informační magazín číslo

Transkript

1 informační magazín číslo CENA ARNOLDA BECKMANA VYHLÁŠENÍ VÍTĚZŮ MEMBRÁNOVÉ MOLEKULY KREVNÍCH DESTIČEK ŠTÍTNÁ ŽLÁZA A TĚHOTENSTVÍ NOVINKA NA TRHU DXH800

2 Jak se u nás probojovávala imunologie jako obor - výzkum, uplatnění a výhled do budoucnosti Rozhovor s významným českým imunologem, nositelem státního vyznamenání Prof. MUDr. Ivem Hánou, CSc. Pane profesore, je o Vás známo, že jste se významně podílel na prosazení imunologie jako oboru biologie a především klinické imunologie jako oboru medicíny u nás. Jistě to nebylo nic snadného Co všechno tomu předcházelo? Imunologie u nás pochopitelně nezačala existovat až po druhé světové válce, jak by se mohlo zdát při nahlédnutí do současných análů nebo kongresových sborníků. Poznatky, práce a výuka byly dříve skryty pod hlavičkami jiných, tehdy již uznaných medicínských oborů, především pod mikrobiologií (ještě dříve bakteriologií a patologií) a infektologií, ale dotýkaly se jí i jiné obory jako interna, pediatrie a další. Je třeba se zmínit, že již ve 30. letech vyšla u nás Kabelíkova Serologie jako předzvěst startujícího samostatného oboru. Ovšem vlastní rozkvět moderní imunologie musíme položit až do doby po druhé světové válce, kdy došlo ve světě k doslovné renesanci imunologického bádání a poznatků a vlastnímu vymezení tohoto oboru proti těm oborům medicíny a biologických věd, pod nimiž se tato vědecká sféra do té doby skrývala. Tento pokrok byl samozřejmě zachycen také u nás v Československu již od začátku 50. let vznikla v Praze centra základního výzkumu v tehdejší Československé akademii věd (ČSAV) po vedením Jaroslava Šterzla a Milana Haška. To ale ještě neznamenalo, že imunologie byla uznána jako samostatná vědní disciplína v medicíně a na vysokých školách. Existovala sice již zmíněná a ve světě uznávaná tzv. Pražská imunologická škola (v ČSAV), ale dopad do praxe na univerzitách a na práce v terénu nebyl zatím příliš patrný. Bylo nutno překonávat předsudky, někdy i určitou nechuť ke změnám, a tak nastávala fáze zahajování imunologických studií pomocí zapálených jedinců a celých skupin, především mladých studentů a vědců. Ve druhé polovině 50. let se začala vytvářet další centra výzkumu (např. Bratislava, Brno, Plzeň, Ústí nad Labem, Martin, Banská Bystrica, Hradec Králové, České Budějovice, Olomouc, Košice a další). Pozvolna se však objevovala také snaha aplikovat nové a často revoluční poznatky v medicínské (humánní a veterinární) praxi. Ve výzkumných ústavech se vytvořily celky nadšenců, kteří hltali nové údaje ze světové literatury, jejíž dostupnost však byla většinou omezena jen na komunistickou vládou fundované knihovny ve výzkumných ústavech, ČSAV a některých univerzitách, což pochopitelně práce a studie redukovalo jen na určité lokality. Velice omezená byla i možnost zúčastnit se vědeckých kongresů v zahraničí, která byla vyhrazena, zvláště v počátcích, prakticky jen pro členy komunistické strany, normálním vědeckým pracovníkům se to podařilo jako zcela výjimečný případ. Rozhodně velice významnou pomocí pro rozvoj imunologie bylo vytváření vědeckých společností, které v tehdejší době mezinárodní izolace, danou komunistickým režimem, umožňovaly přece jen určité šíření informací, přednášky. Později začaly úspěšně organizovat i zájezdy na vědecké kongresy do zahraničí, které se tak stávaly dostupnými i pro řadové členy. V Československu existovala dvě seskupení zájemců o obor věnující se imunologickým otázkám teorie i praxe. Jejich osud však nebyl identický. Jednou skupinou byla Česká alergologická společnost, později přejmenovaná na Československou společnost alergologie a klinické imunologie (ČSAKI), zabývající se převážně otázkami alergologické praxe bez výrazného zdůrazňování nejnovějších poznatků základního imunologického výzkumu. Tato společnost byla vládnoucími kruhy uznána a legalizována. Druhou skupinu tvořili zájemci o nejširší pojetí imunologie se všemi jejími odvětvími základního i aplikovaného výzkumu (včetně antiinfekční imunologie, alergologie, veterinární imunologie, imunopatologie, transplantační imunologie atd.). Tato skupina byla z politických důvodů po roce 1968 dlouho doslova proskribována, ačkoli měla výbornou základnu právě ve zmíněné a uznávané Pražské imunologické škole. I když její členstvo bylo v podstatě stále stejné a početné, prodělávalo sdružení martyrium, jak dosvědčují jeho měnící se názvy: 2 informační magazín číslo

3 Obsah Jak se u nás probojovávala imunologie jako obor výzkum, uplatnění a výhled do budoucnosti 2 Cena Arnolda Beckmana Vyhlášení vítězů 7 Cena Arnolda Beckmana 1. místo v kategorii Buněčná biologie a imunologie 8 Cena Arnolda Beckmana 1. místo v kategorii Genomika a genetika nukleových kyselin 9 Časopis vydává a distribuuje IMMUNOTECH a.s., Radiová 1, Praha 10 Časopis připravují Ing. Vanda Filová, PhD. Ing. Kateřina Kožaná Ing. Eva Králová Ing. Hana Krátká Mgr. Pavel Kružík RNDr. Helena Kurzweilová, CSc. Ing. Kateřina Lapišová RNDr. Běla Říčařová, CSc. Ing. Petr Suchan Mgr. Patrik Šaf RNDr. Jozef Smolka Do časopisu přispěli Prof. MUDr. Ivo Hána, CSc. - Rada vědeckých společností ČR RNDr. Běla Říčařová, CSc.. RNDr. Lubica Dráberová, CSc. - Ústav molekulární genetiky AV ČR MUDr. Martin Hřebíček - VFN a 1. LF UK Ing. Ladislav Kmoch, CSc. - VFN a 1. LF UK Mgr. Helena Skalníková, PhD. - Ústav živočišné fyziologie a genetiky AV ČR Ing. Eva Králová Ing. Roman Vlček Mgr. Pavel Kružík RNDr. Kristián Koubek, DrSc. - Ústav hematologie a krevní transfúze Ing. Drahomíra Springer - VFN a 1. LF UK RNDr. Zdeněk Veškrna - Nemocnice Znojmo Ing. Mgr. Tereza Tietze Ing. Kateřina Lapišová Prim. MUDr. Annamária Bratková - 1. Súkromná nemocnica Košice-Šaca PharmDr. Eva Žemberová - RIA laboratórium s.r.o. Ing. Petr Boudal Bc. Jozefína Bernátová Ing. Vanda Filová, PhD. MUDr. Jana Granátová - Fakultní Thomayerova nemocnice RNDr. Štěpán Tintěra Petr Jabůrek Ing. Hana Krátká Ing. Kateřina Kožaná Ivan Šarkan - autor křížovky Grafická podoba Nina Nováková Tiskárna REPRO servis s. r. o. Starochuchelská 15/195, Praha 5 Náklad čísla 1600 výtisků Cena Arnolda Beckmana 1. místo v kategorii Proteomika 11 Revoluční novinka v oblasti ph metrů 13 Pozvánka na akci DNA Analýza VI. 13 Nový počítač buněk a částic MULTISIZER TM 4 14 Cytometrická analýza 14 Nové výrobky Binding Site 15 Membránové molekuly krevních destiček 16 Poruchy funkce štítné žlázy v těhotenství 21 Ověření referenčního rozmezí FT4 při použití soupravy Access Free T4 firmy Beckman Coulter 23 Anemie 24 Vyšetrenie protilátok proti vnútornému faktoru pri pernicióznej anémii 24 UniCel DxH koncept nová éra v laboratorní hematologii 26 Predstavujeme ACL TOP 500 CTS od výrobcu Instrumentation Laboratory 27 Nová ultrasensitivní ELISA souprava na stanovení PAPP-A 30 Indikátorové proteiny v moči (3) hematurie 31 Obchodní útvar 38 Útvar CAS / LOGISTIKA 39 Setkání uživatelů RIA a imunochemických systémů Beckman Coulter 40 Pražská padesátka 41 Křížovka o ceny 42 Kde se můžeme setkat (leden červen 2009) 44 informační magazín číslo

4 Přípravná komise Československé společnosti imunologické, poté už Imunologická sekce Československé biologické společnosti ČSAV. Teprve v době politického tání došlo konečně k založení a uznání Československé imunologické společnosti (ČSIS) jako reprezentanta všech odvětví imunologie u nás. Vzpomínám, že jsem se jako vedoucí Subkomise lékařské imunologie tehdejší Československé společnosti mikrobiologické ČSAV stal v roce 1974 členem výboru Imunologické sekce. V této funkci jsem pokračoval i v ČSIS a ČIS nepřetržitě až do roku 2003, protože jsem v této činnosti viděl ohromný potenciál pro rozvoj oboru. Za výrazné pomoci pracovníků Imunologického oddělení Mikrobiologického ústavu ČSAV se pořádaly přednášky, instruktáže, kurzy a pracovní imunologické konference v různých místech republiky. První kongres ČSIS s několika stovkami nadšených účastníků zorganizoval v roce 1976 Jindra Lokaj v Brně. Byl to velký přínos. Následovaly kongresy na různých místech v Čechách, na Moravě a na Slovensku. Po revoluci se mi podařilo v roce 1994 zorganizovat 7. Kongres českých a slovenských imunologů (tak zněl oficiální název), poprvé v Praze, ve Svatoanežském klášteře. Akce byla velmi úspěšná také díky výrazné účasti imunologických špiček ze zahraničí. Kongresy českých a slovenských imunologů pokračovaly dále i po rozdělení ČSIS na Českou imunologickou společnost (ČIS) a Slovenskou imunologickou společnost (SIS) až do současné doby s jedinou změnou, a to že poslední z nich byly již organizovány společně s rovněž rozdělenou Českou a Slovenskou společností alergologie a klinické imunologie. Dochází tak pozitivně k užšímu propojení teorie a praxe, i když někdy alergologická problematika trochu disproporčně převažuje a opakuje již známá fakta. V otázce byl ovšem zmíněn proces vzniku imunologie jako oboru u nás. To je sice navazující, ale trochu jiná historie. Prosadit nový obor je vždy otázkou nejen jeho náplně, ale i vymezení vůči oborům stávajícím. To vyžaduje někdy značné úsilí, taktiku a v současné době, řekli bychom, lobování. Vytvořit obor fakticky je snazší než ho legalizovat nějakým výnosem či registrem. Fakticky obor jako takový již v ČSAV existoval a měl pevnou a kvalitní základnu ve velkém počtu pracovníků, ale prosadit ho jako lékařský nebo učební obor na vysokých školách nebylo snadné. Myslím, že zde hrálo roli několik faktorů, z nichž považuji za rozhodující získání zájmu o imunologii odboru protiepidemické péče Ministerstva zdravotnictví (z hlediska kontroly a podpory imunity populace), kde jsem tuto věc opakovaně projednával. Došlo k založení imunologických laboratoří na krajských hygienických stanicích a tam následně také ke zřízení ordinací a obor byl najednou na světě. Zároveň byl jmenován tzv. hlavní odborník pro obor. (Existenci hlavních odborníků ministerstva a na krajích pro medicínské obory dodnes považuji na přínosné a dnes nám určitě chybí.) Ruku v ruce s tím šlo i vymezení oboru jako lékařské specializace (a o něco později také k vymezení s trochu jiným názvem pro nelékaře). Po mém naléhání zřídil v roce 1984 prof. Macúch, ředitel tehdejšího Institutu pro další vzdělávání lékařů a farmaceutů (ILF), Kabinet lékařské imunologie pro vzdělávání a atestace z oboru, který se tak stal specializací. Byl to první útvar pro postgraduální vzdělávání v této sféře a já jsem byl jmenován jeho vedoucím. V oblasti imunologie jsem pak prosadil koncepci klinického oboru s nezbytným laboratorním zázemím, což znamená, že lékař pracující v ordinaci musel mít zažitou také laboratorní složku práce, včetně možných chyb metod a nákladů. Brzy nato byl Kabinet přeměněn na katedru. To se stalo faktickým startem pro následný vznik samostatných učebních programů a později také samostatných imunologických útvarů (kateder nebo ústavů apod.) na univerzitách, i když na některých z nich se v názvu instituce slovo imunologie už dříve vyskytovalo, jako např. v Praze Ústav pro lékařskou mikrobiologii a imunologii 1. LF UK, kde odvedl velkou práci Ctirad John. Později se vytvářely imunologické laboratoře nebo imunologické náplně práce jiných laboratoří (hlavně biochemie) v nemocnicích a postupně vznikaly také ambulance a oddělení. V současné době existuje imunologie prakticky na všech úrovních jako základní obor medicínského a obecně biologického vzdělávání jak na univerzitní, tak na postgraduální úrovni. Klinická imunologie jako aplikace imunologie v medicíně je klinický obor s nezbytným laboratorním zázemím. Je obecně uznávána vzdělanými kliniky jako nezbytné vzdělání pro pochopení základních pochodů v živém organizmu a pochopitelně zahrnuje všechny aplikace, včetně alergologie, která má nejširší uplatnění v terénní praxi. (U nás se po vzoru některých zahraničních názvů již řadu let užívá pro obor termín alergologie a klinická imunologie, který je stejně nesmyslný, jako kdyby se používal např. termín hepatologie a vnitřní lékařství.) Jste živoucím dokladem toho, že odpovídající kvalitní vzdělání je jistě nutný základ, ale pro kompetentní působení v oboru je nezbytné průběžné vzdělávání, které, má-li být účinné, potřebuje určitý systém a řád. Na co jste se především zaměřil v době svého působení jako ředitel tehdejšího Ústavu pro další vzdělávání lékařů a farmaceutů? Na tuto otázku jsem Vám už vlastně částečně dal odpověď v tom, co jsem říkal o prosazování oboru. Nicméně si myslím, že je na místě zmínit, že jsem svou práci ředitele ILF, kterému jsem dal nový statut a přejmenoval ho na Institut postgraduálního vzdělávání ve zdravotnictví (IPVZ) (vzdělávají a atestují se tam totiž i jiní vysokoškoláci než jen lékaři a farmaceuti), považoval za velmi důležitou a věnoval jí spoustu energie a času, protože průběžné vzdělávání je především ve zdravotnictví záležitostí základního významu, determinující kvalitu poskytované péče. Rozšiřoval jsem útvary o nově vznikající obory a podobory. V oblasti imunologie jsem pak prosadil koncepci klinického oboru s nezbytným laboratorním zázemím, což znamená, že lékař pracující v ordinaci musel mít zažitou také laboratorní složku práce, včetně znalosti možných chyb metod a nákladů, a lékař v laboratoři musel mít dostatečný přehled o klinice postižení imunitního systému, včetně vyšetření 4 informační magazín číslo

