Univerzita Palackého v Olomouci Přírodovědecká fakulta Katedra fyzikální chemie

Transkript

1 Univerzita Palackého v Olomouci Přírodovědecká fakulta Katedra fyzikální chemie Efekt tris(hydroxymethyl)aminomethanu na elektrogenerovanou chemiluminiscenci luminolu Diplomová práce Vypracovala: Studijní obor: Vedoucí práce: Bc. Tereza Kovačíková Materiálová chemie doc. RNDr. Jan Hrbáč, Ph.D. Olomouc, květen 21

2 Prohlašuji, že jsem diplomovou práci vypracovala samostatně pod vedením doc. RNDr. Jana Hrbáče, Ph.D., na katedře fyzikální chemie s využitím pouze uvedených pramenů a literatury v přiloženém seznamu. V Olomouci dne

3 Poděkování Chtěla bych poděkovat vedoucímu své diplomové práce doc. RNDr. Janu Hrbáčovi, Ph.D., za odborné vedení, připomínky a za pomoc při tvorbě této práce. Poděkování patří také mým rodičům za jejich veškerou podporu v průběhu mého studia.

4 Obsah 1. Úvod Teoretická část Luminiscence Chemiluminiscence Elektrogenerovaná chemiluminiscence Chemiluminiscence luminolu Elektrogenerovaná chemiluminiscence luminolu Látky ovlivňující CL luminolu Cyklická voltametrie Experimentální část Chemikálie Experimentální vybavení Příprava používaných roztoků Popis průběhu experimentů při měření CL a ECL Měření CL luminolu na přístroji BioOrbit Měření ECL luminolu Výsledky a diskuze Vliv pufru TRIS na CL luminolu Vliv pufru TRIS a fosfátového pufru na ECL luminolu Měření na Pt elektrodě Měření na elektrodě ze skelného uhlíku Závěr Summary Literatura

5 1. Úvod Luminol a jeho deriváty jsou chemiluminiscenčními činidly důležitými v mnoha odvětvích lidské činnosti. Chemiluminiscence luminolu se uplatňuje například v imunoanalýze, k detekci reaktivních forem kyslíku (tzv. ROS), a to jak v medicíně, tak v biochemii. Dále je důležitým pomocníkem v kriminalistice a v neposlední řadě se používá ke stanovení kationů ve slané vodě. Cílem této diplomové práce je zjistit vliv prostředí na objemovou a elektrogenerovanou chemiluminiscenci luminolu. V dřívějších pracích (Tunka, Hlavenková) byl popsán vliv pufrů TRIS a BISTRIS na objemovou chemiluminiscenci a elektrochemiluminiscenci luminolu. Zvýšení světelné emise je velmi výrazné u objemové chemiluminiscence iniciované systémem Co 2+ H 2 O 2. V této práci je jev zkoumán podrobněji. CL luminolu iniciovaná systémem Co 2+ H 2 O 2 je proměřena v širokém rozmezí ph = Pozornost je však věnována zejména elektrochemickému provedení CL reakce, které prokázalo, že TRIS působí na CL luminolu v přítomnosti peroxidu vodíku interakcí s oxidovanými formami luminolu. V práci je zkoumán vliv pracovní elektrody a CTAB na ECL. 5

6 2. Teoretická část 2.1. Luminiscence Luminiscence je obecně definována jako emise elektromagnetického záření obvykle ve viditelné nebo blízké infračervené oblasti elektromagnetického spektra, která nastává při relaxaci molekuly z jejího elektronového excitovaného stavu do základního stavu. Luminiscence je někdy popisována jako studené záření, protože je toto záření generováno bez pozorovatelného tepla. Proto je důležité ji rozlišovat od záření, které je emisí světla, které nastává při zahřívání pevných látek. Název luminiscence, který pochází z latiny (lumen = světlo), byl poprvé zaveden Eilhardtem Wiedemannem v roce 1888 a označen jako všechny světelné jevy, které nejsou podmíněny pouze vzestupem teploty, jako protiklad tepelnému záření [1]. Molekuly schopné emise tohoto studeného záření při návratu z excitovaného do základního stavu se nazývají luminofory. Podle zdroje elektronové excitační energie klasifikujeme různé typy luminiscence: Termoluminiscence je luminiscence sloučenin pevných látek, které jsou mírně zahřívány. Triboluminiscence může být pozorována při drcení krystalů. Při fotoluminiscenci je původcem excitační energie elektromagnetické záření. Fluorescence a fosforescence, jsou oba fotoluminiscenčním jevem. Elektroluminiscence je emise světla generovaná aplikováním elektrického pole na nějakou luminiscenční sloučeninu. Chemiluminiscence je luminiscence jako výsledek chemické reakce, během které je generován elektronově excitovaný stav. Chemiluminiscenční reakce jsou obecně 6

7 oxidační procesy a excitovaná sloučenina, která je produktem reakce, má odlišnou chemickou strukturu od výchozího reaktantu. Bioluminiscence může být považována za speciální případ chemiluminiscence, která se vyskytuje v živých organismech. Bioluminiscence velmi často nastává při enzymatických reakcích. S dobře známými případy bioluminiscence se setkáváme u světlušek, některých hub, hlubokomořských ryb a některých druhů rostlin a mořských bakterií [2, 3]. Tab. 2.1: Rozdělení luminiscence. Druh luminiscence Radioluminiscence Termoluminiscence Elektroluminiscence Katodová luminiscence Triboluminiscence Chemiluminiscence Fotoluminiscence Sonoluminescence Budící energie Krátkovlnné elektromagnetické záření např. γ, rentgenové atd. Tepelná Elektrická Elektrony urychlené v elektrickém poli Mechanická tření, stlačování apod. Chemická reakční Světelné záření, popř. UV záření Ultrazvuk [4] Absorpce UV-VIS záření organickou molekulou vyvolává přechod elektronu ze základního stavu do excitovaného stavu a je doplněna vibračními a rotačními změnami v molekule. Excitovaná molekula je buď v singletovém (S 1 ) nebo v tripletovém (T 1 ) stavu (Obr. 2.1). Návratu do základního stavu (S ) může být doprovázen emisí záření. Tento jev se nazývá fluorescence (S 1 S přechod) nebo fosforescence (T 1 S přechod). Vlnová délka vyzařovaných fotonů je odlišná (delší) od původního záření, které se absorbuje. Návrat elektronu do základního stavu nezářivými procesy je alternativní cestou, ale z analytického hlediska cestou nevýhodnou. Při chemiluminiscenční chemické reakci vznikají organické molekuly ve formě excitovaného stavu bez absorpce záření. Následné deexcitační procesy jsou stejné jak pro chemiluminiscenci, tak pro fluorescenci i fosforescenci.u chemiluminiscence jsou obvykle 7

8 využívány fluorescenční vlastnosti excitovaných molekul, emise z tripletových stavů jsou při chemiluminiscenci vzácné (Obr. 1) [5]. Obr. 2.1: Jablonského diagram Chemiluminiscence Chemiluminiscence (CL) je jev pozorovaný u elektronově excitovaných produktů exoergické chemické reakce při relaxaci do svých základních stavů, která je doprovázena emisí fotonů. Tato definice se dá jednoduše přeložit jako chemická reakce, která emituje světlo [2]. Vlnová délka emise nemusí odpovídat viditelné oblasti spektra, ale může také vzniknout v infračervené nebo ultrafialové oblasti [6]. Chemiluminiscenční reakce jsou zpravidla oxidačně-redukční procesy [7]. Chemické reakce produkující záření by měly splňovat následující základní požadavky: 1. Reakce musí být exotermní, aby produkovala dostatek energie pro tvorbu elektronově excitovaného stavu. 2. Reakční cesta musí být energeticky výhodná pro vytvoření excitovaného stavu. V případě, že dojde ke ztrátě chemické energie ve formě tepla, např. pomocí vibračních a rotačních energií, reakce nebude chemiluminiscenční. 8

