Vlastnosti peptidů a proteinů a jejich implikace pro vývoj HPLC metod Parametry mobilní a stacionární fáze Detekce peptidů a proteinů

Save this PDF as:
 WORD  PNG  TXT  JPG

Rozměr: px
Začít zobrazení ze stránky:

Download "Vlastnosti peptidů a proteinů a jejich implikace pro vývoj HPLC metod... 23 Parametry mobilní a stacionární fáze... 23 Detekce peptidů a proteinů"

Transkript

1

2 Obsah METODY PURIFIKACE PRODUKTŮ... 5 Selektivní precipitace... 5 Chromatografické metody... 6 Afinitní purifikace... 8 Iontově výměnná chromatografie... 9 Gelová filtrace Hydrofobní chromatografie Ultrafiltrace a dialýza nízkomolekulárních kontaminant Uvolnění cílové podjednotky z fúzního proteinu Štěpení fúzního proteinu specifickou endoproteázou Autokatalitická technika odštěpení fúzní kotvy od rekombinantního proteinu Izolace proteinu z inkluzních tělísek a jejich refoldování Metody sušení produktů Stabilizace biopolymerů a rekombinantních proteinů Krystaly makromolekul Speciální část frakcionace biopolymerů HA Redukce molekulové hmotnosti biopolymerů kyselou hydrolýzou Příprava oligosacharidů enzymatickým štěpením OVĚŘENÍ ČISTOTY A CHARAKTERIZACE BIOMOLEKUL Ověření čistoty proteinů, peptidů a polysacharidů a jejich charakterizace HPLC

3 Vlastnosti peptidů a proteinů a jejich implikace pro vývoj HPLC metod Parametry mobilní a stacionární fáze Detekce peptidů a proteinů HPLC Afinitní kapalinová chromatografie (bioafinitní chromatografie) Gelová permeační chromatografie (SEC) Iontově výměnná chromatografie Hydrofobní interakční chromatografie HIC Charakterizace proteinů a polypeptidů pomocí elektroforézy Jednorozměrná denaturační elektroforéza Jednorozměrná elektroforéza za nativních podmínek Dvourozměrná gelová elektroforéza Izoelektrická fokusace (IEF) Kapilární elektroforéza Volná kapilární elektroforéza Stanovení molekulových hmotností proteinů a peptidů pomocí SDS-PAGE Flow field flow frakcionace (FFFF) Stanovení hydrodynamického poloměru pomocí DLS (Dynamic light scattering) Rozptyl světla Brownův pohyb Hydrodynamický poloměr proteinu (Rh)

4 Princip metody DLS Vyjádření výsledků distribuce velikosti Vliv prostředí na difuzní koeficient a tvar nanočástic Přístroje pro měření pomocí DLS Výhody a omezení DLS Ukázka praktické aplikace Diferenciální skenovací kalorimetrie (DSC) Doporučená literatura Internetové zdroje

5 METODY PURIFIKACE PRODUKTŮ Selektivní precipitace Rozpustnost biomakromolekul ve vodném roztoku je ovlivněna jejich solvatací molekulami vody, která může být ovlivněna změnou hodnoty ph, teploty, iontové síly, přídavkem solí či organických látek rozpustných ve vodě. Kombinací různých srážecích činidel tak byly vytvořeny postupy pro srážení, precipitaci různých skupin makromolekul. Pro úspěšnost precipitace je důležité zvolit nejen vhodné činidlo, ale i vhodnou výslednou koncentraci činidla v precipitovaném vzorku. Změnou koncentrace precipitačního činidla v roztoku se totiž změní specifičnost procesu precipitace. Globulární proteiny, které jsou rozpustné ve vodných roztocích, jsou ve své nativní formě uspořádány tak, že rezidua polárních aminokyselin jsou orientována vně molekuly proteinu, zatímco nepolární vedlejší řetězce směřují do nitra molekuly, a tak nejsou ve styku s vysoce polárním vodným prostředím. Stabilita nativní konformace je dána jednak hydrofobními interakcemi uvnitř molekuly, jednak inter- i intramolekulárními vodíkovými vazbami vně molekuly. Dojde-li k narušení rovnováhy mezi jednotlivými interakcemi, je molekula proteinu denaturována a dochází k precipitaci tohoto proteinu. Tato precipitace může být jak vratná reverzibilní, tak nevratná ireverzibilní. Jedna z reverzibilních metod precipitace proteinů je založena na skutečnosti, že nejnižší rozpustnost vykazuje protein ve svém izoelektrickém bodu. Voda je vysoce polární rozpouštědlo, a tudíž se v ní velmi dobře rozpouští látky s elektrickým nábojem. V izoelektrickém bodu jsou kladné i záporné náboje vyrovnány, takže molekula jako celek je bez náboje, což snižuje její rozpustnost ve vodě. Opětovnou změnou ph lze protein opět denaturovat a převést tak zpět do roztoku. Patrně nejpoužívanější metoda srážení proteinů využívá síranu amonného. Velkou výhodou (NH 4) 2SO 4 je možnost jej připravit v dostatečně velkých koncentracích pro srážení takřka všech proteinů, takřka nepatrná produkce tepla při přídavku jeho roztoku, nižší hustota jeho roztoku umožňující odstranění precipitátu centrifugací a v neposlední řadě i skutečnost, že jeho koncentrovaný roztok je bakteriostatický. Vzhledem ke skutečnosti, že je nutné jej použít pro srážení proteinů, které nejsou příliš zředěné, zařazuje se precipitace pomocí (NH 4) 2SO 4 obvykle mezi počáteční kroky při izolaci proteinů. Precipitát lze od roztoku oddělit centrifugací, následně rozpustit ve vhodném pufru a poté oddělit (nh 4) 2so 4 gelovou filtrací či ultrafiltrací. Specifičtější precipitace lze dosáhnou postupným zvyšováním koncentrace (NH 4) 2SO 4, rozdílné proteiny jsou totiž precipitovány při rozdílných koncentracích (NH 4) 2SO 4. Tepelná denaturace naproti tomu představuje ireverzibilní metodu precipitace. Tímto způsobem lze vysrážet poměrně širokou skupinu nežádoucích proteinů, které se 5

6 následně oddělí centrifugací. Obvykle spočívá zmíněná metoda v zahřívání míchaného roztoku proteinu na vodní lázni na teplotu 90 C. Nukleové kyseliny jsou vůči ireverzibilní precipitaci odolnější než proteiny. Stejně jako proteiny jsou i nukleové kyseliny polární makromolekuly, které tak lze vysrážet změnou ph či přídavkem méně polárních organických rozpouštědel. Nejpoužívanější precipitační metodou používanou pro srážení nukleových kyselin je precipitace alkoholem. Používá se zejména etanol či isopropanol v přítomnosti 0,1 až 0,5 m octanu sodného či draselného o hodnotě ph 5,0. Následkem konformačních změn nukleových kyselin dochází k jejich precipitaci. Při vyšších koncentracích probíhá precipitace kvantitativně i při 25 c, zatímco při nižších koncentracích nukleových kyselin je pro jejich kvantitativní precipitaci nutná inkubace v mrazu. Pro velmi zředěné roztoky nukleových kyselin lze použít precipitaci pomocí 10% polyethylenglykolu Jedná se o časově náročnější metodu, která však podobně jako srážení proteinů síranem amonným umožňuje frakční precipitaci. Nukleové kyseliny vyšších molekulových hmotností se totiž sráží již při nižších koncentracích polyethylenglykolu, zatímco nukleové kyseliny s nižší molekulovou hmotností se stále nachází v roztoku. Chromatografické metody Velmi účinnou separační metodou, která našla široké uplatnění jak při izolaci látek ze směsí, tak při stanovení rozličných látek v široké škále vzorků, je chromatografie. Ta je založena na rozdělení látky mezi dvě nemísitelná prostředí, stacionární fázi ukotvenou na pevném nosiči-matrici a mobilní fázi protékající kolem stacionární fáze. Bylo vyvinuto mnoho chromatografických metod, které se od sebe mnohdy výrazně liší. Mohou být vhodné pro separaci látek nízkomolekulárních i makromolekul. Separaci lze provádět podle rozdílné molekulové hmotnosti, polarity, izoelektrického bodu či dle přítomnosti funkční skupiny či značky, která specificky interaguje se stacionární fází. Podle prostorového uspořádání stacionární fáze dělíme chromatografii na plošnou a sloupcovou. Plošná chromatografie má stacionární fázi uspořádanou v ploše, jedná se buď o tenkovrstvou chromatografii (TLC), u níž je stacionární fáze umístěna na tenké vrstvě, např. Na hliníkové folii, nebo o papírovou chromatografii (PC), kde je stacionární fáze voda adsorbovaná v pórech papíru. Plošná chromatografie je nenáročná na laboratorní provedení, papírovou chromatografii lze provést i s obyčejným savým papírem, ovšem v současné době ztrácí na svém významu. Slouží zejména pro relativně rychlou detekci kontaminantů či drog, např. V moči, a některých reakčních produktů v organické chemii. U sloupcové chromatografie tvoří stacionární fáze náplň kolony nebo tenké kapiláry. Mobilní fáze protéká kolonou nebo kapilárou a unáší s sebou vzorek až na 6

7 konec kolony. Za kolonou či kapilárou se stacionární fází se nachází detektor, který zaznamená průchod vzorku. Svým významem sloupcová chromatografie výrazně převyšuje chromatografii plošnou. Mobilní fází může být u sloupcové chromatografie plyn, pak hovoříme o plynové chromatografii (GC), nebo kapalina v případě kapalinové chromatografie (LC). V případě plošné chromatografie je mobilní fází kapalina. GC má velký význam zejména v analytické chemii pro separaci plynných a těkavých nízkomolekulárních látek. Příkladem jejího využití je stanovení obsahu alkoholu v krvi. Pro GC se jako nosiče stacionární fáze využívají tenké kapiláry, jejichž délka dosahuje i několika desítek metrů. Naproti tomu LC lze použít pro separaci vysokomolekulárních i nízkomolekulárních látek. Stacionární fáze může být rovněž v tenké kapiláře, ale i v koloně, jejíž vnitřní průměr může dosáhnout i několika cm. Kapalina tvořící mobilní fázi se může pohybovat kolonou buď vlivem gravitace, nebo pomocí pumpy. Použitím pumpy se zvyšuje zpětný tlak stacionární fáze a rychlost průtoku mobilní fáze. Složení mobilní fáze může být při celé separaci konstantní, nebo se může v průběhu separace měnit. V závislosti na tom hovoříme o isokratické, krokové (jednorázová změna) či gradientové (postupná změna mobilní fáze) eluci. Po ukončení eluce je třeba promýt kolonu původní mobilní fází, aby byla připravena pro další použití. Kapalinovou chromatografii je možné rozdělit na mnoho rozmanitých metod. Tabulka 5.1. Nejběžnější typy kapalinové chromatografie Typ LC Princip Adsorpční chromatografie Afinitní chromatografie Gelová chromatografie Adsorpce na povrchu pevné stacionární fáze Selektivní interakce analytu se stacionární fází (např. antigen protilátka) Zadržování malých molekul jejich vstupem do pórů gelu Hydrofobní chromatografie Iontově chromatografie Reverzní chromatografie výměnná Hydrofobní interakce makromolekul se stacionární fází ve vodném prostředí Interakce iontů s opačně nabitými skupinami stacionární fáze (zvlášť pro anionty a kationty) Záchyt nepolárních látek nepolárními řetězci stacionární fáze v polárním organickém prostředí Důležitou součástí sloupcové chromatografie je detektor. Ten se umisťuje za kolonu a umožňuje detekovat a stanovit látky opouštějící kolonu a určit čas potřebný k jejich průchodu kolonou eluční čas. V chromatografii se používá mnoho typů detektorů. Nejčastěji se používá spektrofotometr, hmotnostní spektrometr, voltmetr, ampérmetr, vodivostní detektor, fluorescenční detektor a další. Volba správného 7

