OXIDATIVNÍ FOSFORYLACE

Transkript

1 OXIDATIVNÍ FOSFORYLACE

2 OBSAH Mitochondrie Elektronový transport Oxidativní fosforylace Kontrolní systém oxidativního metabolismu.

3 Oxidace a syntéza ATP jsou spojeny transmembránovým tokem protonů Dýchací řetězec - oxidativní fosforylace Oxidativní fosforylace je proces tvorby ATP při přenosu elektronů z NADH a FADH 2 na kyslík přes řadu přenašečů elektronů. NADH a FADH 2 jsou vytvořené při glykolýze, oxidaci mastných kyselin a cyklu trikarboxylových kyselin Oxidativní fosforylace je hlavním zdrojem energie aerobních organismů.

4 Významné reakce katalyzované NAD(P)H dehydrogenasami

5 Mitochondrie Mitochondrie jsou místem eukaryotního oxidačního metabolismu. Vnější membrána Vnitřní membrána Kristy Matrix Mezimembránový prostor Drsné endoplazmatické retikulum Mitochondrie obsahují: pyruvátdehydrogenasu enzymy citrátového cyklu enzymy katabolismu mastných kyselin enzymy spolu s proteiny elektronového transportního řetězce a oxidativní fosforylace.

6 Mitochondriální transportní systém Vnější mitochondriální membrána, stejně jako bakteriální, obsahuje poriny, proteiny, které dovolují volnou difúzi molekul do 10 kd. Vnitřní membrána, která je hmotnostně složena ze 75 % z proteinů, volně propouští O 2, CO 2 a H 2 O. Jinak obsahuje řadu transportních proteinů, které kontrolují průchod metabolitů jako jsou ATP, ADP, pyruvát, Ca 2+ a fosfát. Redukované ekvivalenty (NADH) se transportují z cytosolu do mitochondrie, buď malát-aspartátovým člunkem nebo glycerol-3- fosfátovým člunkem. NADH transportované glycerol-3-fosfátovým člunkem poskytuje po oxidaci jen 2 ATP.

7 Mitochondriální přenašeče

8 Malát aspartátový člunek Malát aspartátový člunek (srdce a játra). Reversibilní závisí na poměru NADH/NAD + v cytoplasmě a matrix

9 Malát-aspartátový člunek

10 Glycerol-3-fosfátový člunek Glycerol-3-fosfátový člunek ve svalech(shuttle). Redukce dihydroxyacetonfosfátu na glycerol-3-fosfát a poté mitochondriální glycerol-3-fosfátdehydrogenasa. Tvoří se pouze 2 ATP!!!

11 Glycerol-3-fosfátový člunek

12 Translokátor ADP ATP Většina v mitochondrii vytvořeného ATP se využívá v cytoplasmě. Vnitřní mitochondriální membrána obsahuje ADP-ATP translokator transportující ATP do cytosolu a ADP z cytosolu do mitochondrie. Translokator je dimer identických 30 kd podjednotek s jedním vazebným místem pro ADP i ATP, které vzájemně kompetují. Translokátor mění konformaci při vazbě buď ADP nebo ATP. Export ATP (4 záporné náboje) proti importu ADP (3 záporné náboje) je elektrogenní antiport poháněný rozdílem membránového potenciálu.

13 Mechanismus mitochondriální ATP-ADPtranslokasy Mechanismus mitochondriální ATP-ADPtranslokasy (14 % proteinů mitochondriální membrány) ANTIPORTER. ATP je transportován 30 x rychleji ven, než ADP dovnitř. Čtvrtina energie získaná ox. fosforylací jde na konto exportu ATP. Inhibice atraktylosid (rostlinný glykosid) a bongkreková kyselina (antibiotikum z plísně).

14 Konformační změny ADP-ATP translokátoru

15 Transport fosfátů K syntéze ATP z ADP a P i je nutné transportovat fosfát z cytosolu do mitochondrie. Fosfátový nosič lze charakterizovat jako elektrochemický P i -H + symport poháněný rozdílem (D ph) (transmembránový protonový gradient). Vytvořený transmembránový protonový gradient nevede pouze k syntéze ATP, ale také k transportu ADP a P i.

