickém poli směrem ke katodě. Tyto vodíkové protony obalené molekulami vody strhávají veškerý roztok uvnitř kapiláry s sebou směrem ke katodě, čímž vzniká tok.

49

50 Elektroosmotický tok

51 EOF: ph závislost Lineární rychlost elektroosmotického toku je přímo úměrná intenzitě elektrického pole a závisí na velikosti negativního náboje, který nese vnitřní stěna kapiláry. Čím je vyšší ph roztoku uvnitř kapiláry, tím větší negativní náboj je rozprostřen po vnitřní stěně a tím rychlejší elektroosmotický tok pozorujeme. Elektroosmotický tok vykazuje téměř rovinný rychlostní profil, který vede k velmi malému rozmývání zón separovaných látek, a proto se v elektromigračních separačních metodách setkáváme s mnohem užšímí píky než v HPLC.

52 Elektroosmotický tok 4 eo = potenciál Helmholtzovy dvojvrstvy = viskozita = dielektrická konstanta eo = elektroosmotická mobilita v eo 4 E

53 Elektroforéza Dělení nabitých částic na základě rozdílných elektroforetických mobilit

54 Volná elektroforéza A A+B C B+C A+B+C A+B+C A > B > C

55 Zónová elektroforéza + + A+B+C C B A - - A > B > C

56 Uspořádání Horizontální + -

57 Upořádání Vertikální + -

58 Agar a agarosa Složení kopolymer galaktosy a anhydrogalaktosy - Přítomnost ionogenních skupin silný EOF + Velké pory + Snadná příprava Použití : imunoelektroforetické metody elektroforéza NK

59 Polyakrylamid Složení kopolymer akrylamidu a N,N,- methylenbisakrylamidu + plně splňuje požadavky - Monomery jsou neurotoxiny!!!!!! Použití : analýza bílkovin

60 Polyakrylamid 2C CH C O H 2 C CH C O CH 2 CH C H 2 C O CH C O NH 2 NH NH 2 NH CH 2 NH NH 2 CH 2 NH C O C C O H 2 C CH CH 2 CH H 2 C CH

61 Provedení PAGE

62 SDS PAGE OSO3 - Na g bílkoviny váže 1.4 g SDS uniformní náboj na jednotku MW

63 SDS PAGE

64 KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZA + kv - kapilára detektor čas elektrolyt, elektrody CE, CZE, HPCE

65 + PRINCIP METODY kv různá rychlost (pohyblivost) iontů v elektrickém poli kapilára detektor čas elektrolyt, elektrody CE, CZE, HPCE

66 KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZA EOF endoosmotický tok v jedné analýze lze detekovat kationty, anionty i neutrální látky polymer křemen dutý prostor dva analyty mají blízkou pohyblivost přídavek dalšího separačního modu elektrochromatografie (elektrokinetická chrom.) možnost separace: neutrálních látek R- a S- enantiomerů cis- a trans- izomerů

67 EKC ELEKTROKINETICKÁ CHROMATOGRAFIE chirální separace MEKC micelární EKC cyklodextriny

68 Charakterizace organických molekul a biomolekul Hmotnostní spektrometrie

69 PROBLÉM Identifikace neznámé látky: ANALYT MS UV/VIS NMR FTIR komplexní, křížově ověřená informace

70 Hmotnostní spektrometrie (MS)

71 Jak pracuje hmotnostní spektrometr Sample Ion source: makes ions Mass analyzer: separates ions Mass spectrum: presents information

72 SCHÉMA SPEKTROMETRU

73 Hmotnostní Spektrometr: Blokové schema High Vacuum System Inlet Ion source Mass Analyzer Detector Data System

74 Mass Spectrometer Block Diagram High Vacuum System Turbo molecular pumps Inlet Ion source Mass Analyzer Detector Data System

75 Sample Introduction High Vacuum System Inlet Ion Source Mass Analyzer Detector Data System HPLC Flow injection Sample plate

76 Ion Source High Vacuum System Inlet Ion Source Mass Analyzer Detector Data System MALDI ESI FAB LSIMS EI CI

77 Matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) Laserová desorpční ionizace s pomocí matrice Metoda MALDI MS (od 1988) je rozšířeným Metoda MALDI MS (od 1988) je rozšířeným nástrojem pro separaci přírodních látek, peptidů, proteinů a dalších biomakromolekul (oligonukleotidy, sacharidy, lipidy). Vzorek je na nerezové destičce ukotven v netěkavé matrici (kokrystalizace). Používá se např. kyselina nikotinová nebo 2,5- dihydroxybenzoová. Vzorek se nanese v množství 0.5 μl na nerezovou destičku a nechá se vysušit. Pak se aplikuje 0.5 μl matrice a opět se nechá vysušit. Ale i jiné postupy. Matrice se volí dle vzorku, účelem použití je desorpce energie laseru. Destička se vloží do přístroje, zacílí se laserový paprsek ( fire ), transfer energie způsobí ionizaci. Směrovaný energetický impuls poskytuje vysoké výtěžky iontů intaktního analytu, dosahuje se subpikomolární sensitivity.

78 MALDI: Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Sample plate hn MH + Laser 1. Sample is mixed with matrix (X) and dried on plate. 2. Laser flash ionizes matrix molecules. +/- 20 kv Grid (0 V) 3. Sample molecules (M) are ionized by proton transfer: XH + + M MH + + X.

79 Mass Analyzer High Vacuum System Inlet Ion source Mass Analyzer Detector Data System Time of flight (TOF) Quadrupole Ion Trap Magnetic Sector FTMS

80 detector Time-of-flight (TOF) Mass Analyzer Source Drift region (flight tube) V Ions are formed in pulses. The drift region is field free. Measures the time for ions to reach the detector. Small ions reach the detector before large ones.

81 Princip of MALDI-TOF Mass Spectroscopy

82 Detector High Vacuum System Inlet Ion source Mass Analyzer Detector Data System Microchannel Plate Electron Multiplier Hybrid with photomultiplier

83 Data System High Vacuum System Inlet Ion source Mass Analyzer Detector Data System PC Sun SPARK Station DEC Station

84 Relative Abundance The mass spectrum shows the results MALDI TOF spectrum of IgG MH (M+2H) (M+3H) Mass (m/z)

85

86 MALDI: Matrice

87

88 Clinical Diagnostics Proteomics: Protein Profiling

89