8 detektoru je takřka stejně důležitá jako volba správné chromatografické metody. K detektoru bývá připojeno záznamové zařízení, obvykle počítač nebo posuvný zapisovač, které ukládá naměřená data. Jejich grafickým vyjádřením je chromatogram zobrazující závislost signálu detektoru na čase. Afinitní purifikace Afinitní chromatografie je nejefektivnější chromatografická metoda, přestože není možné ji aplikovat na všechny problémy. V praxi se při purifikacích obvykle jedná o poslední (ne-li jediný) purifikační krok. Využívá biochemicky specifickou interakci mezi dvěma druhy látek. Jedná se např. O dvojici antigen protilátka, enzym substrát, enzym koenzym či protein specifický ligand. Lze využít i tak vysoce specifickou interakci, jako je interakce komplementárních řetězců nukleových kyselin. Základním předpokladem afinitní chromatografie je schopnost matrice kovalentně navázat ligandy, které se specificky váží na purifikovanou látku. Při purifikaci polymerních produktů z geneticky modifikovaných organismů se často využívá specifická značka určená pouze pro usnadnění purifikace. Příkladem jsou proteiny obsahující na c-konci řetězce šestkrát his, které jsou specificky zachyceny kyselinou nitrilotrioctovou koordinačně spojenou s Ni 2+ nebo Co 2+. Mnoho postupů je natolik specifických, že lze z buněčného extraktu získat v jediném kroku pomocí afinitní chromatografie požadovanou látku. Některé ligandy a jimi zachycované molekuly jsou uvedeny v Tab Při afinitní chromatografii se využívají dvě mobilní fáze. Jedná se o ekvilibrační a eluční pufr. Ekvilibračním pufrem je kolona promývána před nanesením vzorku, který by měl být rozpuštěn ve stejném či podobném pufru. Po nanesení vzorku je dále na kolonu čerpán ekvilibrační pufr do doby, než dojde k eluci nezachycených látek. Po eluci nezachycených látek dojde k zapojení elučního pufru, slouží k vymytí látek specificky zachycených na koloně. Jeho eluční síla je oproti ekvilibračnímu pufru výrazně vyšší díky obsahu stejného ligandu, který zachycuje purifikovanu látku či jeho analogu. Tento volný ligand kompetuje (soutěží) s ligandem vázaným k matrici o vazbu do vazebného místa zachycené molekuly, a tak ji uvolňuje z vazby s ukotveným ligandem. Jinou možností zvýšení eluční síly bývá změna ph, použití chaotropních solí či organických látek narušujících vazbu ligandu s purifikovanou molekulou. Např. Proteiny s histidinovou značkou lze z kolony s obsahem Ni 2+ či Co 2+ vymýt pomocí pufru s imidazolem. Změna ph či použití chaotropních solí může vézt k poškození purifikovaných komponent. Existují i protokoly, v nichž se nepoužívá kroková, ale gradientová eluce. 8

9 Je-li purifikovaná látka vázána na kotvený ligand příliš pevně, bývá prospěšné po aplikaci elučního činidla na kolonu zastavit jeho tok a nechat je chvíli působit. Obvykle se tok zastavuje na 10 minut až 2 hodiny. Afinitní chromatografii lze rovněž použít pro selektivní odstranění vybraných kontaminantů. V tomto případě se vybírá stacionární fáze tak, aby zachytila tuto nečistotu, která je po získání frakce se vzorkem vymyta elučním pufrem dle výše zmíněného principu. Tabulka 5.2. Některé ligandy používané při afinitní chromatografii Ligand Zachycované molekuly Arginin Prothrombin, plasminogen Kyselina nitriloctová v komplexu Co 2+ či Ni 2+ Proteiny s histidinovou značkou Polymyxin Endotoxin Heparin Protein A, protein G 5 -AMP Nukleové kyseliny Lektin 2,5 -ADP Proteiny vázající nukleové kyseliny Imunoglobin G ATP dependentní kinasy, NADP + dependentní enzymy Komplementární řetězce nukleových kyselin, histony Polysacharidy, glykoproteiny NADP + dependentní enzymy Iontově výměnná chromatografie Iontově výměnná chromatografie, nazývaná často též iontoměničovou chromatografií, je založena na interakci iontů vzorku a mobilní fáze s opačně nabitými skupinami ve stacionární fázi. Podle náboje zadržovaných iontů dělíme iontoměniče na anexy a katexy. Anexy zachycují anionty a jejich stacionární fáze tudíž obsahuje kladně nabité skupiny, zatímco katexy zachycují kationty. Díky skutečnosti, že mnoho biomakromolekul nese v nativním stavu náboj, jehož hodnota i znaménko se při změně ph postupně mění, je iontoměničová chromatografie významnou purifikační metodou pro separaci proteinů, polysacharidů a dalších biopolymerů. Tyto polymery totiž obsahují mnoho protonizovatelných skupin, přičemž jejich míra protonizace je závislá na hodnotě ph. Jako nosiče stacionární fáze se využívá mnoho rozličných polymerů. Z přírodních polymerů se jedná o celulosu, dextran či agarosu, mezi syntetické nosiče patří polystyren, polyakrylamid a mnoho dalších. Tyto nosiče jsou derivatizovány nabitými skupinami. Slabé anexy obsahují obvykle primární či sekundární aminoskupinu, silné anexy kvartérní aminoskupinu. Záporný náboj slabých katexů je tvořen karboxylovými 9

10 skupinami, zatímco u silných katexů se využívá síranová skupina. Slabé katexy potřebují mobilní fázi s ph kolem 4, zatímco slabé anexy s ph kolem 11. Přiblíží-li se ph k neutrální hodnotě, ztrácí tyto katexy i anexy svůj náboj. Naproti tomu silné katexy i anexy je možné použít při širším rozsahu ph. Dostupné jsou ionexy s pracovním rozsahem jedné jednotky i deseti jednotek ph. Před nanesením vzorku je nutno promýt kolonu mobilní fází, která bude použita pro nanášení vzorku a promývání kolony. Hodnota ph mobilní fáze vytékající z kolony musí odpovídat hodnotě mobilní fáze vstupující do kolony. V opačném případě nelze nanést vzorek na kolonu. Eluční síla mobilní fáze závisí na jejím ph a na její iontové síle. V případě změny ph je změna iontové síly způsobena změnou v ionizaci separovaných látek. Slabé kyseliny se v bazickém prostředí vyskytují ve formě aniontu a v kyselém ve formě neutrálních molekul. Podobně je tomu u slabých bází. Při zvýšení iontové síly mobilní fáze se k nabitým skupinám stacionární fáze dostává větší množství iontů, které vzájemně soutěží (kompetují) o možnost iontové vazby s touto skupinou. Mobilní fáze je u iontově výměnné chromatografie buď gradientová, či se skokovým zvýšením eluční síly, jak je tomu u afinitní chromatografie. Gradientová mobilní fáze s postupně rostoucí či klesající hodnotou ph je využívána při dělení látek dle izoelektrického bodu. Sbíráním frakcí mobilní fáze tak můžeme získat separované látky vzorku tak, jak postupně s měnícím se ph ztrácí svůj náboj díky vyrovnání počtu kladně a záporně nabitých skupin. Při volbě podmínek iontově výměnné chromatografie je nutné uvážit mnoho faktorů, které úží možný výběr experimentu. Jedná se o náboj separovaných molekul a jeho velikost. Molekula s jedním záporným nábojem je eluována při nižší koncentraci chloridů v mobilní fázi než molekula se dvěma či třemi náboji. Dále je nutno vzít v úvahu izoelektrický bod hodnotu ph, při které je celkový náboj molekuly, obsahující kladně i záporně nabité skupiny, nulový. Kladně nabitá molekula s vyšší hodnotou isoelektrického bodu je tudíž eluována při vyšší hodnotě ph. Gelová filtrace Gelová filtrace umožňuje separovat od sebe látky na základě jejich rozdílné molekulové hmotnosti a je založena na existenci přesně definovaných či různě velkých pórů v částicích gelu. Malé molekuly při průchodu kolem částic gelu vstupují difuzí do zmíněných pórů a jsou tak zadržovány, zatímco velké molekuly se do těchto pórů nedostanou a jsou vylučovány z kolony. Proto se pro gelovou filtraci používá i označení gelová permeační (zadržovací) či exlusní (vylučovací) chromatografie. 10