16 1. Vstup do matrix je poháněn membránovým potenciálem (uvniř negativní) 2. Antiport s H + Transport Ca 2+ Mitochondrie působí jako pufr pro cytosolový Ca 2+

17 Elektronový transport / Termodynamika Elektronové nosiče přenášející elektrony z NADH a FADH 2 na kyslík jsou lokalizovány ve vnitřní mitochondriální membráně. Oxidace NADH je silně exergonická. Měřítkem afinity substrátu k elektronům je standardní redukční potenciál ( o ). Čím vyšší hodnota, tím větší afinita k elektronům. Poloreakce oxidace NADH kyslíkem jsou: NAD + + H e - NADH ½ O H e - H 2 O o = - 0, 315 V o = 0, 815 V NADH je donor elektronů, O 2 akceptor. Celková reakce: ½ O 2 + NADH + H + H 2 O + NAD + D o = 0, 815 V (-0, 315 V) = 1, 130 V!!!

18 Elektronový transport / Termodynamika Redukční potenciál páru H + : H 2 je definován jako 0 voltů. Např. NADH jako silné redukční činidlo předává elektrony a má tak negativní redukční potenciál. Silné oxidační činidlo jako je O 2 přijímá elektrony a má tak pozitivní redukční potenciál. V biochemických textech je redukční potenciál uváděn při koncentraci H + = 10-7 M (ph 7), zatímco v chemických 1 M (ph 0) Redukční potenciál v biochemii je tak označen jako E o (obdobně jako D G o ) Vztah mezi změnou standardní volné (Gibbsovy) energie a změnou redukčního potenciálu: D G o = - nfde o n = počet přenášených elektronů, F je Faradayův náboj (96, 48 kj.mol -1.V -1 ) a DE o je ve voltech.

19 Elektronový transport / Termodynamika Oxidace NADH poskytuje D G o = kj.mol -1 volné energie. K syntéze jednoho molu ATP z ADP a P i je třeba 30, 5 kj.mol -1. Energetický rozdíl D G o = kj.mol -1 nelze přímo převést na několik ATP. Ve vnitřní mitochondriální membráně je soustava tří proteinových komplexů přes které putují elektrony z NADH ke kyslíku. Celková volná energie je tak rozdělena na tři menší části z nichž každá se podílí na tvorbě ATP oxidativní fosforylací. Oxidace NADH poskytne přibližně 3 ATP. Termodynamická efektivita za standardních biochemických podmínek je 42 %. (3 x 30,5 kj.mol -1 x 100 / 218 kj.mol -1 ).

20 Komplexy sekvence elektronového transportu

21 Komplexy sekvence elektronového transportu Komplexy jsou řazeny podle vzrůstajícího redukčního potenciálu. Komplex I: Katalyzuje oxidaci NADH koenzymem Q (CoQ). NADH + CoQ (oxidovaný) NAD + + CoQ (redukovaný) D o = 0, 360 V; D G o = - 69, 5 kj.mol -1 Komplex II: Katalyzuje oxidaci FADH 2 koenzymem Q. FADH 2 + CoQ (oxidovaný) FAD + CoQ (redukovaný) D o = 0, 085 V; D G o = - 16, 4 kj.mol-1 Redoxní reakce neposkytuje dostatečné množství energie pro tvorbu ATP. Funkcí je, pouze předávat elektrony z FADH 2 do elektronového transportního řetězce.

22 Komplexy sekvence elektronového transportu Komplex III: Katalyzuje oxidaci CoQ (red.) cytochromem c. CoQ (redukovaný) + 2 cytochrom c (oxidovaný) CoQ (oxidovaný) + 2 cytochrom c (redukovaný) D o = 0, 190 V; D G o = - 36, 7 kj.mol -1 Komplex IV: Katalyzuje oxidaci redukovaného cytochromu c kyslíkem terminálním akceptorem elektronů. 2 cytochrom c (red.) + ½ O 2 2 cytochrom c (oxid.) + H 2 O D o =0, 580 V; D G o = kj.mol -1.

