Úvod. Mikroskopie. Optická Elektronová Skenující sondou. Mikroskopie je metod kterej dovoluje sledovat malé objekty a detaile jejích povrchů.

Transkript

1 Mikrosvět

2 Úvod Mikroskopie je metod kterej dovoluje sledovat malé objekty a detaile jejích povrchů. Mikroskopie Optická Elektronová Skenující sondou

3 Optická mikroskopie zorný úhel osvětlení zvětšení zorného uhlu interakce světa s povrchem vzorku

4 Zorný úhel Lidské oko nemůže vidět předměty nebo detail předmětu, jestliže je zorný úhel menší než 1' tgτ y d - zorný úhel y - velikost předmětu d - vzdálenost předmětu d Význam zvětšení zorného úhlu : oko rozezná na předmětu více podrobností předmět se jeví více osvětlen, než při přímém pozorování

5 Zařízení pro zvětšení zorného uhlu Zorný úhel je možné opticky zvětšit pomoci lupy (do 10x) Úhlové zvětšení ( ): tg y y : tg a d d a d konvenční zraková vzdálenost (25 cm) a předmětová vzdálenost Lupa je spojná čočka s malou ohniskovou vzdáleností

6 Zařízení pro zvětšení zorného uhlu dosáhl zvětšení až 270x Právě lupa byla zakladem prvního jednoduchého a jednočočkového mikroskopů Antonina van Leeuwenhoeka (rok 1676). Anton van Leeuwenhoek ( )

7 Zařízení pro zvětšení zorného uhlu První mikroskop pro vědecká pozorovaní sestavil anglický fyzik a chemik Robert Hooke. V roce 1765 zdokonalil osvětlení, vynalezl irisovou clonu a mikroskop složil z více čoček. Robert Hooke ( )

8 Zařízení pro zvětšení zorného uhlu Carl Zeiss ( ) Carl Zeiss byl mechanik a podnikatel. V roce 1846 v Jeně založil dílnu pro jemnou mechaniku. Spolupráce s E. K. Abbem (německým fyzikem, který se zabýval zejména teorií optických přístrojů) přivedla k sériové výrobě mikroskopů.

9 Zařízení pro zvětšení zorného uhlu Základem optické soustavy mikroskopu jsou dvě spojné čočky, které se liší ohniskovou vzdáleností. Princip zobrazování: Pozorovaný předmět se umístí před ohniskovou rovinou objektivu Objektivem se vytvoří převracený, zvětšený a skutečný obraz objektu Tento obraz se pozoruje okulárem (lupou) Okulár pak zobrazuje předmět v nekonečnu Úhlové zvetšení mikroskopu: f f 1 d2 optický interval mikroskopu d konvenční zraková vzdálenost f 1 ohnisková vzdálenost objektivu f 2 ohnisková vzdálenost okuláru

10 Optická mikroskopie: mikroskopické techniky (světelná mikroskopie) Mikroskopie světlého a tmavého pole (brightfield and darkfield microscopy) Mikroskopie odráženého světla (reflected light microscopy) Chycený hmyz na listu Droserý 30x Živí vodní roztoč (brightfield microscopy) List Drosera sp (darkfield microscopy) 14x Fluorescenční mikroskopie (fluorescence microscopy) Buňky ledvin křečka 1500x Konfokální mikroskopie (confocal microscopy) Každý mikroskop má určité maximální zvětšení, které je pro něj charakteristické. Nejlepší optické mikroskopy dosahují maximálního úhlového zvětšení γ~2000.