11 Gelová filtrace je použitelná zejména pro oddělení nízkomolekulárních látek od látek vysokomolekulárních, např. Pro odsolení roztoků proteinů, separaci makromolekul podle jejich molekulové hmotnosti a určení molekulové hmotnosti makromolekul. V poslední zmiňované funkci ji však stále častěji nahrazuje hmotnostní spektrometrie. Stacionární fází u gelové filtrace je kapalina uvnitř pórů gelu. Ideální nosič stacionární fáze, který vytváří gelové částice, by měl být hydrofilní polymer bez náboje, maximálně inertní a pevný. V praxi se používají především přírodní polymery na bázi agarosy či dextranu. Komerčně dostupné jsou gely s různým stupněm zesíťování polymeru, které zvyšuje jeho pevnost a rovněž určuje velikost pórů gelu. Velikost těchto pórů určuje rozsah velikosti částic, které lze daným gelem od sebe oddělit. Gely se prodávají pod různými komerčními názvy. Jedním z nejpopulárnějších materiálů je Sephadex, dextran zesíťovaný pomocí epichlorhydrinu. Sepharosa je vyráběna z agarosy, polymeru D-galaktosy a 3,6-anhydro-L-galaktosy. Oproti Sephadexu je Sepharosa vhodná i pro dělení větších makromolekul až do molekulové hmotnosti 40,000 kda, u Sephadexu je to maximálně 750 kda. Krom materiálu a velikosti pórů se dodávané nosiče liší i velikostí částic, která se pohybuje od 10 do 300 µm. Superdex a Superosa odpovídají svým materiálovým složením Sephadexu, resp. Sepharose. Oproti nim poskytují lepší výsledky, avšak jsou výrazně dražší. Používají se tedy jen v případech, kdy je kladen velký důraz na kvalitu separace. Vzhledem k tomu, že zde nedochází ke specifickým interakcím, ani není potřeba měnit náboj separovaných molekul, používá se isokratická mobilní fáze. Důležité však je, aby mobilní viskozita mobilní fáze nebyla výrazně nižší než viskozita vzorku; doporučuje se, aby byla minimálně poloviční. To vytváří problémy zejména při obsahu glycerolu ve vzorku, a nikoliv v mobilní fázi či při vysoké koncentraci biopolymerů. Gelová filtrace je často používaná analyticky, zejména pro stanovení molekulové hmotnosti nativních proteinů. V tomto případě se experiment provádí nejméně dvakrát. Jednou pro kalibraci, kdy se jako vzorek použije směs standardních proteinů známé molekulové hmotnosti, a minimálně jednou při samotném měření molekulové hmotnosti vzorku. Do grafu se pak zanáší dekadický logaritmus molekulové hmotnosti polymeru na osu x a poměr elučního objemu k mrtvému objemu na osu y. Z regresní přímky se pomocí rovnice V e/v 0 = - a.log M r + b, ve které jsou a a b jsou empirické konstanty, vypočítá molekulová hmotnost polymeru. Hydrofobní chromatografie Mnohé molekuly obsahují na svém povrchu nepolární hydrofobní oblasti. Rozdílů mezi nepolárním charakterem molekul se využívá i pro jejich separaci. Nízkomolekulární 11

12 látky jsou na základě toho separovány adsorpční chromatografií, zatímco pro makromolekuly se používá hydrofobní chromatografie (HIC). Tento typ chromatografie využívá jako nosiče stacionární fáze hydrofilní gely, na nichž jsou navázány nepolární alkylové či arylové skupiny. Jedná se často o methyl, oktyl, oktadecyl či fenyl. Tím je hydrofobní chromatografie shodná s chromatografií na reverzní fázi. Obě metody se však liší stupněm substituce hydrofilního gelu. V případě hydrofilní chromatografie je koncentrace substituovaných skupin v rozmezí od 10 do 50 µmol.ml -1 gelu, u chromatografie na reverzní fázi je substituce přibližně o řád vyšší. Rovněž eluční roztok se u obou chromatografií liší. Pro hydrofobní chromatografii je používán roztok nižší iontové síly a bez organických rozpouštědel typických pro chromatografii na reverzní fázi. Vazba proteinu k matrici závisí na mnoha faktorech. Z vlastností matrice se jedná především o její funkční skupiny a stupeň derivatizace, z vlastností polymerů pak zejména o velikost a charakter hydrofobní části povrchu. Proteiny s větší hydrofobní částí povrchu jsou vázány těsněji než proteiny s menším hydrofobním regionem. Těsnější vazbu k hydrofobním regionům vykazují alkylové substituenty, u kterých se těsnost vazby zvyšuje s délkou řetězce. Těsnější vazby se docílí i použitím matrice s vyšším stupněm derivatizace. Matrice pro hydrofobní chromatografii dosahují velké kapacity záchytu polymerů. Podle typu matrice, mobilní fáze a polymeru se může na 1 g gelu zachytit až 50 mg polymeru. Vznik a pevnost hydrofobních vazeb polymerů k matrici velmi závisí na použité mobilní fázi. Vyšší koncentrace soli zvyšuje pevnost vazby polymerů k matrici. Mimo koncentraci je důležitá i volba konkrétní soli v mobilní fázi. Pro kationty i anionty byla vypracována Hofmeisterova řada iontů: NH 4 + > K + > Na + > Li + > Mg 2+ > Ca 2+ PO 4 3 > F ~ SO 4 2 > HPO 4 2 > CH 3COO > Cl > Br > NO 3 > I > SCN. Tato řada srovnává ionty podle jejich podpory vazby polymeru k matrici. Obě uvedené řady obsahují jen několik významnějších iontů, ačkoliv byl studován vliv mnoha jiných, které byly rovněž zařazeny do Hofmeisterovy řady. Ionty v levé části řady navíc zvyšují stabilitu proteinů. Obojí je dáno zvýšením organizovanosti molekul vody v okolí iontu, kdy voda obaluje jednotlivé ionty v několika vrstvách. Na průběh hydrofobní chromatografie má vliv i hodnota ph mobilní fáze, avšak vliv změny ph je často nepředvídatelný. Mobilní fází je obvykle pufr s obsahem vhodné soli, často se jedná o fosforečnanový pufr nastavený na ph 7,0 s 1M (NH 4) 2SO 4. Eluce se zajišťuje 12

13 postupným snižováním koncentrace soli. Často je navíc usnadňována přídavkem organických látek, zejména glycerolu či neionogenních detergentů. Ultrafiltrace a dialýza nízkomolekulárních kontaminant Pro odstranění nízkomolekulárních komponentů, např. Síranu amonného z precipitace proteinů, se používají dvě podobné metody, dialýza a ultrafiltrace. Obě metody jsou založeny na stejném principu. Jedná se o průchod malých molekul přes membránu s póry s přesně definovanou velikostí. Ta určuje, jak velké molekuly jsou membránou zachyceny a jak velké molekuly jsou schopny projít přes membránu. Tato hranice je důležitou charakteristikou membrány, kterou je nutné vzít při volbě membrány v úvahu a je označována jako cut-off value. Její hodnota se udává v kda a je míněna pro globulární proteiny, které při vyšší molekulové hmotnosti prochází přes membránu jen velmi pomalu, nebo neprochází vůbec. Základní rozdíl mezi oběma metodami spočívá v síle, která pohání transport molekul přes membránu. V případě dialýzy se jedná o prostou difuzi přes membránu, zatímco v případě ultrafiltrace je průchod roztoku přes membránu poháněn vnějším tlakem. Ultrafiltrace je proto rychlejší než dialýza. Dialýza. Nejjednodušším provedením dialýzy je použití dialyzačního střívka naplněného dialyzovaným roztokem, které se vloží do nádoby s dialyzačním roztokem, do kterého se difuzí přesouvají nízkomolekulární komponenty. Vzhledem k vyšší koncentraci rozpuštěných látek v dialyzovaném roztoku uvnitř střívka může zároveň dojít ke vstupu rozpouštědla do střívka a následnému nárůstu jeho objemu. Proto je nutné plnit střívko jen částečně. Dialyzační roztok by měl obsahovat pufr, který stabilizuje jeho ph na požadované hodnotě. Rychlost difuze lze určit pomocí Fickova zákona. Podle něj záleží na ploše, přes kterou difuze probíhá, koncentračním gradientu a difuzní konstantě závislé na velikosti a tvaru částice. Dialýza je poměrně zdlouhavá metoda, která probíhá obvykle 12 až 24 hodin. Ukončení dialýzy lze detekovat měřením konduktivity dialyzačního roztoku. Dialýzu lze urychlit výměnou dialyzačního roztoku za čistý. Membrány a střívka pro dialýzu se obvykle vyrábí z celulosy a jejich hodnota cutoff se pohybuje v rozmezí 1 až 50 kda. Pro dialýzu malých objemů do 1 ml lze použít buď komerčně vyráběné mikrodialyzační komůrky, nebo je možné je vyrobit přímo v laboratoři z ependorfových trubiček odstraněním víčka a překrytím jejich konců dialyzační membránou, kterou je nutné dobře upevnit. 13

14 Dialýzu lze použít i pro zakoncentrování roztoku makromolekul. V tomto případě se využije polyetylen glykol přidaný do dialyzačního pufru, který postupně nasává vodu a zvětšuje svůj objem. Pro odstranění nízkomolekulárních látek lze kromě dialýzy použít i obdobnou metodu, ultrafiltraci či gelovou filtraci. Ty jsou sice rychlejší, ale rovněž náročnější na laboratorní vybavení a zručnost. Ultrafiltrace. Ultrafiltrace se ve svém principu podobá dialýze do té míry, že je možné pro ni použít dialyzační střívko umístěné v nádobě připojené k vakuové pumpě. Přesto je výhodnější použít membránu určenou přímo pro ultrafiltraci. Membrána pro ultrafiltraci se skládá ze dvou vrstev. První, obrácená směrem k ultrafiltrovanému roztoku, je tenká a obsahuje póry s přesně definovanou velikostí. Druhá vrstva je širší a obsahuje větší póry, jejichž velikost již nemusí být přesně určena. Při sestavování ultrafiltrační komůrky je důležité dbát na správnou orientaci membrány; strana přivrácená směrem k roztoku bývá obvykle hladší a při pohledu proti světlu se více leskne. V současnosti se vyrábí různé druhy membrán pro ultrafiltraci. Jejich hodnota cutoff se pohybuje v rozmezí od 0,5 kda po 1000 kda (membrána Millipore PCXK). Jednotlivé membrány se od sebe liší i materiálem, ze kterého jsou vyráběny. Je možné zakoupit membránu z acetátu celulosy, regenerované celulosy, hydrofilních polymerů, syntetických polymerů či inertních polymerů. Do pórů membrány jsou samozřejmě tlačeny i molekuly, jejichž hmotnost přesahuje hodnotu cut-off. Menší z nich mohou velmi pomalu projít přes membránu, jiné se však v pórech zapříčí a ucpou je. Aby k tomu nedocházelo, je při každé ultrafiltraci použito magnetické míchadlo. Jedná se o oblý tyčový magnet, který se vlivem otáčení magnetu v míchačce, na kterou je ultrafiltrační komůrka položena, otáčí a zajišťuje tak míchání kapaliny v ultrafiltrační komůrce. Elektromagnetické míchadlo se samozřejmě spolu s míchačkou nevyužívá jen při ultrafiltraci, ale všude tam, kde je třeba zajistit míchání roztoku. Na rozdíl od dialýzy je při ultrafiltraci pro urychlení procesu rozpouštědlo hnáno přes membránu tlakem. Tento tlak může být vytvořen přetlakem inertního plynu, nejčastěji dusíku, v ultrafiltrační komůrce, vakuem v nádobě pro zfiltrovaný roztok či centrifugací. Je-li makromolekulární látka, kterou chceme zahustit či odsolit, odolná vůči oxidaci vzdušným kyslíkem, je možné použít k vytvoření tlaku v komůrce namísto dusíku vzduch. Pro ultrafiltraci prováděnou při centrifugaci se vyrábí zvláštní kyvety pro použití v rotorech s fixním úhlem. Tyto kyvety umožňují v relativně krátké době zahuštění z několika ml i na méně než 100 µl. 14