5 Prof. MUDr. Ivo Hána, CSc. (nar. 1928) je významný český vědec, lékař, pedagog. Jako první u nás byl jmenován profesorem imunologie a alergologie. Je stále aktivní, předsedá Radě vědeckých společností ČR, účastní se odborného života, kongresů, v ordinaci se věnuje pacientům s poruchami imunity. Po řadu let pracoval ve velmi náročných podmínkách v rozvojových zemích (v Indii, Etiopii, Íránu, Sýrii) jako expert Světové zdravotnické organizace (WHO). Je držitelem mnoha našich i zahraničních vědeckých ocenění. V loňském roce, kdy oslavil 80. narozeniny, mu byla prezidentem republiky udělena Medaile za zásluhy o stát v oblasti vědy. V odůvodnění bylo kromě jiného uvedeno: Je autorem rozsáhlého vědeckého díla, zasloužilým pedagogem a organizátorem vědeckého života. pacienta při atestaci. Vycházel jsem přitom nejen z objektivního posuzování oboru, ale především ze své praxe již jako student jsem pracoval na klinikách, poté jsem léta strávil v laboratořích v Československu a rok také v USA a v dalších letech jsem se kromě velké organizační práce věnoval ambulantní praxi v klinické imunologii, včetně alergologie. Začátkem 90. let, kdy jsem pracoval jako ředitel IPVZ, jsem nepřipustil, aby byla privatizována kolej IPVZ v Praze (měla z ní být akciová společnost, která by vydělávala na mladých špatně placených vysokoškolácích připravujících se na atestace). Jako následek mne tehdejší ministr zdravotnictví Rubáš (ODS), který tuto privatizaci favorizoval, odvolal. Jediné, co mi bylo vytknuto, bylo, že jsem si rok předtím dal udělat nestranný audit, který ukázal, že jsme hospodařili dobře! Litoval jsem, že jsem nemohl dále rozvíjet tuto práci, která mne upřímně těšila, protože jsme organizaci zvládali a měli úspěchy naši instituci nám zahraniční návštěvníci vysloveně záviděli. Dnes jsme svědky toho, jak současné Ministerstvo zdravotnictví tuto instituci demontuje způsobem, který považuji za skandální (např. zrušení rozsáhlé vědecké knihovny). V době totality bylo pro většinu vědeckých a hlavně mladých pracovníků obtížné získávat průběžný přehled o vývoji toho oboru ve světě bez internetu, ne vždy s dostatečným přístupem k vědeckým publikacím a s velmi omezenými možnostmi cestovat. Byl toto důvod, proč jste se rozhodl pro pořádání pracovních imunologických konferencí, pro něž se zažil název PIK? Vy jste, vážená paní doktorko, vlastně odpověď našla již ve své otázce. Je obecně známo, že se mi podařilo iniciovat a zorganizovat celkem 22 pracovních imunologických konferencí (PIK), které se konaly v rámci ČSIS a později ČIS na různých místech Československa a Česka a věnovaly se určitému vybranému tématu. První z nich se konala v Židlochovicích v roce 1975 a poslední v Rožnově v roce Cílem těchto malých sympozií, kterých se zúčastňovaly desítky mladých imunologů a také kliničtí pracovníci, bylo nahradit v době totality zcela omezené možnosti sdělování výsledků na kongresech a získávání nových poznatků, naučit se diskutovat v naprosto neformálním prostředí a navázat kontakty, jinak nesnadno dosažitelné. Ke všemu se navíc dařilo od určitého data odpřednášené práce také publikovat ve sbornících jako původní práce s literaturou. Po revoluci se v 90. letech postupně otevíraly dveře k setkáním i na mezinárodních fórech; narostl zájem nezbytného publikování výsledků v impaktovaných časopisech a diskusí v zahraničí, a to vše ukázalo, že PIKy, ve své době tak vyhledávané a ceněné pro své přátelské, poučné, ale i vysoce kritické a neformální prostředí, již svou původní, podle tehdejších možností nezastupitelnou funkci splnily, a bylo proto od jejich dalšího konání upuštěno. Nicméně vzpomínky na jejich jedinečnou atmosféru zůstávají. Rozvoj mnoha oborů je exponenciální, orientace v záplavě informací i možnosti sledovat obor v širším záběru jsou čím dál obtížnější. Někdy si přestáváme vzájemně rozumět i v příbuzných oborech. Domníváte se, že k tomu přispívá i to, jak se vyjadřujeme? Jak se díváte na někdy až nekritické (nebo možná pohodlné) přejímání výrazů především z angličtiny, přestože v češtině máme výstižné a zavedené výrazy? Lingvistika byla vždy tak trochu mým koníčkem. Mluvím a jsem schopen i myslet několika světovými jazyky, ale vždy mě fascinoval můj rodný jazyk čeština. Snad je na vině Karel Čapek se svou chválou rodné řeči nebo Pavel Eisner (Chrám i tvrz) a naši básníci (Seifert, Nezval), ale i moji rodiče, kterým vděčím za mnoho z toho, co ve mě je. Jako národ jsme měli v minulosti éru, kdy jsme čelili germanizaci naší řeči, a poté přišlo období rusismů. Dnes jsme svědky toho, že naše řeč je zraňována jednak chudobou a vulgarizací mediálního jazyka (jen málo novinářů svou řeč pěstuje), jednak naší leností překládat cizí termíny a vyhledávat jejich nejvýstižnější český ekvivalent a také určitou snahou být módní tím, že budu užívat především z angličtiny (nebo američtiny) přejímané a často ještě navíc zkomolené výrazy. Setkáváme se s tím bohužel často i ve vědě a ani imunologie není výjimkou. Myslím si, že v tomto vědním oboru jsem se vždy snažil o slušnou češtinu. Určitým vzorem a oporou mi byl Karel Nouza, který někdy až úporně hájil své české výrazy. Musí být naší snahou, abychom byli schopni se vždy dobře česky vyjadřovat. Na závěr si, vážený pane profesore, nemohu odpustit zeptat se Vás na to, jak vidíte budoucnost imunologie? Být haruspikem není ani snadné, ani vděčné. Přesto se Vaší otázce nevyhýbám. Při pohledu do minulosti jsem byli svědky různých etap, kdy byly někdy celé dekády věnovány preferenčně určitým tématům, která ovládala pole bádání. Zažili jsme např. éru imunoglobulínů, éru vrozené imunity nebo éru cytokinů. Tyto éry skončily, i když nepochybně přinesly spoustu důležitých poznatků. Dnes jsou to regulační buňky, které udávají směr. Nebudu se pouštět do odvážných předpovědí zabírajících celé rozsáhlé pole imunologie, zkusím se věnovat trochu těm oblastem, v nichž jsem se v posledních létech více pohyboval. Na poli imunomodulace, která se bytostně začala dotýkat praktického a širšího užití v klinice, nevidím, na rozdíl od řady perspektivních očekávání, velké informační magazín číslo