11 Elektronová mikroskopie Elektronové mikroskopy pracují s proudem elektronů ve vakuu Proud elektronů - záření velmi malé vlnové délky. Elektronové mikroskopy se dělí na dva druhy: Transmisní elektronový mikroskop (TEM Transmission Electron Microscope) Rastrovací elektronový mikroskop (SEM Scanning Electron Microscope)

12 Transmisní elektronový mikroskop Viditelný obraz se vytváří na fluorescenčním stínítku svazkem elektronů, prošlým studovaným vzorkem. Zdrojem proudu elektronů je kovová katoda Kondenzátor, soustřeďuje elektrony na pozorovaný předmět (preparát). Vrstva preparátu musí být velmi tenká (~1 µm) aby nepohlcovala elektrony. Proud elektronů pak prochází další elektronovou čočkou (objektivem) a vytvoří první elektronový obraz. Část tohoto obrazu se elektronovou čočkou (projektivem) znovu zvětší. Výsledný obraz se promítá na stínítko nebo na fotografické desce či filmu. Součásti elektronového mikroskopu jsou uloženy ve vakuu

13 Rastrovací elektronový mikroskop Rastrovací elektronový mikroskop pracuje tak, že na preparát směrován tenký svazek elektronů, který dopadá postupně na všechna místa vzorku. Odražený (emitovaný) paprsek se převádí na viditelný obraz. Napětí na katodě 1 5 kv. Mechanická clona vybírá pouze část elektronů, které dopadnou na preparát. Projekční čočka způsobí, aby zaostřený svazek elektronů dopadl na preparát. Preparát může být 2 3 cm tlustý a 15 cm dlouhý a musí být kvalitně pokoven. Zaostřený svazek elektronů musí po povrchu preparátu rastrovat synchronně s kamerou

14 Příklady aplikace TEM a SEM LiFePO 4 /C komposit syntetizovaný 30 hodin při 700 C TEM obrázek SEM obrázek Mi C.H. et al./ J. Alloys Comp. 424 (2006) 327.

15 Příklady aplikace TEM a SEM Si-Ni-C komposit (Si:Ni:C= 4:1:5) HR-TEM obrázek SEM obrázek M.-S. Park et al./ Materials Chem. Phys. 100 (2006) 496.

16 Příklady aplikace TEM a SEM Nanosféry koloidu zlata stabilizované COOH skupinami poly(dvb-co-aa) SEM obrázek TEM obrázky W. Liu et al./ J. Colloid Interface Sci. 304 (2006) 160.

17 Příklady aplikace SEM Vlas napadený kožní plísní-dermatofitem Pokoveno zlatem (M. Hejtmánek, V. Horn) Buňka (adiospora) mikroskopické patogenní houby (M. Hejtmánek, V. Horn)

18 Elektronová mikroskopie: výhody a nevýhody Výhody TEM a SEM: velmi velké zvětšení řádově až x, umožňuje pozorovat nanočástice velké rozlišení (0,1 nm) velká hloubka ostrosti (několik mm) poskytuje informaci nejen o topografii, ale i o materiálovém složení vzorku Nevýhody TEM a SEM: velké nároky na prostor vysoká pořizovací cena Nevýhody TEM: velmi tenký vzorek (~1 µm) preparát musí být umístěn ve vakuu, což neumožňuje pozorovat živé organismy

19 Mikroskopie skenující sondou (SPM - Scanning Probe Microscopy) Mikroskopie skenující (rastrující) sondou je soubor experimentálních metod určených ke stanovování struktury povrchu se subatomárním rozlišením ve směru kolmém k povrchu, a možností stanovení 3D obrazu povrchu.

20 Mikroskopie skenující sondou (SPM - Scanning Probe Microscopy) Experimentální počátek metod SPM je datovan už od roku 1972 Russell Young, Fredric Scire and John Ward s topografinerem. Mapování povrchu ze vzdálenosti 100 nm Rizlišení: vertikální 3 nm laterálně 400 nm R. Young, J. Ward, and F. Scire, Rev. Sci. Instrum. 43, 999 (1972)

21 Mikroskopie skenující sondou (SPM - Scanning Probe Microscopy) Princip metod SPM: obraz povrchu je získáván pomocí mechanického pohybu sondy, skenovaní a zaznamenávání interakce sonda-povrch jako funkce polohy sondy. R. Kubínek, M. Vůjtek, M. Mašlaň: Mikroskopie skenující sondou, ISBN , vydatelství Univerzity Palackého v Olomouci, 2003