9 3. Emise fotonu musí být výhodný deaktivační proces excitovaného produktu ve vztahu k jiným konkurenčním nezářivým procesům, které se mohou také objevit. (Obr. 2.2). Obr. 2.2: Procesy ztráty energie z excitovaného stavu: (1) přímá CL; (2) molekulární disociace; (3) chemické reakce s jinými reaktanty; (4) intramolekulární přenos energie; (5) intermolekulární přenos energie (v případě fluoroforu, nepřímé CL); (6) izomerace; (7) fyzikální zhášení. Chemiluminiscenční reakce mohou být rozděleny podle typu luminiscenční sloučeniny, která je organická nebo anorganická, nebo mohou být rozděleny podle toho, v jaké fázi reakce probíhá (pevná, kapalná, plynná). Další klasifikace může být podle mechanismu reakce emitující světlo. Vzhledem k mechanismu reakce jsou významné dva hlavní typy chemiluminiscence, CL přímá a nepřímá (senzitizovaná CL) (Obr. 2.3) [3]. Jak již bylo uvedeno, při CL reakci vzniká určitý podíl produktu nebo meziproduktu v excitovaném stavu, který může následně relaxovat do základního stavu, což je doprovázeno emisí fotonu, pokud je excitovaná molekula schopna zářivé relaxace. V přímé reakci dva reaktanty, obvykle substrát a oxidační činidlo (dále může být nutná přítomnost některých kofaktorů nebo katalyzátor), reagují na produktovou nebo meziproduktovou formu. Substrát je CL prekurzor, který je přeměněn na elektronově excitovanou molekulu, odpovědný za světelné záření, nebo působí jako donor energetického přenosu v nepřímých CL. 9

10 Katalyzátory (nejčastěji enzymy nebo ionty kovů) snižují aktivační energii a poskytují vhodné prostředí pro tvorbu vysoce účinného CL procesu. Obr. 2.3: Typy CL reakcí. P produkt, F fluoreskující látky. Nepřímá (senzitizovaná) CL je založena na procesu přenosu energie excitovaného stavu na fluorofor. V případě senzitizované CL je účinnost přenosu energie z excitovaných stavů k fluoroforu i účinnost fluorescence důležitá. Ve všech luminiscenčních procesech je intenzita vzniklé emise závislá na účinnosti generování molekul v excitovaném stavu, což je dáno kvantovým výtěžkem a rychlostí reakce [8]. Pro intenzitu chemiluminiscence platí vztah I CL da = Φ CL. (1) dt Účinnost chemiluminiscenčních procesů je, jak již bylo uvedeno, definována jako kvantový výtěžek Φ cl představující podíl molekul, které vyzařují foton při návratu do základního stavu. Kvantový výtěžek je u přímé CL produktem tří hodnot: 1

11 Φ = Φ Φ Φ, (2) cl c e f kde Φ c je podíl molekul, který reaguje cestou poskytující excitovaný produkt, Φ e je exitační kvantový výtěžek udávající zlomek molekul, které se při reakci dostanou do elektronově excitovaného stavu a Φ f je zlomek těchto molekul, které relaxují vyzářením fotonu. U senzitizované CL má vztah (3) pro kvantový výtěžek následující tvar: [( Φ ) Φ + Φ ] Φ, (3) cl = Φ c Φ e 1 et f etφ a Kde Φ et je kvantový výtěžek přenosu energie a Φ a je kvantový výtěžek fluorescence akceptoru (Φ f je v tomto případě kvantový výtěžek fluorescence donoru). Kvantový výtěžek chemiluminiscence je často velmi nízký, typické hodnoty jsou menší než l %. V některých případech, kdy excitovaná molekula vystupuje jako neefektivní emiter, může být použit pro zvýšení intenzity přídavek fluoresceru, který převede chemiluminiscenční reakci z přímé na senzitizovanou [5] Elektrogenerovaná chemiluminiscence Elektroluminiscence (také elektrogenerovaná chemiluminiscence a zkráceně ECL) se týká světelného záření, které vzniká přenosem vysoce energetického elektronu (ET) při reakci mezi elektrogenerovanými radikálovými ionty [9]. Obecně lze říci, že se elektronově generované reaktanty šíří z jedné nebo více elektrod a účastní se vysoce energetické reakce přenosu elektronů buď se sebou navzájem nebo s chemickými látkami v roztoku. Tento proces přináší excitovaný stav molekuly, které pak produkují chemiluminiscenční emise v okolí povrchu elektrody [8]. Typická ECL organických molekul je založena na reakci elektronového přenosu zahrnující aromatické radikálové ionty (tzv. iontovou anihilací). Radikálové ionty vznikají anodickou oxidací a katodickou redukcí pomocí dvou elektrod nebo na jedné elektrodě při střídání potenciálu [1]. Obecný mechanismus navrhovaný pro tyto reakce je následující: 11

12 + A A + e Anodická oxidace (4) B + e B Katodická redukce (5) Jsou možné dvě hlavní CL dráhy: Je-li k dispozici dostatek energie pro elektronový přenos, kde je přístupný singletový excitovaný stav A (6). Jinak jsou možné energeticky-deficitní trasy, kdy je energie ze dvou tripletních excitovaných stavů sdružena k tomu, aby poskytly dostatek energie ke tvorbě singletového excitovaného stavu. Tento děj se nazývá triplettripletová anihilace (7) a (8). A + + B 1 A + B (6) nebo A + 3 A + + B 3 A 3 1 A A + B + A (7) (8) 1 A A + hv (9) [8, 1] Světlo emitující excitovaný singletový stav zahrnující radikály + A a B, kde + A a 1 A mohou pocházet ze dvou různých prekurzorů [1]. vzniká při iontové anihilační reakci B mohou být buď stejné sloučeniny nebo 12

13 Chemiluminiscence luminolu O NH NH NH 2 O Obr. 2.4: 5-amino-2,3-dihydro-1,4-ftalazindion (luminol) Chemiluminiscenční vlastnosti luminolu (5-amino-2,3-dihydro-1,4-ftalazindion) byly poprvé publikovány v roce 1928 Albrechtem. Od té doby je chemiluminiscenci luminolu a jemu podobných hydrazidů věnována velká pozornost. Zatímco v aprotickém prostředí (dimethylsulfoxid nebo dimethylformamid) vyžaduje chemiluminiscence luminolu pouze kyslík a silnou zásadu, v protických rozpouštědlech (voda, vodné směsi rozpouštědel, nižší alkoholy, různé deriváty kyslíku molekulární kyslík, peroxidy, superoxidový anion) je k oxidaci luminolu potřeba přídavek katalyzátorů. CL reakce probíhá v alkalickém prostředí (ph 1 13). Jako oxidační činidlo se velice často používá peroxid vodíku a jako katalyzátory kationy přechodných kovů (Cr 3+, Mn 4+, Fe 2+, Fe 3+, Co 2+, Ni 2+, Cu 2+, Hg 2+ ) a jejich komplexy. Peroxid vodíku se může zapojit jako peroxidový anion vzniklý superoxidový radikál HO 2 nebo po oxidaci O 2. Také řada enzymů může působit jako katalyzátory. Jsou to mikroperoxidáza, myeloperoxidázy, křenová peroxidáza, kataláza, xanthinoxidáza, metaloproteiny jako cytochrom c, hemoglobin, haptoglobin, deuterohemin. Dále pak chemiluminiscenci luminolu iniciují oxidanty jako molekulární ozon, halogeny nebo anion peroxodisíranu [11]. CL luminolu katalyzují některé komplexní sloučeniny s organickými i anorganickými ligandy. Účinnými katalyzátory jsou proteiny obsahující hem, obzvláště křenová peroxidáza (EC ), které jsou schopny katalyzovat CL v přítomnosti peroxidu vodíku. Použití těchto enzymů má výhodu oproti ostatním katalyzátorům, jako je hexakyanoželezitan draselný, protože chemiluminiscenční reakce může probíhat blízko neutrálních hodnot ph (8 8,5) [3]. 13

