Bioelektrické jevy a jejich měření (B150P30)

Transkript

1 Bioelektrické jevy a jejich měření (B150P30) snímek 2 prezentace 3 Dnešní přednáška je zaměřena hodně technicky. Měli byste se v ní seznámit s některými elektrofyziologickými měřícími technikami a pomůckami. Samozřejmě, že po vás nebudu chtít, abyste znali schémata elektrofyzilogických aparatur, ale měli byste mít přehled o tom, k čemu se který typ snímání hodí a které základní vybavení se při něm používá. Elektrofyziologických metod je povícero a dají se dělit podle různých kritérií. My se budeme orientovat podle toho, zda je snímací elektroda umístěna v buňce, mimo ni, případně zda s ní komunikuje jiným způsobem. Podle toho můžeme (bazálně) odlišit tři typy snímání: A) Extracelulární snímání historicky starší (neb jednodušší ) Extracelulární snímání je založeno na registraci potenciálů nebo proudů a stimulaci vzhledem k referenční elektrodě pomocí elektrody umístěné mimo buňku, v její blízkosti. Používají se elektrody skleněné, kovové či uhlíkové. Lze tak snímat potenciály z jednotlivých buněk (neuronů, svalových vláken), proudy či změny koncentrace iontů v mezibuněčném prostoru (svalu, mozku), plošně potenciály z celých nervů, oddílu mozku či srdce a pod. Tyto snímací techniky neurčují dobře velikost klidového membránového či akčního potenciálu, nepotřebují ale tak složité doprovodné přístroje (zesilovače) jako snímání intracelulárními elektrodami s vysokým tzv. hrotovým odporem. B) Intracelulární snímání problém vstupního odporu zesilovače Intracelulární snímání je založeno na registraci potenciálů nebo proudů a stimulaci vzhledem k referenční elektrodě pomocí skleněné mikropipetky se vsunutou Ag/AgCl elektrodou. Tato skleněná elektroda penetruje membránu buňky; musí být proto velmi tenká a ostrá, aby byl kontakt elektrody s membránou velmi těsný a buňka nebyla příliš poškozena (např. díry v membráně, kterými by tekly ionty). Skleněné mikroelektrody mají velmi tenký hrot, a díky tomu (a vlastnostem skla) také vysoký tzv. hrotový odpor. Proto musí být spojeny se zesilovači, jejich vstupní odpor je aspoň 100x vyšší než hrotový odpor pipetky (tím se chyba měření minimalizuje pod 1%). C) Terčíkový zámek (patch-clamp) jak vyzrát na jeden jediný iontový kanál Registrace miniaturních proudů technikou terčíkového zámku je založena na přisátí ústí skleněné mikropipetky na buněčnou membránu. Díky různým konfiguracím pipetka/membrána lze provádět např. registrace pa proudů z kanálů v terčíků membrány vymezených ústím skleněné mikropipetky či registrace proudových odpovědí z celé buňky. snímek 3 prezentace 3 Vlastním pracovním nástrojem, který je v kontaktu se zkoumanou tkání, jsou elektrody. V běžné lékařské praxi jsou to věci makroskopické (viz EKG, EEG a podobně, narazíme na ně v dalších přednáškách), v elektrofyziologickém výzkumu dnes povětšinou mikroskopické. Pak bývají označovány jako mikroelektrody (ME) či mikropipetky termín užívaný pro ME skleněné. Slouží zejména k zaznamenávání potenciálů (klidových, akčních) a aplikaci proudů, což jsou techniky, na kterých stojí celá klasická elektrofyziologie.

2 Co je to mikroelektroda (ME)? Jedna z definic by mohla znít elektroda vyrobená s hrotem o rozměru v řádu mikrometrů (10-6 m), tedy typicky skleněná mikropipeta navržená Lingem a Gerardem (1949), naplněná roztokem elektrolytu sloužícím jako vodič. Mikroelektrody se užívají např. pro zaznamenávání potenciálů (klidových, akčních) aplikaci proudů a látek zaznamenávání volných koncentrací různých látek (nabitých) v cytosolu, iontově selektivní záznamy A) Skleněné mikroelektrody ( Ag/AgCl elektrody ve skleněné mikropipetce ) Nejčastěji jsou používány mikroelektrody skleněné. K jejich výrobě se používají kapiláry o různé síle stěny, nejčastěji z borosilikátového skla (o složení 80.9% SiO 2, 12.9% B 2 O 3, 4.4% Na 2 O, 1.8% Al 2 O 3 ). Pracovní elektrodou, zasunutou ve vodivém roztoku, kterým je pipetka naplněna, bývá nejčastěji tzv. argentchloridová elektroda. Proč se používá na výrobu ME sklo? sklo je dielektrikum, slouží jako izolant od okolí dobře očištěné a odmaštěné sklo tvoří s lipidickou membránou velmi těsný spoj (minimální únik iontů okolo vpichu) Nejčastěji se používá jednoduchá kapilára, ať už s vláknem usnadňujícím její plnění, nebo bez něj. Existují ovšem i různé modifikace, např. svazky více kapilár používané k mikroiontoforese (dříve velmi populární metoda ). Kapilár může být ve svazku různý počet (nejčastěji 2, 3, 5 či 7). Vyskytnou se i speciální konfigurace se septem (septum theta) nebo přídatnou ME (piggyback, vpravo, užívané např. pro dendritickou stimulaci). Skleněné ME se vyrábějí ze skleněných kapilár tahem, během něhož jsou taveny. Když je sklo nahřáto tak, že je ještě plastické, ale už začíná chladnout, je tahem kapilára rozdělena na dvě půlky odlomené od sebe v hrotech. Vytáhnout elektrodu lze ručně, ale reprodukovatelné výsledky poskytují tzv. tahače. Podle typu experimentu se skleněné ME dále opracovávají. 2