22 Vzájemné interakce Míra, s jakou se hrot a vzorek vzájemně ovlivňují, záleží na jejích vzájemné vzdálenosti d d > 10 nm zanedbatelný vliv 1 < d < 10 nm uplatňují se velmi slabé van der Waalsovy síly. Při nízkých napětích (do 5V), nedochází k tunelování. 0.3 < d < 1 nm výměna procházejících elektronů vede ke vzniku přitažlivých sil (počátek chemické vazby), pod napětím dochází k tunelování pracovní režim STM d < 0.3 převládá odpudivá interakce, která plyne z Pauliho principu.

23 Mikroskopie skenující sondou vlastnosti (Výhody) velký rozsah zvětšení (rozlišení je nezávislé na vlnové délce objektu, ale pouze na parametrech sondy) až atomární rozlišení zobrazení v prostoru a 3D obraz v reálném čase aplikace v různých prostředích (vzduch, vakuum, voda, elektrolyty) vhodné pro zobrazování nativních biologických vzorků obvykle není třeba speciálních úprav vzorku (fixace, odvodnění, vysoušení, nanesení vodivé vrstvy - není zapotřebí žádného externího zdroje částic) metoda registruje zvlnění určité fyzikální vlastnosti, např. plochy konstantní hustoty náboje interakce hrotu se vzorkem může být použita ke změně povrchu a vzniku nových struktur (nanolitografie) vzhledem k malé velikosti SPM sondy ji lze vestavět do zařízení pro jiné typy mikroskopických technik (světelný a elektronový mikroskop)

24 Mikroskopie skenující sondou vlastnosti (Nevýhody) je citlivá pouze na pár povrchových vrstev (často na jednu) při malých zvětšeních lze zkoumat jen místo těsně pod hrotem je omezena lokálně a neobsahuje obraz informaci o zbytku povrchu obtížnost opětovného zobrazení stejného místa na vzorku (obejít lze jen vyrytím orientační značky do vzorku). citlivost k vibracím a teplotním driftům velké množství artefaktů (falešných obrazů) vliv adsorbované vody na povrchu vzorku hodnota měřené veličiny prudce klesá se vzdáleností od povrchu (je to metoda v blízkém poli, využívající zpětné vazby k poloze sondy) není obecně citlivá na chemickou podstatu atomů, určit typ atomu lze jen z doplňujících metod a úvah neexistuje jednoduchá inverzní transformace, tj. z naměřených hodnot není zpravidla možno přímo určit strukturu, lze jen porovnat s očekávanými hodnotami z modelu

25 Mikroskopie skenující sondou Jednotlivé metody Skenovací tunelová mikroskopie (STM) scanning tunneling microscope Mikroskopie atomární síly (AFM) - atomic force microscopy Mikroskopie magnetických sil (MFM) magnetic force microscopy Mikroskopie elektrostatické síly (EFM) - electrostatic force microscopy Skenovací teploměrná mikroskopie (SThM) - scanning thermal microscopy (Protonová) skenovací tunelová mikroskopie ((P)STM) - (proton) scanning tunnelling microscopy

26 Skenující tunelová mikroskopie Gerd Binnig (STM) Metoda STM byla vyvinuta v laboratořích IBM pracovníky G. Binnigem a H. Rohrerem roku 1981, kterým za jejich objev byla v roce 1986 udělena Nobelova cena. Je to jedna z mála metod, která je schopna poskytnout až atomární rozlišení Výhody: nevyžaduje náročnou přípravu vzorku, ale poskytuje jen informace o povrchu. Heinrich Rohrer Nevýhody: neposkytuje okamžitý a vizuální obraz, snímání je postupné

27 Skenující tunelová mikroskopie uspořádání STM zařízení Základem STM je kovový hrot umístěný v blízkosti vodivého povrchu vzorku. Přiložené napětí mezí hrotem a povrchem vede ke vzniku tunelového proudu, který poskytuje informace o povrchové struktuře vzorku. (Tunelový proud vzniká jen v případě že hrot i vzorek jsou z vodivého materiálu, případně polovodiče) Každý mikroskop SPM se skládá z dvou součásti: mechanická část stolek k upevnění vzorku polohovací zařízení, které umožňuje pohyb ve třech rozměrech sondy (hrot, nosník) elektrická část napájení zpětné vazby sběr signálu ovládání pohybu.