14 CL reakce jsou velmi atraktivní díky jejich snadnému použití, vysoké citlivosti a jednoduché instrumentaci [7]. Použití CL jako detekční metody dovoluje kvantitativní stanovení různých sloučenin při nízkých koncentracích. Na CL reakci jsou založeny detekční systémy ve spojení s FIA nebo kapalinové chromatografie na základě imobilizace enzymů [12]. Ve studii provedené Takayanagim [13] jsou uvedeny výhody chemiluminiscence luminolu jako detekčního nástroje pro realizaci vysoké citlivosti v sekvenční injekční analýze (SIA) bez nutnosti externího zdroje světla. Vodný roztok luminolu, peroxidu vodíku a vzorek obsahující kovové ionty byl postupně nasáván do reakční cívky, kde byly zóny okamžitě poháněny do detektoru. Po optimalizaci parametrů byl katalytický efekt porovnáván u šestnácti kovových iontů na CL luminolu v přítomnosti peroxidu vodíku v prostředí borátového pufru. Silný katalytický účinek byl nalezen u iontů Fe 3+, Fe 2+, VO 2+, VO 3, MnO 4, Co 2+ a Cu Elektrogenerovaná chemiluminiscence luminolu ECL reakce luminolu s peroxidem vodíku v alkalickém prostředí je podobná CL luminolu aktivované chemickou oxidací. Práce Wróblewské [14], která zkoumá ECL luminolu na platinové a uhlíkové elektrodě v závislosti na vloženém potenciálu a termodynamických podmínkách, poukazuje na možnost několika reakčních cest, kterými se ECL luminolu může ubírat. Vznik produktů emitujících světlo je iniciován jednoelektronovou elektrochemickou oxidací luminolu na radikálanion (semidiazachinon), a to v alkalickém prostředí. Takto vytvořené radikálové produkty mohou podstoupit druhou elektrochemickou oxidaci, která vede k tvorbě diazachinonu (možná je i přímá dvouelektronová oxidace luminolu přímo na diazachinon). Důležitým, tzv. klíčovým meziproduktem, je α-hydroxyperoxid luminolu. Sato [15] uvádí, že α-hydroxyperoxid, excitovaný stav může vzniknout dvěma cestami: zaprvé reakcí luminolového radikálu (semidiazachinonu) se superoxidovými radikálanionty ( O ), nebo zadruhé diazachinonu s peroxidovým iontem ( HO ) (Obr. 2.5) [15]. Rozklad tohoto meziproduktu 2 (3-aminoftalátu) vede ke vzniku excitovaného stavu, účinnost tohoto kroku záleží pouze na ph systému rozklad protonované formy α-hydroxyperoxidu nevede k chemiluminiscenci, proto je optimální pro CL reakci luminolu alkalické prostředí. Elektrogenerovaná chemiluminiscence luminolu dovoluje detekci širokého spektra analytů. Například peroxid 2 14

15 vodíku může být detekován s velkou citlivostí a v závislosti na nastavení systému mohou být dosaženy nízké detekční limity. Mnoho enzymů produkuje peroxid vodíku přes své substráty specifickou enzymatickou aktivitou. Kombinace těchto vysoce specifických biologických reakcí a citlivé ECL reakce tvoří silný analytický nástroj. Požadované alkalické ph pro reakci luminolu se někdy neshoduje s požadavky enzymů, a proto musí být nalezen kompromis. Luminol může být pomocí ECL detekován v subnanomolárních koncentracích. Široké spektrum derivátů luminolu bylo zkoumáno pro značení jiných molekul, zejména biomolekuly. To znamená, že ECL detekce luminolu může být použita v kombinaci s chromatografií a biologickým značením. Jinou skupinou analytů pro systém luminol/peroxid vodíku jsou elektrogenerované katalyzátory, které propagují konvenční CL reakci. Tyto katalyzátory mohou být okamžitě detekovány nebo mohou být použity k vylepšení signálu pro detekci jiných analytů [1]. Wilson ve své studii [16] zkoumá oxidovaný ferrocen a jeho deriváty jako katalyzátory chemiluminiscenční oxidace luminolu peroxidem vodíku. Katalytický efekt souvisí s redoxním potenciálem ferrocenu. Ferrocen slouží k označení vzorků DNA a imunologii. V této práci byl také zkoumán vliv dvanácti pufrů s různými hodnotami pk a a čtyři různé materiály pracovních elektrod (ITO elektroda, platinová elektroda, zlatá elektroda, elektroda ze skelného uhlíku). Ferrocenem katalyzovaná chemiluminiscence byla nejvyšší u ITO elektrody, následované uhlíkovou a zlatou elektrodou a nejnižší u platinové elektrody. Práce Robinsona [17] se zabývá detekcí oxidu dusnatého a systémem, který byl vyvinut a aplikován na analýzu vydechovaného vzduchu. Analýza je založena na přeměně NO na NO 2 pomocí oxidu chromového a následující chemiluminiscenční detekcí reakce NO 2 s alkalickým roztokem luminolu a H 2 O 2. Přítomnost H 2 O 2 zvyšuje citlivost NO 2 detekce. Měření koncentrace oxidu dusnatého ve vydechovaném vzduchu je dostatečně citlivé, přesné a vhodné pro klinické měření. Liu ve své studii [18] navrhuje glukózový biosenzor založený na ECL luminolu, která je katalyzována nanočásticemi zlata. Nanočástice jsou uspořádány na prostorovou křemičitou síť a poté je glukosaoxidasa adsorbována na povrch zlatých nanočástic. Liu zkoumal proces tvorby povrchu biosenzoru a ECL reakci biosenzoru. ECL intenzita biosenzoru závisí na skenovací rychlosti, koncentraci luminolu a velikosti nanočástic. ECL biosenzor má široký lineární rozsah (1 µm 5 mm), reprodukovatelnost, stabilitu a selektivitu. Účinné biosenzory mohou sloužit k detekci biologicky důležitých sloučenin. 15

16 Zhang [19] zkoumal ECL chování luminolu ve slabě kyselém prostředí (ph = 4). Pozoroval, že Co 2+ může znatelně zlepšit ECL luminolu v kyselém prostředí při potenciálu od 1,8 do +1, V (proti Ag/AgCl). Tato vlastnost byla využita k selektivnímu určení stanovení stopového množství Co 2+. Pro navrhovanou metodu je detekční limit 2, 1-12 mol/l Co 2+. Přestože je mnoho metod schopných detekovat Co 2+ při stejné nebo dokonce nižší koncentraci, slabě kyselé prostředí je vhodné pro biomolekuly (proteiny, nukleové kyseliny atd.). Metoda má aplikační potenciál pro elektrochemiluminiscenční DNA senzory. O NH NH luminol NH 2 O H + OH - O O - O - N - -e - C N -H + C N NH N N NH 2 O NH 2 O semidiazachinon NH 2 O -2e - -e - -e - O 2 - O N N HO 2 - O - OH NH NH +H + HO O N N OH NH 2 O diazachinon NH 2 O α hydroxyperoxid NH 2 O -N 2 -N 2 hν + O O O - OH O * O - OH NH 2 O aminoftalátový anion NH 2 O O O - OH Obr. 2.5: Reakční schéma chemiluminiscence luminolu. 16