6 V transplantační imunologii při typizaci znaků HLA na úrovni tzv. high level resolution je doslova otázkou života a smrti nalézt maximální shodu mezi dárcem hematopoetických kmenových buněk z kostní dřeně nebo periferní krve a mezi příjemcem. možnosti a úspěchy. Jistě se najdou jiné a lepší imunosupresivní látky (farmaceutický průmysl má pro tento výzkum jistě dost silné ekonomické zázemí) a snad se po létech bádání dočkáme i vyhovujících vakcín proti malárii nebo HIV infekcím, ale látky působící selektivně na jednotlivé imunitní pochody (třeba stimulačně) budeme těžko hledat. K potlačení alergických reakcí určitě najdou produkční továrny nové generace léčiv a bude jistě snahou najít pro alergologickou imunoterapii (AIT) skutečně specificky působící látky na vymezené složky jednotlivých alergenů, jak nazýváme většinou velice komplexní alergizující látky. Tam všude vidím možnosti určitého pokroku, avšak v oblasti základních imunomodulačních zásahů do specifických složek imunitní odpovědi vidím velké obtíže, protože imunologická síť je nesmírně složitá, navzájem se ovlivňující na všech úrovních (jako jsou např. různá působení cytokinů), a to v daleko komplexnější formě, než tomu je např. v hormonálních funkcích. Čili pokroky je možné očekávat, ale těžko budeme svědky revolučních převratných úspěchů. V posledních dvaceti letech jsem se velmi věnoval transplantační imunologii. Ta za tu dobu učinila veliký vývoj i praktický rozvoj v humánní medicíně, kdy bylo za spolupráce především internistů a chirurgů dosaženo nevídaných úspěchů při transplantacích orgánů, ale i tkání. Zatímco na poli úspěšně a široce prováděné transplantace orgánů hrála značnou roli složka organizační (získávání orgánů), kdy již klasická typizace znaků HLA dárce a příjemce na buněčné úrovni a následná aplikace imunosupresiv zajišťovala úspěch, došlo na poli transplantace kostní dřeně, tj. hematopoetických kmenových buněk, k ohromnému pokroku v oblasti zcela zásadní typizace znaků HLA molekulárními metodikami (tzv. high level resolution), vedoucí k rozvinutí nových laboratorních postupů a poznání nových antigenů, jejich splitů a závislostí. Zde je dosažení maximální shody mezi dárcem a příjemcem doslova otázkou života a smrti, neboť hematopoetické kmenové buňky z kostní dřeně nebo z periferní krve dárce mají kapacitu při větších rozdílech v HLA znacích snadno svého příjemce zahubit. Zde není možnost retransplantace. Na našem imunologickém pracovišti v IKEM v Praze se nám za vedení Evy Ivaškové podařilo tyto metodiky úspěšně zvládat. Dovolte, abych se při této příležitosti zmínil ocenění, jehož se našemu týmu dostalo pozváním z USA, abychom na výročním kongresu NMDP (National Marrow Donor Program) v Minneapolis realizovali před velkým publikem setkání dvou našich českých příjemců hematopoetických kmenových buněk z kostní dřeně od amerických dárců (šlo o děti vyléčené z leukémie). Bylo to na těchto kongresech první pozvání země mimo USA! (Dárcovství kostní dřeně je anonymní a setkání dárců s příjemcem se uskutečňuje jen při zvláštních příležitostech.) Byli jsme oceněni obrovským aplausem v sále naplněném zhruba 600 specialisty na transplantace kostní dřeně a transplantační imunologii z celého světa. A to mne uvádí do oblasti vlastního odhadu, že v budoucnosti budou kmenové buňky hrát stále stoupající úlohu nejen v oblasti transplantace krvetvorných tkání spojených s transplantační imunologií, ale v daleko širších souvislostech, nepochybně také ve sféře základních imunitních mechanismů. Na loňském kombinovaném kongresu českých a slovenských imunologů s mezinárodní účastí v Praze jsem zdůraznil, že bylo již dávno uznáno jako neplatné dřívější dogma, že kmenové buňky jsou predeterminovány jen k určitému, již nezměnitelnému vývoji, jako tomu je třeba u krvetvorných kmenových buněk kostní dřeně. V posledních letech bylo nezvratně dokázáno, že mezi kmenovými buňkami, které se nacházejí v různých embryonálních tkáních, existují základní formy, které jsou schopné vytvořit nejrůznější tkáně, a to zcela odlišné od tkání, z nichž byly izolovány, jsou tedy pluripotentní. Počáteční studie nacházely tyto kmenové buňky prakticky jen v různých tkáních embryonálních a později fetálních, což výrazně limitovalo jejich použití a vytvářelo zároveň půdu pro závažné etické i legislativní problémy pro použití v humánní medicíně. Studie z posledních let však vedly k dalším překvapivým nálezům, že je totiž tyto pluripotentní kmenové buňky možné najít prakticky ve všech tkáních těla, včetně tkání centrálního nervového systému, a to i u dospělých jedinců, což rovněž poráží dřívější dogmata. Pro tyto buňky se ujal název (trochu matoucí) dospělé kmenové buňky ( adult stem cells ) a v posledních letech je jim věnována ohromná pozornost. Jednak je možné izolovat tyto buňky třeba z tukové nebo svalové tkáně, pomnožit je (v tom zatím tkví určité technické úskalí), aniž ztratí svou pluripotencionalitu, a např. po vstřiknutí do srdce pacienta docílit reparace infarktem poškozeného myokardu nebo reparace jater či poškozené míchy. Přitom existuje možnost použít tyto kmenové buňky od samotného nemocného a odpadne tak nutnost typizace HLA a obav ze zhoubné reakce štěpu proti hostiteli. Navíc, což je krajně zajímavé, se ukázalo, že pluripotentní kmenové buňky jsou schopny významně ovlivňovat funkce buněk a složek imunitního systému, určitým způsobem je modifikovat. To jsou naprosto nové poznatky. Nestojíme tedy dnes na prahu nových revolučních objevů a snad i aplikací, které by možná mohly ovlivnit např. imunodeficience, či stimulovat nebo suprimovat imunitu nebo vyřešit některá těžká alergická postižení? Je to určitě běh na dlouhou trať. Budoucnost nám ukáže, zda se úvaha o možných dalších revolučních objevech v této oblasti kmenových buněk s dopady na imunologii (nejen transplantační, a s výhledem nejenom na poznatky základního výzkumu, ale i na praktické využití) ukáže platnou. Jménem našich čtenářů, redakce i jménem svým Vám, pane profesore, upřímně děkuji za rozhovor. PROF. MUDR. IVO HÁNA, CSC. RADA VĚDECKÝCH SPOLEČNOSTÍ ČR IVOHANA@SEZNAM.CZ BĚLA ŘÍČAŘOVÁ BRICAROVA@BECKMAN.COM 6 informační magazín číslo

7 Cena Arnolda Beckmana vyhlášení vítězů V roce 2008 byl, stejně jako před dvěma lety, společně s Českou společností pro biochemii a molekulární biologii uspořádán 2. ročník Ceny Arnolda Beckmana. outěžící své práce přihlašovali do tří kategorií - Buněčná biologie a imunologie, Genomika a genetika nukleových kyselin, Proteomika. Akce se shledala s velkým zájmem, takže to ani tentokrát neměli odborní hodnotitelé v čele s předsedou ČSBMB profesorem Václavem Pačesem snadné. Prací se sešlo více než padesát. Výhercům byla cena slavnostně předána na XXI. biochemickém sjezdu České společnosti pro biochemii a molekulární biologii a Slovenské spoločnosti pre biochémiu a molekulárnu biológiu, který se konal v září v Českých Budějovicích. Hlavní ocenění Kč a možnost čerpat 50 % slevu na jakýkoli analyzátor z produkce koncernu Beckman Coulter získaly v jednotlivých kategoriích tyto práce. Buněčná biologie a imunologie RNDr. Lubica Dráberová, CSc. Ústav molekulární genetiky AV ČR Za práci: Regulation of Ca2 + signaling in mast cells by tyrosine-phosphorylated and unphosphorylated non-t cell activation linker. J. Immunol. 179, Genomika a genetika nukleových kyselin MUDr. Martin Hřebíček Ústav dědičných a metabolických poruch 1.LF UK Za práci: Mutations in TMEM76* Cause Mucopolysaccharidosis IIIC (Sanfilippo C Syndrome) Am. J. Hum. Genet. 2006;79: Proteomika Mgr. Helena Skalníková, PhD. Ústav živočišné fyziologie a genetiky AV, Liběchov Za práci: A proteomic approach to studying the differentiation of neural stem cells Proteomics 2007, 7, BLAHOPŘEJEME VÍTĚZŮM, DĚKUJEME VŠEM SOUTĚŽÍCÍM A TĚŠÍME NA VAŠE PŘÍSPĚVKY DO SOUTĚŽE O CENU ARNOLDA BECKMANA V ROČNÍKU informační magazín číslo

8 Cena Arnolda Beckmana 1. místo v kategorii Buněčná biologie a imunologie za práci: Regulation of Ca2 + signaling in mast cells by tyrosine-phosphorylated and unphosphorylated non-t cell activation linker AUTOŘI: Lubica Dráberová, Gouse Mohiddin Shaik, Petra Volná, Petr Heneberg, Magda Tůmová, Pavel Lebduška, Jan Korb a Petr Dráber Laboratoř signální transdukce, Ústav molekulární genetiky AV ČR, v.v.i., Vídeňská 1083, Praha 4-Krč Práce se zabývá molekulárními mechanismy aktivace žírných buněk. Tyto buňky jsou důležitou součástí imunitního systému, kde slouží k obraně organismu před parazity, bakteriemi a toxiny a podílí se na zánětlivých procesech. Žírné buňky jsou klíčové při tak závažných onemocněních, jakými jsou alergie a astma. Vazba antigenu (alergenu) na membránový receptor vyvolává řadu biochemických dějů, které nakonec vyústí v uvolnění obsahu sekrečních granul, obsahujících řadu farmakologicky aktivních látek, jakými jsou histamin a proteázy. Molekulární mechanismy aktivace žírných buněk nejsou ještě stále úplně objasněné. Nedávno jsme na našem ústavu objevili nový protein buněčných membrán žírných buněk. Zjistili jsme, že tento protein, označený NTAL (non T cell activation linker), je regulátor Dvojí regulační funkce adaptorového proteinu NTAL při aktivaci žírných buněk. V časných stadiích buněčné aktivace (fáze I) se multivalentní antigen (Ag) naváže na imunoglobulin E (IgE), který je zakotven na IgE imunoreceptoru (IR). Tím dojde k agregaci a následné fosforylaci jak tohoto receptoru, tak i dalších signálních molekul, včetně adaptorů NTAL (N) a LAT (L). V přítomnosti NTAL dochází k částečnému útlumu aktivační odpovědi z důvodu menší fosforylace LAT (soutěž o substrát). LAT je důležitý pro aktivaci fosfolipázy C (PLC), která svou aktivitou vede k produkci inositolu 1,4,5 trifosfátu (IP3) a následnému uvolnění vápníku z endoplazmatického retikula (ER). Uvolněný vápník pak ve fázi II způsobí otevření vápenatých kanálů SOC (store operated channels) na plazmatické membráně (PM) a prostup vápníku do buňky. Tento proces je však inhibován u buněk, které postrádají NTAL. buněčné aktivace. Předkládaná práce se zabývala možnými mechanismy této regulace. Pomocí genetických metod jsme hladinu této molekuly buď zvýšili, nebo snížili a srovnávali aktivační pochody u takto modifikovaných buněk. Zjistili jsme, že v časných fázích buněčné aktivace se NTAL uplatňuje jako negativní regulátor aktivace; v přítomnosti NTAL dochází k snížené fosforylaci jiné důležité adaptorové molekuly LAT, která se zprostředkovaně podílí na přenosu vápníku do buněk. V pozdních fázích aktivace funguje NTAL jako pozitivní regulátor transportu vápenatých iontů, které jsou důležité pro finální fázi buněčné aktivace - uvolnění sekrečních komponent (viz. přiložené schéma). RNDR. LUBICA DRÁBEROVÁ, CSC. LABORATOŘ SIGNÁLNÍ TRANSDUKCE, ÚSTAV MOLEKULÁRNÍ GENETIKY AV ČR, V.V.I., VÍDEŇSKÁ 1083, PRAHA 4 KRČ DRABERLU@IMG.CAS.CZ 8 informační magazín číslo