3 snímek 4 prezentace 3 Tahače mikroelektrod jsou zařízení, která produkují standardizovené ME s nastavitelným průměrem hrotu a hrotovým odporem. Podle toho, v jaké poloze je skleněná kapilára při vytahování ME umístěna, se tahače dělí na horizontální a vertikální. Tahače Narishige, které vidíte dole na slidu, jsou jedny z v dnešní době nejkvalitnějších. tahače horizontální produkují ME tahem nahřátých kapilár ve vodorovné poloze - tahače typu Livingstone mají zpravidla tah kapiláry zajištěn pomocí soukolí ozubených koleček a jako zdroj tavícího tepla platinovou fólii (produkují velmi jemné hroty ME s hrotovým odporem MΩ, tyto ME mívají dlouhé skleněné vlásky, které poněkud znepříjemňují práci) - tahače typu Brown-Flaming mají obvykle platinový nebo nichromový žhavící prvek a tah kapiláry zajištěn cívkami; vytahují ME v 1-2 krocích, některé mají i plynové trysky, které rychle žhavící prvek ochladí produkují (jemné hroty ME s hrotovým odporem MΩ, dobrá reprodukovatelnost, krátké vlásky, u neprogramovaných, manuálních typů někdy náročné nastavení tahače) tahače vertikální mají jako žhavící prvek zpravidla nichromovou nebo platinovou smyčku a využívají v prvním kroku vytažení ME gravitaci, ve druhém je tah dokončen díky elektromagnetické cívce, jemné hroty ME s hrotovým odporem MΩ snímek 5 prezentace 3 Na horním obrázku je kapilára zasunutá do obloučku žhavící platinové smyčky v horizontálním tahači Narishige (ne už nejnovějším ;-). Dole vidíte dva oddělené konce kapiláry po dokončení žhavení a tahu. Tyto ME mají hrotový odpor kolem 3-5 MΩ. snímek 6 prezentace 3 Skleněné ME se využívají pro intracelulární i extracelulární snímání, patch clamp nebo třeba jako mikropipetky sací. hrot intracel. ME nepolishovaná ME na patch nebo sání (hrot 27 µm) polishovaná patch pipeta hrot (8 µm) 3

4 Při intracelulárním snímání se nejčastěji využívají skleněné ME k těmto účelům: - měření membránových potenciálů; tvaru, doby vzestupu a jiných parametrů akčních potenciálů; ploténkových potenciálů na nervosvalovém spojení aj. (farmakologie: sledování vlivu různých farmak na hodnotu MP, na latence a velikost výlevu jednotlivých kvant na synapsi aj.); určování pasivních elektrických charakteristik vzrušivých membrán a faktorů, které je ovlivňují - iontově selektivní ME (sledování změn koncentrací iontů, změn ph, určování cytoplasmatických koncentrací různých látek aj.) - aplikace proudových pulsů (stimulace) nebo různých látek (nabitých kladně nebo záporně podle toho, jakým napěťovým pulsem je chceme aplikovat) - metoda patch clamp zejména tzv. whole-cell (snímání z celé buňky) konfigurace jako nejsofistikovanější náhrada intarcelulárního měření Nevýhodou intracelulárního měření je mj. to, že buňka je zavedením elektrody více či méně poškozena. Záznam může zkreslit únik iontů z cytoplasmy vpichem, v kontraktilních tkáních se při kontrakci (např. svalového vlákna) ME může během měření zlomit a podobně. Extracelulární snímání se používá mj. k extracelulárním záznamům ploténkových proudů, studiu odpovědí neuronů na různé podněty nebo k záznamům jejich (jednotkové) aktivity, ke studiím vzorců aktivity neuronů (dobře lokalizováno místo snímání vizuálně polohou hrotu ME), k měření redox potenciálů různých látek v bezporistředním okolí buněk aj.; nepoškozuje sledovanou buňku vpichem. snímek 7 prezentace Po vytažení se skleněné ME dále upravují. Je třeba je naplnit vodivým či aplikačním roztokem, do kterého bude vložena elektroda, a ME na patch-clamp je třeba tzv. polishovat. Polishování spočívá v lehkém otavení hrotu ME v blízkosti rozžahveného Pt drátku (vpravo). Tím se spálí se případné elektrostaticky nachytané nečistoty a hrot ztratí ostré okraje vzniklé přelomením chladnoucího skla při tahu; vypadá pak trochu jako korunkový uzávěr na lahvi od piva. Bez toho by se ME na membránu buňky nepřisála a nevytvořila by s n těsné spojení propíchla by ji jako při snímání intracelulárním, kdy ME zavedete vpichem. ME na patch-clamp jsou určeny k bezprostřednímu použití, ME např. na nervosvalové preparáty lze skladovat (naplněné, v chladu) řádově až týden. Skleněné ME jsou obvykle plněny elektrolytem roztokem nějaké soli. Složení daného elektrolytu závisí na typu experimentálního protokolu. Dnes nejužívanější způsob plnění je injikace elektrolytu do lumen ME, která je vyrobena z kapiláry se skleněným vláknem nataveným už výrobcem na stěně. Roztok je kapilárními silami vtažen až do hrotu ME a vznikající bubliny nejsou tak velké (neucpou lumen ME kompletně). Dřívější způsoby, jak se v co největší míře vyhnout vzniku bublin při plnění ME, zahrnovaly nejrůznější triky. ME se např. nejprve naplnila ethanolem nebo jinou těkavou organikou a následně se koncem ponořila do požadovaného roztoku. Při odpařování ethanolu byl pak vzniklým podtlakem nasáván elektrolyt. Dnes se většinou používá tenká 4