15 Je-li účelem ultrafiltrace snížení koncentrace nízkomolekulárních látek v roztoku, přidává se k tomuto roztoku další roztok, který tyto kontaminanty neobsahuje, a tento roztok se zahustí na požadovaný objem. Tím dojde ke snížení koncentrace kontaminantu v koncentrátu. Je-li potřeba výrazné snížení koncentrace kontaminantů, je výhodnější použít opakovanou ultrafiltraci menším objemem než jednu ultrafiltraci menším objemem. Chceme-li například snížit koncentraci kontaminantu v 5 ml roztoku na 1 % původní koncentrace, potřebujeme při jedné ultrafiltraci přidat 495 ml čistého roztoku, zatímco při 2 ultrafiltracích použijeme vždy jen 45 ml čistého roztoku a při čtyřech ultrafiltracích jen po 11 ml roztoku. Spotřeba roztoku tak při dosažení stejného výsledku činí jen 18, resp. 9 % spotřeby při jednorázové ultrafiltraci. Výhodnost opakované ultrafiltrace stoupá s rostoucím poměrem mezi původní a požadovanou koncentrací ultrafiltrovaného roztoku. Bude-li třeba snížit koncentraci nízkomolekulárních kontaminant na setinu procenta, bude spotřeba promývacího roztoku při 2, resp. 4 ultrafiltracích činit jen 2, resp. 0,4 % spotřeby při jednorázové ultrafiltraci. Uvolnění cílové podjednotky z fúzního proteinu Štěpení fúzního proteinu specifickou endoproteázou Získání rekombinantního proteinu v aktivní a vysoce čisté formě je jedním ze základních metodik biotechnologického výzkumu. Při přípravě těchto proteinů se využívá fúzních proteinů, jejichž součástí je sekvence aminokyselin, která umožňuje jejich purifikaci. Tyto sekvence však mohou omezovat biologickou aktivitu sledovaného proteinu. Odštěpení těchto sekvencí pomocí specifických endoproteáz, enzymů štěpících určitou aminokyselinovou sekvenci, je často nezbytné pro další využití cílového proteinu. Specifické endoproteasy minimalizují nechtěné nespecifické štěpení, které se vyskytuje při štěpení fúzních proteinů chemickými látkami (bromkyan, hydroxylamin, ph). Příkladem specifických endoproteas je enterokinasa rozpoznávající aminosekvenci Asp-Asp-Asp-Asp-Lys X-, dále pak prolin, specifické endoproteasu hydrolyzující peptidy, endoproteáza AspN selektivně štěpící peptidové vazby mezi N-koncem a kyselinou aspartámovou, faktor Xa štěpící sekvenci Ile-Glu(nebo Asp)-Gly-Arg nebo trombin štěpící sekvenci Leu-Val-Pro-Arg Gly-Ser. Autokatalitická technika odštěpení fúzní kotvy od rekombinantního proteinu Purifikace fúzních a následně rekombinantních proteinů je proces zahrnující několik na sebe navazujících chromatografických purifikací, které musí být vždy optimalizovány. Pro zjednodušení tohoto procesu byla vyvinuta jednokroková afinitní purifikace fúzního proteinu, tedy cílového proteinu značeného afinitní koncovkou připojenou na n- nebo c- konec rekombinantního proteinu. Jako afinitní koncovka jsou 15

16 úspěšně používány malé peptidy, např. Poly-His, poly-arg, c.myc, Flag, nebo velké peptidy, např. Glutation s transferasa, doména vážící chitin. Abychom zajistili biologickou aktivitu rekombinantního proteinu, musíme tuto koncovku odstranit před jeho samotným využitím. Z tohoto důvodu je mezi rekombinantní protein a koncovku umístěna krátká aminokyselinová sekvence, která je rozpoznávána specifickou endoproteázou. Tento způsob přípravy rekombinantního proteinu má několik omezení: 1. Odseparování proteinu od fúzní koncovky a použité endoproteasy vyžaduje další purifikační krok. 2. Použité proteasy nejsou zcela specifické a mohou částečně štěpit cílový protein. 3. Štěpené místo může být nepřístupné pro endoproteasu. 4. Štěpení vyžaduje dlouhý reakční čas a je drahé. K překonání uvedených omezení byl vyvinut samoštěpící systém, kdy je tzv. Self processing modul umístěn mezi cílový protein a afinitní kotvou. Po navázání fúzního proteinu na kolonu a odmytí všech kontaminujících nečistot je štěpící aktivita samoštěpícího modulu aktivována malou molekulou a vyúsťuje v uvolnění rekombinantního proteinu s tím, že afinitní koncovka včetně samoštěpící modulu zůstává na koloně. Vhodný samoštěpící modul splňuje následující podmínky: 1. Štěpí pouze vazbu mezi cílovým proteinem a tímto modulem. 2. Není aktivován in vivo, pouze po cílené indukci in vitro. Izolace proteinu z inkluzních tělísek a jejich refoldování Přirozeně produkované proteiny jsou v buňce bezprostředně po translaci skládány do své nativní struktury. Ta je však v mnoha případech heterologní exprese (například eukaryontní proteiny exprimované v mikroorganismech) či po denaturační purifikaci narušena. Nesprávně složené proteiny vytváří v bakterii (pro nás nejdůležitější je E. coli) nerozpustné agregáty, tzv. Inkluzní tělíska. Ve formě inkluzních tělísek se tak vyskytují až tři čtvrtiny proteinů biotechnologicky exprimovaných v E. coli. Za stabilitu nativní konformace i za vznik inkluzních tělísek z nesprávně složených proteinů a jejich agregátů jsou odpovědny stejné typy interakcí. Jedná se o hydrofobní interakce mezi nepolárními vedlejšími řetězci aminokyselin uvnitř proteinu či inkluzního tělíska, iontové interakce a kovalentní či vodíkové vazby. Důvod vzniku inkluzních tělísek dosud není plně objasněn, ale předpokládá se, že proteiny jsou exprimovány ve větším množství, než je kapacita bakteriální buňky pro jejich správné skládání. Z toho vyplývají možnosti, jak se tvorbě inkluzních tělísek vyhnout. Často je účinné snížení teploty pro kultivaci exprimujících buněk z 37ºC na pokojovou teplotu a patřičné prodloužení doby exprese či použití lowcopy expresního plasmidu. Náročnější metodou je koexprese chaperonů potřebných pro skládání proteinu do správné konformace (u E. coli hlavně molekuly GroEl a GroEs). V některých případech se osvědčil krátký tepelný šok (42 C), po kterém dochází v exprimujících buňkách k přechodnému zvýšení exprese proteinů tepelného šoku zvyšujících stabilitu nascentních proteinů. Příznivý vliv na rozpustnost proteinů může mít 16

17 také typ připojené značky (Tagu). Fúze s doménovými nebo proteinovými značkami (celulose binding domains, glutathione s-transferase tag (GST), maltose-binding protein (MBP), thioredoxin (TRXA), transcription termination anti-termination factor (NUSA), protein disulfide isomerase i) často zvyšuje rozpustnost a stabilitu rekombinantních proteinů. Navíc některé značky jsou s výhodou použitelné pro afinitní purifikaci. Kvůli své velikosti ale pro většinu aplikací musejí být z proteinu po purifikaci odstraněny. V současné době je také možno použít speciální kmeny E. coli geneticky upravené pro expresi eukaryotických proteinů jako je kmen Rosseta TM nesoucí geny pro trna rozeznávající kodony vzácné v E. coli, kmen Origami TM mutovaný v genech pro thioredoxin reduktasu a glutathion reduktasu umožňující tak tvorbu disulfidických můstků v cytoplasmě nebo kmen Rrosseta-Gami TM kombinující obě tyto vlastnosti. Obrázek 5.1. Inkluzní tělíska v elektronové mikroskopii Inkluzní tělíska (označená šipkami) u kultury E. coli. (převzato z www stránek Working group downstream processing at the Department of biotechnology, University of Natural Resources and Applied Life Sciences Vienna, Vienna, Austria). Z inkluzních tělísek je možné získat funkční a správně složený protein a to často ve vyšší čistotě a koncentraci, než jakou můžeme dosáhnout při expresi proteinu za podmínek, kdy se inkluzní tělíska netvoří. Postup, který umožňuje převést protein 17

18 z inkluzních tělísek do nativní plně funkční podoby se nazývá refoldování. Jelikož není k dispozici univerzální refoldovací pufr a výsledek refoldování je poměrně nejistý, využívá se při produkci proteinů jen omezeně. Ačkoliv je refoldování poměrně levné a rychlé, mnoho pracovníků při expresi proteinu v nerozpustné formě volí změnu expresního systému. V současnosti je možno z inkluzních tělísek refoldovat více než polovinu proteinů. Pro ověření správné konformace získaného proteinu je třeba mít k dispozici nástroj potvrzující, že produkt je refoldování převeden do nativní formy. Je možno využít: - stanovení enzymové aktivity - ověření imunogenity experimentální vakcinací - stanovením reaktivity s protilátkami proti konformačním epitopům - ověření vazby na receptor nebo ligand - použití spektroskopických metod Obrázek 5.2. Schéma purifikace proteinu z inkluzních tělísek Inkluzní tělíska Denaturace a solubilizace (8M Urea, 6M Guanidin hydrochlorid, Mercaptoethanol, detergenty) Purifikace za denaturačních podmínek (afinitní chromatografie) Čistý denaturovaný solubilní protein Renaturace 18

19 Čím více je o daném proteinu známo, tím větší je pravděpodobnost úspěchu. Postup pro refoldování některých proteinů lze nalézt v databázích refoldování, jako je např. Refold, který je k dispozici na internetových stránkách melbournské univerzity monash (http://clims.med.monash.edu.au/). Inkluzní tělíska lze získat z buněk jejich lyzováním, centrifugací a promytím pelety roztokem tritonu x-100 nebo deoxycholátu. Rozpuštění (solubilizace) inkluzních tělísek vyžaduje narušení interakcí, které se podílejí na jejich vzniku a stabilitě. Toho je možné dosáhnout přídavkem chaotropních činidel (8M močovina, 8M hydrochlorid guanidinu apod.) Či detergentů (sarkosyl, SDS apod.) A redukčních činidel (2- merkatoethanol nebo dithiotreitol). Rychlejší a účinnější solubilizace se dosáhne použitím hydrochloridu guanidia, zatímco močovina je výhodnější při nanášení na gel pro SDS- PAGE elektroforézu. Proto se v mnoha protokolech v průběhu purifikace přechází z hydrochloridu guanidinu na močovinu, což může být provedeno např. při chromatografické purifikaci, kdy je na kolonu nanesen vzorek v roztoku hydrochloridu guanidinu, ale eluční pufr obsahuje močovinu. Samotné renaturaci často předchází purifikace denaturovaného proteinu. Nejvýhodnější je použití afinitní chromatografie v případě, že obsahuje polyhistidinovou značku, naopak problematické může být použití hydrofobní či iontoměničové chromatografie. Při renaturaci jsou solubilizační činidla odstraněna a nahrazena pufrem, jenž podporuje správné složení proteinu do aktivní formy a umožňuje následné použití proteinu, tj. Má pokud možno fyziologické ph a osmotický tlak. Je-li protein jednou správně složen, může být obvykle pro další použití rozpuštěn v různých pufrech. Jedna z prvních metod refoldování v roztoku využívala dialýzu. Protein v dialyzačním střívku je ve více krocích dialyzován za použití pufrů, které se svým složením postupně přibližují finálnímu refoldovacímu pufru. Při průtokové metodě se složení pufru nemění skokově, ale plynulým gradientem. Tato metoda vyžaduje desítky hodin a řádově litry pufrů. Nejdynamičtěji se rozvíjející metodou refoldování je rychlá diluční metoda, která je při nulových či nízkých zkušenostech s refoldováním nejvýhodnější. Protein se postupně po malých dávkách přidává do nadbytku nativního pufru za stálého míchání.. Jsou-li podmínky ideální, protein se po zředění v průběhu několika sekund správně složí do nativní konformace. Odstranění solubilizačních činidel a jejich nahrazení nativním pufrem může být také provedeno přímo na koloně při afinitní purifikaci, kdy eluován je již refoldovaný protein. 19