28 Tunelový jev Na rozdíl od isolovaných atomů, elektrony v makroskopickém vzorku kovu nemají dobře rozlišitelné energetické hladiny a postupně naplňuji energetickou jámu. Nejvyšší energetická hladina, která je obsazena elektrony, odpovídá hladině Fermiho energie (E F ). Lokální hustota stavu (ρ) s energií E je poměr počtu elektronů v okolí tohoto stavu N E ke změně energie ΔE: N E E

29 Tunelový jev Mezí hrotem a povrchem vzorku ve vakuu existuje energetická bariera. Výška této bariery je označovaná jako Ф. Podle klasické fyziky elektron nemůže proniknout přes potenciální bariéru je-li jeho energie menší než potenciální energie bariéry. Kvantová mechanika umožňuje elektronu projít barierou ( tunelem ), což vede ke vzniku tunelového proudu. Podmínkou tunelového efektu je rozdíl hodnot E F vzorku a hrotu, čehož lze dosáhnout pomocí vloženého napětí.

30 Skenující tunelová mikroskopie Režimy měření režim s konstantní výškou udržuje se jednou nastavená hodnota z 0, měří se velikost tunelového proudu I umožňuje rychlé snímání obrazu, protože není nutno pohybovat vzorkem je méně přesný, neboť při velkých vzdálenostech hrotu od povrchu se proud dostává pod dobře měřitelnou úroveň režim s konstantním proudem pomocí zpětné vazby se udržuje konstantní úroveň proudu I měří se napětí U přikládané k piezokeramickým pohybovým prvkům je pomalejší, umožňuje však sledovat větší změny profilu povrchu je závislý na převodním vztahu přiloženého napětí a změně rozměru piezoprvku, což lze odstranit vnějším měřičem polohy, např. laserovým. je možné poškození povrchu, přejde-li hrot nad oblast s výrazně odlišnými elektrickými vlastnostmi (např. zoxidovaná místa), aby byl udržen nastavený proud, dojde k velkému snížení hrotu. režim s nákresem bariérové výšky měří se bariérová výška φ na základě změny vzdáleností mezí hrotem a vzorkem při modulaci proudu pomocí zpětnovazební smyčky umožňuje měření heterogenních povrchů

31 Skenující tunelová mikroskopie Umístění vzorku a skenování Hrubý mechanický posuv vzorku směrem ke hrotu (z) Přiložení napětí mezi hrotem a vzorkem, aby mohl procházet proud je zapotřebí vodivý vzorek Jemným posuvem pomocí piezokeramiky přiblíží vzorek ke hrotu tak, aby procházející proud nabyl měřitelných hodnot Získání obrazu (skenování) skokovým posuvem ve dvou rozměrech (x, y) po příslušné matici měřicích bodů zpravidla se pohybuje po řádcích a v jednom směru Výstupem měření je matice prvků a ij, jejíž indexy označují polohu bodu a příslušná hodnota je velikost měřeného signálu.

32 Skenující tunelová mikroskopie Jak vzniká obraz Hrot skenuje povrch vzorku ve vzdálenosti rovné průměru atomu. Při každé poloze hrotu se měří tunelující proud I mezi hrotem a povrchem. Měřené hodnoty I se sbírají, vyhodnocují a zobrazují na obrazovce v škále šedi. Barevná paleta může být použita pro znázornění prostorové deformace povrchu. Černě, škálou šedi nebo barevně se dá zobrazit výška nebo zakřivení povrchu.