5 polyethylenová kanyla, která se zavede co nejdál do vytažené ME, a stříkačkou se vpraví požadovaný roztok. Bublina se v lednici díky teplotní roztažnosti zmenší a lze ji pak vyklepat ven. O tohle jste bohužel přišli, loni si vaši kolegové cvičně s ME pohráli). Elektrolytem je nejčastěji 2,5-3 M KCl, často také 1-2% agar/0,15 M NaCl, formující tzv. solný můstek. Proč 2,5 M KCl? K + i Cl - mají ve vodném prostředí podobné mobility. Navíc, při vysoké koncentraci KCl difunduje z ME (hydrostatický tlak 1-2 cm sloupce přes 2-5 mm hrot), takže solný můstek se neředí tím, že by nasával roztok, v němž je preparát ponořen, a nevznikají problémy s potenciálovým gradientem na pracovní elektrodě. Mezi pracovní a referenční elektrodou stejně vzniká koncentrační článek (E c = RT/zF ln c 2 /c 1 ), protože jsou v roztocích o různých koncentracích iontů 5 mm KCl vs. 2,5 M KCl. Dobré chloridování a častá výměna čerstvě naplněných ME jej ale umenšuje. snímek 8 prezentace 3 Skleněná ME musí být do elektrického obvodu pracovní aparatury připojena nějakým vodičem - musí být naplněná vodivým elektrolytem a spojena s přístroji předzesilovači, zesilovači, osciloskopy, převodníky, stimulátory, počítači. Tento kovový vodič je pak spojený s kvalitními (měděnými) vodiči v těchto přístrojích. Na rozhraní voda-kov se při průchodu proudu často tvoří bublinky plynu (vodík, kyslík), což mění kapacitní vlastnosti daného vodiče a zkresluje měření. Zapojení ME do obvodu se proto provádí zejména pomocí nepolarizovatelných reverzibilních vodičů, nejčastěji tzv. argentchloridových elektrod (Ag/AgCl). Na těch pak probíhá následující děj: AgCl Ag + + Cl - + e - -e - Ag/AgCl elektrody vyměňují elektrony za ionty Cl - v roztoku. AgCl je velmi málo rozpustné, takže elektroda má víceméně konstantní potenciál a pro preparát toxické stříbro se neuvolňuje do roztoku. Vzhledem k tomu, že koncentrace Ag + je nepřímo úměrná koncentraci Cl - a referenční elektroda je v roztoku o neměnné koncentraci KCl, neuvolňuje se z ní nijak masivně Ag toxické pro preparát. Ag/AgCl elektrody se buď vyrábějí v laboratoři na koleně, nebo jsou komerčně dostupné. A) Stříbrné drátky pokryté vrstvou AgCl, používané jako pracovní i referenční elektrody vyráběné vlastnoručně elektrolytické pochloridování (na jednu elektrodu připevníte odmaštěný a lehce obroušený Ag drátek, druhá je zpravidla uhlíková elektroda obě ponoříte do roztoku HCl nebo KCl; po určité době průchodu proudu se na drátku vytvoří křehká, ale jednotná vrstva AgCl) Ag drátky ponořené do roztaveného AgCl (vyžaduje ovšem výkonný ohřevný systém k tavení AgCl; vzniklá vrstva AgCl na drátku je tuhá) 5