20 Do renaturačních pufrů se často přidávají aditiva, snižující agregaci proteinů a/nebo usnadňující tvorbu disulfidických vazeb. Patři mezi ně hlavně arginin (0,5 1m), glycerol, oxidovaný a redukovaný glutathion, dithiotreitol, polyethylen glykol, detergenty, edta atd. Efektivita aditiv je jen obtížně predikovatelná a jejich účinnost je nutno ověřovat empiricky. Je také možno zakoupit komerční refoldovací kity obsahující různé koncentrace a poměry aditiv, které mohou poskytnout za spotřeby minima vzorku cenné informace pro refolding ve větším měřítku. Metody sušení produktů Stabilizace biopolymerů a rekombinantních proteinů Proteiny jsou amfifilní molekuly, tedy molekuly mající jak hydrofobní, tak hydrofilní skupiny. Rozpustnost proteinu ve vodných roztocích úzce souvisí s jejich aminokyselinovým složením a jejich solvatačním obalem, tj. Vrstvou molekul vody a iontů, které obalují jejich molekuly. Příčinnou solvatačního obalu jsou elektrostatické síly mezi polárními strukturami proteinů a dipóly vody. Rozpustnost proteinů se s rostoucí koncentrací solí zpravidla nejprve zvyšuje (vsolovací efekt), prochází maximem a posléze klesá (vysolovací efekt). Vsolování je způsobeno vytvořením iontového oblaku kolem ionizovaných skupin biopolymeru dochází ke snížení interakce nabitých skupin biopolymeru mezi sebou a zvýšení interakcí s rozpouštědlem. Dalším přídavkem neutrální soli se snižuje tloušťka solvatačního obalu a efektivní koncentrace vody, a tím se snižuje i rozpustnost proteinu. Charakter závislosti rozpustnosti na koncentraci soli je určen nejen typem biopolymeru, ale i typem soli a hodnotou ph, nejnižší je rozpustnost v izoelektrickém bodě. Při frakcionaci organickými rozpouštědly mísitelnými s vodou (methanol, ethanol, aceton) se využívá rozdílná rozpustnost proteinu v těchto rozpouštědlech a ve vodě. Zvyšováním koncentrace organického rozpouštědla se zmenšuje i solvatační obal kolem molekul proteinu, což nakonec vede k jejich vysrážení. Frakcionace organickými rozpouštědly se může kombinovat se změnami koncentrace solí, ph a teploty. Proteiny i nukleové kyseliny jsou vysoce senzitivní, nepatrná změna některé z podmínek může způsobit jejich denaturaci, degradaci nebo změnu vlastností, které jsou nutné pro úspěšnou krystalizaci. Z tohoto důvodu musí být proteiny v hydratované formě udržovány při konstantním ph a teplotě. Krystaly makromolekul Obsahují průměrně 50 % rozpouštědla, většinou mají charakter gelu s mnoha intersticiálními prostory, kterými může proudit rozpouštědlo nebo difundovat malé 20

Autor prezentace: Mgr. Michal Křupka

Autor prezentace: Mgr. Michal Křupka Práce s inkluzními tělísky Refoldování Fúzní proteiny Autokatalitická technika odštěpení fúzní kotvy a její separace od rekombinantního proteinu Mgr. Michal Křupka Ústav imunologie LF UP Inkluzní tělíska

Více

Princip ionexové chromatografie a analýza aminokyselin

Princip ionexové chromatografie a analýza aminokyselin Princip ionexové chromatografie a analýza aminokyselin Teoretická část: vysvětlení principu ionexové (iontové) chromatografie, příprava vzorku pro analýzu aminokyselin (kyselá a alkalická hydrolýza), derivatizace

Více

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie Vysokoúčinná kapalinová chromatografie HPLC High Performance Liquid Chromatography Vysokoúčinná...X... Vysoceúčinná kapalinová chromatografie RRLC Rapid Resolution Liquid Chromatography Rychle rozlišovací

Více

ZŠ ÚnO, Bratří Čapků 1332

ZŠ ÚnO, Bratří Čapků 1332 Animovaná chemie Top-Hit Analytická chemie Analýza anorganických látek Důkaz aniontů Důkaz kationtů Důkaz kyslíku Důkaz vody Gravimetrická analýza Hmotnostní spektroskopie Chemická analýza Nukleární magnetická

Více

V organismu se bílkoviny nedají nahradit žádnými jinými sloučeninami, jen jako zdroj energie je mohou nahradit sacharidy a lipidy.

V organismu se bílkoviny nedají nahradit žádnými jinými sloučeninami, jen jako zdroj energie je mohou nahradit sacharidy a lipidy. BÍLKOVINY Bílkoviny jsou biomakromolekulární látky, které se skládají z velkého počtu aminokyselinových zbytků. Vytvářejí látkový základ života všech organismů. V tkáních vyšších organismů a člověka je

Více

Analýza kofeinu v kávě pomocí kapalinové chromatografie

Analýza kofeinu v kávě pomocí kapalinové chromatografie Analýza kofeinu v kávě pomocí kapalinové chromatografie Kofein (obr.1) se jako přírodní alkaloid vyskytuje v mnoha rostlinách (např. fazolích, kakaových bobech, černém čaji apod.) avšak nejvíce je spojován

Více

Látky obsahují aminoskupinu

Látky obsahují aminoskupinu Látky obsahují aminoskupinu pro aminy a aminokyseliny se běžně používají derivatizace (viz kapitola o derivatizaci), peptidy lze detekovat přímo při krátkých UV vlnových délkách (amidická vazba 200 nm),

Více

DOUČOVÁNÍ KVINTA CHEMIE

DOUČOVÁNÍ KVINTA CHEMIE 1. ÚVOD DO STUDIA CHEMIE 1) Co studuje chemie? 2) Rozděl chemii na tři důležité obory. DOUČOVÁNÍ KVINTA CHEMIE 2. NÁZVOSLOVÍ ANORGANICKÝCH SLOUČENIN 1) Pojmenuj: BaO, N 2 0, P 4 O 10, H 2 SO 4, HMnO 4,

Více

Molekulová spektroskopie 1. Chemická vazba, UV/VIS

Molekulová spektroskopie 1. Chemická vazba, UV/VIS Molekulová spektroskopie 1 Chemická vazba, UV/VIS 1 Chemická vazba Silová interakce mezi dvěma atomy. Chemické vazby jsou soudržné síly působící mezi jednotlivými atomy nebo ionty v molekulách. Chemická

Více

Separační metody SEPARAČNÍ (DĚLÍCÍ) METODY CHROMATOGRAFIE ROZDĚLENÍ SEPARAČNÍCH METOD. www.natur.cuni.cz/~suchan. Jana Sobotníková

Separační metody SEPARAČNÍ (DĚLÍCÍ) METODY CHROMATOGRAFIE ROZDĚLENÍ SEPARAČNÍCH METOD. www.natur.cuni.cz/~suchan. Jana Sobotníková Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta Katedra analytické chemie Separační metody Jana Sobotníková tel.: 221951230 e-mail: jana.sobotnikova@natur.cuni.cz www.natur.cuni.cz/~suchan *přednášky

Více

Sbohem, paní Bradfordová

Sbohem, paní Bradfordová Sbohem, paní Bradfordová aneb IČ spektroskopie ve službách kvantifikace proteinů Mgr. Stanislav Kukla Merck spol. s r. o. Agenda 1 Zhodnocení současných možností kvantifikace proteinů Bradfordové metoda

Více

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU MELAMINU A KYSELINY KYANUROVÉ METODOU LC-MS

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU MELAMINU A KYSELINY KYANUROVÉ METODOU LC-MS Národní referenční laboratoř Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU MELAMINU A KYSELINY KYANUROVÉ METODOU LC-MS 1 Rozsah a účel Postup je určen pro stanovení obsahu melaminu a kyseliny kyanurové v krmivech. 2 Princip

Více

Chemická vazba. Příčinou nestability atomů a jejich ochoty tvořit vazbu je jejich elektronový obal.

Chemická vazba. Příčinou nestability atomů a jejich ochoty tvořit vazbu je jejich elektronový obal. Chemická vazba Volné atomy v přírodě jen zcela výjimečně (vzácné plyny). Atomy prvků mají snahu se navzájem slučovat a vytvářet molekuly prvků nebo sloučenin. Atomy jsou v molekulách k sobě poutány chemickou

Více

OBSAH 1. ÚVOD... 5 2. SEPARAČNÍ TECHNIKY BIOMAKROMOLEKUL...

OBSAH 1. ÚVOD... 5 2. SEPARAČNÍ TECHNIKY BIOMAKROMOLEKUL... OBSAH 1. ÚVOD...5 2. SEPARAČNÍ TECHNIKY BIOMAKROMOLEKUL...8 2.1 FÁZOVÉ SEPARACE...8 2.1.1 Klasické separační techniky...8 2.1.2 Extrakce do dvoufázových vodných systémů...15 2.2 MEMBRÁNOVÉ PROCESY...21

Více

Praktický kurz Monitorování hladiny metalothioneinu po působení iontů těžkých kovů Vyhodnocení měření

Praktický kurz Monitorování hladiny metalothioneinu po působení iontů těžkých kovů Vyhodnocení měření Laboratoř Metalomiky a Nanotechnologií Praktický kurz Monitorování hladiny metalothioneinu po působení iontů těžkých kovů Vyhodnocení měření Vyučující: Ing. et Ing. David Hynek, Ph.D., Prof. Ing. René

Více

Tabulace učebního plánu. Obecná chemie. Vzdělávací obsah pro vyučovací předmět : Ročník: 1.ročník a kvinta

Tabulace učebního plánu. Obecná chemie. Vzdělávací obsah pro vyučovací předmět : Ročník: 1.ročník a kvinta Tabulace učebního plánu Vzdělávací obsah pro vyučovací předmět : CHEMIE Ročník: 1.ročník a kvinta Obecná Bezpečnost práce Názvosloví anorganických sloučenin Zná pravidla bezpečnosti práce a dodržuje je.