17 CL luminolu záleží na použitém materiálu elektrody, ale také na stavu povrchu elektrody. Pro systém s luminolem byly pozorovány různé ECL píky, které odpovídají odlišným reakčním mechanismům, na Pt a Au elektrodě, dále pak na elektrodě ze skelného uhlíku a parafínem impregnované grafitové elektrodě. Méně obvyklé jsou práce zabývající se ECL luminolu na elektrodách z méně ušlechtilých kovů (např. mědi) nebo na modifikovaných elektrodách. V práci od Hong-Xiao Yu [2] byly porovnávány zlatá elektroda s měděnou elektrodou. ECL luminolu na zlaté elektrodě vykazuje vyšší citlivost ve srovnání s měděnou elektrodou. Kromě toho, zlatá elektroda nabízí větší použitelný potenciálový rozsah a lepší reprodukovatelnost a stabilitu než měděná elektroda; měděná elektroda však může sloužit jako náhradní elektroda pro konkrétní účel z důvodu nízkých nákladů. Reprodukovatelnost v úzkém potenciálovém rozsahu je dostačující pro některé typy analytických stanovení. Problematickým momentem použití měděné elektrody pro ECL luminolu je tvorba vrstvy oxidu mědi (Cu 2 O), která zpomaluje elektro-oxidaci luminolu, vedoucí k poklesu ECL intenzity. Je to doloženo experimenty, které provedl Kautket [21] na předoxidované měděné elektrodě v zásaditém prostředí. Práce Wanga [22], kde byla používána elektroda ze skelného uhlíku modifikovaná vrstvou nafionu a sloučeniny niklu (NiTSPc), uvádí mechanismus ECL, kde se modifikovaná vrstva Ni 2+ zapojuje do katalytické oxidace luminolu. Ni 2+ působí stejně jako jiné ionty kovů, které se přidávají do roztoků Látky ovlivňující CL luminolu Pufry Biologické reakce fungují dobře pouze v mezích úzkého koncentračního rozsahu vodíkových iontů. Pufry jsou látky, které podstupují reverzibilní protonaci během určitého ph rozsahu, a proto zachovávají koncentraci vodíkových iontů v přijatelných mezích. Pufry jsou schopny udržovat ph roztoku v určitém rozmezí [23]. Ideální biologické pufry by měly: mít pk a mezi ph 6 až ph 8, být inertní k široké škále chemikálií a enzymů, 17

18 být netoxické, levné, nesmí být citlivé k solným nebo teplotním efektům, neabsorbovat viditelné nebo ultrafialové světlo. Žádný z pufrů používaných v molekulární biologii nesplňuje všechna tato kritéria zároveň. Je známo, že velmi málo slabých kyselin má disociační konstanty mezi 1 7 a 1 9. Mezi anorganickými solemi jsou to pouze boritany, hydrogenuhličitany, fosfáty a amonné soli, které leží v tomto rozmezí. Nicméně jsou nevhodné pro fyziologické prostředí. Jak již bylo dříve zmíněno, Wilson [16] se zabýval katalytickým vlivem ferrocenů na CL luminolu ve dvanácti běžných biologických pufrech (Bicin, Bis-Tris propan, DISPO, EPPS, HEPES, fosfátový pufr, POPSO, TAPSO, TES, Tricin, TRIS, Triethanolnamin) vhodných k použití při ph = 8,. S výjimkou bicinu byl u pufrů lineární vztah mezi světelnou intenzitou a hodnotou pk a, což naznačuje, že pufrační činidlo funguje jako akceptor protonů v katalytické reakci. Maximální světelná intenzita pro katalytickou reakci byla pozorována v pufru bis-tris a druhá nejvyšší v TRIS pufru. Další práci, která zkoumá vliv pufrů na CL luminolu uvedl Sasaki [24], který porovnával vliv uhličitanového pufru a borátového pufru na CL. Uhličitanový pufr vykazoval třikrát vyšší CL než borátový pufr v systému který obsahoval luminol, peroxid vodíku o stejné koncentraci. Pufr TRIS OH HO H O NH 2 Obr. 2.6: TRIS (tris(hydroxymethyl)aminomethan) TRIS (THAM), je látka, ze které se dají připravit pufry, jejichž pufrační kapacita je optimální při ph = 7 9, tj. v tzv. fyziologické oblasti ph. TRIS je proto velmi vhodný 18

19 pufr pro mnohé biochemické účely. Jeden z prvních komerčních úspěchů TRISu, který si tím získal širokou pozornost, bylo snížení úmrtnosti při manipulaci a dopravě ryb [23]. TRIS má velmi vysokou pufrační kapacitu. Je vysoce rozpustný ve vodě a je inertní v širokém spektru enzymatických reakcí. Nicméně má také řadu nedostatků: pk a TRISu je při ph = 8 (při 2 C), to znamená, že jeho pufrační kapacita je velmi nízká při ph nad 7,5 a pod 9,. Teplota má podstatný vliv na disociaci TRISu. ph roztoku poklesne o,3 ph jednotek na každý 1 C vzrůstu teploty. Například,5M roztok má ph 9,5, 8,9, a 8,6 na 5 C, 25 C a 37 C. V odborné literatuře je uvedeno měření ph při 25 C. Při přípravě zásobního roztoku TRISu je vhodné, aby ph bylo v požadovaném rozsahu a potom nechat roztok vychladnout na 25 C před konečnou úpravou. Koncentrace má významný efekt na disociaci TRISu. Například ph roztoku, který obsahuje 1 mm a 1 mm TRISu se bude lišit o,1 jednotky ph, více koncentrovaný roztok má vyšší ph. Je toxický pro mnoho typů savčích buněk. TRIS a primární aminy nemohou být použity v přítomnosti glutaraldehydu a formaldehydu. TRIS také reaguje s glyoxalem. Fosfátový nebo MOPS pufr jsou obecně používány místo TRISu s těmito reagenty. Pod ph 7,5 je TRIS nevhodný pufr. Proto v letech 196 Norman Good a jeho kolegové reagovali na potřebu lepších pufrů v tomto rozsahu za vývoje sérií N-substituovaných aminosulfonických kyselin, které se chovají jako zwiterionové pufry za biologicky příhodného ph [23]. Fosfátový pufr Nejčastěji používané fosfátové pufry jsou založeny na směsi dihydrogenfosfátu a monohydrogenfosfátu. Vhodným poměrem uvedených solí se může ph pufru pohybovat v rozmezí ph 5,8 a ph 8,. Fosfáty mají velmi vysokou pufrační kapacitu a jsou vysoce rozpustné ve vodě. Avšak mají i nevýhody: Fosfáty inhibují mnoho enzymatických reakcí a procesů. 19