6 různá bělidla (Savo aj., do kterých se drátek na 24 h ponoří metoda laciná, ale vrstva AgCl není tak uniformní ) B) Komerčně dostupné Ag pelety posypané AgCl (stabilní na světle, vedou hodně proudu, pelety se vstrčí do skleněné ME) nebo peletové či diskové elektrody, s průměrem Ag/AgCl pelety na konci typicky 0,8-2,0 mm a často i s Ag/AgCl pokrytím odstupujícího drátku o průměru obvykle 0,25 mm. snímek 9 prezentace 3 B) Kovové mikroelektrody Kovové ME jsou používány na extracelulární a na dlouhodobé záznamy. Velkou výhodou extracelulárních záznamů je to, že se ME nemusí zavádět do buňky, což může být velmi obtížné, je-li malá, a navíc ji to poškodí. Extracelulární záznamy jsou také výhodné u tkání, které se pohybují, mění objem a pod. Nevýhodou těchto záznamů je zejména to, že je velmi snadné pořizovat záznam z více buněk najednou, aniž to chceme, i když je hrot ME velmi malý (i pod 1 µm). Pak je třeba odlišit charakteristický projev jednoho neuronu od druhého (není snadné odlišit dva lidi v jedné místnosti plné jiných a co teprve zjistit parametry komunikace jednoho neuronu: amplituda?, frekvence?, tvar AP?,...). Extracelulárně zaznamenávané AP často leží těsně nad hranicí šumu pozadí (nekoordinovaných náhodných výbojů, výtoky iontů apod.). ME vhodné k jejich zaznamenávání musí proto mít velmi nízký vlastní šum. Skleněné ME s k tomu nehodí sklo je velice komplexní materiál a čím je hrot ME tenčí a delší, tím víc sklo interaguje s ionty v roztoku (hrotový potenciál ME přispívající k naměřeným hodnotám potenciálů), hrot má též vysoký odpor a ME hodně šumí. Kovové ME tento problém nemají, zato na rozhraní kov/vodný roztok dochází k oxidacím, mohou vznikat bublinky plynu (s kapacitou, která ovlivní měřené napětí i proud) proto nejsou kovové ME vhodné k intracelulárnímu měření. Kovové ME mohou být používány opakovaně, jednotlivě i jako stereody (dvě spojené), koncentrické ME, multielektrodové systémy apod. Nejčastěji jsou vyrobeny z wolframu, směsi platiny a iridia, čisté platiny, z čistého iridia a nerezové oceli. Podobné využití jako kovové ME mají i ME z uhlíkových vláken, které se snadněji vyrábějí, jsou dobrými vodiči a mají nízký šum na rozhraní s elektrolyty. Wolframové ME jsou asi nejužívanější, neb T mají téměř ideální tuhost a biokompatibilitu (a taky jsou nejlevnější). Jsou vhodné pro většinu stimulačních protokolů a užívají se i v tzv. deep brain studiích záznamech z hlouběji uložených struktur mozku, kdy je třeba používat delší elektrody- např. při studiu Parkinsonovy nemoci. Platinové a platino/iridiové ME jsou extrémně inertní a proto se využívají v intenzivních stimulačních protokolech, kdy by W nebo nerezové ME mohly korodovat. Mají také nižší hrotový odpor a tím i šum. Díky své inertnosti se hodí na chronické bioimplantáty. 6

7 Iridiové ME mají ze všech ušlechtilých kovů nejnižší hodnoty odporu a používají se zejména na chronické implantáty. Minimálně korodují a elektrochemicky (cyklickou voltametri) mohou být nabuzeny k výraznému zvětšení své povrchové kapacity pro akumulaci náboje, takže jsou vynikajícími stimulačními ME. Nerezové ME jsou poměrně tuhé a snadno mohou být elektrochemicky pokoveny jinými kovy. Užívají se pro vibrační studie nebo pro histologické značení pruskou modří, aplikovanou miniaturními anodickými proudovými pulsy. snímek 10 prezentace 3 Kovové ME jsou používány na extracelulární a na dlouhodobé záznamy. Dnes jsou používány víceméně bez výjimky ME komerční (wolfra; slitina Pt, Ir). Dříve byly kovové ME vyráběny svépomocí a následně izolovány:drátek (ocel, Pt/Ir) byl nastříhán na patřičnou délku. upevněn do držáku a galvanicky naostřen. Držák byl zapojen do elektrického obvodu a byl pod napětím v řádu voltů. Elektrody po obvodu držáku se rovnoměrně otáčely a postupně se zužovaly v periodicky ponořovaných částech. V místě hladiny byla ME nejmíň času, čím dále od hladiny, tím byla při otáčení v lázni déle. Takto nabroušené ME se následně elektricky izolovaly. Izolace může být provedena různými materiály. komerční kovové ME jsou lakovány izolačním lakem pokrývajícím ME až ke hrotu, ten je neizolován v délce asi 10 µm (čím je neizolovaný hrot kratší, tím je ME přesnější co do lokalizace sledovaného místa); jiné typy izolace zahrnují pokrytí polyimidy, Parylenem; polarizace těchto elektrod se mění v průběhu experimentu, často nepredikovatelně spíše krátkodobější měření; typické použití sledování elektrické jednotkové aktivity mozku); odpor typicky kω či jednotky MΩ izolace sklem jako žhavící prvek slouží Pt plíšek s prohnutou jamkou umístěnou podélně (v y ose). Do jamky se nasype borosilikátové sklo, do roztaveného skla se zanoří elektroda, pod optickou kontrolou se posunuje a pokryje se asi do 2 cm délky, hrot zůstává nezaizolován; odpor těchto ME je řádově jednotky megaohmů. snímky 11 a 12 prezentace 3 Drtivá většina kovových ME je komerční. Jsou nabízeny v různých uspořádáních, jako jednotlivé ME, dvě ME spojené ve stereody či jako multieletrodové systémy s různým počtem ME, které mohou být ve svazku vhodném k implantování, ve formě manžet obalující sledovaný nerv či úsek míchy nebo jako plošné ME systémy umístěné na dnech kultivačních nádob (Petriho misek aj.). Pokud pokryjeme dno kultivační nádoby patřičným povrchem (např. polylysinem), můžeme na určených místech vypěstovat například směsné kultury (kokultury) motorických neuronů a kosterních svalů a sledovat formování kontaktů na nervosvalovém spojení. 7