33 Příklady aplikace STM studium Pt vrstvy (Pt/C film) Simulovaná a změřená STM topografie Pt/C filmu F.Keilmann et al./ Phys. stat. sol. B 215, 849.

34 Příklady aplikace STM studium nanotrubiček uhlíkové saze HR-TEM obrázek nanotrubic STM obrázky a čáry skenování povrchu jednotlivých a slepených nanotrubic W. Rivera et al./ J. Vac. Sci. Thechnol. B 13 (1995) 327.

35 Příklady aplikace STM studium izolovaného acetylenu (C 2 H 2 ) STM obrázek (25 25A ) C 2 H 2 na povrchu Cu(100) s maximální hloubkou 0.23A. Obrázek byl skenován při napětí 100 mv a tunelovém toku 10 na. B. C. Stipe et al./science 280 (1998) 1782

36 Příklady aplikace STM studium Ni(II) oktaethylporpyrinu.

37 Příklady aplikace STM studium adsorpce porfyrinu na povrchu Cu a samo-uspořádaní molekul adeninu na porfyrin/cu povrchu

38 Mikroskopie atomární síly AFM Mikroskopie AFM je založena na mapování rozložení atomární sily na povrchu vzorku AFM byla navržena G. Biningem, Quatem a Gerberem v roce 1986 Je to metoda, která poskytuje atomární rozlišení a zvětšení až C. Hall et al./ Materials Science of Concrete VI AFM je široce používaná pro zobrazení, měření a manipulace v nanoměřítku

39 Mikroskopie atomární síly uspořádání AFM zařízení Detektor ohnutí je tvořen laserovou diodou, vytvářecí stopu konečné velikosti na špičce nosníku a od něj se odráží na světelný detektor, který je rozdělen na dvě citlivé části (duanty) před měřením se systém mechanicky vyváží tak, aby energie svazku dopadající do obou duantu byla stejná při měření se ohyb projeví posunem odrazu, takže signály v jednotlivých duantech už nebudou stejné a z jejich poměrů je možno určit vychýlení nosníku V současné době využívá kvadrantní detektor, který je rozdělen na čtyři části a umožňuje detekovat pohyb skvrny v dalším kolmém směru

40 Mikroskopie atomární síly Příroda atomárních sil Síly ohýbající nosník mohou být různé fyzikální podstaty, především se však uplatňuje: přitažlivá van der Waalsova síla mezi dvěma atomy - působí na větší vzdálenosti odpudivá síla plynoucí z Pauliho principu - působí na menší vzdálenosti Celková síla může být jak odpudivá, tak i přitažlivá v závislosti na vzdálenosti hrotu.

41 Mikroskopie atomární síly Režimy měření dotykový - vzdálenost hrotu a povrchu tak malá, že výsledná síla je odpudivá a snaží se ohýbat nosník od povrchu s konstantní výškou, kdy se udržuje určená hodnota výšky z 0 a měří se ohnutí nosníku; s konstantní silou, kdy se udržuje konstantní ohnutí nosníku a posunuje se vzorkem (či hrotem) ve směru osy z. bezdotykový - vzdálenost mezi hrotem a vzorkem udržována v strmé části vzestupné závislosti van der Waalsových sil poklepový - rozkmit je tak velký, že dochází k dotyku hrotu s povrchem

42 Mikroskopie atomární sily Výhody poskytuje 2D projekce (obraz) vzorku a 3D profil jeho povrchu nevyžaduje speciálních úprav vzorku obvykle nevyžaduje práce ve vakuu, což umožňuje analýzu biologických objektů včetně živých buněk Nevýhody relativně malá velikost obrazu (velikost skenovací plochy μm, max. výška 2 3 μm) kvalita obrazu je omezená zakřivením hrotu, což může vést k projevení artefaktů pomalé skenování může vést k teplotním efektům urychlení pomoci video AFM hysterezi piezoelektrického materiálu ovlivňuje AFM obraz využití ortogonálních skenerů

43 Příklady aplikace AFM studium nanostruktur uhlí TEM a HR-TEM obrázky AFM obrázek Q. Li et al./ultrasonics Sonochemistry 14 (2007) 225

44 Příklady aplikace AFM studium povrchu bakterii Deinoccocus radiodurans D.J Müller et al/ 178 (1996) Journal of Bacteriology, 3025.