9 Cena Arnolda Beckmana 1. místo v kategorii Genomika a genetika nukleových kyselin za práci: Mutations in TMEM76* Cause Mucopolysaccharidosis IIIC (Sanfilippo C Syndrome) Gen pro mukopolysacharidosu III C Lysosomální choroby jsou skupina klinicky různorodých dědičných onemocnění, jimž je společné hromadění ( střádání ) makromolekulárního materiálu v lysosomech uvnitř buňky. Většina z nich je způsobena absencí aktivity některé z lysosomálních hydroláz v důsledku mutací v genech, které ji kódují. Deficit hydrolázy určuje charakter střádání deficit enzymu katalyzujícího krok při odbourávání glykolipidů, řekněme glukosylceramidasy, vede k hromadění glukosylceramidu jako hlavní střádané látky v lysosomech. Nejběžnějšími jsou lysosomální onemocnění postihující katabolismus lipidů a mukopolysacharidů (glykosaminoglykanů): lipidosy a mukopolysacharidosy. Od šedesátých let bylo popsáno zhruba 40 enzymových deficitů, které vedou k lidským onemocněním a do roku 2006 byly postupně nalezeny geny, které příslušné enzymy kodují. Výjimkou byl enzym chybějící u jednoho typu mukopolysacharidosy typu III Sanfilippovy choroby typu C. Tento syndrom má své jméno podle amerického pediatra Sylvestera Sanfilipa, který jej se spolupracovníky popsal v roce 1963 [1]. Všem typům Sanfillipova syndromu (A, B, C, D) je společná porucha lysosomálního odbourávání glykosaminoglykanu heparansulfátu, i když jednotlivé typy jsou způsobeny deficity různých enzymů. Klinicky mezi jednotlivými typy nejsou podstatné rozdíly. Onemocnění má pomalu postupující průběh. Relativně mírné tělesné postižení (malé zvětšení jater a sleziny, hrubé rysy obličeje, postižení kostí, hrubé vlasy aj.) kontrastuje s těžkým postižením nervového systému. Děti s MPS IIIC se po narození nějakou dobu vyvíjejí normálně, po měsících nebo několika málo letech po narození se projeví vývojové opoždění. Mezi druhým a šestým rokem začínají být děti s MPS IIIC výrazně hyperaktivní, někdy až agresivní a současně se projeví porucha spánku, díky které děti spí jen několik hodin denně, třeba jen tři nebo čtyři. V dalším stadiu dítě postupně začne ztrácet nabyté schopnosti a dovednosti. Zhoršuje se mluvení, současně se zhoršuje schopnost porozumět řeči. Zhoršuje se také chůze a postupně vede k upoutání pacienta na lůžko a k používání kolečkového křesla. V důsledku postupujícího postižení mozku jsou svaly končetin spastické. Později se objevují další komplikace. Mohou se objevit křeče, ve spánku bývají běžné pauzy v dýchání (apnoické pauzy). Některé děti začnou mít potíže s polykáním a musí být krmeny sondou. Pacienti umírají obvykle mezi rokem věku. Léčba je pouze symptomatická, není známa žádná terapie, která by zvrátila nepříznivý průběh nemoci. U typu C chybí aktivita acetyl koenzym A: glukosaminid N-acetyl transferasy (N-acetyltransferasy). Tento enzym není hydrolasa, naopak katalyzuje jedinou syntetickou reakci v lysosomu acetylaci terminálních glukosaminových zbytků na oligosacharidech vzniklých přechozím enzymatickým štěpením heparansulfátu. Acetylace je zapotřebí pro další krok odštěpení N-acetylglukosaminu alfa-n-acetylglukosaminidasou. Reakci katalyzovanou N-acetyltransferasou objasnili v osmdesátých letech minulého století Karen Bame a Leonard Rome [2]. Jejich model předpokládá acetylaci enzymové bílkoviny na cytosolární straně lysosomální membrány zdrojem acetylu je acetyl koenzym A, translokaci acetylového zbytku do nitra lysosomu a jeho přenos na glukosaminový zbytek uvnitř lysosomu. N-acetyltransferasa je extrémně hydrofobní membránový protein a díky jeho nestabilitě se doposud podařila pouze parciální purifikace aktivity [3]. Nebylo tedy možné ze sekvence purifikované enzymové bílkoviny určit parciální sekvenci transkriptu a na jejím základě identifikovat gen. Skupina Alexeje Psezhetského z Montréalu se pokusila identifikovat gen pomocí genové vazby v několika desítkách rodin. Onemocnění mapovali jako autosomálně recesivní vlohu. Podařilo se jim zjistit, že gen se nachází v pericentromerické oblasti na chromozomu 8 [4], ale přes několikaleté úsilí se jim informační magazín číslo

10 Z biochemických studií jsme věděli, že N-acetyltransferáza je extrémně hydrofobní membránový protein, bylo tedy možné očekávat, že protein kodovaný genem bude mnohočetné predikované transmembránové domény. nepodařilo jej identifikovat. Nepodařilo se to ani sofistikovanými proteomickými postupy založenými na analýze acetylovaných proteinů z lysosomální membrány [5]. Naše pracoviště (Ústav dědičných metabolických poruch (ÚDMP) Všeobecné fakultní nemocnice a 1. lékařské fakulty UK) se zabývá diagnostikou a péčí o pacienty s dědičnými metabolickými onemocněními (v těsné spolupráci s Klinikou dětského a dorostového lékařství VFN). Sledovali jsme čtyři rodiny s MPS IIIC. Z diagnostické práce jsme věděli, že stanovení aktivity N- acetyltransferázy dovede nejen zcela spolehlivě určit pacienty, ale i poměrně velmi spolehlivě odlišit přenašeče od zdravých homozygotů a rozhodli jsme se toho využít při mapování MPS IIIC. Lidé přenášející mutaci mají aktivity zhruba poloviční oproti kontrolním osobám. Onemocnění jsme mapovali pomocí genové vazby na základě výsledků enzymového vyšetření jako kodominantní vlohu, nikoli jako autosomálně recesivní. Díky tomu byl pro mapování postačující i malý počet čtyř rodin. Enzymovou aktivitu jsme vyšetřili u všech dostupných členů čtyř českých rodin s MPS IIIC a na základě aktivity jsme je klasifikovali jako přenašeče, zdravé homozygoty nebo sporné. U všech jsme vyšetřili polymorfní markery v pericentomerické oblasti chromosomu 8 a jejich vazbu s vlohou pro onemocnění, tak jak jsme ji vyšetřili pomocí enzymového stanovení. Dosáhli jsme maximálního lod skore 6.5 a kandidátní oblast jsme zúžili na úsek obsahující 32 známých nebo predikovaných genů mezi markery D8S1115 a D8S1831. Úsek bohužel obsahoval i v podstatě neznámou oblast centromery. Gen jsme v kandidátní oblasti hledali dvěma metodami. První bylo hledání kandidáního genu podle známých vlastností genového produktu - N-acetyltransferasy. Z biochemických studií jsme věděli, že N-acetyltransferáza je extrémně hydrofobní membránový protein, bylo tedy možné očekávat, že protein kodovaný genem bude mnohočetné predikované transmembránové domény. Z 32 genů v kandidátní oblasti pouze jeden obsahoval více než čtyři transmembránové domény, predikovaný gen označovaný jako TMEM76. Druhá metoda hledání genu využívala analýzu genové exprese a byla založena na předpokladu, že u řady mutantních alel je množství transkriptu snížené. Pomocí DNA čipů, které jsme si připravili, jsme vyšetřili expresi oněch 31 genů a hledali jsme takové geny, jejichž exprese byla významně nižší u pacientů s MPS IIIC než u kontrolních osob. Po statistické analýze výsledků vyšel jako positivní opět pouze TMEM76. Osekvenovali jsme gen u pacientů s MPS IIIC a nalezli jsme mutace. Mutace v rodinách plně segregovaly se sníženými aktivitami N-acetyltransferasy. To byl přesvědčivý výsledek a byli jsme si jisti, že máme správný gen. Dalšími analýzami jsme ověřili strukturu genu a jeho vlastnosti. V závěru jsme spojili úsilí s konkurenční skupinou Dr. Alexeje Psezhetského z Montrealu, která gen doposud neúspěšně hledala. To nám umožnilo publikovat výsledky vyšetření mnohem většího počtu pacientů, kteří měli mutace v TMEM76. Skupina Dr. Psezhetského biochemicky prokázala, že TMEM76 skutečně kóduje N-acetyltransferasu. Výsledky jsme společně uveřejnili (6). Pro hledání genu byla nezbytná pomoc rodin s MPS IIIC, které se nám plně dostalo. Odběry krve u desítek osob znamenaly pro mnohé nepohodlí a nadbytečné cestování. Jsme všem zúčastněným velmi zavázáni a zvlášť musíme poděkovat za podporu české Společnosti pro mukopolysacharidosu ( a jejímu předsedovi Dr. Janu Michalíkovi. [1] Sanfilippo, S. J.; Podosin, R.; Langer, L. O., Jr.; Good, R. A. : Mental retardation associated with acid mucopolysacchariduria (heparitin sulfate type). J. Pediat. 63: , [2] Bame KJ, Rome LH: Acetyl coenzyme A: alphaglucosaminide N-acetyltransferase. Evidence for a transmembrane acetylation mechanism. J Biol Chem Sep 15;260(20): [3] Freeman C, Clements PR, Hopwood JJ: Acetyl CoA:alpha-glucosaminide N-acetyl transferase: partial purification from human liver. Biochem Int May;6(5): [4] Ausseil J, Loredo-Osti JC, Verner A, Darmond- Zwaig C, Maire I, Poorthuis B, van Diggelen OP, Hudson TJ, Fujiwara TM, Morgan K, Pshezhetsky AV: Localisation of a gene for mucopolysaccharidosis IIIC to the pericentromeric region of chromosome 8. J Med Genet Dec;41(12): [5] Ausseil J, Landry K, Seyrantepe V, Trudel S, Mazur A, Lapointe F, Pshezhetsky AV: An acetylated 120-kDa lysosomal transmembrane protein is absent from mucopolysaccharidosis IIIC fibroblasts: a candidate molecule for MPS IIIC. Mol Genet Metab Jan;87(1): [6] Hrebicek M, Mrazova L, Seyrantepe V, Durand S, Roslin NM, Noskova L, Hartmannova H, Ivanek R, Cizkova A, Poupetova H, Sikora J, Urinovska J, Stranecky V, Zeman J, Lepage P, Roquis D, Verner A, Ausseil J, Beesley CE, Maire I, Poorthuis BJ, van de Kamp J, van Diggelen OP, Wevers RA, Hudson TJ, Fujiwara TM, Majewski J, Morgan K, Kmoch S, Pshezhetsky AV: Mutations in TMEM76 Cause Mucopolysaccharidosis IIIC (Sanfilippo C Syndrome). Am J Hum Genet Nov;79(5): MUDR. MARTIN HŘEBÍČEK ING. STANISLAV KMOCH, CSC. ÚSTAV DĚDIČNÝCH METABOLICKÝCH PORUCH, VFN A 1. LF UK, KE KARLOVU 2D, PRAHA 1 MARTIN.HREBICEK@LF1.CUNI.CZ STANISLAV.KMOCH@LF1.CUNI.CZ 10 informační magazín číslo