8 Kovové ME jsou používány na extracelulární a na dlouhodobé záznamy. Typická kovová ME W, délka 76 mm, izolant silný 1 µm, odpor 1MΩ (±20%!), hrot 1 µm; užití nahrávky z jednoho a více neuronů a z malých buněk ležících těsně u sebe, mikrostimulace, penetrační ME, deep-brain studies Stereody studie založené na bipolární stimulaci malých lokalizovaných částí nervové tkáně, simultánní nahrávky dvou neuronů ležících u sebe Koncentrické ME studie dlouhodobé, nahrávky z větších oblastí a nahrávky evokovaných potenciálů, bipolární stimulace; W ME o průměru 75 µm, hrotu 1-2 µm a odporu kω; vnější vodič je jehla z neroezové oceli (referenční elektroda); při zavádění se nejprve udělá průchod mozkovými plenami a posléze stereotakticky napolohuje ME Multielektrodové systémy chronicky implantovatelné multime sety, mikrodrátkové sety na dlouhodobé stimulace Multielektrodové systémy chronicky implantovatelné multime sety, mikrodrátkové sety na dlouhodobé stimulace, snímání či stimulace z in vivo preparátů, z tkáňových kultur Manžety (ME for nerve cuffs) s elektrodami k dlouhodobým záznamům a/nebo stimulaci izolovaných nervů in situ (př. studium neuronů řídících dýchání: odkrytá prodloužená mícha pokrytá minerálními oleji; savčí periferní nervy manžety s typickým průměrem 3 mm; většina myelinizovaných vláken manžety s dstupem elektrod 5 mm) Plošně (na dně kultivační Petriho misky) umístěné elektrody určené ke snímání nebo ke stimulaci z tkáňových kultur neuronů nebo myotub. 8

9 snímek 13 prezentace 3 Na záběrech z mikroskopu vidíte detaily plošných ME na dně kultivační Petriho misky, přerostlých rannou kulturou myotub z m. tibialis anterior. V pravém dolním rohu je pak záznam ploténkového potenciálu na čerstvě se formujícím mervosvalovém spojení v této kultuře (vlny různé velikosti v dolní části). Jde o záznamy pořízené v těšné blízkosti spojení jejich nástup je velmi rychlý, mají téměř kolmou vzestupnou (levou) část. Kdyby byly elektrody umístěny od formujícího se spojení dále, nástup ploténkových potenciálů by byl pozvolnější. snímky 14 a 15 prezentace 3 C) Mikroelektrody z uhlíkových vláken Extracelulární záznamy jsou, jak už jsme se zmínili, zatíženy tím, že snadno nahrajete např. více neuronů v mozkovém řezu najednou, a navíc je celkové pozadí takového preparátu často velice hlučné: elektrická aktivita může být zachycena z (v relacích k velikosti buněk) velké vzdálenosti a rušit aktivitu blízkou, která může být poměrně tichá jen těsně nad hladinou šumu pozadí. Proto je třeba pracovat s ME s velmi nízkým vlastním šumem. Skleněné ME se k tomu kvůli svému vysokému šumu proto příliš nehodí. Dříve se tento problém řešil spojením wolframové ME (W ME) se svazkem ME skleněných nebo zavedením předbroušené W ME do skleněné mikropipetky. Proto byly vyvinuty na konci 70. let mikroelektrody z uhlíkatých vláken jako pokus o řešení tehdy velmi populárních (mikro)iontoforetických aplikací a současných záznamů z tkání. Mikroiontoforesa funguje následujícím způsobem: do elektrody či svazku elektrod jsou přiváděny nanoampérové proudové pulsy, které ejekují ionizované farmakum na jednu či více buněk. Jejich odpověď je pak extracelulárně zaznamenávána. Namísto těžce vyrobitelných W ME patřičných parametrů se začala používat uhlíkatá vlákna ve spojení s aplikační ME pipetkou (vlevo dvě, vpravo tři pipetky + uhlíkaté vlákno). Výhody uhíkových ME: jsou laciné (komerčně k zakoupení svazky mnoha set vláken o průměru 7-8 µm), dobře vedou a mají nízký šum, vyrábí se snadněji než W ME. Dají se zakoupit v nejrůznějších formách nebo vyrobit svépomocí (viz slide). Nevýhody: jsou křehčí, mají uniformní průměr bez tvarovatelně ostřeného hrotu, nedají se příliš používat opakovaně Použití uhlíkových ME je různé. Díky svým vlastnostem se hodí ke studiu chemické aktivity neuronů ve stejném časovém okamžiku jako je studována jejich aktivita elektrická. Za užití cyklické voltametrie lze např. sledovat výlev dopaminu v ncl. caudatus poté, co byly elektricky stimulovány dopaminergní nigrostriatální neurony. Obecně se uhlíkové ME hodí např. pro voltametrickou analýzu výlevu neuropřenašečů in vivo či studium redox potenciálů oxidovaných látek v buňkách aj. 9