23 Komplexy sekvence elektronového transportu

24

25 Mitochondriální elektronový transport

26 Mitochondriální elektronový transport

27 Komplex I: NADH koenzym Q oxidoreduktasa Komplex I je největší protein v mitochondriální membráně 43 podjednotek o celkové hmotnosti 900 kd. Komplex I obsahuje jednu molekulu FMN a 6 až 7 komplexů (klastrů) železo-síra. Klastry jsou prostetickými skupinami proteinů železo-síra nebo jinak nehemové proteiny. FMN je pevně vázaný na proteiny; zatímco CoQ je, díky svému hydrofobnímu isoprenoidnímu řetězci, volně pohyblivý v lipidové dvojvrstvě membrány. U savců obsahuje řetězec CoQ 10 C 5 isoprenoidních jednotek (Q 10 ). U některých organismů je řetězec CoQ kratší 6 nebo 8 jednotek.

28 Struktura NADH-Q oxidoreduktasy (Komplex I) Matrix Skládá se z části lokalizované v membráně a ramene v matrix. NADH se oxiduje v rameni a elektrony jsou přeneseny do membrány, kde redukují CoQ.

29 Klastry železo-síra. Přechod elektronů mezi Fe 2+ a Fe 3+

30 Oxidační stavy FMN a koenzymu Q (CoQ) 2- H 2 C OPO 3 H 3 C H 3 C H 3 C C C C CH 3 CH 3 CH 3 H CH 2 O H 3 C N N O H 3 CO CH 3 C H 3 H N O N H CH 3 H 3 CO CH 2 CH C CH 2 H n O Isoprenoidní jednotky Flavinmnonukleotid (FMN) (oxidovaná nebo chinonová forma) H Koenzym Q (CoQ) nebo ubichinon (oxidovaná nebo chinonová forma) H H R O H 3 C N N O H 3 CO CH 3 C H 3 N N H H 3 CO R H H O FAMNH (radikálová nebo semichinonová forma) H OH Koenzym QH nebo ubisemichinon (radikálová nebo semichinonová forma) H H R H OH H 3 C N N O H 3 CO CH 3 C H 3 N N H H 3 CO R H H O OH FMNH 2 (redukovaná nebo hydrochinonová forma) Koenzym QH 2 nebo ubichinol (redukovaná nebo hydrochinonová forma)

31 Reakce katalyzovaná NADH-Q oxidoreduktasy NADH + Q + 5 H + matrix NAD + + QH H + cytoplasma První krok: vazba NADH a přenos dvou elektronů na FMN (FMNH 2 ). Druhý krok: elektrony jsou přeneseny na soustavu sloučenin železo síra. Třetí krok: elektrony jsou přeneseny na vázaný CoQ. Tok dvou elektronů z NADH na vázaný CoQ přes komplex I pumpuje čtyři elektrony z matrix. Redukce CoQ na CoQH 2 vyžaduje další dva protony z matrix. Čtvrtý krok: pár elektronů z vázaného CoQH 2 se přenáší na 4Fe 4S a protony se uvolňují do cytoplasmy. Pátý krok: elektrony z 4Fe 4S se přenáší na mobilní CoQ v hydrofobní části membrány. To vede k odebrání dalších dvou protonů z matrix.

32 Přenos elektronů a translokace protonů v komplexu I. Tok elektronů z NADH na CoQ probíhá stupňovitě mezi redox centry. NADH se účastní vždy jen dvouelektronové výměny. FMN a CoQ mohou přenášet jak dva, tak jeden elektron a proto tvoří elektronovou spojku mezi dvouelektronovým NADH a jednoelektronovými akceptory cytochromy. Při toku elektronů mezi redox centry komplexu I jsou transportovány čtyři protony z matrix do mezimembránového prostoru.

33 Spojení přenosu elektron proton. Redukce chinonu (CoQ) na CoQH 2 vede k odčerpání dvou protonů z matrix

34 Komplex II: sukcinát-koenzym Q Komplex II obsahuje enzym citrátového cyklu sukcinátdehydrogenasu. Přenáší elektrony z FADH 2 na CoQ. Komlex II obsahuje sukcinátdehydrogenasu s kovalentně vázaným FAD, několik klastrů Fe-S a jeden cytochrom b 560. Komplex I a II nejsou v sérii. Komplex II přenáší elektrony ze sukcinátu na CoQ. CoQ je mobilní sběrač elektronů. oxidoreduktasa Cytochrom b 560 slouží pravděpodobně k odstraňování kyslíkatých radikálů vznikajících vedlejšími reakcemi.