20 Vzhledem k tomu, že se fosfáty srážejí v etanolu, není možné vysrážet DNA a RNA z pufrů, které obsahují významné množství fosfátových iontů. Fosfáty se srážejí dvojmocnými kationy, jako jsou Ca 2+ a Mg 2+ [23] ROS reaktivní formy kyslíku ROS jsou molekuly kyslíku, nebo sloučeniny kyslíku, vodíku a dusíku, které jsou více reaktivní než molekulární kyslík. Mezi ROS se řadí molekuly peroxidu vodíku (H 2 O 2 ), některé ionty (např. hypochloridový iont (ClO - ) a peroxonitrit (ONOO - )) některé radikály (např. hydroxylový radikál ( OH ) a superoxidový radikál ( O ). Radikály (také nazývané volné radikály ) jsou molekuly s nejméně jedním nepárovým elektronem ve valenční vrstvě. Díky přítomnosti nepárového elektronu jsou volné radikály vysoce reaktivní k oxidaci biomolekul (proteiny, DNA, lipidy). Nejreaktivnější ROS je ( OH ). H 2 O 2 má párové elektrony a není považován za volný radikál, ale je pod ROS obvykle zahrnován [25]. CL luminolu je účinná metoda pro výzkum radikálů, může být vysoce citlivá a také použita pro rychlou detekci [26]. 2 O 2 O 2-2H + OH - H + H 2 O 2 OH H 2 O e - e - e - e - Obr. 2.7: Schéma ROS vznikající z molekuly kyslíku (O 2 ). V tomto procesu O 2 přijme 4 elektrony k vzniku H 2 O. Přidáním 1 elektronu vznikne a OH [25]. O, další redukce vede k H 2 O 2 2 Peroxid vodíku Peroxid vodíku (H 2 O 2 ) je jedním z nejsilnějších oxidačních činidel i když v některých reakcích působí jako redukční činidlo. Hraje důležitou roli v atmosférických a biochemických procesech. Vzniká reakcí hydrogenperoxidových radikálů ( HO 2 ) a jejich hydratované formy tvořené fotochemickou reakcí atmosférických stopových plynů, 2

21 jako jsou ozon a těkavé organické sloučeniny. H 2 O 2 je také velmi rozpustný ve vodě. Vliv koncentrace peroxidu vodíku na CL a ECL luminolu byl studován v mnoha pracích. Například v práci Wanga [22], kde se vzrůstající koncentrací H 2 O 2 vzrůstá i intenzita ECL. Tvorba hydroxylového radikálu Hydroxylový radikál je extrémně silné oxidační činidlo - má schopnost oddělit elektron z různých organických nebo anorganických molekul a atomů. Je velice reaktivní a může být vytvořen při vystavení vody ionizujícímu záření, které zanechává jediný elektron na vodíku a jeden na kyslíku. H O H H+ OH (1) Hydroxylové radikály jsou tvořeny katalytickými rozklady peroxidu vodíku. Nejznámější reakce tohoto typu je rozklad je peroxid vodíku železnatými ionty - Fentonovou reakcí (11). Superoxydový radikál může napomáhat tvorbě hydroxylového radikálu přes Haber-Weissovu reakci (11) [27]. M + ( n ) + ( n+ 1) + H O 2 2 M + OH + OH (11) (Fentonova reakce) O + O O + OH + OH (12) H (Haber-Weissova reakce) kobalt [29]. Železo ve Fentonově reakci můžou nahradit také jiné kovy jako je měď [28] nebo Superoxidový radikál 2 Superoxidový radikál ( O ) vzniká přidáním jednoho elektronu ke kyslíku. Ačkoli 2 O je relativně nereaktivní, jeho metabolity (např. H 2 O 2 a ONOO - ) jsou vysoce reaktivní. O je slabá báze, velmi rozpustná ve vodě. Při neutrálním ph není silné oxidační činidlo, 2 21

22 nicméně je jednoelektronovým redukčním činidlem kovů. protonován na hydroperoxylový radikál [25]. O může být při nízkém ph Povrchově aktivní látky (PAL) Povrchově aktivní látky (jinak surfaktanty, tenzidy) jsou většinou organické molekuly amfifilního (amfipatického, bifilního) charakteru. Jsou rozpustné ve vodě a mají silně hydrofilní polární skupinu a hydrofobní řetězec. Ve vodném roztoku se buď absorbují na fázové rozhraní, nebo mají schopnost agregovat do útvarů nazývaných micely, které mají velikost koloidu. Surfaktanty lze rozdělit podle schopnosti disociovat ve vodném roztoku: 1. Ionogenní (ionické) Aniontové při disociaci vznikají povrchově aktivní anionty. Příkladem jsou alkalické soli vyšších mastných kyselin (např. mýdla). Dále pak alkylarylsulfonany, alkylsulfonany a alkylsulfáty (SDS). Kationtové při disociaci ve vodě vznikají povrchově aktivní kationy. Příkladem jsou soli čtyřsytných amonných bází (CTAB, CTAC), pyridinové sloučeniny substituované na atomech dusíku a alkylaminy. Amfoterní náboj micely je závislý na ph. Disociují za vzniku organického kationu nebo aniontu (bílkoviny, betainy). 2. Neionogenní (neionické) elektrolyticky nedisociují. Tvoří je dlouhý uhlovodíkový řetězec s několika polárními skupinami, ale také s neionogenními skupinami, díky nimž jsou tyto molekuly rozpustné (TRITON, TWEEN) [3]. Micely a kritická micelární koncentrace (KMK) Micelizace Micely vznikají v pravém roztoku po dosažení určité koncentrace PAL, tzv. kritické micelární koncentrace (KMK). Tvorba micel je závislá na délce uhlíkového řetězce, na vlastnostech hydrofilní skupiny, na vlastnostech protiiontů vzniklých disociací, na 22

23 přítomnosti dalších látek v roztoku a na tlaku a teplotě (Krafftova teplota). Vliv hydrofilní skupiny na KMK je velký. Při agregaci PAL, v důsledku vzniku micel, se v okolí KMK mění koncentrační závislost některých fyzikálně chemických vlastností jako je: - povrchové napětí - hustota - osmotický tlak - viskozita - povrchové napětí - elektrická vodivost - molární vodivost - turbidita - rozpustnost (v závislosti na teplotě) Obr. 2.8: Fyzikální vlastnosti roztoků koloidních PAL: ρ hustota, π osmotický tlak, η viskozita, γ povrchové napětí, λ molární vodivost, τ turbidita V typickém vodném roztoku jsou molekuly surfaktantu dispergovány jako monomery, tvoří agregáty (micely), nebo se absorbují jako film na fázové rozhraní. 23

24 Surfaktant je v dynamické rovnováze mezi těmito vztahy. Z čehož vyplývá, že míra adsorpce a desorpce jsou si rovny. Při dané teplotě, tlaku a koncentraci se počet monomerů adsorbuje na fázové rozhraní a počet monomerů vyskytujících se v roztoku je daný rovnovážnými podmínkami. Koncentrace monomerů a micel se mění v závislosti na rovnovážných podmínkách, jako je tlak teplota, nebo koncentraci PAL a soli. Agregace PAL neboli micelizace je entropií řízený proces. Ve vodných roztocích rozpuštěné PAL, jejichž hydrofobní skupina narušuje strukturu vodíkových vazeb, zvyšuje volnou energii systému. PAL se proto koncentrují na rozhraní tak, že jejich hydrofilní skupiny jsou vzdáleny (odtaženy), nebo směřují směrem pryč od vody, a tím je minimalizována volná energie roztoku. Narušení struktury vody se může také sníženo (a redukovat volnou energii roztoku) agregací povrchově aktivní molekuly do klastrů (micel), s tím že jejich hydrofobní skupiny jsou přesměrovány na vnitřek klastru a jejich hydrofilní skupiny směřují směrem k molekulám vody. Kromě toho může docházet k elektrostatickým repulzím z podobně nabitých povrchově aktivních molekul v případě surfaktantu s iontovým charakterem. Tyto síly zvyšující volnou energii systému a působí proti micelizaci. Tvorba micel závisí na rovnováze sil mezi faktory, které buď : 1. upřednostňují micelizaci - Van der Waalsovy síly - hydrofobní síly 2. anebo působí proti micelizaci - kinetická energie molekul - elektrostatická repulze Koncentrace, při které začínají vznikat micely v roztoku, se nazývá kritická micelární koncentrace (KMK) a může být určena z diskontinuity nebo z inflexního bodu v grafu fyzikální vlastnosti roztoku jako funkce koncentrace PAL. Proces micelizace je popisován reakcí: 24