Více

Chromatografie Královna analýz

Chromatografie Královna analýz Chromatografie Královna analýz Monika Klusáčková monika.klusackova@jh-inst.cas.cz Ústav fyzikální chemie J.Heyrovského, AVČR, v.v.i. Analytická chemie Jaké látky se nachází ve vzorku? kvalitativní složení

Více

Eva Benešová. Dýchací řetězec

Eva Benešová. Dýchací řetězec Eva Benešová Dýchací řetězec Dýchací řetězec Během oxidace látek vstupujících do různých metabolických cyklů (glykolýza, CC, beta-oxidace MK) vznikají NADH a FADH 2, které následně vstupují do DŘ. V DŘ

Více

Gymnázium Vysoké Mýto nám. Vaňorného 163, 566 01 Vysoké Mýto

Gymnázium Vysoké Mýto nám. Vaňorného 163, 566 01 Vysoké Mýto Gymnázium Vysoké Mýto nám. Vaňorného 163, 566 01 Vysoké Mýto SUBSTITUČNÍ DERIVÁTY KARBOXYLOVÝCH O KYSELIN R C O X karboxylových kyselin - substituce na vedlejším uhlovodíkovém řetězci aminokyseliny - hydroxykyseliny

Více

Lodish et al, Molecular Cell Biology, 4-6 vydání Alberts et al, Molecular Biology of the Cell, 4 vydání

Lodish et al, Molecular Cell Biology, 4-6 vydání Alberts et al, Molecular Biology of the Cell, 4 vydání Lodish et al, Molecular Cell Biology, 4-6 vydání Alberts et al, Molecular Biology of the Cell, 4 vydání http://web.natur.cuni.cz/~zdenap/zdenateachingnf.html CHEMICKÉ SLOŽENÍ BUŇKY BUŇKA: 99 % C, H, N,

Více

Ing. Libor Vodehnal, AITEC s.r.o., Ledeč nad Sázavou

Ing. Libor Vodehnal, AITEC s.r.o., Ledeč nad Sázavou Základní parametry procesů likvidace odpadních vod s obsahem těžkých kovů Ing. Libor Vodehnal, AITEC s.r.o., Ledeč nad Sázavou Technologie likvidace OV z obsahem těžkých kovů lze rozdělit na 3 skupiny:

Více

Využití UV/VIS a IR spektrometrie v analýze potravin

Využití UV/VIS a IR spektrometrie v analýze potravin Využití UV/VIS a IR spektrometrie v analýze potravin Chemické laboratorní metody v analýze potravin MVDr. Zuzana Procházková, Ph.D. MVDr. Michaela Králová, Ph.D. Spektrometrie: základy Interakce záření

Více

Aminokyseliny, proteiny, enzymologie

Aminokyseliny, proteiny, enzymologie Aminokyseliny, proteiny, enzymologie Aminokyseliny Co to je? Organické látky karboxylové kyseliny, které mají na sousedním uhlíku navázanou aminoskupinu Jak to vypadá? K čemu je to dobré? AK jsou stavební

Více

TEST + ŘEŠENÍ. PÍSEMNÁ ČÁST PŘIJÍMACÍ ZKOUŠKY Z CHEMIE bakalářský studijní obor Bioorganická chemie 2010

TEST + ŘEŠENÍ. PÍSEMNÁ ČÁST PŘIJÍMACÍ ZKOUŠKY Z CHEMIE bakalářský studijní obor Bioorganická chemie 2010 30 otázek maximum: 60 bodů TEST + ŘEŠEÍ PÍSEMÁ ČÁST PŘIJÍMACÍ ZKUŠKY Z CEMIE bakalářský studijní obor Bioorganická chemie 2010 1. apište názvy anorganických sloučenin: (4 body) 4 BaCr 4 kyselina peroxodusičná

Více

BÍLKOVINY HLÍZ BRAMBOR

BÍLKOVINY HLÍZ BRAMBOR Jihočeská univerzita v Českých Budějovicích ZEMĚDĚLSKÁ FAKULTA BÍLKOVINY HLÍZ BRAMBOR jejich izolace a možnosti uplatnění Jan Bárta a kol. 19. května 2015, České Budějovice Kancelář transferu technologií

Více

CHEMIE. Pracovní list č. 10 - žákovská verze Téma: Bílkoviny. Mgr. Lenka Horutová

CHEMIE. Pracovní list č. 10 - žákovská verze Téma: Bílkoviny. Mgr. Lenka Horutová www.projektsako.cz CHEMIE Pracovní list č. 10 - žákovská verze Téma: Bílkoviny Lektor: Mgr. Lenka Horutová Projekt: Student a konkurenceschopnost Reg. číslo: CZ.1.07/1.1.07/03.0075 Teorie: Název proteiny

Více

Přípravný kurz k přijímacím zkouškám. Obecná a anorganická chemie. RNDr. Lukáš Richtera, Ph.D. Ústav chemie materiálů Fakulta chemická VUT v Brně

Přípravný kurz k přijímacím zkouškám. Obecná a anorganická chemie. RNDr. Lukáš Richtera, Ph.D. Ústav chemie materiálů Fakulta chemická VUT v Brně Přípravný kurz k přijímacím zkouškám Obecná a anorganická chemie RNDr. Lukáš Richtera, Ph.D. Ústav chemie materiálů Fakulta chemická VUT v Brně část III. - 23. 3. 2013 Hmotnostní koncentrace udává se jako

Více

ZŠ ÚnO, Bratří Čapků 1332

ZŠ ÚnO, Bratří Čapků 1332 Úvodní obrazovka Menu (vlevo nahoře) Návrat na hlavní stránku Obsah Výsledky Poznámky Záložky edunet Konec Chemie 1 (pro 12-16 let) LangMaster Obsah (střední část) výběr tématu - dvojklikem v seznamu témat

Více

Absorpční fotometrie

Absorpční fotometrie Absorpční fotometrie - v ultrafialové (UV) a viditelné (VIS) oblasti přechody mezi elektronovými stavy +... - v infračervené (IČ) oblasti přechody mezi vibračními stavy +... - v mikrovlnné oblasti přechody

Více

06. Plynová chromatografie (GC)

06. Plynová chromatografie (GC) 06. Plynová chromatografie (GC) Plynová chromatografie je analytická a separační metoda, která má výsadní postavení v analýze těkavých látek. Mezi hlavní výhody této techniky patří jednoduché a rychlé

Více

Nukleární Overhauserův efekt (NOE)

Nukleární Overhauserův efekt (NOE) Nukleární Overhauserův efekt (NOE) NOE je důsledek dipolární interakce mezi dvěma jádry. Vzniká přímou interakcí volně přes prostor, tudíž není ovlivněn chemickými vazbami jako nepřímá spin-spinová interakce.

Více

Sešit pro laboratorní práci z chemie

Sešit pro laboratorní práci z chemie Sešit pro laboratorní práci z chemie téma: Reakce aminokyselin a bílkovin autor: MVDr. Alexandra Gajová vytvořeno při realizaci projektu: Inovace školního vzdělávacího programu biologie a chemie registrační

Více

NMR spektroskopie. Úvod

NMR spektroskopie. Úvod NMR spektroskopie Úvod Zkratka NMR znamená Nukleární Magnetická Rezonance. Jde o analytickou metodu, která na základě absorpce radiofrekvenčního záření vzorkem umístěným v silném magnetickém poli poskytuje

Více

Didaktické testy z biochemie 1

Didaktické testy z biochemie 1 Didaktické testy z biochemie 1 Trávení Milada Roštejnská elena Klímová Trávení br. 1. Trávicí soustava Rubrika A Z pěti možných odpovědí (alternativ) vyberte tu nejsprávnější. A B D E 1 Mezi monosacharidy

Více

Určení koncentrace proteinu fluorescenční metodou v mikrotitračních destičkách

Určení koncentrace proteinu fluorescenční metodou v mikrotitračních destičkách Určení koncentrace proteinu fluorescenční metodou v mikrotitračních destičkách Teorie Stanovení celkových proteinů Celkové množství proteinů lze stanovit pomocí několika metod; například: Hartree-Lowryho

Více

Inovace profesní přípravy budoucích učitelů chemie

Inovace profesní přípravy budoucích učitelů chemie Inovace profesní přípravy budoucích učitelů chemie I n v e s t i c e d o r o z v o j e v z d ě l á v á n í CZ.1.07/2.2.00/15.0324 Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem

Více

Biogenníaminy. pro HPLC. Dny kontroly kvality a speciálních metod HPLC Bio-Rad Lednice 8.-9. Listopadu, 2012

Biogenníaminy. pro HPLC. Dny kontroly kvality a speciálních metod HPLC Bio-Rad Lednice 8.-9. Listopadu, 2012 Bio-Rad Laboratories Munich Manufacturing Biogenníaminy pro HPLC Dny kontroly kvality a speciálních metod HPLC Bio-Rad Lednice 8.-9. Listopadu, 2012 Bio-Rad Laboratories München, Germany Biogenníaminy

Více

Potravinářské aplikace

Potravinářské aplikace Potravinářské aplikace Nanodisperze a nanokapsle Funkční složky (např. léky, vitaminy, antimikrobiální prostředky, antioxidanty, aromatizující látky, barviva a konzervační prostředky) jsou základními složkami

Více

Chemická vazba Něco málo opakování Něco málo opakování Co je to atom? Něco málo opakování Co je to atom? Atom je nejmenší částice hmoty, chemicky dále nedělitelná. Skládá se z atomového jádra obsahujícího

Více

Výukový materiál zpracován v rámci projektu EU peníze školám Registrační číslo projektu: CZ.1.07/1.5.00/34.0996

Výukový materiál zpracován v rámci projektu EU peníze školám Registrační číslo projektu: CZ.1.07/1.5.00/34.0996 Výukový materiál zpracován v rámci projektu EU peníze školám Registrační číslo projektu: CZ.1.07/1.5.00/34.0996 Šablona: III/2 č. materiálu: VY_32_INOVACE_CHE_413 Jméno autora: Mgr. Alena Krejčíková Třída/ročník:

Více

Studijní materiál. Úvod do problematiky extrakčních metod. Vypracoval: RNDr. Ivana Borkovcová, Ph.D.