35 Struktura sukcinát-koenzym Q oxidoreduktasy

36 Cytochromy-hemové transportní proteiny Během transportu elektronů alternují mezi Fe 2+ a Fe 3+. PROTEIN CH 3 Cys HO H 2 C CH CH 2 CH C CH 2 H 3 CH 3 CH 2 CH CH 3 H 3 C S CH CH 3 Cys 2 3 S H 3 C 1 N + N 4 CH CH 2 H 3 C N + N CH CH 2 H 3 C N + N CH CH 3 Fe 2+ Fe 2+ Fe 2+ O CH 8 N N + 5 CH 3 H 3 C N N + CH 3 H 3 C N N + CH CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH COO COO Hem a - - COO COO Hem b (Fe-protoporfyrin IX) - - COO COO Hem c

37 ABSORBANCE Absorpční spektra hemových skupin redukovaných Fe 2+ cytochromů Soretovy pásy Cytochrom a Cytochrom b Cytochrom c Cytochrom c Cytochrom c Vlnová délka (nm)

38 Komplex III: koenzym Q cytochrom c oxidoreduktasa Komplex III (také jako cytochrom bc 1 ) transportuje elektrony z redukovaného CoQH 2 na cytochrom c. Obsahuje: Dva cytochromy typu b, jeden c 1 a jeden klastr [2Fe- 2S], znám také jako Rieskeho centrum. Transport elektronů a pumpování protonů probíhá tzv. Q cyklem. CoQH 2 podstupuje dva cykly reoxidace za tvorby stabilních meziproduktů semichinonů CoQ. Existují dvě nezávislá centra pro koenzym Q: Q o vážící CoQH 2 (blíže vnější straně membrány out) a Q i (blíže vnitřní straně membrány inner) vážící semichinon CoQ..

39 Struktura koenzym Q cytochrom c oxidoreduktasy

40 Q-cytochrom c oxidoreduktasa Druhá protonová pumpa. Funkcí komplexu III je katalyzovat přenos elektronů z QH 2 na oxidovaný cytochrom c za současného pumpování protonů z matrix. QH Cyt c ox + 2 H + matrix Q + 2 Cyt c red + 4 H + cytoplasma

41 První cyklus: CoQH 2 + cytochrom c 1 (Fe 3+ ) CoQ. + cytochrom c 1 (Fe 2+ ) + 2 H + (mezimembránový prostor) Druhý cyklus - nejdříve další CoQH 2 opakuje první cyklus. CoQH 2 + CoQ. + cytochrom c 1 (Fe 3+ ) + 2 H + (z matrix) CoQ + CoQH 2 + cytochrom c 1 (Fe 2+ ) + 2 H + (do mezimembrány) Z každých dvou CoQH 2 vstupující do Q cyklu, je jeden regenerován. Celková reakce: Reakce Q cyklu CoQH cytochrom c 1 (Fe 3+ ) + 2H + (z matrix) CoQ + 2 cytochrom c 1 (Fe 2+ ) + 4 H + (do mezimembránového prostoru). Elektrony jsou následně přenášeny na cytochrom c, který je transportuje do komplexu IV.

42 Q cyklus první část M E Z I M E M B R Á N O V Ý Z KOMPLEXU I QH 2 QH 2 2H + Q - e - e - FeS-protein b Q - L e - P R e - b e - H O Q Q S c 1 Q Q T o i O R PRVNÍ CYKLUS M A T R I X

43 Q cyklus druhá část M E Z I M E M B R Á N O V Ý Z KOMPLEXU I QH 2 QH 2 2H + Q - QH 2 e - e - e - FeS-protein b L e - Q - P R O S T O R e - b H Q Q c 1 Q o DRUHÝ CYKLUS Q i 2H + M A T R I X

44 Q cyklus

45 Komplex IV: cytochrom c oxidasa Katalyzuje jednoelektronovou oxidaci čtyřech redukovaných cytochromů c a současnou čtyřelektronovou redukci jedné molekuly O 2. 4 Cytochrom c (Fe 2+ ) + 4 H + + O 2 4 cytochrom c (Fe 3+ ) + 2 H 2 O Obsahuje čtyři redoxní centra: cytochrom a, cytochrom a 3, atom mědi značený jako Cu B a dvojici atomů mědi označovaných jako Cu A centrum. Redukce O 2 cytochrom c oxidasou je postupný složitý proces.