10 Vlevo vidíte extracelulární záznam akčních potenciálů neuronů zadních rohů míšních pořízený uhlíkovou ME z obrázku vpravo. Jde o odpovědi na NMDA aplikovaný iontoforeticky přidruženým systémem kapilár. snímky 16 a 17 prezentace 3 Přístrojové a softwarové vybavení elektrofyziologické laboratoře je finančně velice nákladná záležitost, nicméně se (podle mého názoru) na nich nevyplatí šetřit, neboť jejich cena zahrnuje i servis a kdo jsme taky zároveň dobrým elektroinženýrem-slaboproudařem ;-). Dodnes se ale používají i svépomocí vyrobení experimetální setupy, jako vidíte na obrázku v presentaci. Tyto sestavy zahrnují přístroje jako různé stimulační jednotky, zdroje (určitého výstupního) napětí/proudu, předzesilovače, zesilovače a podobně samozřejmě po vás schéma běžné elektrofyziologické aparatury chtít nebudu, stejně jako popis jejích vlastností. Nicméně je dobré, abyste věděli, že elektrofyziologické snímání je zatíženo různými technickými problémy nejen na straně mikroelektrod, ale i na straně měřící aparatury samotné. My se zmíníme jen o jediném, a to o potenciálových ztrátách. Každý měřící systém musí co nejpřesněji měřit daný parametr (napětí, proud...) musí vlastnosti daného parametru co nejméně poškozovat Experimentální protokol často vyžaduje manipulace s membránovým potenciálem buňky (např. při měření pasivních vlastností membrány, jako je vstupní odpor r input, aplikací proudu). Zpravidla se k tomu používají dvě elektrody: jedna záznamová (recording) a druhá aplikační (current passing), obě umístěné v praparátu. Hodnotu naměřeného potenciálu ovlivňuje řada faktorů. Velkou roli hrají kapacity (mezi pracovními ME a uzemněním): kapacita membrány buňky, kapacita ME a roztoku... Všechny tyto součásti obvodu se při průchodu proudu nabíjejí a ze sledovaných hodnot potenciálu tak ukrajují. Tyto kapacitní ztráty je třeba nějak kompenzovat. Částečně si lze pomoci např. ME s tenkými stěnami (nebo potzžením stěny ME například Sylgardem či jiným polymerem) nebo nízkou hladinou roztoku v měřící komůrce, ale obecně je třeba tyto napěťové ztráty kompenzovat. k tomu slouží zpětnovazebné obvody, jaký např. vidíte ve velmi zjednodušené formě dole na 16. stránce prezentace. Vlevo vidíte obvod kompenzující potenciálové ztráty během aplikace proudového pulsu. (Všimněte si, že membrána buňky je znázorněna jako RC člen. Do buňky je zavedena ME o odporu R ME.) Ke kapacitním ztrátám dochází mj. díky transmurální kapacitě elektrody C t, kapacitním ztrátám přístrojového vybavení 10

11 C s a vstupním kapacitám zesilovačů C a. Všechny tyto ztráty musí být kompenzovány. Obvod je nastaven na nějaké řídící napětí a zdroj proudu pak do něj dodává proud úměrný tomuto napětí (viz Ohmův zákon). Výstupní hodnota napětí je pak (po odečtení od potenciálu elektrody) porovnána s napětím řídícím. Podle toho, jak si řídící a výstupní pulsy odpovídají, je přidáváno či ubíráno různé množství proudu, aby zůstal zachován tvar řídícího pulsu (nejčastěji pravoúhlý). snímek 18 prezentace 3 Ve zbylé části dnešní přednášky se trochu blíže podíváme na dvě velmi užívané elektrofyziologické techniky: na techniku napěťového zámku (voltage clamp) a techniku terčíkového zámku (patch clamp). snímek 19 prezentace 3 Napěťový zámek je metoda vynalezená Kenethem Colem a Curtisem roku 1949 a zdokonalená Hodgkinem, Huxleyem a Katzem (1952). Dovoluje nastavit membránový potenciál buňky na určitou hodnotu (mv) a zamknout jej na této úrovni, přičemž lze zaznamenávat proudy tekoucí přes membránu dané buňky. V buňce tedy máme dvě skleněné ME: jedna zaznamenává proud a druhá udržuje patřičný transmembránový potenciál. Jedna ME zaznamenává transmembránové napětí (a toky proudů) oproti zemnící elektrodě umístěné extracelulárně a je připojena na zesilovač. Druhá ME je připojena ke zdroji napětí a je na ni nastaveno tzv. řídící napětí, tj. úroveň potenciálu, na které má být uzamčena membrána. Pokud se liší hodnota tohoto řídícího napětí a membránového potenciálu měřeného první ME, vyšle zdroj proudový puls, který tyto hodnoty zase srovná. Takže: je-li řídící napětí nastaveno na hladinu klidového membránového (např. 60 mv) potenciálu a změřený potenciál je -60 mv, není třeba aplikovat žádný proud. Pokud je řídící napětí nastaveno např. na 40 mv, zesilovač odpoví aplikací takového proudu, aby membránu depolarizoval z 60 mv na požadovaných 40 mv. Takto dojde mj. k otevření napěťově ovládaných sodíkových kanálů, sodné ionty vtékají do buňky a nesou tak dovnitř tekoucí proud. U nezamčeného vlákna by vtékaly sodné ionty dál a dál (snaha dosáhnou E Na ), ale u vlákna zamčeného zesilovač operativně vyšle opačný proudový puls v takové výši, aby udržel membránu na požadovaném řídícím napětí. Velikost dovnitř tekoucího sodíkového proudu a opačného proudu aplikovaného zesilovačem je naprosto stejná (zanedbáme v úvahách tzv. kapacitní a únikové proudy). Metoda napěťového zámku tedy umožňuje měřit velikosti proudů nutných k dosažení určitého membránového potenciálu. Spolu se specifickými blokátory různých typů kanálů můžeme také např. určit typ proudu za danou odpověď zodpovědného a pod. Tato technika umožnila Hodgkinovi s Huxleyem analyzovat jednotlivé fáze akčního potenciálu co do typu proudů (směr toku a typ iontů, jimiž je proud nesen). snímek 20 prezentace 3 Schéma jejich experimentu vidíte na obrázku. Do obřího axonu sépie zavedli dva drátky. Jeden sloužil jako záznamová elektroda k registraci transmembránového potenciálu, druhý sloužil k aplikaci proudů nutných k udržování řídícího napětí. Následně membránu depolarizovali (nastavili řídící napětí na nižší hodnotu, než byla hodnota klidového membránového potenciálu vlákna) a měřili proud, který bylo nutno aplikovat, aby se 11