11 Cena Arnolda Beckmana 1. místo v kategorii Proteomika za práci: A proteomic approach to studying the differentiation of neural stem cells Proteomika nervových kmenových buněk V polovině 90. let minulého století bylo prokázáno, že v některých oblastech centrálního nervového systému (CNS) mohou vznikat nové neurony a že se tyto neurony diferencují z nervových kmenových buněk. Nervové kmenové buňky (NKB) jsou nediferencované buňky podobné buňkám, ze kterých během embryonálního a fetálního vývoje vzniká mozek a mícha. Dalším výzkumem bylo zjištěno, že z NKB vznikají nejen neurony, ale i podpůrné gliové buňky (oligodendrocyty a astrocyty). Tyto poznatky vzbudily velký zájem o NKB pro jejich možné aplikace při léčbě některých onemocnění CNS. V dnešní době se předpokládá, že přenos NKB do postiženého CNS nemusí nutně vést pouze k diferenciaci NKB do neuronů, ale že přenesené buňky jsou schopné produkovat růstové faktory, hormony a další signální molekuly, které mohou aktivovat pacientovy endogenní kmenové buňky a opravné mechanismy [1]. Obrovský zájem o tvorbu neuronů z NKB je doprovázen intenzivními in vitro kultivačními a diferenciačními experimenty a zároveň transplantačními pokusy s cílem najít vhodné buňky pro léčbu poškození nebo degenerací CNS, jako např. míšních lézí, mozkové mrtvice, Parkinsonovy, Alzheimerovy a Huntingtonovy choroby nebo amyotrofické laterální sklerózy. Nervové kmenové buňky a prekurzory neuronů je možné v dnešní době izolovat nejen z fetálního nebo dospělého centrálního nervového systému, ale lze je také získat cílenou diferenciací embryonálních kmenových buněk. Pro pochopení mechanismů řídících sebeobnovu a diferenciaci se NKB staly objektem molekulárního profilování, ať už na úrovni genové exprese nebo proteinů. Transkriptomové studie, např. pomocí cdna mikročipů, umožňují charakterizaci exprese mnoha tisíců genů v jednom experimentu. Díky amplifikaci pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) jsou tyto metody velice citlivé a lze sledovat i mrna přítomné v buňkách ve velmi malém počtu kopií za použití malého výchozího množství biologického materiálu. I když je nasnadě, že hladina mrna určuje množství následně syntetizovaného proteinu, řada dynamicky regulovaných procesů (např. stabilita konkrétní mrna, různé sestřihové varianty mrna, účinnost translace a stabilita proteinu) ve výsledku často vede k nízké korelaci mezi expresí genu a hladinou proteinu. Např. při studiu vlivu transfekce a exprese genu pro GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor) do linie striatálních nervových progenitorů byla mezi GDNFtransfekovanou a výchozí netransfekovanou linií pozorována změna hladiny 43 proteinů, ale mikročipová analýza genové exprese odhalila změnu pouze v jednom případě [2]. Je nutné si uvědomit, že proteiny podléhají různým posttranslačním úpravám (např. proteolytickému štěpení, fosforylacím, glykosylacím, metylacím, acetylacím aj.), které jsou klíčové pro aktivitu proteinu, jeho interakci s dalšími molekulami i subcelulární lokalizaci. Příkladem mohou být receptory pro steroidní hormony, které pro svou aktivitu vyžadují konformační změnu vyvolanou vazbou ligandu, dimerizaci, fosforylaci a přesun z cytoplasmy do jádra buňky, kde spouští transkripci genů, na jejichž responzivní element se vážou. Posttranslační modifikace proteinů jsou pouze omezeně predikovatelné z genové sekvence, a proto je nutné sledovat nejen expresi mrna, ale také studovat kódované proteiny. Analýza proliferace a diferenciace nervových kmenových buněk na úrovni proteinů je velmi obtížná díky variabilním fyzikálně-chemickým vlastnostem proteinů a vysokým požadavkům na vstupní biologický materiál. Pro analýzu proteomu jsou obvykle potřeba miliony až desítky milionů buněk. K separaci proteinů se nejčastěji používá dvojrozměrná gelová elektroforéza, při které jsou proteiny děleny v gelu nejprve dle svého izoelektrického bodu a následně podle molekulové hmotnosti. Po obarvení lze proteiny z gelu vyříznout, naštěpit proteázou na menší peptidy a identifikovat hmotnostní spektrometrií. Nevýhodou 2D elektroforézy je obtížnost analýzy extrémně malých/velkých proteinů, proteinů s extrémním izoelektrickým bodem a zejména proteinů, které jsou v buňkách zastoupeny jen v malém počtu molekul (např. signální proteiny). Mezi nové metody pro analýzu proteomu patří separace peptidů pomocí kapalinové chromatografie s přímým Obr. 1 Mikroskopická fotografie nervových kmenových buněk kultivovaných in vitro ve formě neurosfér (A) a buněk po 5 dnech diferenciace v přítomnosti kyseliny retinové; (B) fázový kontrast. Imunocytochemická detekce přítomnosti základních typů diferencovaných nervových buněk: (C) barvení neuronů na antigen βiii-tubulin, zeleně; jádra buněk jsou barvená červeně; (D) barvení astrocytů na antigen GFAP, červeně; informační jádra buněk magazín jsou barvená číslo modře; 11 (E) - barvení 2009 oligodendrocytů na antigen CN- Pasa, zeleně; jádra buněk jsou barvená červeně. 11

12 napojením na hmotnostní spektrometr. Zde lze využít i izotopová značení pro kvantifikaci peptidu při hmotnostní spektrometrii, např. itraq (isobaric tags for absolute and relative quantification). Nevýhodou analýzy na úrovni peptidů je ztráta informace o původním proteinu (molekulová hmotnost nebo náboj proteinu), které jsou ovlivněny právě posttranslačními modifikacemi. Pro detekci proteinů přítomných v buňkách v nižších koncentracích je výhodné použít specifické protilátky, např. techniky imunoblotu, imunocytochemie nebo protilátkových mikročipů. Přehled dosavadních výsledků proteomových studií nervových kmenových buněk je shrnutý v Skalníková aj [3]. V naší práci [4] oceněné cenou Arnolda Beckmana jsme použili 2D elektroforézu a hmotnostní spektrometrii k charakterizaci prasečích fetálních nervových kmenových buněk. Narozdíl od hlodavců je prase anatomicky a fyziologicky velmi blízké člověku a je tak výhodným zvířecím modelem pro biomedicínský výzkum [5]. Nejprve jsme zmapovali proteiny přítomné v nervových kmenových buňkách a poté sledovali rozdíly v hladinách proteinů mezi kmenovými a diferencovanými buňkami. V kmenových buňkách byly nejčastěji identifikovány proteiny účastnící se metabolismu a úprav RNA a proteinů včetně chaperonů, dále následovaly proteiny účastnící se buněčné organizace (cytoskelet a anexiny). Během diferenciace nervových kmenových buněk docházelo ke snižování hladin DNA vazebných proteinů paraspeckle protein 1 alpha a Far upstream element binding protein 1 a zvýšení hladin proteinů účastnících se úprav a transportu mrna (heterogenních jaderných ribonukleoproteinů hnrnp A1, hnrnp A2/B1, hnrnp H). Dále docházelo ke změnám hladin proteinů účastnících se odpovědí na stres, skladování železa a regulace redox potenciálu a porinu voltage-dependent anion channel 2. Zvýšení hladin hnrnp A1, hnrnp A2/B1 a α-b crystalinu během diferenciace jsme potvrdili imunoblotem a lokalizaci těchto proteinů u jednotlivých typů diferencovaných buněk jsme studovali imunocytochemickým barvením. Přítomnost faktorů sestřihu premrna (splicing factors) byla již dříve pozorována v dendritech neuronů [6], kde se mohou spolupodílet na různorodosti postsynaptické odpovědi. Studie proteomu fetálních NKB prasete byla doplněna i analýzou změn signálních proteinů a jejich fosforylací během diferenciace za použití protilátkového mikročipu [7]. Obr. 2 Separace proteinů nervových kmenových buněk pomocí dvojrozměrné gelové elektroforézy. Proteiny byly separovány izoelektrickou fokusací v gradientu ph 3-10 a následně SDS elektroforézou v 12% polyakrylamidovém gelu. Výřezy ukazují zvětšenou oblast gelu, kde byly detekovány změny v hladinách heterogenních jaderných ribonukleoproteinů hnrnp A1 (modře) a hnrnp A2/B1 (červeně). Horní výřez představuje gel připravený z nervových kmenových buněk a spodní z diferencovaných 12 informační nervových buněk. magazín číslo Poznatky získané z proteomových analýz představují prvotní náhled do biologie NKB. Další validace výsledků a zejména funkční studie budou nutné pro odhalení konkrétní role proteinů v diferenciaci NKB. Teprve spojení poznatků z kultivačních, transplantačních, transkriptomových, proteomových a dalších studií povede k úspěšným a v prvé řadě bezpečným protokolům pro použití nervových kmenových buněk v transplantační medicíně. Poděkování Děkuji kolegům z Ústavu živočišné fyziologie a genetiky AV ČR Mgr. Petru Vodičkovi, Ph.D., RNDr. Haně Kovářové, CSc. a prof. Janu Motlíkovi, DrSc. za výbornou spolupráci a dále Ing. Petru Haladovi, Ph.D. z Mikrobiologického ústavu AV ČR, v.v.i., a Mgr. Pavlu Řehulkovi, Ph.D. z Ústavu analytické chemie AV ČR, v.v.i. za identifikace proteinů. Práce vznikla za finanční podpory výzkumného záměru ÚŽFG AV0Z a Centra buněčné terapie a tkáňových náhrad 1M0538. MGR. HELENA SKALNÍKOVÁ, PHD. ÚSTAV ŽIVOČIŠNÉ FYZIOLOGIE A GENETIKY AV ČR, V.V.I. A CENTRUM BENĚČNÉ TERAPIE A TKÁŇOVÝCH NÁHRAD, RUMBURSKÁ 89, LIBĚCHOV SKALNIKOVA@IAPG.CAS.CZ [1] Einstein O, Ben-Hur T. The changing face of neural stem cell therapy in neurologic diseases. Arch Neurol 2008;65(4): [2] Hoffrogge R, Beyer S, Hübner R, Mikkat S, Mix E, Scharf C, Schmitz U, Pauleweit S, Berth M, Zubrzycki IZ, Christoph H, Pahnke J, Wolkenhauer O, Uhrmacher A, Völker U, Rolfs A. 2-DE profiling of GDNF overexpression-related proteome changes in differentiating ST14A rat progenitor cells. Proteomics 2007;7(1): [3] Skalníková H, Vodička P, Gadher SJ, Kovářová H. Proteomics of neural stem cells. Expert Rev Proteomics 2008;5(2): [4] Skalníková H, Halada P, Vodička P, Motlík J, Řehulka P, Hørning O, Chmelík J, Jensen ON, Kovářová H. A proteomic approach to studying the differentiation of neural stem cells. Proteomics 2007;7(11), [5] Vodička P, Smetana K Jr., Dvořánková B, Emerick T, Yingzhi ZX, Ouředník J, Ouředník V, Motlík J. The miniature pig as an animal model in biomedical research. Ann NY Acad Sci 2005; 1049: [6] Glanzer J, Miyashiro KY, Sul JY, Barrett L, Belt B, Hazdon P, Eberwine J. RNA splicing capability of live neuronal dendrites. Proc Natl Acad Sci USA 2005;102, [7] Skalníková H, Vodička P, Pelech S, Motlík J, Gadher SJ, Kovářová H. Protein signalling pathways in differentiation of neural stem cells. Proteomics 2008;8(21):

13 roce 1935 Dr. Arnold Beckman vynalezl tzv. kyselinoměr (acidimetr), který se později stal základním kamenem společnosti Beckman Instruments Inc. Zpočátku byl tento přístroj využíván firmou Beckmanova spolužáka, zpracovávající citrusy, k měření kyselosti citrónové šťávy. Později byl kyselinoměr přejmenován na ph metr a záhy se stal nepostradatelnou pomůckou v každé chemické laboratoři. Od té doby však ph metry prošly řadou změn a nyní přichází společnost Beckman Coulter v oblasti ph metrů s revoluční novinkou. Jedná se o ph metry série Φ 400 a 500, ruční přenosné a stolní ph metry, které vynikají např. možností připojení k PC a přenosu dat pomocí Bluetooth technologie. Bezdrátově tak můžete ovládat svůj ph metr až do vzdálenosti 10 metrů. ph metry vynikají samozřejmě jednoduchým ovládáním a výkonným softwarem, pomocí kterého Revoluční novinka v oblasti ph metrů přístroj jednoduše připojíte k vašemu PC. Software umožňuje stahovat data a exportovat je v obvyklých formátech, stejně tak jako přímo přístroj přes PC ovládat. Ergonomický design ručních ph metrů série Φ 400 s povrchem ze silikonu umožňuje nejen snadnou manipulaci a ovládání jedním palcem, ale také jednoduchou údržbu v případě znečištění přístroje. Všechny ruční ph metry jsou voděodolné a vodotěsné. Jsou schopny dokonce plavat na hladině. Vodotěsné konektory znemožňují proniknutí vlhkosti dovnitř stroje i při připojení klasických nevoděodolných elektrod. Ke všem ph metrům je k dispozici široká škála elektrod a měřících sond od kombinovaných, 3 v 1, referenčních, indikačních, iontově selektivních, ORP elektrod v různých délkách (pro mikrozkumavky až po velké lahve), tvarech a materiálech těla (skleněné, epoxy). V nabídce naleznete také sondy pro měření konduktivity a rozpuštěného kyslíku designované přímo pro ph metry série Φ 400 a 500. EVA KRÁLOVÁ EKRALOVA@BECKMAN.COM Pozvánka na akci DNA Analýza VI. ( května 2009) Místo konání akce: hotel Novotel, Kateřinská ulice, Praha 2 1. den - genetika a analýza nukleových kyselin 2. den - buněčná analýza Přihlášky, prosím, posílejte na kkozana@beckman.com informační magazín číslo