46 Komplex IV: cytochrom c oxidasa Cytochrom c oxidasa má dva kanály translokace protonů. Čtyři tzv. chemické nebo skalární protony jsou odňaty z matrix během redukce kyslíku za tvorby dvou molekul vody. Proces je spojen s translokací čtyř tzv. pumpovaných nebo vektorových protonů z matrix do mezimembránového prostoru. Při reakci komplexu IV je celkově transportováno přes vnitřní mitochondriální membránu osm protonů. 8 H + (matrix) + O cytochrom c (Fe 2+ ) 4 cytochrom c (Fe 3+ ) + 2 H 2 O + 4 H + (do mezimembránového prostoru)

47 Struktura cytochrom c oxidasy

48 Transport protonů z matrix cytochrom c oxidasou Čtyři protony do cytoplasmy a čtyři na tvorbu vody

49 Reaktivní kyslíkaté radikály (ROS) Čtyřelektronová redukce kyslíku cytochrom c oxidasou je rychlá a precizní. Přesto vznikají kyslíkaté radikály, které reagují s různými buněčnými součástmi. Nejznámější je superoxidový radikál: O 2 + e - O 2 -. Superoxidový radikál je prekurzorem silnějších oxidačních radikálů jako jsou protonovaný (hydroxoniový) O 2 -. HO 2. a hydroxylový radikál. OH

50 Reaktivní kyslíkaté radikály (ROS) Antioxidační mechanismus: superoxiddismutasa (SOD) přítomná téměř ve všech buňkách. Katalyzuje přechod O 2 -. na peroxid vodíku. Vytvořený peroxid vodíku je degradován katalasou na vodu a kyslík: 2 H 2 O 2 2 H 2 O + O 2 nebo glutathionperoxidasou: 2 GSH + H 2 O 2 GSSG + 2 H 2 O Dalšími potenciálními antioxidanty jsou rostlinné sloučeniny jako askorbát (vitamin C) a -tokoferol (vitamin E). Pravděpodobně chrání rostliny před oxidačním stresem během fotosyntézy, kdy je H 2 O fotolýzou rozkládána na O 2, protony a elektrony.

51 Redoxní systémy dýchacího řetězce

52 Komplex V: ATP synthasa Oxidativní fosforylace. Energetické spojení. Volná energie transportu protonů se uplatní při tvorbě ATP.

53 Komplex V: ATP synthasa

54 Chemiosmotická hypotéza oxidativní fosforylace Mitchell, P., Coupling of phosphorylation to electron and hydrogen transfer by a chemiosmotic type of mechanism. Nature 191, (1961). Peter Mitchell ( ), Nobelova cena za Fyziologii a medicínu Volná energie elektronového transportu je realizována pumpováním H + z mitochondriální matrix do mezimembránového prostoru za tvorby elektrochemického H + gradientu přes membránu. Elektrochemický gradient je posléze uplatněn při syntéze ATP. Tato volná energie se nazývá protonmotivní síla.

55 Chemiosmotická hypotéza oxidativní fosforylace Naměřený membránový potenciál přes membránu jaterní mitochondrie je 0, 168 V (v matrix negativní). Naměřené ph v matrix je o 0,75 jednotky vyšší než v mezimembránovém prostoru. DG pro transport protonů z matrix je 21, 5 kj.mol -1 endergonní proces. Rušení gradientu, syntéza ATP, je proces exergonní!!

56 Procesy oxidace NADH a tvorby ATP NADH + ½ O 2 + H + H 2 O + NAD + D G o = - 220, 1 kj/mol ADP + P i + H + ATP + H 2 O D G o = + 30, 5 kj/mol

57 ATP synthasa protony pumpující ATP synthasa, F1Fo-ATPasa Multipodjednotkový transmembránový protein o celkové molekulové hmotnosti 450 kd. Složena ze dvou funkčních jednotek (komponent), F o a F 1. (F o vyslovuj ef ó - o znamená na oligomycin citlivá komponenta). protonvodivá (Fo) v membráně katalytická (F1) v matrix