Studijní materiál. Úvod do problematiky extrakčních metod. Vypracoval: RNDr. Ivana Borkovcová, Ph.D. Studijní materiál Úvod do problematiky extrakčních metod Vypracoval: RNDr. Ivana Borkovcová, Ph.D. Úvod do problematiky extrakčních metod Definice, co je to extrakce separační proces v kontaktu jsou dvě

Více

Výukový materiál zpracován v rámci projektu EU peníze školám Registrační číslo projektu: CZ.1.07/1.5.00/34.0996

Výukový materiál zpracován v rámci projektu EU peníze školám Registrační číslo projektu: CZ.1.07/1.5.00/34.0996 Výukový materiál zpracován v rámci projektu EU peníze školám Registrační číslo projektu: CZ.1.07/1.5.00/34.0996 Šablona: III/2 č. materiálu: VY_32_INOVACE_CHE_419 Jméno autora: Třída/ročník: Mgr. Alena

Více

Příprava materiálu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253

Příprava materiálu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253 Příprava materiálu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253 Část 24 Speciální metody Mikro HPLC, kapilární HPLC a LC na čipu Většina v současnosti používaných kolon má vnitřní průměr 4,6 mm,

Více

Membránové procesy v mlékárenském průmyslu

Membránové procesy v mlékárenském průmyslu Membránové procesy v mlékárenském průmyslu situace v ČR, jak to je rozmanité, jak to nemusí být jednoduché Ing. Jan Drbohlav, CSc., Výzkumný ústav mlékárenský drbohlav@milcom-as.cz Membránové procesy v

Více

Výukové texty pro předmět Měřící technika (KKS/MT) na téma Podklady k principu měření hodnoty ph a vodivosti kapalin

Výukové texty pro předmět Měřící technika (KKS/MT) na téma Podklady k principu měření hodnoty ph a vodivosti kapalin Výukové texty pro předmět Měřící technika (KKS/MT) na téma Podklady k principu měření hodnoty ph a vodivosti kapalin Autor: Doc. Ing. Josef Formánek, Ph.D. Podklady k principu měření hodnoty ph a vodivosti

Více

Úvod do studia organické chemie

Úvod do studia organické chemie Úvod do studia organické chemie 1828... Wöhler... uměle připravil močovinu Organická chemie - chemie sloučenin uhlíku a vodíku, případně dalších prvků (O, N, X, P, S) Příčiny stability uhlíkových řetězců:

Více

Příprava materiálu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253

Příprava materiálu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253 Příprava materiálu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253 Část 19 Chirální separace Enantiomery jsou molekuly, které nejsou ztotožnitelné se svými zrcadlovými obrazy. Obě zrcadlové formy

Více

Spektroskopie v UV-VIS oblasti. UV-VIS spektroskopie. Roztok KMnO 4. pracuje nejčastěji v oblasti 200-800 nm

Spektroskopie v UV-VIS oblasti. UV-VIS spektroskopie. Roztok KMnO 4. pracuje nejčastěji v oblasti 200-800 nm Spektroskopie v UV-VIS oblasti UV-VIS spektroskopie pracuje nejčastěji v oblasti 2-8 nm lze měřit i < 2 nm či > 8 nm UV VIS IR Ultra Violet VISible Infra Red Roztok KMnO 4 roztok KMnO 4 je červenofialový

Více

ÚVOD DO BIOCHEMIE. Dělení : 1)Popisná = složení org., struktura a vlastnosti látek 2)Dynamická = energetické změny

ÚVOD DO BIOCHEMIE. Dělení : 1)Popisná = složení org., struktura a vlastnosti látek 2)Dynamická = energetické změny BIOCHEMIE 1 ÚVOD DO BIOCHEMIE BCH zabývá se chemickými procesy v organismu a chemickým složením živých organismů Biologie: bios = život + logos = nauka Biochemie: bios = život + chemie Dělení : Chemie

Více

TUKY. Autor: Mgr. Stanislava Bubíková. Datum (období) tvorby: 15. 3. 2013. Ročník: devátý

TUKY. Autor: Mgr. Stanislava Bubíková. Datum (období) tvorby: 15. 3. 2013. Ročník: devátý TUKY Autor: Mgr. Stanislava Bubíková Datum (období) tvorby: 15. 3. 2013 Ročník: devátý Vzdělávací oblast: Člověk a příroda / Chemie / Organické sloučeniny 1 Anotace: Žáci se seznámí s lipidy. V rámci tohoto

Více

Základy NIR spektrometrie a její praktické využití

Základy NIR spektrometrie a její praktické využití Nicolet CZ s.r.o. The world leader in serving science Základy NIR spektrometrie a její praktické využití NIR praktická metoda molekulové spektroskopie, nahrazující pracnější, časově náročnější a dražší

Více

Interakce proteinu p53 s genomovou DNA v kontextu chromatinu glioblastoma buněk

Interakce proteinu p53 s genomovou DNA v kontextu chromatinu glioblastoma buněk MASARYKOVA UNIVERZITA V BRNĚ Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie Oddělení genetiky a molekulární biologie Interakce proteinu p53 s genomovou DNA v kontextu chromatinu glioblastoma buněk

Více

Koloidní zlato. Tradiční rekvizita alchymistů v minulosti sofistikovaný (nano)nástroj budoucnosti?

Koloidní zlato. Tradiční rekvizita alchymistů v minulosti sofistikovaný (nano)nástroj budoucnosti? Koloidní zlato Tradiční rekvizita alchymistů v minulosti sofistikovaný (nano)nástroj budoucnosti? Dominika Jurdová Gymnázium Velké Meziříčí, D.Jurdova@seznam.cz Tereza Bautkinová Gymnázium Botičská, tereza.bautkinova@gybot.cz

Více

Detekce a detektory část 2

Detekce a detektory část 2 Detekce a detektory část 2 Ivan Mikšík Fyziologický ústav AV ČR, v.v.i. Praha Spojení (spřažení) hmotnostní spektrometrie a separačních technik Analýza složitých směsí (nejdříve separace, poté analýza)

Více

Využití membránových procesů při zpracování syrovátky

Využití membránových procesů při zpracování syrovátky Seminář Membránové procesy v mlékárenství Pardubice 7. 5. 2013 Využití membránových procesů při zpracování syrovátky Jiří Štětina Ústav mléka, tuků a kosmetiky Osnova Charakterizace syrovátky přehled membránových

Více

ANODA KATODA elektrolyt:

ANODA KATODA elektrolyt: Ukázky z pracovních listů 1) Naznač pomocí šipek, které částice putují k anodě a které ke katodě. Co je elektrolytem? ANODA KATODA elektrolyt: Zn 2+ Cl - Zn 2+ Zn 2+ Cl - Cl - Cl - Cl - Cl - Zn 2+ Cl -

Více

VYHODNOCOVÁNÍ CHROMATOGRAFICKÝCH DAT

VYHODNOCOVÁNÍ CHROMATOGRAFICKÝCH DAT VYHDNCVÁNÍ CHRMATGRAFICKÝCH DAT umístění práce: laboratoř č. S31 vedoucí práce: Ing. J. Krupka 1. Cíl práce: Seznámení s možnostmi, které poskytuje GC chromatografie pro kvantitativní a kvalitativní analýzu.

Více

Derivační spektrofotometrie a rozklad absorpčního spektra

Derivační spektrofotometrie a rozklad absorpčního spektra Derivační spektrofotometrie a rozklad absorpčního spektra Teorie: Derivační spektrofotometrie, využívající derivace absorpční křivky, je obecně používanou metodou pro zvýraznění detailů průběhu záznamu,

Více

Metody využívající rentgenové záření. Rentgenovo záření. Vznik rentgenova záření. Metody využívající RTG záření

Metody využívající rentgenové záření. Rentgenovo záření. Vznik rentgenova záření. Metody využívající RTG záření Metody využívající rentgenové záření Rentgenovo záření Rentgenografie, RTG prášková difrakce 1 2 Rentgenovo záření Vznik rentgenova záření X-Ray Elektromagnetické záření Ionizující záření 10 nm 1 pm Využívá

Více

Vitamin C důkaz, vlastnosti

Vitamin C důkaz, vlastnosti Předmět: Doporučený ročník: 4. - 5. ročník Zařazení do ŠVP: biochemie, přírodní látky, vitaminy Doba trvání pokusu: 45 minut Seznam pomůcek: zkumavky, kádinky, pipety (automatické), míchací tyčinky, odměrné

Více

Chemie - 8. ročník (RvTv)

Chemie - 8. ročník (RvTv) Chemie - 8. ročník (RvTv) Školní výstupy Učivo Vztahy charakterizuje chemii jako jednu z přírodních věd, rozlišuje a definuje jednotlivé chemické obory, rozlišuje látky a tělesa analyzuje fyzikální a chemické

Více

test zápočet průměr známka

test zápočet průměr známka Zkouškový test z FCH mikrosvěta 6. ledna 2015 VZOR/1 jméno test zápočet průměr známka Čas 90 minut. Povoleny jsou kalkulačky. Nejsou povoleny žádné písemné pomůcky. U otázek označených symbolem? uvádějte

Více

Organická chemie 3.ročník studijního oboru - kosmetické služby.

Organická chemie 3.ročník studijního oboru - kosmetické služby. Organická chemie 3.ročník studijního oboru - kosmetické služby. T-7 Funkční a substituční deriváty karboxylových kyselin Zpracováno v rámci projektu Zlepšení podmínek ke vzdělávání Registrační číslo projektu:

Více

Měření ph nápojů a roztoků

Měření ph nápojů a roztoků Měření ph nápojů a roztoků vzorová úloha (ZŠ) Jméno Třída.. Datum.. 1 Teoretický úvod Kyselý nebo zásaditý roztok? Proč je ocet považován za kyselý roztok? Ocet obsahuje nadbytek (oxoniových kationtů).

Více

Konsultační hodina. základy biochemie pro 1. ročník. Přírodní látky Úvod do metabolismu Glykolysa Krebsův cyklus Dýchací řetězec Fotosynthesa

Konsultační hodina. základy biochemie pro 1. ročník. Přírodní látky Úvod do metabolismu Glykolysa Krebsův cyklus Dýchací řetězec Fotosynthesa Konsultační hodina základy biochemie pro 1. ročník Přírodní látky Úvod do metabolismu Glykolysa Krebsův cyklus Dýchací řetězec Fotosynthesa Přírodní látky 1 Co to je? Cukry (Sacharidy) Organické látky,

Více

PROTOKOL WESTERN BLOT

PROTOKOL WESTERN BLOT WESTERN BLOT 1. PŘÍPRAVA ELEKTROFORETICKÉ APARATURY Saponátem a vodou se důkladně umyjí skla, plastové vložky a hřebínek, poté se důkladně opláchnou deionizovanou/destilovanou vodou a etanolem a nechají

Více

Absorpční spektroskopie při biologické analýze molekul

Absorpční spektroskopie při biologické analýze molekul Absorpční spektroskopie při biologické analýze molekul Pokročilé biofyzikální metody v experimentální biologii Ctirad Hofr 8.11.2007 7 1 UV spektroskopie DNA a proteinů Všechny atomy absorbují v UV oblasti

Více

VI. Disociace a iontové rovnováhy

VI. Disociace a iontové rovnováhy VI. Disociace a iontové 1 VI. Disociace a iontové 6.1 Základní pojmy 6.2 Disociace 6.3 Elektrolyty 6.3.1 Iontová rovnováha elektrolytů 6.3.2 Roztoky ideální a reálné 6.4 Teorie kyselin a zásad 6.4.1 Arrhenius

Více

Gymnázium a Střední odborná škola, Rokycany, Mládežníků 1115

Gymnázium a Střední odborná škola, Rokycany, Mládežníků 1115 Číslo projektu: Gymnázium a Střední odborná škola, Rokycany, Mládežníků 1115 Číslo šablony: 31 Název materiálu: Ročník: Identifikace materiálu: Jméno autora: Předmět: Tématický celek: Anotace: CZ.1.07/1.5.00/3.0

Více

Využití technologie Ink-jet printing pro přípravu mikro a nanostruktur II.