14 Nový počítač buněk a částic MULTISIZER TM 4 Multisizer TM 4 je nejnovějším členem rodiny počítačů buněk a částic, která pamatuje svůj počátek již v roce 1956, kdy byl bratry Coultery sestrojen první COULTER COUNTER A. rvní typ byl tedy uveden pro komerční použití již před 53 lety a od té doby spatřila světlo světa již celá řada inovativních počítačů buněk a částic využívající osvědčenou a dosud nepřekonanou Coulterovu impedanční metodu. V Multisizeru TM 4 jsou zahrnuty veškeré nejnovější výhody digitální technologie spolu s uživatelsky velmi přístupným softwarem a externí počítačovou stanicí pracující pod Microsoft Windows*. Vysokorychlostní digitální signál, použitý v Mulitisizeru TM 4, umožňuje přesnější vyhodnocení pulzů a tím jejich vyšší rozlišení s dosažením vyšší citlivosti. Vzorky mohou být načteny a evidovány pomocí zabudované čtečky čárového kódu. Změřená data mohou být uchována pro pozdější reanalýzy a vyhodnocení bez nutnosti opětovné analýzy vzorku. Použití SMART technologie (sample management), která zaručuje vysokou reprodukovatelnost analýz a EZAccess (reagent management) pro jednoduchou manipulaci s reagenciemi a nosnými roztoky, dělá práci s Multisizerem TM 4 opravdu snadnou. Software je plně ve shodě s 21 CFR část 11. Všechny tyto vlastnosti dělají z Multisizeru TM 4 jeden z nejvhodnějších, nejpřesnějších a uživatelsky nejjednodušších přístrojů pro měření velikosti buněk a částic na trhu. Hlavní výhody Multisizeru TM 4: Pracuje s vysokorychlostním digitálním signálem (DPP) Vyšší rozlišení Osvědčená a dosud nepřekonaná technologie Umožňuje dynamické měření velikosti Umožňuje měřit distribuci počtu, objemu, hmotnosti a plochy povrchu buněk a částic Celkový rozsah pro měření je 0,4 až 1600 μm Nový design přístroje umožňuje umístění nosných roztoků přímo v přístroji (nižší nároky na prostor) Umožňuje použití čárových kódů pro načítání a evidenci vzorků * všechny registrované ochranné známky jsou majetkem příslušných vlastníků Cytometrická analýza Cytometrická analýza devíti subpopulací lymfocytů metodou bez lýzy erytrocytů. Základní součástí přípravy vzorků z plné krve pro analýzu průtokovým cytometrem je lýza erytrocytů. K tomu lze použít řadu lyzačních činidel (VersaLyse, OptiLyse C nebo B, Whole blood lysing kit). Pro pracoviště s velkým počtem vzorků je výhodné použít pracovní stanici TQ-Prep, která provede automaticky v karuselu s 32 zkumavkami lýzu erytrocytů pomocí soupravy ImmunoPrep. Plně automatickou přípravu vzorků, včetně pipetování monoklonálních protilátek, plné krve, inkubace, přidání lyzačního činidla a kalibračních partikulí pro stanovení absolutních počtů, zajišťuje automatická stanice FP1000. Při manuální přípravě vzorků metodou bez promývání představuje lýza erytrocytů min. Průtokový cytometr CyAn ADP 9-color umožňuje načítat buňky při průtoku μl za vteřinu. Za těchto podmínek cytometr za 30 vteřin zanalyzuje leukocytů, z toho přibližně lymfocytů. Toto velké množství dat lze získat z jediné zkumavky s 50 μl krve. K této analýze je nezbytný mix monoklonálních protilátek značených různými fluorochromy: CD45- Cascade Yellow, CD8-Pacific Blue, CD14/CD15-FITC, CD56-PE, CD19-ECD, CD4-PC5, CD20-APC, CD5- PC7, CD3-APC-Cy7. Cytometrický software Summit verze 4.3 usnadňuje nastavení kompenzací devíti fluorochromů pomocí nástroje Auto Compensation. Správnost nastavení kompenzací je poté možno ověřit pomocí funkce VisiComp. Použitím devítibarevné imunofluorescence metodou bez promývání lze ušetřit min na přípravu vzorků. Tímto způsobem lze velmi rychle stanovit základní subpopulace lymfocytů v jediné zkumavce. Po přidání referenčních partikulí získáme také absolutní počty těchto subpopulací. S použitím Bulletin CyAn ADP 9 Color No-Lyse Lymphocyte Subset Enumeration. ROMAN VLČEK RVLCEK@BECKMAN.COM PAVEL KRUŽÍK PKRUZIK@BECKMAN.COM 14 informační magazín číslo

15 VZV Glycoprotein IgG Binding Site uvádí na trh EIA soupravu v řadě VaccZyme TM pro stanovení specifických protilátek třídy IgG proti glykoproteinu viru Varicella zoster (VZV). Souprava je určená pro stanovení protilátek tvořených jako reakce na infekci VZV i na imunizaci vakcínou VZV. Přesné stanovení specifických protilátek IgG proti VZV má z klinického hlediska velký význam, poskytuje informaci o stavu imunity. Virus Varicella zoster, známý též jako lidský herpes virus 3 (HHV-3), patří mezi osm herpetických virů patogenních pro člověka. VZV způsobuje při prvotní infekci plané neštovice, později se během života může reaktivovat a vyvolat pásový opar. U zdravých dětí mívají plané neštovice mírný průběh, avšak u osob s oslabenou imunitou, u těhotných žen, novorozenců a dospělých může být průběh choroby závažný a dokonce i život ohrožující. Novorozencům, jejichž matky prodělaly infekci VZV během prvních 20 týdnů těhotenství, hrozí riziko vrozených vývojových vad v 1 2 %. Virion VZV má strukturu typickou pro herpetické viry. Virovou dřeň, tvořenou lineární dvojvláknovou DNA a proteiny, obklopuje kapsida ve tvaru pravidelného dvacetistěnu tvořená 162 kapsomerami, nad ní následuje vrstva vyplněná bílkovinnou hmotou, označovaná jako tegument, a vnější lipidní obal, z něhož vyčnívají hroty glykoproteinů. Právě tyto povrchové glykoproteiny mají pro mechanismus infekce VZV klíčový význam; usnadňují virové částici uchycení a průnik do hostitelské buňky. Následně exprese virových glykoproteinů na povrchu hostitelských buněk napomáhá buněčné fúzi a rozšíření viru na další buňky. Protilátky namířené proti epitopům povrchových glykoproteinů VZV mají neutralizační účinek, blokují schopnost živého VZV infikovat. Možnost stanovení protilátek specificky rozeznávajících pouze povrchové glykoproteiny VZV představuje významný posun ve výpovědní hodnotě vyšetření v porovnání se stanovením protilátek metodou, kde je jako cílový antigen extrakt z buněčné kultury infikované VZV. Hladina specifických protilátek proti glykoproteinu VZV je indikátorem hladiny imunity a schopnosti chránit daného jedince před další infekcí, je také vodítkem při rozhodování, zda použít terapeutický specifický imunoglobulin proti VZV. Souprava je kalibrována proti prvnímu standardu pro VZV imunoglobulin (1987) kód W1044 Světové zdravotnické organizace, standard je dodáván Národním ústavem pro biologické standardy a kontroly (NIBSC), Velká Británie. Název soupravy BINDAZYME TM Anti-C1q EIA Katalogové číslo MK072 Rozsah stanovení 1, U/ml Ředění vzorku 1 : 100 Počet testů 96-jamková mikrotitrační destička 12 řad po 8 jamkách Doba stanovení Méně než 2 hodiny Nové výrobky Binding Site Anti C1q EIA V řadě BINDAZYME TM byla vyvinuta nová EIA souprava pro stanovení autoprotilátek třídy IgG proti složce komplementu C1q. Stanovení protilátek proti C1q napomáhá v diferenciální diagnostice pacientů s SLE (systémový lupus erythematodes) určit, zda se jedná o lupus nephritis nebo ne. Složka komplementu C1q je prvním článkem klasické aktivační dráhy komplementu. C1q má zásadní význam při odstraňování imunokomplexů a apoptotických tělísek z tkání. Vrozený deficit C1q je známým rizikovým faktorem pro rozvoj autoimunitních onemocnění, zejména SLE. I když se autoprotilátky proti C1q mohou vyskytovat i při některých dalších autoimunitních i infekčních onemocněních, jednoznačnou prevalenci mají tyto protilátky u pacientů s lupusovou nefritidou, přičemž u pacientů s difúzní proliferativní lupusovou nefritidou se tyto protilátky vyskytují až v 80 % případů. Nárůst titru má také prediktivní hodnotu, může předcházet propuknutí lupusu nebo relapsu. Na druhé straně mají tyto autoprotilátky vynikající negativní prediktivní hodnotu (v rozmezí 95 až 100 %), nepřítomnost anti C1q protilátek indikuje, že k rozvoji lupusové nefritidy nedojde. Název anti-c1q trochu svádí k záměně s CIK C1q. Je potřeba mít na zřeteli, že se jedná o zcela jiné stanovení než stanovení imunokomplexů vazbou na C1q (CIK C1q). Přestože autoprotilátky anti C1q se především vyskytují u lupusové nefritidy, jejich přítomnost není omezena jen na tuto chorobu (mohou se vyskytovat při různých revmatických, infekčních neoplastických i metabolických poruchách). Z tohoto důvodu je zapotřebí sledovat průběh onemocnění molekula C1q a jeho aktivitu zjišťováním hladin anti C1q protilátek spolu s dalšími laboratorními testy, jako je stanovení autoprotilátek proti dsdna i anti-dsdna s vysokou aviditou. Souprava pro semikvantitativní stanovení anti-c1q tak vhodně doplňuje řadu testů doporučovanou pro diagnostiku SLE (z produkce Binding Site EIA souprava BINDAZYME TM anti-dsdna - kód MK017, IFA soupravy Crithidia luciliae kód FK002.1 a FK002.2 a EIA souprava FARRZYME TM High Avidity antidsdna - kód MK072). informační magazín číslo BĚLA ŘÍČAŘOVÁ BRICAROVA@BECKMAN.COM Název soupravy VaccZyme TM VZV glycoprotein IgG Low Level EIA Katalogové číslo MK092 Rozsah stanovení miu/ml Kalibrace NIBSC W1044 Ředění vzorku 1 : 100 Počet testů 96-jamková mikrotitrační destička 12 řad po 8 jamkách Doba stanovení Méně než 2 hodiny imunokomplex vazba imunokomplexu na C1q vazba autoprotilátky anti C1q na C1q