58 ATP synthasa protony pumpující ATP synthasa, F1Fo-ATPasa Oligomycin B Antibiotikum produkované streptomycety Inhibuje ATP synthasu vazbou na F o Brání transportu H + kanálkem F o

59 ATP synthasa protony pumpující ATP synthasa, F1Fo-ATPasa. F o je ve vodě nerozpustný transmembránový protein obsahující více jak osm různých typů podjednotek. F 1 je vodě rozpustný periferní membránový protein složený z pěti typů podjednotek, které lze jednoduše oddělit od F o působením močoviny. Rozpuštěná F 1 komponenta (oddělená od F o ) hydrolyzuje, ale nesyntetizuje ATP. F 1 komponenta ATPsynthasy má podjednotkové složení 3 3 e. Další dva polipeptidy b2 a d tvoří stator, kterým jsou podjednotky a přichyceny k F o F o komponenta je složena z 12 peptidů c procházejících membránou a jedné podjednotky a.

60 Model F1Fo-ATPasy

61 Model F1Fo-ATPasy

62 Mechanismus syntézy ATP Rotace podjednotky o 120 o proti směru hodinových ručiček mění strukturu tří podjednotek. Podjednotka s nově syntetizovaným ATP je ve formě T (tight) nemůže uvolnit ATP. Pohybem podjednotky se převede na O formu, uvolní ATP a váže nové ADP a P i Tok protonů přes ATPsynthasu vede k uvolnění pevně vázaného ATP Role protonového gradientu nespočívá v syntéze ATP, ale v jeho uvolnění ze synthasy!!! ATP se tvoří i bez protonmotivní síly, ale neuvolňuje se (hydrolyzuje)

63 Mechanismus rotace F1Fo-ATPasy Protony z mezimembránového prostoru vstupují do podjednotky c, reagují s podjednotkou a vystupují ven až se c kruh otočí o jednu otočku, kdy se podjednotka c znovu setká s podjednotkou a.

64 Pohyb protonů přes membránu pohání rotaci c kruhu

65 Mechanismus vazebné změny tvorba ATP z ADP a Pi F 1 komponenta má tři reaktivní katalytické protomery ( jednotky), každý ve jiném konformačním stavu. L - váže substrát a produkt slabě (L = loosely) T - váže pevně (T = tightly) O - neváže vůbec, je otevřený (O = open) Uvolněná energie translokací protonů se realizuje přechodem mezi těmito stavy. Fosfoanhydridová vazba ATP je syntetizována jen ve stavu T a ATP se uvolňuje ve stavu O. Tři stupně: ADP a P i se váží do stavu L. Průchod protonů mění konformaci L na T. ATP je syntetizované ve stavu T, druhé ATP se dostává pohybem rotoru do stavu O a oddisociuje.

66 Mechanismus vazebné změny tvorby ATP 1. Vazba ADP a Pi k L-místu 2. Energeticky závislá konformační změna přemění vazebná místa L na T, T na O a O na L 3. Syntéza ATP v místě T a uvolnění ATP z místa L

67 Poměr P/O Poměr P/O reprezentuje relaci mezi množstvím syntetizovaného ATP (P) a množství redukovaného kyslíku (O). Tok dvou elektronů přes komplexy I, III a IV vede ke translokaci 10 protonů. Zpětný tok těchto protonů přes ATPasu poskytuje 3 ATP. Elektrony z FADH 2, vynechávají komplex I, vedou ke translokaci 6 protonů, což poskytuje jen 2 ATP. U aktivně respirujících mitochondrií nebývá poměr P/O celé číslo. Peter Hikle prověřoval P/O poměry a prokázal, že aktuální hodnoty jsou blíže číslů 2,5 a 1,5.