12 nastavené parametry udržely měřili celkové proudy tekoucí přes membránu a vyvolané depolarizací. Za použití specifických blokátorů různých napěťově ovládaných kanálů pak mohli odlišit, který proud kdy nastupuje a zda teče dovnitř či ven z buňky. snímek 21 prezentace 3 Jako selektivní blokátor napěťově ovládaných Na kanálů je používán tetrodotoxin (TTX) či saxitoxin (STX, produkt mořských obrněnek). Při použití TTX lze tedy studovat draslíkové proudy. Jako selektivní blokátor napěťově ovládaných draslíkových kanálů se používá tetraethyamonium (TEA); v případě obřího axonu sépie jej Hodgkin a Huxley museli aplikovat intracelulárně, na jiných preparátech (např. Ranvierovy zářezy myelinizovaných žabích vláken) funguje i extracelulárně. Při použití TEA lze tedy studovat sodíkové proudy. Jak tedy Hodgkin ahuxley postupovali při sloupávání jednotlivých proudů z celkové proudové odpovědi: mějme (žabí myelinizovaný) nerv uzamčený na membránovém potenciálu 0 mv. Dojde k otevření napěťově ovládaných sodíkových kanálů, sodné ionty vtékají do buňky a nesou tak dovnitř tekoucí proud. Se zpožděním se otevírají draslíkové kanály, draslík vytéká z buňky a nese tak ven tekoucí proud. U nezamčeného vlákna by vtékaly sodné i draselné ionty dál a dál (snaha dosáhnou E Na a E K ), ale u vlákna zamčeného zesilovač operativně vyšle opačný proudový puls v takové výši, aby udržel membránu na požadovaném řídícím napětí (0 mv). Toky proudů můžeme souhrnně zaznamenat (viz obr. v prezentaci). Po zablokování sodíkových kanálů pomocí TTX pak vidíme časový průběh a směr toku draslíkových proudů (vlevo), po zablokování draslíkových kanálů pomocí TEA vidíme časový průběh a směr toku proudů sodíkových (vpravo). Všimněte si, že draslíkový proud teče ven z buňky, má pomalejší nástup a pozvolna sále roste, zatímco sodíkový proud rychle vtéká do buňky a pak ustává. Jinými slovy, časové konstanty sodíkových a draslíkových proudů jsou rozdílné. Pokles amplitudy sodíkového proudu k nule (zastavení toku Na + ) je označován jako inaktivace (sodíkového proudu). snímek 22 prezentace 3 mv mv mv mv membránový potenciál membránový proud čas (ms) čas (ms) Podobným postupem Hodgkin a Huxley rozložili akční potenciál na příspěvky jednotlivých typů proudů (postupným zamykáním membrány na různé hodnoty membránového potenciálu a analýzou toků jednotlivých proudů při těchto potenciálech). Zrušili tím definitivně ani ne půl století starou membránovou teorii Julia Bernsteina a prokázali, že během akčního potenciálu dochází díky tokům sodíkového proudu k překmitu membránového potenciálu do kladných hodnot. Hodgkin a Huxley studovali inaktivaci sodíkového proudu velmi podrobně. Zjistili, že pokud před depolariazí membránu naopak na 12

13 dostatečně dlouhou dobu hyperpolarizují (sníží její potenciál směrem k zápornějším hodnotám), vzroste celková amplituda sodíkového proudu. Pokud membránu před vlastní depolarizací depolarizují na určitou dobu jen lehounce, celková amplituda sodíkového proudu se naopak sníží. Tyto jejich pokusy ilustruje obrázek vlevo dole na předchozí stránce. Horní záznam představuje kontrolní depolarizaci z 65 mv na 21 mv, která vyvolá určitou odpověď. Pod ní je prepulsní hyperpolarizační krok, spodní dva záznamy jsou kroky depolarizační. Zjistili, že hyperpolarize před vlastní pulsem vyvolá nárůst celkové sodíkové odpovědi až o 70%. Dále zjistili, že za hodnoty klidového membránového potenciálu je dosaženo asi 40% inaktivace sodíkových proudů. Když Hodgkin a Huxley vynesli amplitudy a časové konstanty sodíkových a draslíkových proudů jako funkci membránového potenciálu, byli schopni vypočítat velikosti a časové konstanty vodivosti membrány pro sodík a draslík (g K a g Na ). Použili pro to následující vztahy: g K = I K (V m E K ) a g Na = I Na (V m E Na ) Na obrázku vpravo vidíte vztah mezi maximální vodivostí membrány pro sodík a draslík v závislosti na různých hodnotách membránového potenciálu. Časový průběh těchto vodivostí během akčního potenciálu máte znázorněn v presentaci. Souhrnně: pokusy Hodgkina ahuxleyho, prováděné technikou napěťového zámku, ukázaly, že depolarizace vzrušivé membrány zahrnuje (přinejmenším) tři různé procesy: 1) aktivaci mechanismů zvyšujících sodíkovou vodivost (otevírání kanálů...) 2) následnou inaktivaci těchto mechanismů a 3) aktivaci mechanismů zvyšujících draslíkovou vodivost. vodivost (ms / cm 2 ) g K g Na V m (mv) snímek 23 prezentace 3 Jednou z nejrozšířenějších elektrofyziologických technik je v dnešní době technika terčíkového zámku patch clamp. Tuto metodu vyvinuli v letech pánové Erwin Neher a Bert Sackman. Roku 1991 za ni byli odměněni Nobelovou cenou. Podle tradované historky za to mohou vlastně jejich potomci na nějaké zahraní party u jednoho z nich se v rámci her bavily děti tím, že si podtlakem vytvářeným ústy přisávali na pusinky plastové kelímky od limonád, což otcům vnuklo ideu: přisajeme skleněné ME na buńky! 13