45 Příklady aplikace AFM Agregace polymerních řetězců Jednotliví polymerní řetězce (0,4 nm) modré Dvou řetězcové shluky s tloušťkou 0,8 nm zelené Agregáte polymerních řetězců s tlouštkou vice než 2 nm. Roiter and Minko, 2005

46 Příklady aplikace AFM studium porfyrinových derivátů

47 Příklady aplikace AFM studium porfyrin-elektrodových filmů B.Duong et al./journal of Electroanalytical Chemistry 447 (1998)

48

49

50 Skenující tunelová mikroskopie Cantilevery (hroty) běžné

51

52

53

54

55

56 Modifikace povrchu

57

58

59

60 Příklady aplikace různých metod studium uhlíkových nanotrubiček HR-TEM obrázek STM obrázek Histogram počtu jednotlivých nanotrubiček podle poloměru Ramanova spektra jednostěnné uhlíkové nanotrubičky měřené při různých l ex E. D. Obraztsova et al./ NanoStructured Materials 11 (1999) 295

61 Ramanova spektroskopie v poznání mikrosvěta

62 Čandrašékhar Venkatau Raman Grigoryj Landsberg Kariamanickam Srinivasa Krishnan Leonid Mandelstam Ramanův jev Neelastický rozptyl světla, nebo Ramanův jev, dostal svoje jméno podle jednoho z objevitelů tohoto jevu, indického vědce sira C. V. Ramana (1928, spolu s K. S. Krishnanem a nezávislé Grigoryem Landsbergem a Leonidem Mandelstamem). Za tento objev získal sir C. V. Raman Nobelovou cenu z fyziky v 1930 roce. První Ramanův přistroj využíval sluneční světlo jako zdroj fotonu, barevné filtry jako monochromátor a lidské oko jako detektor. Tato technika se stala široce používanou po vynálezu laseru.

63 Ramanův jev Podstata Ramanova jevu - rozptyl záření - rozptýlený foton má odlišnou energii oproti dopadajícímu hν 0 hν R + hν 0 hν R -

64 1 2 3 Ramanův jev

65 1 hν 0 hν 0 výchozí stav stav koncový Rayleighův rozptyl

66 2 hν 0 hν R - hν S výchozí stav koncový stav Stokesův Ramanův rozptyl

67 3 hν 0 hν R + hν S výchozí stav koncový stav anti-stokesův Ramanův rozptyl

68 Vztah intenzity pásů - Možnost měření teploty vzorku

69 Ramanův jev

70 rezonanční Ramanův rozptyl hν 0 hν R - hν S výchozí stav koncový stav - excitace molekuly ve viditelné oblastí (nežádoucí fluorescence) - volba excitace vhodnou vlnovou délkou

71 laser molekula vzorku (do ozáření) vibrující molekula (po ozáření) Princip Ramanove spektroskopii získávaní spekter vzorek je excitován monochromatickým zářením v UV, vis nebo NIR oblastí elastický Rayleighův rozptyl neelastický Ramanův rozptyl holografická difrakční mřížka filtr spektrum detektor filtr odděluje intensivní Rayleighův rozptyl, který je v 10 8 krát větší než Ramanův rozptyl detekce signálu: photon-counting photomultiplier tube (PMT) silicon charge-coupled device (CCD) kamera

72 IČ a Ramanova spektroskopie srovnání vlastností IČ spektroskopie Ramanova spektroskopie Fyzikální děj absorbance, reflektance rozptyl Detekce změna dipolového momentu změna polarizovatelnosti C=C, CS, SS Intenzivní pásy OH, NH Úprava vzorku optimální tloušťka (transmisní) minimální kontakt povrchu (ATR) Komplikace absorbance skla, vody, CO 2 fluorescence Vzorky hlavně organické látky obvykle bez omezení Rozlišení - laterální µm 1-2 µm - konfokální žádné ca. 2.5 µm mapování a globální obraz Chemický obraz mapování Rozsah měření cm -1 (MIR) cm -1 (Stokes a anti-stokes)