68 Kontrolní mechanismy oxidativní fosforylace Dospělý člověk spotřebuje denně kj metabolické energie. To odpovídá volné energii hydrolýzy 200 molů ATP na ADP a P i. Celkové množství v těle přítomného ATP je méně než 0,1 molu!!! ATP musí být nutně recyklován a jeho produkce regulována, protože se neprodukuje nikdy více ATP než je potřeba. V lidském těle se denně vytvoří 65 kg ATP Celkový obsah AMP + ADP + ATP je jen 3-4 g Každá molekula ADP se za den několikatisíckrát fosforyluje a pak defosforyluje

69 Regulace oxidativní fosforylace poměrem ATP/ADP regulace akceptorem Oxidativní fosforylace (od NADH k cytochromu c) je v rovnováze: ½ NADH + cytochrom c (Fe 3+ ) + ADP + P i ½ NAD + + cytochrom c (Fe 2+ ) + ATP D G 0 K eq = ([NAD + ] / [NADH]) ½.[c 2+ ] / [c 3+ ]. [ATP] /[ADP].[P i ] V cytcytochrom c oxidasové reakci je konečný krok řetězce elektronů ireversibilní. Cytochromoxidasa je řízena dostupností substrátů [NADH] / [NAD + ] a [ATP] / [ADP].[P i ]. Čím vyšší je poměr [NADH] / [NAD + ] a nižší [ATP] / [ADP].[P i ], tím vyšší je koncentrace redukovaného cytochromu c [c 2+ ] a vyšší cytochrom c oxidasová aktivita.

70 Regulace oxidativní fosforylace glykolýza, citrátový cyklus Vliv poměru NADH/NAD + Inhibice fosfofruktokinasy citrátem

71 Regulace oxidativní fosforylace poměrem ATP/ADP regulace akceptorem

72 Regulace oxidativní fosforylace poměrem ATP/ADP regulace akceptorem

73 Respirační kontrola Elektrony jsou trasportovány na O 2 tehdy, když je současně ADP fosforylováno na ATP. Kontrola hladinou ADP.

74 Inhibitory blokující elektronový transportní řetězec -0.4 NADH NAD + 2e - ( V) -0.2 KOMPLEX I D = V (DG = kj.mol -1 ) ADP + P i Rotenon, amytal ATP 0 ( V) Sukcinát 2e - FADH 2 KOMPLEX II CoQ ( V) D (V) +0.2 Fumarát KOMPLEX III D = V (DG = kj.mol -1 ) ADP + P i ATP Antimycin A Cytochrom c ( V) KOMPLEX IV D = V (DG = -112 kj.mol -1 ) 2e - ADP + P i ATP CN H + + 1/2 O 2 H 2 O ( V)

75 Inhibitory blokující elektronový transportní řetězec

76 Inhibitory blokující elektronový transportní řetězec Rotenon rostlinný toxin používaný indiány na Amazonce k lovu ryb, také insekticid) Amytal barbiturát. Antimycin antibiotikum. Proč lze inhibici rotenonem zrušit přídavkem sukcinátu??

77 Inhibitory blokující elektronový transportní řetězec OCH 3 CH 3 H 3 CO CH H O O C H 2 CH 3 HN CH 2 CH 2 CH 3 O H O O CH 2 O N H O Rotenon H CH 3 Amytal O O N C - NH O CH 3 Kyanid H 3 C OH O O CH 3 HN CHO (CH 2 ) 5 O CH 2 CH 3 Antimycin A H 3 C

78 Rozpojovače oxidativní fosforylace. Probíhá respirace netvoří se ATP

79 Rozpojovače oxidativní fosforylace. Probíhá respirace netvoří se ATP MATRIX Vysoká [H + ] CYTOSOL Nízká [H + ] O - OH OH O - H + + NO 2 NO 2 Difuze NO 2 NO 2 + H + NO 2 NO 2 NO 2 NO 2 2,4-Dinitrofenol (DNP) 2,4-Dinitrofenol (DNP)

80 Funkce odpojovacího proteinu UCP-1 Thermogenin UCP-1 protein) hnědá adiposní tkáň bohatá na mitochondrie (zazimující živočichové, novorozenci, zvířata adaptovaná na zimu) dimer (2x32 kda) u zvířat adaptovaných na chlad 15 % proteinů mitochondriální membrány hnědé adiposní tkáně

81 Funkce odpojovacího proteinu UCP-1

82 Regulace na úrovni proteinkinasy závislé na AMP Proteinkinasa závislá na AMP v játrech svalech a CNS Při vysoké spotřebě ATP je ADP přeměňován adenylátkinasou na ATP a AMP AMP aktivuje proteinkinasu závislou na AMP fosforylacíe řady enzymů - aktivace katabolických drah - inaktivace anabolických drah 2 adenylátkinasa 3 proteinkinasa závislá na AMP

83 Produkce ATP