25 ns S n (9) Kde S je surfaktant (monometní jednotka) a S n je micelární agregát složený z n molekul surfaktantu. Takzvané agregační (asociační) číslo n (představuje počet povrchových molekul v micele) bylo zjištěno, že se zvětšuje se stoupající délkou hydrofobního uhlovodíkového řetězce a s klesá s velikostí hydrofilní části. Obecně platí, že čím delší je uhlovodíkový řetězec PAL, tím vyšší je agregační číslo micel. Faktory zvyšující agregační číslo, snížují KMK. Faktory snižující KMK: - prodloužení délky alkylových řetězců surfaktantu - přítomnost elektrolytu, kvůli tzv. solnému efektu Práce potřebná pro přizpůsobení nepolární látky rozpuštěné v roztoku v daném objemu vody se zvyšuje v elektrolytickém roztoku kvůli silným vodíkových/iontových interakcí. Když jsou monomery surfaktantu v přítomnosti elektrolytu, micelizace je favorizována a KMK je snižována. Další faktor upřednostňující micelizaci v elektrolytickém roztoku je stínění náboje mezi iontovou částí PAL (v případě iontových PAL). Je důležité říci, že KMK představuje koncentraci volných povrchových monomerů v micelárním roztoku za daných podmínek (tlaku, teploty a složení) [31]. Struktura, velikost a typy micel Teorie micelárních struktur je založena na geometrii různých micelárních tvarů a prostoru obsazeného hydrofilní nebo hydrofobní skupinou molekul PAL. Například ve vodném prostředí surfaktanty s rozměrnou, nebo volně sbalenou hydrofilní skupinou a dlouhou, slabou hydrofobní skupinou mají tendenci tvořit kulovité micely. A surfaktanty s krátkou a rozměrnou hydrofobní skupinou a malou, těsně sbalenou hydrofilní skupinou inklinují k tvorbě lamelových nebo válcových micel. Ve zředěných vodných roztocích, při koncentraci mírně nad KMK vznikají malé agregáty molekul PAL kulovitého tvaru tzv. Hartleyovy micely. Změny teploty, koncentrace surfaktantu nebo aditiva v roztoku mohou změnit velikost, tvar, agregační číslo a stabilitu micel. Struktura micely se může měnit z kulovitého do válcovitého tvaru nebo laminárního tvaru. V koncentrovaných roztocích 25

26 (mnohem vyšší koncentrace než je KMK) vznikají laminární (McBainovy) micely, složené ze dvou paralelních vrstev PAL, kde ionické (ionogenní) skupiny směřují ven a uhlovodíkové řetězce dovnitř (směrem k sobě). Struktura a stabilita micel významně ovlivňuje dynamické vlastnosti systému. Obr. 2.9: Tvary micel: a-sférická micela; b-válcovitá micela; c-laminární micela; d-reverzní micela Vliv CTAB na CL a ECL luminolu Druh a koncentrace používaného surfaktantu ovlivňuje CL a ECL luminolu. Ve studii A. Safaviho [32] byl pozorován vliv koncentrace a typ použitého surfaktantu (kationické, anionické, amfoterní) na CL luminolu v systému N-bromsukcinimid-luminol. Největší efekt na CL měly kationické surfaktanty, z nichž nejlepší byl CTAB, u kterého se projevovalo zvýšení CL luminolu nad KMK. Pokles kv. výtěžku CL luminolu v přítomnosti PAL, kdy má kationtová PAL koncentraci nižší než je její KMK můžeme připsat tomu, že excitovaný 3-aminoftalát může tvořit iontově asociativní komplex s kationtovou PAL, který však nefluoreskuje. Zvýšení účinnosti CL vlivem CTAB při koncentracích nad KMK lze vysvětlit tím, že reagující látky, potřebné pro CL luminolu se mohou koncentrovat ve Sternově vrstvě micely CTAB, a tím způsobit zvýšení intenzity CL. 26

27 V pracích Hadjianestise a Nikokavourase [33, 34], kteří se zabývali CL luminolu a přenosem excitační energie luminolu na fluorescein v micelárním prostředí CTAC je ukázáno, že molekuly CTAC způsobují chemické a fotofyzikální zhášení excitovaného 3-aminoftalátu. Přesto je chemiluminiscence luminolu v prostředí CTAC zvýšena a chemiexcitační výtěžky jsou v micelárních roztocích CTAC vyšší, než v homogenním vodném prostředí, kvůli méně polárnímu mikropostředí micelární Sternovy vrstvy. V micelárním prostředí je luminol solubilizován ve střední části micelární Sternovy vrstvy. Při malé koncentraci CTAC jsou kvantové výtěžky nízké a přenos energie na fluorescein je neefektivní, kvůli absenci micelárních efektů. Maximálních kvantových výtěžků lze dosáhnout těsně nad KMK, díky micelárnímu vlivu na reakci. S dalším nárůstem koncentrace CTAC se kvantový výtěžek CL sníží. Analytickými chemiky je velice ceněna závislost intenzity CL jako funkce koncentrace, jejíž obrovský nárůst pozorovaný v micelárním systému by mohl být použitelný v analytickém stanovení používající světelnou reakci [33]. Při návrhu analytického stanovení pesticidu DDVP ( Dichlorvos ) Chenem [35] založeném na ECL luminolu byl porovnáván vliv PAL (PVA, PVP, CTAB, CTAC, SDS) na intenzitu ECL. Nejúčinněji zvyšovaly ECL kationické surfaktanty, z nichž nejlepší byl CTAB. V prostředí bez PAL je signál ECL luminolu velmi slabý. Výsledky naznačují, že CTA micely koncentrují anionty luminolu a DDVP a vytvářejí tím micelární mikroreaktor, který koncentruje reaktanty, které pak působí efektivněji při generování ECL. Faktem je, že neutrální a anionické surfaktanty nemohou zlepšit ECL to také dokazuje. Nejlepší výsledky měl CTAB při c =,5 mol/l. Obecně platí, že pokud je koncentrace vyšší než druhá KMK (KMK: 2,1 1-2 mol/l), micely zvýší místní koncentrace luminolu a DDVP. Experimentální výsledky ukazují, že když CTAB překročí koncentrační hranici,5 mol/l, tak způsobí pokles intenzity ECL z důvodu krystalizace CTAB. Krystaly CTAB blokují a odráží ECL emisi Cyklická voltametrie Tak jako polarografie je i voltametrie mikroanalytickou technikou, při které je vždy přeměněno malé množství elektroaktivní látky (depolarizátoru) v zkoumaném roztoku. Při cyklické voltametrii je na pracovní elektrodu vkládán potenciál s trojúhelníkovým průběhem (Obr. 2.1) a je sledována závislost proudu, který prochází touto elektrodou, 27