73 IČ a Ramanův spektra polyamidu (Nylon 66) Q - normální souřadnice Pro výskyt pásů v Ramanově spektru je nutná nenulová změna polarizovatelnosti dané vazby ( α/ Q) Symetrické molekuly mnohem aktivnější v Ramanově spektru než asymetrické

74 Konfokální Ramanova mikrospektroskopie Rozptýlené světlo je sbíráno jen z tenké vrstvy O (konfokální oblasti) Světlo rozptýlené z vrstev nad (A) a pod (B) vrstvou O je fokusované mimo štěrbinu a nedostane se na detektor štěrbina objektiv

75 Konfokální Ramanova spektroskopie Lineární skenování Ramanových spekter Mapovaní 2D obrazu podle vybraného vlnočtu N. M. Sijtsema et al./applied Spectroscopy 52 (1998) 348

76 Ramanův spektrometr přímého obrazu zvolení vlnočtu pro mapovaní

77 Konfokální Ramanova spektroskopie studium filmu modifikované celulosy Série Ramanovych spekter měřených v různých hloubkách filmu (l ex = 633 nm, 100 objektiv) F. J. Weesner et al./application Note 50832

78 Konfokální Ramanova spektroskopie Výhody Možnost měření Ramanových spekter mikroskopických vzorků a struktur Vzorky mikroskopických řezů se analyzují přímo, ve vzduchu, v rozsáhlém teplotním a tlakovém rozmezí, vlhké a suché, a bez destrukce vzorku Spektroskopická informace je komplementární FT-IR mikroskopu Vysoká prostorová rozlišitelnost (1 mm) s konfokálním zařízením pro zkoumaní hloubky (2 mm) Možnost měření Ramanových spekter poskytuje informace o každé poloze na povrchu vzorku Integrální barevný video display a možnost přímého prohlížení pozice laseru Mapování povrchu vzorku Autofokusace na nehladkém povrchu poskytuje maximální signál a identifikuje vliv povrchového profilu

79 Aplikace Ramanovy mikrospektroskopie studium lokalizace texafyrinu v nádorové tkáni Mikroskopický obraz Ramanova spektra 2D mapa 3D mapa

80 Aplikace Ramanovy mikrospektroskopie studium lokalizace kurkuminu v kořenech Curcuma longa M. Baranska et al., Analyst 129 (2004)

81 Aplikace Ramanovy mikrospektroskopie b c a PCA of Raman spectra of normal, malignant, and benign breast tissues.a) Normal; b) Malignant; c)benign. Mean Raman spectra of breast tissues: (a) normal; (b) malignant; (c) benign. M. V. P. Chowdary at al. Biopolymers, Vol. 83, (2006)

82 Otázky 1. Popište princip zvětšení obrazu v optické mikroskopii. 2. Charakterizujte transmisní (TEM) a rastrovací (SEM) elektronovou mikroskopii. 3. Charakterizujte mikroskopii skenující sondou (SPM) a uveďte její výhody a nevýhody. 4. Charakterizujte skenující tunelovou mikroskopii (STM): tunelový jev, režimy měření a využití. 5. Charakterizujte mikroskopii atomární síly (AFM): původ atomárních sil, uspořádání AFM zařízení, režimy měření a využití. 6. Vysvětlete vznik Ramanova spektra, vysvětlete rozdíl mezi Stokesovými a anti-stokesovými liniemi v Ramanově spektru. 7. Vysvětlete rozdíl mezi normálním a rezonančním Ramanovým rozptylem. 8. Charakterizujte konfokální Ramanovu mikroskopii: uspořádaní konfokálního spektrometru, způsob vytváření obrazu a využití