16 Krevní destičky Krevní destičky jsou bezjaderné krevní elementy hrající významnou roli v hemostáze. Vznikají jako úlomky polyploidních megakaryocytů v kostní dřeni. Jedná se o složitý proces kontrolovaný cytokiny a hormony. Fyziologická koncentrace destiček se pohybuje v rozmezí x 10 9 /l krve a jejich průměrná životnost je 9,5 dne. Krevní destičky hrají důležitou roli při obranných mechanismech organismu a jejich hlavní funkcí je účast při vzniku hemostatické zátky. Nezanedbatelný je také jejich vliv na hojení ran, alergické a imunitní reakce. Vývojová řada krevních destiček Krevní destičky vznikají z pluripotentní kmenové buňky. Následující obrázek (obr. 1) podává přehled o výskytu CD znaků na prekurzorech krevních destiček, destičkách a faktorech působících na tuto řadu. Membránové molekuly krevních destiček Souhrn Na povrchu krevních destiček jsou membránové molekuly, které se uplatňují při různých normálních a patologických procesech. V rámci inventarizace lidského leukocytárního systému do CD nomenklatury je snaha i jednotlivým destičkovým molekulám přiřadit jejich CD označení. U membránových znaků se detailněji objasňuje molekulární hmotnost, genetická determinace, jejich exprese a funkce. Mimo to se zpřesňuje jejich význam pro patogenezi a patofyziologii krevních destiček u různých nemocí. Cílem tohoto sdělení je podat ucelený přehled o základních vlastnostech membránových molekul krevních destiček zahrnutých do CD nomenklatury. Úvod V průběhu posledních let probíhají v mnoha laboratořích studie mající za cíl charakterizovat membránové molekuly z hlediska jejich exprese, genetické determinace a funkce. Vzhledem ke vzrůstajícímu počtu těchto molekul bylo nutné vytvořit určitý systém. Vznikla tedy tzv. CD nomenklatura, která byla původně zamýšlena pouze pro lidské leukocytární antigeny. Časem však bylo nutné rozšířit její užívání i na jiné buňky a elementy lidského těla, tedy i na krevní destičky. CD nomenklatura u krevních destiček není příliš užívána a stejné znaky se označují různými synonymy. Cílem tohoto článku je podat ucelený přehled o membránových molekulách krevních destiček, které jsou do tohoto systému zahrnuty. Morfologie krevních destiček Tvar krevních destiček se mění v závislosti na stupni jejich aktivace. Neaktivované destičky jsou diskoidního tvaru o průměru 1,5 3,5 μm, tloušťce 1 1,5 μm a objemu 8 12 fl. Anatomické znaky destiček lze rozdělit do čtyř funkčních zón: periferii, rozpustný gel, organely a membránové systémy. Obrázek podává základní představu neaktivované krevní destičky z hlediska morfologických struktur (obr. 2). Struktury periferní zóny komunikují na molekulární úrovni s mimobuněčným prostředím. Tvoří je vnější obal, vlastní membrána a submembránové oblasti. Vnější obal krevních destiček obsahuje glykoproteiny (GP) označované podle elektroforetické pohyblivosti číslicemi I IX a písmeny a nebo b. GP jsou nepostradatelné pro správnou funkci destiček, např. GPIa-IIa (CD49b/CD29) je důležitý při adhezi destiček na subendoteliální matrix a GPIIb-IIIa (CD41/CD61) se podílí na agregaci. Povrchové GP obsahují molekuly kyseliny sialové, která pomáhá udržovat negativní povrchový náboj. Ten zabraňuje adhezi destiček na neporušený endotel a jejich vzájemné agregaci. Intracelulární část GP je ve spojení s vnitřním kontraktilním systémem. Vlastní membrána destiček je tvořena fosfolipidovou dvojvrstvou obsahující membránové proteiny. Důležitým faktorem pro funkci destiček je asymetrické rozložení membránových fosfolipidů, kde fosfatidylcholin s fosfatidylethanolaminem jsou lokalizovány vně a sfingomyelin s fosfatidylinositolem uvnitř membrány. Struktura zóny rozpustného gelu je tvořena převážně fibrilárními proteiny. Oblast zahrnuje obvodový pás mikrotubulů, submembránové filamenty, mikrofilamenty a proteinové podjednotky. Tyto struktury představují základní jednotku destičkového kontraktilního systému. Zóna organel se nachází v cytoplazmě a tvoří ji mitochondrie, glykogen a tři různé typy granul. Granula slouží jako skladovací místa pro proteiny a další látky nezbytné pro funkci destiček. Mezi 16 informační magazín číslo

17 Obr. 1: Vývojová řada krevních destiček s vybranými CD znaky Myeloidní progenitor CFU-GEMM Progenitor CFU-Meg Promegakaryoblast Megakaryoblast Megakaryocyt Krevní destičky Krevní destičky aktivované HLA-DR HLA-DR granula patří denzní tělíska, α-granula a lysosomy. Denzní tělíska obsahují řadu látek jakými jsou: ATP, ADP, Ca 2+ a serotonin. α-granula jsou zásobárnou bílkovin tvořených v megakaryocytech (destičkový faktor 4, vwf = von Willebrandův faktor) i bílkovin získaných z plazmy endocytosou (fibrinogen, IgG, albumin). Na povrchu destiček se kromě receptorů pro jejich stimulaci či inhibici vyskytují např. receptory pro složky komplementu, insulin a Fc fragmenty imunoglobulinů. Membránový systém zahrnuje otevřený kanálkový systém a denzní tubulární systém. Otevřený kanálkový systém je tvořen početnými zvlněnými vychlípeninami povrchové membrány, které zvětšují povrch destičky a urychlují tak membránový transport. Denzní tubulární systém je odvozen od endoplazmatického retikula a utváří souvislou síť úzkých kanálků. Je hlavní zásobárnou vápníku, který je důležitý při procesech kontrakce destiček. CD1 1c CD13 CD14* CD15* CD33 CD34 CD1 10* CD1 11* CD1 12* CD1 17 CD123 CDw131 CD133* CD173* CD174* CD176 CD227* CD228 CD34 (CD38) CD41 CD61 CD109 CD1 10 EPO CD1 17 EPO TPO CDw123 TPO GM-CSF CD133 GM-CSF IL3 SCF IL6 IL3 IL1 1 IL6 IL7 IL1 1 Destičková řada CD41 CD1 10 CDw123 CDw131 CD1 16 Kostní dřeň EPO TPO GM-CSF IL3 IL6 IL7 IL1 1 CD4* CD41 CD1 10 CD1 16 CDw123 CDw131 CD41 CD42a CD42b,c,d CD49f (CD51) CD61 CD1 10 (CD1 16) CDw123 CDw131 CD151 CD203c CD9 CDw17 CD23 CD31 CD36 CD41 CD42a-d CD49b CD49f (CD51) CD60 CD61 CD84 CD92 CD102 CD109 CD1 10 CD147 CD151 CD173 CD226 Obr. 2: Morfologie neaktivované krevní destičky v podélném řezu (DTS = hustý tubulární systém; GLY = glykogen; GR = granula; MIT = mitochondrie; MT = mikrotubuly; SCS = otevřený kanálkový systém; VD = denzní tělíska) EPO TPO GM-CSF IL3 IL6 IL7 IL1 1 EPO TPO IL6 IL1 1 Krev Základní znaky destiček + CD29 CD62P CD63 CD107a CD107b EGF TGF-β PDGF IL1 HGP CXCL1 PD-ECGF Aktivace krevních destiček Aktivace destiček probíhá od interakce agonisty s membránovým receptorem, přes přenos signálu do buňky až po specifickou odpověď krevních destiček. Jedná se o komplexní proces zahrnující metabolické změny, změnu tvaru, aktivaci povrchových receptorů a změny v uspořádání fosfolipidové membrány. Tvar se mění z diskoidního na sférický s řadou pseudopodií. Dochází k centralizaci organel a sekreci látek z granulí, které aktivují další krevní destičky. Po navázání ligandu na příslušný membránový receptor dochází ke stimulaci G-proteinů. Obrázek 3 představuje mechanismus přenosu signálu krevních destiček podle M. Gawaze v naší částečné úpravě. G-proteiny aktivují enzymy: fosfolipasu C, fosfolipasu A2 a adenylátcyklasu. Fosfolipasa C katalyzuje hydrolýzu fosfatidylinositol-4,5-bisfosfátu (PIP2) na druhé posly inositol- 1,4,5-trifosfát (IP3) a diacylglycerol (DAG). IP3 navozuje uvolňování vápenatých iontů z denzního tubulárního systému, zatímco DAG aktivuje proteinkinasu C. Dochází k přeorganizování cytoskeletu, centralizaci organel a sekreci granul. Při tvorbě stabilní membrány pseudopodií je nutná polymerace monomerního G-aktinu za vzniku F-aktinových vláken, která jsou spojena se strukturními membránovými proteiny. Centralizace organel a následná sekrece granul nastává díky aktomyosinu, který vzniká po navázání aktinových filament na zpolymerovaný myosin (polymerace myosinu je indukována proteinkinasou C). K sekreci granul dochází splynutím s otevřeným kanálkovým systémem nebo exocytosou. CD nomenklatura Nomenklatura CD antigenů je vytvářena na základě mezinárodních pracovních setkání, na kterých je jednotlivým znakům přiřazováno určité číslo. Zavedení CD systému bylo nutné vzhledem k velkému Obr. 3: Mechanismus přenosu signálu při aktivaci krevních destiček rozšíření monoklonálních protilátek v průtokové cytometrii, kdy docházelo k označování totožných znaků různými názvy. První setkání se uskutečnilo v Paříži roku 1982 a do nomenklatury bylo zahrnuto prvních patnáct molekul, které získaly označení pomocí písmen CD ( cluster of differentiation ). Od té doby proběhlo již dalších sedm setkání (Boston 1984, Oxford 1986, Vídeň 1989, Boston 1993, Kobe 1996, Harrogate 2000, Adelaide 2004) a počet CD znaků se vyšplhal již na 350. Ve skutečnosti je počet znaků mnohem vyšší, neboť pod některými čísly je zahrnuto několik podskupin znaků. Systém byl původně zamýšlen pouze pro lidské diferenciační leukocytární antigeny. Časem však bylo nutné rozšířit užívání CD nomenklatury i na jiné informační magazín číslo

18 Obr. 4: Schéma uspořádání některých membránových molekul krevních destiček buňky a elementy lidského těla, tedy i na krevní destičky. CD znaky krevních destiček CD znaky krevních destiček můžeme rozlišovat podle toho, zda-li se nacházejí na neaktivovaných krevních destičkách nebo se objevují až po jejich aktivaci. Na neaktivovaných destičkách je zastoupeno 53 CD znaků a po aktivaci se k nim přidává dalších 7 znaků (CD62P, CD63, CD68, CD107a, CD107b, CD109, CD154). Tabulka 1 udává základní přehled CD znaků krevních destiček s jejich synonymy, molekulovými hmotnostmi a typy uspořádání membránových molekul. CD znaky, které nalézáme na buňkách a elementech ve vývojové řadě krevních destiček se vyskytují až na malé výjimky i na jiných elementech a buňkách lidského těla (tab. 2). Tab. 1: Základní přehled CD znaků krevních destiček CD synonyma MW* typ** CD synonyma MW* typ** CD9 p24, MRP-1 24/24, 26 g CD63 LIMP, MLA1, LAMP /- g CDw12 p /120 a CD68 gp110, macrosialin 110/110 a CDw17 lactosylceramide /120 f CD69 AIM, EA 1, MLR3 60/28+32 i CD23 FceRII, BLAST-2, B6 45/- e CD82 R2, C33, IA4, 4F9, KAI /- g CD29 VLA, 1integrin, GPIIa 110/130 b CD84 GR /72-86 f CD31 PECAM-1, endocam 135/135 a CD92 CTL1 70/70 a CD32 Fc RII, Ly-17 40/40 a CD102 ICAM /- a CD36 GPIV (plt), GPIIIb 88/113 a CD107a LAMP /- a CD41 GPIIb, integrin 2 135/120, 23 b CD107b LAMP /- a CD42a GPIX 22/17-22 a CD109 8A3, 7D1, E /170 h CD42b GPIb 160/145 a CD110 MPL, TPO-R, C-MPL 85-92/- a CD42c GPIb 160/24 c CD111 HIgR, PRR1, nectin /64-72 a CD42d GPV 82/82 a CD112 PRR2, nectin /64-72 a CD43 leukosialin, sialophorin 115/135 a CD114 HG-CSFR, G-CSFR 130/130 a CD46 MCP 64/68 a CD132 IL-2R,4R,7R,9R,15R 64 a CD47 IAP, gp42, OA /50 f CD140a PDGF-R, PDGF-Ra 180/180 a CD47R MEM-133, IAP 115/125 CD140b PDGF-Rb 180/180 a CD49b VLA-2, GPIa 160/165 d CD141 TM, fetomodulin 105/105 a CD49e -5integrin, VLA-5 155/ a CD147 neurotelin, EMMPRIN 50-60/55-65 a CD49f VLA-6, GPI 140/120 c CD148 HTPT-ETA, DEP-1 250/250 a CD51 VNR-, vitronectin.rec. 150/124,24 c CD151 PETA-3, SFA-1 32/- g CD54 ICAM-1 90/95 a CD154 CD40ligand, gp /33 e CD55 DAF 80/80 h CD165 AD2, gp37 37/42 CD58 LFA a CD173 krevní skupina H typu 2 f CD59 protectin, MIRL, MACIF 19-25/19-25 h CD226 DNAM-1, PTA-1 65/65 a CD60a GD3 120/- f CD245 p220/240 / CD60b 9-O-acetyl GD /120 f CD295 Leptin R, LEPR, OBR 130/150 a CD60c 7-O-acetyl GD3 f CD298 Na+/K+-ATPase 32 II CD61 GPIIIa, 3integrin 90/110 a CD321 JAM-1, KAT, JCAM 32/35 a CD62P P-selectin, GMP /140 a CD323 JAM-C,JAM-3, VE-JAM 43 a Poznámky: * = molekulová váha v kda: neredukovaná/redukovaná forma; ** = uspořádání membránových receptorů: a = monomer, b = heterodimer nekov. typu, c = heterodimer kov. typu, d = homodimer nekov. typu, e = homotrimer, f = sacharidová struktura antigenu, g = protein 4x procházející membránou, h = GPI-kotvený protein, i = homodimer kov., II = molekula typu II. 18 informační magazín číslo