28 přičemž získáváme polarizační křivku (Obr 2.11). Ta je dána rychlostí s jakou se časem změní potenciál a má tvar píku. Obr. 2.1: Potenciálový program pro cyklickou voltametrii V průběhu cyklické voltametrie je potenciál zvyšován z počátečního potenciálu (E i ), ale na konci lineární polarizace je směr potenciálového scanu obrácen a poté se zastaví na počátečním potenciálu (E i ) (nebo může začít další cyklus). Potenciál, který je zpětný se nazývá měnící potenciál (E λ ) Téměř vždy je skenovací rychlost mezi E i a E λ stejná jako mezi E λ a E i. Hodnoty skenovacích rychlostí v forvard a v backward jsou vždy psány jako kladná čísla. Obr. 2.11: Cyklický voltamogram 28

29 Při elektrodové reakci nestačí produkty od elektrody oddifundovat, protože difuze je poměrně pomalý proces. Proto je můžeme při opačném směru potenciálu detekovat. Při CV je koncentrace přímo úměrná velikosti proudu a dovoluje také získávání informací o kvantitativních vlastnostech. CV má velký význam při studiu reakcí na elektrodách. Z katodické a anodické větve voltamogramu můžeme rozpoznat mechanismus reakci na elektrodě [36]. 29

30 3. Experimentální část 3.1. Chemikálie Tab. 3.1: Používané chemikálie Název Vzorec M [g/mol] Výrobce Hydroxid sodný NaOH 4, Lachner Kyselina chlorovodíková HCl 36,46 Lachner Luminol C 8 H 7 N 3 O 2 177,16 Sigma Peroxid vodíku H 2 O 2 34,2 Sigma-Aldrich TRIS Tris-(hydroxymethyl)-methylamin (HOCH 2 )CNH 2 121,14 Sigma-Aldrich Dihydrogenfosforečnan sodný dihydrát NaH 2 PO 4 2H 2 O 156,1 Lachner Hydrogenfosforečnan disodný dodekahydrát Na 2 HPO 4 12H 2 O 358,14 Lachner CTAB (Hexadecyltrimethylamonium bromid) C 16 H 33 (CH 3 ) 3 NBr 364,46 Biochemica Fluka Chlorid kobaltnatý CoCl 2 129,84 Lachner 3.2. Experimentální vybavení Přístroj pro měření ECL Přístroj pro měření elektrogenerované chemiluminiscence je složen z luminometru s kyvetovým prostorem. Do kyvetového prostoru se vkládá kyveta o objemu 3 ml, do které je ponořen systém tří elektrod (pracovní, pomocné a referentní). Zařízení je dále vybaveno potenciostatem s tříelektrodovým systémem. Měření (snímání) chemiluminiscence je zajištěno fotonásobičem M1FQS29 (VEB WERK fűr 3

31 Fernsehnelectronic, NDR), napájeným napětím 4 9 V. Ovládání celého systému zabezpečuje AD/DA převodníková karta Adicom 1216A (Pascal, Delphi Pascal), která současně provádí tři činnosti: - generuje průběh napětí pro potenciostat - snímá proud odpovídající elektrodovému ději - snímá signál z fotonásobiče Elektrody Pro měření chemiluminiscence s tříelektrodovým systémem byly použity tyto elektrody: - pracovní elektrody platinová (CHI12) a skelná uhlíková (CHI14), CH Instruments, USA - referentní argentochloridová elektroda - pomocnou elektrodou byl platinový drátek ph metr Při měření ph byl používán přístroj WTW Multi 34i s ph-kombinovanou elektrodou. Před měřením ph se elektroda nejdříve důkladně opláchla redestilovanou vodou a osušila. Poté se provedla dvoubodová kalibrace přístroje pomocí roztoků standardních kalibračních pufrů o ph 4,1 a 7,, které jsou dodávány spolu s přístrojem. Membrána elektrody musí být uchovávána v 3M roztoku KCl. BioOrbit 125 (BioOrbit, Finsko) Luminometr dodávaný komerčně je poměrně citlivý a manipulace je snadná. Kyvetový prostor je vhodný pro kyvety (vyrobené z polystyrenu nebo polypropylenu) válcovitého tvaru o objemu maximálně 4 ml. Jako detektor slouží fotonásobič R 15 Hamamatsu se spektrální charakteristikou 35K(S 4) jehož maximální citlivost je při 38 4 nm. Při větších vlnových délkách klesá citlivost fotonásobiče (mez použitelnosti je do 6 nm). Kalibrace přístroje je prováděna s pomocí vnitřního standardu. Sběr dat zajišťuje A/D karta Burr-Bown PCI-298X-1 a pomocí komerčního programu dodávaného s přístrojem Luminometer programme je umožněn odečet měřených veličin (maximální hodnota CL a integrál). 31

32 3.3. Příprava používaných roztoků TRIS Pufr TRIS byl připravován rozpuštěním TRISu ve vodě. Na přípravu,1 M roztoku TRISu je třeba 6,6 g pevného TRISu, který se rozpustí v,5 l vody. Požadovaného ph pufru TRIS dosáhneme přidáním hydroxidu sodného nebo kyseliny chlorovodíkové. Fosfátový pufr Fosfátový pufr byl připravován z dihydrogenfosforečnanu sodného dihydrátu a z hydrogenfosforečnanu disodného dodekahydrátu. Na přípravu,1 M roztoku je třeba 8,95 g Na 2 HPO 4 12H 2 O který se rozpustí v,25 l vody a 3,9 g NaH 2 PO 4 2H 2 O rozpuštěné v,25 l vody, které se následně smíchají. Přičemž ph bylo upravováno také hydroxidem sodným a kyselinou chlorovodíkovou. CTAB CTAB byl rozpuštěn ve vodě. Roztok CTAB musí být před použitím zahřát na teplotu 25 C, v chladnějším roztoku se tvoří viditelné mikrokrystalky, což je způsobeno tím že roztok nepřekročil tzv. Krafftovu teplotu Po překročení Krafftovy teploty stoupá rozpustnost PAL a roztok je čirý. Luminol Luminol ve formě volné kyseliny se nerozpouští ve vodě, takže je potřeba jeho převedení na sodnou sůl přidáním hydroxidu sodného. Na přípravu,1 M luminolu je třeba luminol rozpustit ve dvakrát koncentrovanějším roztoku NaOH (tj. c =,2 M). 32

33 3.4. Popis průběhu experimentů při měření CL a ECL Měření CL luminolu na přístroji BioOrbit 125 Pro experimenty s objemovou CL luminolu bylo použito zásobních roztoků o koncentracích uvedených v tabulce 3.2. Tab. 3.2: Koncentrace používaných roztoků pro CL luminolu Sloučenina Koncentrace zásobních roztoků [M] Koncentrace složek v CL směsi [M] Luminol M M TRIS M M Dihydrogenfosforečnan sodný M M Hydrogenfosforečnan sodný M M Co M M H 2 O M M CTAB M M Složky reakční směsi byly postupně napipetovány do kyvet z polystyrenu (Clinicon) o maximálním objemu 4 ml. Do kyvet byly postupně napipetováno 4 µl CTAB, 1 µl pufru TRIS, popřípadě 1 µl fosfátového pufru, 1 µl luminolu, voda a těsně před spuštěním měření bylo přidáno 1 µl Co 2+. Reakční směs měla vždy objem 1 ml. Poté byla kyveta vložena do kyvetového prostoru, jenž byl následně uzavřen. Těsně po spuštění experimentu bylo do směsi pomocí Hamiltonovy mikrostříkačky napipetováno ještě 1 µl H 2 O 2. Iniciace systému byla prováděna přes septum s pryžovou membránou, přičemž nástřik byl prováděn co možná nerychleji a stejným způsobem. Před začátkem měření je potřeba nakalibrování a nastavení přístroje, které se dělá pomocí vnitřního standardu. Pomocí dvou otočných potenciometrů gain a background se přístroj nastaví na požadované hodnoty. Nejdříve se za přítomnosti prázdné kyvety v kyvetovém prostoru pomocí potenciometru background nastaví nulová hodnota přístroje. Poté se potenciometrem gain a pomocí vnitřního standardu nastaví přístroj na odezvu 1 mv. Toto nastavení umožňuje měření až 1 mv. Přístroj umožňuje měření vysokých 33

