Metodika 3: uvedení systému Jasco LC 2000 do provozu

Transkript

1 Metodika 3: uvedení systému Jasco LC 2000 do provozu (HPLC High Performance Liquid Chromatography) Popis sestavy: 1) Refraktometrický detektor RI 2000, 2) detektor diodového pole Jasco MD 2018 Plus, 3) fluorescenční detektor Jasco FP 2020 Plus, 4) vakuový degasser VD 020, 5) termostat kolon Jasco CO 2060 Plus, 6) mixer pro HPLC Sunchrom, 7 + 8) mobilní fáze A + mobilní fáze B, 9) 1 pumpa pro mobilní fázi A Jasco PU 2080 Plus, 10) 2 pumpa pro mobilní fázi B Jasco PU 2080 Plus, 11) autosampler Jasco AS 2059 Plus, 12) sběrná datová linka Jasco LC-Net II/ADC.

2 Postup spuštění systému Jasco: 1) zapněte kolíbky zásuvek do elektrické sítě, 2) zapněte kolíbky do polohy 1 u přístrojů viz popis sestavy, 3) ručně propláchněte (purchin) pumpy mobilními fázemi A a B, doba 5 minut, (nastavte flow = 3 ml/minutu, zmáčkněte pump 1 a pump 2, otevřete černé knoflíky), 4) do držáku kolonového termostatu upevněte kolonu a zapojte ji do systému, flow 5) propláchněte celý systém včetně kolony mobilními fázemi A a B, doba 5 minut, (nastavte flow = 0,25 ml/minutu, zmáčněte pump 1 a pump 2, zavřete černé knoflíky) 6) autosampler uveďte do programu USER (viz metodika 5),

3 7) umístěte vialky s reagenty a vzorky do autosampleru (viz metodika 5), reagent 1 a reagent 2 vialka se vzorkem prázdná vialka určená pro derivatizaci 8) zapněte počítač program Chrom Nav (plocha) heslo - user1; enter, start Chrom Nav Jasco HPLC, project 1, 9) otevřete a zkontrolujte metodu na stanovení AMK (viz metodika 4): FILE METHOD EDITOR CONTROL METHOD OPEN METHOD AMK 10) vytvořte novou sekvenci: FILE METHOD EDITOR ACQUISITION SEQUENCE SAVE AS

4 11) otevřete vytvořenou sekvenci: FILE METHOD EDITOR ACQUISITION SEQUENCE OPEN 12) pusťte pumpy PUMP, nechte cca 5 minut puštěné do ustálení tlaků, 13) klikněte na ikonu START, 14) průběh analýzy sledujte na CHROMATOGRAM MONITOR (aktuální stav). Postup ukončení systému Jasco + ruční promývání systému: 1) pumpa 1-50 % H 2 O pumpa 2-50 % mobilní fáze B (flow 1 = 0,5 ml/minutu, flow 2 = 0,5 ml/minutu, start pump 1 i pump 2; 5 minut) 2) pumpa 1 80 % H 2 O pumpa 2 20 % mobilní fáze B (flow 1 = 0,8 ml/minutu, flow 2 = 0,2 ml/minutu, start pump 1 i pump 2; 10 minut) 3) pumpa % mobilní fáze B (flow 2 = 1 ml/minutu, stop pump 1, start pump 2; 5 minut) odpojit kolonu ze systému a systém propojit spojkou 4) pumpa % H 2 O + metanol (3 díly +1 díl) (flow 1 = 1 ml/minutu, start pump 1, stop pump 2; 5 minut) Vypněte kolíbky u všech přístrojů a centrální kolíbkou vypněte přístroje od zdroje elektrického napětí!!!

5 Metodika 4: nastavení HPLC pro stanovení AMK Nastavení čerpadla: Stop Time min Flow ml/min Max. Pressure Limit 400 bar Min. Pressure Limit 0 bar Gradient: Time [min] mobilní fáze % B Nastavení autosampleru: poloha USER pro derivatizaci v autosampleru, poloha NORMAL pro manuální derivatizaci. Změna programu NORMAL za USER a opačně: na autosampleru zmáčkněte ručně SHIFT 5, 2: injection mode edit enter, edit enter, šipky (nahoru či dolu), user program edit enter, monit, monit. Použít kolonu: ZORBAX Eclipse XDB-C18, 4,6 x 50 mm, 1,8 μm

6 Dle dostupnosti použít předklonu: ZORBAX Eclipse-AAA 4,6 x 12,5 mm, 5 μm Nastavení termostatu kolony: C Nastavení detektoru: Fluorescenční detektor: Ex / Em 340 nm / 450 nm Detektor diodového pole: 338 nm

7 Metodika 5: nastavení autosampleru pro stanovení AMK Derivatizace manuální (autosampler je v programu NORMAL) do 2 ml vialky odměřit borátový pufr (např. 1 ml), přidat roztok vzorku popř. standardu v 0,1N-HCl, směs promíchat, přidat roztok derivatizačního činidla OPA (objem shodný s objemem vzorku), směs promíchat a nechat zreagovat (např. 4 min). Pozn.: reakční dobu je pro dobrou reprodukovatelnost výsledků nutno dodržovat stále stejnou Derivatizace v autosampleru (autosampler je v programu USER) podle programu nástřiku (vialka 1 reagent borátový pufr; vialka 2 reagent OPA). krok STEP Function funkce Value poznámka 1 1 Metering Init Port&NDL Flush Load 3 4 Needle UP 4 5 Draw Air Reagent # borát Needle DOWN 5 8 Draw Vol Needle UP Draw Air Set Sam Load vialka definovaná v sekvenci 5 12 Draw Air MIX Sam#(+) Needle DOWN 5 15 Eject Vol Needle UP Port&NDL Flush Draw Air Reagent # opa Needle DOWN 5 21 Draw Vol Needle UP Draw Air MIX Sam#(+) vialka definovaná v sekvenci 25 Needle DOWN 5 26 Eject Vol Needle UP Mix Air 027 N 3 V 100 H Wait Port&NDL Flush Ana Sam Load(+) vialka definovaná v sekvenci H Sample Inject 1 objem definován v sekvenci MONIT

8 Vložení vialek s reagentem 1 a 2 (4 ml vialky) do autosampleru: na autosamleru zmáčkněte ručně SHIFT 4, 1: change rack edit/enter, change rack, exekute ok? šipkami YES edit/enter, monit.