19 Typy uspořádání membránových molekul krevních destiček Membránové molekuly mohou být asociovány s membránou různým způsobem. Rozeznáváme čtyři typy membránových molekul. Molekuly jedenkrát procházející membránou, vícekrát procházející membránou, molekuly kotvené GPI-kotvou a molekuly kotvené k membráně. Obrázek 4 představuje uspořádání některých membránových molekul krevních destiček (obr. 4). Nejhojněji zastoupeným typem membránových molekul na krevních destičkách je monomer (obr. 4a). Častěji je zastoupena molekula, u kterého je NH2 lokalizován vně, zatímco COOH konec je lokalizován uvnitř. Na krevních destičkách je monomer zastoupen např. molekulami CD32, CD36 a CD61. Dalším typem je homodimer, který může být spojen kovalentně pomocí disulfidových můstků nebo nekovalentně. Příkladem nekovalentního homodimeru (obr. 4b) je molekula CD49b a kovalentního homodimeru molekula CD69 (obr. 4c). Heterodimer se může vyskytovat také jak ve formě kovalentní, tak i nekovalentní. Zástupci nekovalentního heterodimeru na krevních destičkách jsou např. molekuly CD29 a CD41 (obr. 4d) a kovalentního heterodimeru CD51 a CD69 (obr. 4e). Homotrimerem na krevních destičkách jsou molekuly CD23 a CD154 (obr. 4f). Dalším typem je protein, který prochází čtyřikrát membránou, který je zastoupen molekulami CD9 a CD63 (obr. 4g). Posledním typem je protein kotvený tzv. GPI-kotvou (GPI = glykosylfosfatidylinositol). Na krevních destičkách se tento typ vyskytuje jako CD55, CD59 a CD109 (obr. 4h). Základní funkce CD znaků krevních destiček V následující tabulce jsou stručně popsány funkce jednotlivých CD znaků krevních destiček (tab. 3). U některých však funkce není přímo objasněna nebo je známa na jiných typech buněk a elementech lidského těla. Nemoci krevních destiček v souvislosti s membránovými receptory Nemoci krevních destiček mohou být vyvolány změnou počtu nebo funkce krevních destiček. Nemoci z funkční nedostatečnosti se nazývají trombocytopatie. V souvislosti s poruchami membránových receptorů mluvíme o trombocytopatiích vrozených. Počet krevních destiček je většinou normální, případně lehce zvýšený či snížený. Bernard-Soulierův syndrom je autozomálně recesivní onemocnění vzniklé důsledkem dědičného defektu komplexu CD42a, CD42b, CD42c a CD42d (glykoproteinu Ib/IX a glykoproteinu V). Za normálních okolností dochází po vazbě von Willebrandova faktoru k přilnutí krevních destiček k endotelu. Onemocnění je charakterizováno rozličným spektrem projevů krvácení destičkového Tab. 2: Výskyt CD znaků krevních destiček na jiných buňkách a elementech CD výskyt CD výskyt CD9 TL, BL, MON, BAS, EOS, END, EPI CD63 CDw12 GRA, MON, NK, MB CD68 MON, DB, END, MAK, NEU, FIB MON, MAK, NEU, BAS, KD, BL, MB CDw17 TL, BL, MON, BAS, DB, GRA, END, EPI, MB CD69 TL, BL, NEU, EOS, THY, GRA CD23 BL, MON, EOS CD82 TL, BL, NK, MON, GRA, LEU CD29 TL, BL, GRA, NK, END, EPI, MON, AS, ŽB CD84 CD31 TL, BL, MON, KB, NK, END, GRA, AS CD92 CD32 MON, DB, KB, ERY, END CD102 CD36 MEG CD107a TL, BL, MON, DB, MAK, THY MB, MON, GRA, NEU, END TL, BL, MON, NK, END, LEU, MON, AS TL, MON, GRA, MAK, END, EPI, DB CD41 MEG CD107b GRA, END, EPI, NB CD42a MEG CD109 TL, KB, END, EPI CD42b MEG CD110 KB, MEG CD42c MEG CD111 CD42d MEG CD112 CD43 TL, NEU, THY, NK, GRA, MON, MAK, KD CD114 CD46 PBK, END, FB, EPI, NB CD132 CD47 TL, BL, MON, ERY, EPI, END, FIB, NB, AS, ŽB CD140a END, FIB CD47R EOS, MON, NEU, BL, TL CD140b END, FIB CD49b BL, NK, MON, KB, MEG, END, EPI, TL, MEG CD141 CD49e MON, THY, MON, AS, END, EPI, TL, BL CD147 CD49f TL, BL, MON, KB, MEG, END, EPI, THY, AS CD148 CD51 MON, END, MEG, NK, MAK, NEU CD151 CD54 TL, BL, MON, FIB, EPI, NB, ERY, END, AS CD154 CD55 široký CD165 KB, MAK, NEU, MB, END, EPI MEG, KB, MON, NEU, END, EPI NEU, KD, END, MB, NB, KB, GRA, MON TL, BL, EPI, END, KD, THY, MB, NEU, MAK END, MEG, MON, NEU TL, BL, MON, GRA, NK, ERY, END MB, MON, GRA, DB, KB, MEG, END, EPI, MON ŽB, BAS, TL TL, BL, THY, MON, NB, EPI, AS CD58 ERY, END, EPI, THY, MAK, MON, AS CD173 KB, ERY, END, ERY CD59 LEU, ERY, END, EPI CD226 TL, BL, MON, KB, NK, THY CD60a TL, BL, GRA, EPI, FIB, THY CD245 TL, MON, GRA, BL, NK CD60b TL, KB, GRA, EPI, FIB CD295 široký CD60c EPI, FIB CD298 široký CD61 MON, END, FIB, MAK, ŽB CD321 EPI, END, LEU, ERY CD62P MEG, END, AS CD323 TL, NK Poznámky: AS = adhezní struktury, BAS = basofily, BL = B-lymfocyty, DB = dendritické buňky, END = buňky endotelu, EOS = eosinofily, EPI = buňky epitelu, ERY = erytrocyty, FB = fibroblasty, GRA = granulocyty, KB = kmenové buňky, KD = kostní dřeň, MAK = makrofágy, MB = myeloidní buňky, MEG = megakaryocyty, MON = monocyty, NB = nádorové buňky, NEU = neutrofily, NK = NK buňky, PBK = periferní buňky krve, THY = thymocyty, TL = T-lymfocyty, ŽB = žírné buňky; široký = zastoupení na různých typech buněk a elementech lidského těla informační magazín číslo

20 Tab. 3: Funkce receptorů krevních destiček CD funkce CD funkce CD9 induktor agregace destiček; buněčná adheze a migrace CD63 lysosomální membránový protein; po aktivaci vystaven na povrch CDw12 není dosud objasněna CD68 lysosomální membránový protein CDw17 CD23 možná role u fagocytózy nízkoafinitní receptor pro Fc-IgE; signální transdukce CD69 CD82 přispívá k aktivaci destiček, aktivace a proliferace lymfocytů signální transdukce CD29 fibronektinový receptor; uplatnění při embryogenezi CD84 kostimulační molekula, zřejmě role při přenosu signálu CD31 adhezivní molekula CD92 pravděpodobně role při přenosu signálu CD32 CD36 CD41 CD42a CD42b úloha při imunitních mechanismech receptor pro kolagen; adhezivní molekula receptor pro fibrinogen, fibronektin, von Willebrandův faktor, trombospondin adheze destiček; komplex CD42(=a+b+c+d) - receptor pro vwf a trombin adheze destiček; komplex CD42(=a+b+c+d) - receptor pro vwf a trombin CD102 CD107a CD107b CD109 CD110 adhezivní a kostimulační molekula; asociuje s CD11a/CD18 lysosomální membránový protein; po aktivaci vystaven na povrch lysosomální membránový protein; po aktivaci vystaven na povrch možná role při signální transdukci regulace tvorby megakaryocytů a destiček CD42c CD42d CD43 CD46 adheze destiček; komplex CD42(=a+b+c+d) - receptor pro vwf a trombin adheze destiček; komplex CD42(=a+b+c+d) - receptor pro vwf a trombin adheze; aktivace T-buněk; migrace neutrofilů regulace aktivace komplementu CD111 CD112 CD114 CD132 adhezivní molekula adhezivní molekula proliferace a diferenciace neutrofilů, myeloidní diferenciace a proliferace aktivace a proliferace T-buněk, B-buněk, thymocytů, NK buněk a makrofágů CD47 CD47R adheze, migrace a aktivace leukocytů interakce s integriny; uvolňování intracelulárního vápníku během adheze CD140a CD140b receptor pro PDGF A a PDGF B; proliferace a diferenciace receptor pro PDGF B; proliferace a diferenciace CD49b adheze; asociuje s CD29 - váže kolagen a laminin CD141 možný fibrinolytický receptor; iniciace proteinu C CD49e adheze; asociuje s CD29 - váže fibronektin, invasin CD147 adhezivní molekula CD49f adheze; asociuje s CD29 - váže laminin, invasin, merosin CD148 signální molekula regulující různé buněčné procesy CD51 CD54 CD55 CD58 adheze; asociuje s CD61 - váže vitronektin, vwf, fibrinogen, trombospondin adheze; váže CD11a/CD18 a CD11b/CD18 - role při imunitní reakci regulace aktivace komplementu kostimulační signalizace; adheze CD151 CD154 CD165 CD173 buněčná adheze; asociuje s β1-intergriny ligand pro CD40; induktor B buněčné proliferace a aktivace role při tvorbě destiček; adheze krevní skupina H typu II; osidlování hematopoetických kmen. buněk CD59 membránový inhibitor reaktivní lýzi; signální transdukce CD226 adhezivní molekula; cytolytická funkce zprostředkovaná NK buňkami CD60a permeabilita mitochondrií během apoptózy; kostimulace CD245 signální transdukce a kostimulace T-buněk a NK-buněk CD60b kostimulace CD295 regulace metabolismu tuků CD60c CD61 kostimulace asociuje s CD41-receptor pro fibrinogen nebo s CD51-receptor pro vitronektin CD298 CD321 transport sodných a draslíkových iontů přes buněčnou membránu spojená s agregací krevních destiček CD62P adheze destiček a monocytů; rolování leukocytů na endotel CD323 buněčná adheze a interakce s endotelovými buňkami 20 informační magazín číslo