34 intenzit do 1 mv, pokud se pomocí vnitřního standardu nastaví přístroj na odezvu 1 mv Měření ECL luminolu Pro experimenty s ECL luminolu bylo použito zásobních roztoků o koncentracích uvedených v tabulce 3.3. Tab. 3.3: Koncentrace používaných roztoků pro ECL luminolu Sloučenina Koncentrace zásobních roztoků [M] Koncentrace složek v ECL směsi [M] Luminol M M TRIS M M Dihydrogenfosforečnan sodný M M Hydrogenfosforečnan sodný M M CTAB M M Složky reakční směsi byly napipetovány do skleněné kyvety o celkovém objemu 25 ml. Do kyvety bylo postupně pipetováno,25 ml luminolu (c = M), 1 ml pufru TRIS (c = M), nebo fosfátového pufru (c = M), 14,75 ml deionizované vody a poté postupně přídavky peroxidu vodíku (3%) o objemu, 12,5, 25, 37,5, 5, 62,5 nebo 7 µl. Roztok byl promíchán a kyveta byla vložena do kyvetového prostoru. Následně byly vloženy používané elektrody a přístroj byl světlotěsně uzavřen. Před každým cyklováním proudu byly pracovní elektrody (platinová i uhlíková) očištěny leštěním na speciální podložce (Microcloth, Buehler, USA) navlhčené suspenzí aluminy (5 nm, Buehler, USA) vždy stejným způsobem. Poté byly zadány parametry experimentu a spuštěno samotné měření, které ovládala AD/DA převodníková karta. Jako pracovní elektrody byly použity platinová elektroda nebo elektroda ze skelného uhlíku. Argentochloridová elektroda plnila funkci srovnávací elektrody a jako pomocná elektroda byl používán platinový drátek se světlotěsným obalem. V průběhu měření byly elektrody vždy umístěny na stejné místo a byly ve stejné výšce. Při měření se zaznamenávala závislost proudu na vloženém potenciálu, tzv. voltamogram a také závislost intenzity ECL na vloženém potenciálu, tzv. 34

35 světelný voltamogram. Přístroj umožňoval také 1krát snížit citlivost pro měření vzorků s vysokou intenzitou ECL Výsledky a diskuze Vliv pufru TRIS na CL luminolu Vliv pufru TRIS na objemovou CL luminolu iniciovanou CoCl 2 a H 2 O 2 v prostředí CTAB byl zkoumán v závislosti na koncentraci látky TRIS v pufru v rozmezí ph = Získané závislosti jsou uvedeny na obr Je zřejmé, že pufr TRIS má výrazný vliv na CL luminolu. Bez přítomnosti TRISu je CL prakticky nulová. Postupným zvyšováním koncentrace pufru TRIS dochází k nárůstu intenzity CL. I [CL] max a. u ,1,2,3,4 c TRIS [mol/l] 8 8, Obr. 3.1: Závislost maximální intenzity CL luminolu na koncentraci TRISu (ph = 8 12) bez fosfátového pufru, c(ctab) =,4 mol/l, c(luminol) = mol/l, c(cocl 2 ) = mol/l, c(h 2 O 2 ) =,5 mol/l. Na obr. 3.2 jsou uvedená data znázorněná v závislosti na ph pufru pro danou koncentraci TRISu. U všech koncentrací bylo nejvyšší intenzity dosaženo při ph = 9, optimální koncentrace TRIS byla,1 mol/l. Při velmi nízkých koncentracích TRISového pufru se optimum mírně posunuje k vyšší hodnotě ph (ph = 1). Při ph = 7 a 7,5 nebyla 35

36 pozorována žádná chemiluminiscence a nárůst světelné intenzity je pozorovatelný od ph = 8. I [ECL] max a.u ph,1,2,4,6,8,9,1,2,25,35,4 Obr. 3.4: Závislost maximální intenzity CL luminolu ph při různé koncentraci pufru TRIS, příslušná koncentrace pufru TRIS je uvedena v legendě grafu, c(ctab) =,4 mol/l, c(luminol) = mol/l, c(cocl 2 ) = mol/l, c(h 2 O 2 ) =,5 mol/l. Protože u nízkých koncentrací, kde je efekt TRISu nejvyšší, není zaručeno stejné ph reakční směsi jako u vyšších koncentrací TRISu díky nízké pufrační kapacitě, byla v dalším experimentu udržována konstantní pufrační kapacita chemiluminiscenční směsi (Obr. 3.3). K pufru TRIS byl přidán fosfátový pufr tak, aby celková koncentrace pufrů byla konstantní c(pufrů) =,4 mol/l. Tento experiment byl proveden pro ph = 9, tj. v ph optimu CL reakčního systému luminol-tris-ctab. 36

37 I [CL] max a.u ,1,2,3,4 c TRIS [mol/l] Obr. 3.3: Závislost maximální intenzity CL luminolu na koncentraci TRISu (ph = 9) bez fosfátového pufru (kolečka) a s fosfátovým pufrem (čtverce), c(ctab) =,4 mol/l, c(luminol) = mol/l, c(cocl 2 ) = mol/l, c(h 2 O 2 ) =,5 mol/l. Pokud je v uvedené reakční směsi přítomen také fosfátový pufr, závislost světelné intenzity na koncentraci pufru se změní. Je zřejmé, že fosfátový aniont účinně zháší CL luminolu, přesto je zvýšení CL vlivem TRISu dobře patrné. Proto intenzita CL u koncentrace TRISu,4 mol/l je skokově zvýšena ve srovnání s předchozím měřením, kde je v reakční směsi přítomen i fosforečnan Vliv pufru TRIS a fosfátového pufru na ECL luminolu V experimentech s objemovou CL byl prokázán výrazný vliv TRISu na CL reakci luminolu iniciovanou systémem Co 2+ H 2 O 2. Tento efekt může být způsoben buďto reakcí Co 2+ H 2 O 2 s TRISem, která by mohla poskytovat reaktivní produkt snadno reagující s luminolem, nebo může jít o reakci oxidovaných forem luminolu s TRISem tj. o přímý vstup TRISu do mechanismu CL reakce luminolu. Z tohoto důvodu nás zajímal vliv TRISu na ECL luminolu. U ECL luminolu je CL iniciována přímo oxidací luminolu a to buďto jednoelektronovou (tvorba semidiazachinon), nebo dvouelektrodovou (tvorba diazachinon) cestou. Jak již bylo zmíněno, ECL může být ovlivněna materiálem pracovní elektrody a také prostředím, kde ECL probíhá. Měření probíhala na dvou různých pracovních 37