14 Principem této metody je (zjednodušeně pojato) přisátí na konci otavené skleněné ME k buněčné membráně. Díky přilnavosti lipidů k čistému sklu vznikne velmi pevné spojení (vyšší než soudržnost membrány samotné!). Ústím pipety (2-4 µm) je vymezen malý terčík (patch). Metoda je vhodná jen pro buňky zbavené buněčné stěny či bazální membrány. Existují různé konfigurace této techniky (viz obr. v prezentaci): A) přisátí k buňce (cell-attached configuration: po přiblížení k buňce lze aplikací mírného podtlaku (sání) vtáhnout část membrány do ústí pipety (gigaseal, GΩ); registrace aktivity jednotlivých kanálů v terčíku při přirozeném membránovém potenciálu buňky B) snímání z celé buňky (whole-cell configuration: aplikací dalšího podtlaku lze terčík protrhnout, membrána se přilepí na vnitřní povrch ME; stejný potenciál aplikovaný v pipetce jako KMP buňky, nízká koncentrace Ca 2+ v pipetce; souhrnný proud vzniklý činností všech kanálů vmembráně buňky C) snímání z terčíku (inside-out, outside-out configuration): terčík v ústí pipety lze odtrhnout (intracelulární strana membrány do roztoku, inside-out), nebo lze pipetu jemně a s ní i membránu vytahovat: poté, co se krček přetrhne, membrána se zase spojí (outside-out) D) perforated-patch configuration: terčík v ústí pipety přisáté k buňce (viz A) lze proděravět přidání ionoforů do roztoku v pipetě; amfotrecin nebo nystatin vytvoří umělé kanály v membráně, přes které ale z buňky neuniknou větší částice Využití patch-clampu: - záznamy aktivity jediného iontového kanálu, jediné pumpy (k popisu základní vlastností dané molekuly, ke studiu vlivu mutací či chimér apod.) na membráně buňky nebo organely - studium celkových proudů určitého typu z jedné buňky - měření změn v kapacitě membrány - identifikace iontových kanálů - skenovací patch clamp ve vysokém rozlišení (high-resolution scanning patch-clamp) ke studiu prostorového rozložení iontových kanálů v membráně malých buněk či submikroskopických buněčných struktur - patch na chipu: automatické snímání pikoampérových proudů z biologických struktur snímek 24 prezentace 3 Přisátí skleněné ME k membráně buňky je třeba kontrolovat na stínítku osciloskopu nebo dnes (povětšinou) na monitoru počítače. Správné přisátí indikuje vytvoření velkého elektrického odporu mezi pipetkou a membránou (ME je ucpaná membránou a nemůže jí procházet proud), odporu v řádech gigaohmů. Tomuto se říká vznik gigasealu. Proud procházející pipetou tím klesne na minimum na obrazovce se aplikované pravoúhlé pulsy ztratí, čára se vyrovná. Můžeme vidět tzv. kapacitní proudy (nabíjení a vybíjení při začátku a konci aplikovaného pulsu), které lze uměle (zesilovačem) z obrazovky odstranit. Dále záleží na typu konfigurace, kterou pro experiment zvolíme. V prezentaci vidíte tzv. whole-cell, při kterém se pořizuje záznam z celé buňky. Toho docílíte protržením membrány. Ústím pipetky protéká určité množství proudu, protože se nabíjí ME i membrána buňky na obrazovce jsou patrné další hroty kapacitních proudů. (S příklady záznamů aktivity jednotlivých kanálů se setkáme v jedné z dalších přednášek.) 14

15 Patch-clamp na stínítku osciloskopu El. odpor při úspěšném přisátí vzroste na gigaohmy a velikost protékajícího proudu klesne na minimum. Zkreslení kpacitních proudů lze zesilovačem odstranit / snížit na minimum. Při protržení terčíku (whole-cell) se odpor sníží, kapacitní proudy vzrostou (nabíjí se terčík, elektroda) a obsah buňky je vymyt roztokem z pipety. snímek 25 prezentace 3 To je video zachycující záležitosti popsané na předchozím snímku (demonstrační patchové přisátí se na buňku v praktikovém podání Tobiáše :-). Pokud vám v prezentaci nechodí, stáhněte si ho zvlášť ze stránky přednášky pozor, musíte mít v PC patřičné kodeky. Komentář jsem vám nechala v angličtině. Co si pamatovat z této přednášky specifiky extracelulárního, intracelulárního snímání a patch clampu využití skleněných, kovových a uhlíkových mikroelektrod princip napěťového zámku (voltage clampu) využití napěťového zámku (Hodgkin a Huxley) princip a jednotlivé modifikace terčíkového zámku (patch clampu) využití terčíkového zámku (patch clampu) 15