Využití technologie Ink-jet printing pro přípravu mikro a nanostruktur II. Ústav fyziky a měřicí techniky Vysoká škola chemicko-technologická v Praze Využití technologie Ink-jet printing pro přípravu mikro a nanostruktur II. Výrobci, specializované technologie a aplikace Obsah

Více

Bílkoviny. Charakteristika a význam Aminokyseliny Peptidy Struktura bílkovin Významné bílkoviny

Bílkoviny. Charakteristika a význam Aminokyseliny Peptidy Struktura bílkovin Významné bílkoviny Bílkoviny harakteristika a význam Aminokyseliny Peptidy Struktura bílkovin Významné bílkoviny 1) harakteristika a význam Makromolekulární látky složené z velkého počtu aminokyselinových zbytků V tkáních

Více

Obor Aplikovaná chemie ŠVP Aplikovaná chemie, životní prostředí, farmaceutické substance Maturitní témata Chemie

Obor Aplikovaná chemie ŠVP Aplikovaná chemie, životní prostředí, farmaceutické substance Maturitní témata Chemie STŘEDNÍ ŠKOLA INFORMATIKY A SLUŽEB ELIŠKY KRÁSNOHORSKÉ 2069 DVŮR KRÁLOVÉ N. L. Obor Aplikovaná chemie ŠVP Aplikovaná chemie, životní prostředí, farmaceutické substance Maturitní témata Chemie Školní rok:

Více

Dělení a svařování svazkem plazmatu

Dělení a svařování svazkem plazmatu Dělení a svařování svazkem plazmatu RNDr. Libor Mrňa, Ph.D. Osnova: Fyzikální podstat plazmatu Zdroje průmyslového plazmatu Dělení materiálu plazmou Svařování plazmovým svazkem Mikroplazma Co je to plazma?

Více

Vyšší odborná škola, Obchodní akademie a Střední odborná škola EKONOM, o. p. s. Litoměřice, Palackého 730/1

Vyšší odborná škola, Obchodní akademie a Střední odborná škola EKONOM, o. p. s. Litoměřice, Palackého 730/1 DUM Základy přírodních věd DUM III/2-T3-2-20 Téma: Test obecná chemie Střední škola Rok: 2012 2013 Varianta: A Test obecná chemie Zpracoval: Mgr. Pavel Hrubý Mgr. Josef Kormaník TEST Otázka 1 OsO 4 je

Více

Uhlíkové struktury vázající ionty těžkých kovů

Uhlíkové struktury vázající ionty těžkých kovů Uhlíkové struktury vázající ionty těžkých kovů 7. června/june 2013 9:30 h 17:30 h Laboratoř metalomiky a nanotechnologií, Mendelova univerzita v Brně a Středoevropský technologický institut Budova D, Zemědělská

Více

5. Příjem, asimilace a fyziologické dopady anorganického dusíku. 5. Příjem, asimilace a fyziologické dopady anorganického dusíku

5. Příjem, asimilace a fyziologické dopady anorganického dusíku. 5. Příjem, asimilace a fyziologické dopady anorganického dusíku 5. Příjem, asimilace a fyziologické dopady anorganického dusíku Zdroje dusíku dostupné v půdě: Amonné ionty + Dusičnany = největší zdroj dusíku v půdě Organický dusík (aminokyseliny, aminy, ureidy) zpracování

Více

2. PROTOLYTICKÉ REAKCE

2. PROTOLYTICKÉ REAKCE 2. PROTOLYTICKÉ REAKCE Protolytické reakce představují všechny reakce spojené s výměnou protonů a jsou označovány jako reakce acidobazické. Teorie Arrheniova (1884): kyseliny disociují ve vodě na vodíkový

Více

Chemie 8.ročník. Rozpracované očekávané výstupy žáka Učivo Přesuny, OV a PT. Pozorování, pokus a bezpečnost práce předmět chemie,význam

Chemie 8.ročník. Rozpracované očekávané výstupy žáka Učivo Přesuny, OV a PT. Pozorování, pokus a bezpečnost práce předmět chemie,význam Chemie 8.ročník Zařadí chemii mezi přírodní vědy. Pozorování, pokus a bezpečnost práce předmět chemie,význam Popisuje vlastnosti látek na základě pozorování, měření a pokusů. těleso,látka (vlastnosti látek)

Více

CHEMIE. Pracovní list č. 7 - žákovská verze Téma: ph. Mgr. Lenka Horutová. Projekt: Student a konkurenceschopnost Reg. číslo: CZ.1.07/1.1.07/03.

CHEMIE. Pracovní list č. 7 - žákovská verze Téma: ph. Mgr. Lenka Horutová. Projekt: Student a konkurenceschopnost Reg. číslo: CZ.1.07/1.1.07/03. www.projektsako.cz CHEMIE Pracovní list č. 7 - žákovská verze Téma: ph Lektor: Mgr. Lenka Horutová Projekt: Student a konkurenceschopnost Reg. číslo: CZ.1.07/1.1.07/03.0075 Teorie: Pro snadnější výpočet

Více

energetického využití odpadů, odstraňování produktů energetického využití odpadů, hodnocení dopadů těchto technologií na prostředí.

energetického využití odpadů, odstraňování produktů energetického využití odpadů, hodnocení dopadů těchto technologií na prostředí. Příjemce projektu: Partner projektu: Místo realizace: Ředitel výzkumného institutu: Celkové způsobilé výdaje projektu: Dotace poskytnutá EU: Dotace ze státního rozpočtu ČR: VŠB Technická univerzita Ostrava

Více

FLUORIMETRICKÉ STANOVENÍ FLUORESCEINU

FLUORIMETRICKÉ STANOVENÍ FLUORESCEINU FLUORIMETRICKÉ STANOVENÍ FLUORESCEINU návod vznikl jako součást bakalářské práce Martiny Vidrmanové Fluorimetrie s využitím spektrofotometru SpectroVis Plus firmy Vernier (http://is.muni.cz/th/268973/prif_b/bakalarska_prace.pdf)

Více

Laboratoř ze speciální analýzy potravin II. Úloha 3 - Plynová chromatografie (GC-MS)

Laboratoř ze speciální analýzy potravin II. Úloha 3 - Plynová chromatografie (GC-MS) 1 Úvod... 1 2 Cíle úlohy... 2 3 Předpokládané znalosti... 2 4 Autotest základních znalostí... 2 5 Základy práce se systémem GC-MS (EI)... 3 5.1 Parametry plynového chromatografu... 3 5.2 Základní charakteristiky

Více

Vyjadřuje poměr hmotnosti rozpuštěné látky k hmotnosti celého roztoku.

Vyjadřuje poměr hmotnosti rozpuštěné látky k hmotnosti celého roztoku. Koncentrace roztoků Hmotnostní zlomek w Vyjadřuje poměr hmotnosti rozpuštěné látky k hmotnosti celého roztoku. w= m A m s m s...hmotnost celého roztoku, m A... hmotnost rozpuštěné látky Hmotnost roztoku

Více

ODSTRAŇOVÁNÍ SÍRANŮ Z PRŮMYSLOVÝCH VOD

ODSTRAŇOVÁNÍ SÍRANŮ Z PRŮMYSLOVÝCH VOD ODSTRAŇOVÁNÍ SÍRANŮ Z PRŮMYSLOVÝCH VOD STRNADOVÁ N., DOUBEK O. VŠCHT Praha RACLAVSKÝ J. Energie a.s., Kladno Úvod Koncentrace síranů v povrchových vodách, které se využívají krom jiného jako recipienty

Více

Chemie - 8. ročník (RvMP)

Chemie - 8. ročník (RvMP) Chemie - 8. ročník (RvMP) Školní výstupy Učivo Vztahy charakterizuje chemii jako jednu z přírodních věd, rozlišuje a definuje jednotlivé chemické obory, rozlišuje látky a tělesa analyzuje fyzikální a chemické

Více

Veronika Janů Šárka Kopelentová Petr Kučera. Oddělení alergologie a klinické imunologie FNKV Praha

Veronika Janů Šárka Kopelentová Petr Kučera. Oddělení alergologie a klinické imunologie FNKV Praha Veronika Janů Šárka Kopelentová Petr Kučera Oddělení alergologie a klinické imunologie FNKV Praha interakce antigenu s protilátkou probíhá pouze v místech epitopů Jeden antigen může na svém povrchu nést

Více

DESINFEKCE A VYUŽITÍ CHLORDIOXIDU PŘI ÚPRAVĚ BAZÉNOVÉ VODY

DESINFEKCE A VYUŽITÍ CHLORDIOXIDU PŘI ÚPRAVĚ BAZÉNOVÉ VODY DESINFEKCE A VYUŽITÍ CHLORDIOXIDU PŘI ÚPRAVĚ BAZÉNOVÉ VODY.1Úvod Autor: Ing. František Svoboda Csc. Zvážení rizik tvorby vedlejších produktů desinfekce (DBP) pro úpravu konkrétní vody je podmíněno návrhem

Více

MINISTERSTVO ŠKOLSTVÍ MLÁDEŽE A TĚLOVÝCHOVY

MINISTERSTVO ŠKOLSTVÍ MLÁDEŽE A TĚLOVÝCHOVY MINISTERSTVO ŠKOLSTVÍ MLÁDEŽE A TĚLOVÝCHOVY Schválilo Ministerstvo školství mládeže a tělovýchovy dne 25. 7. 2002, č. j. 23 852/2002-23 s platností od 1. září 2002 počínaje prvním ročníkem Učební osnova

Více

Při průchodu proudu iontovými vodiči dochází k transportním, tedy nerovnovážným jevům. vodivost elektrolytů elektrolytický převod I I U

Při průchodu proudu iontovými vodiči dochází k transportním, tedy nerovnovážným jevům. vodivost elektrolytů elektrolytický převod I I U TNSPOTNÍ JEVY V OZTOCÍCH ELETOLYTŮ Při průchodu proudu iontovými vodiči dochází k transportním, tedy nerovnovážným jevům. vodivost elektrolytů elektrolytický převod Ohmův zákon: VODIVOST ELETOLYTŮ U I

Více

POPIS VYNÁLEZU K AUTORSKÉMU OSVĚDČENÍ. československa socialistická ( 19 ) (61) (23) Výstavní priorita (22) Přihlášeno 05 09 83 (21) PV 6457-83

POPIS VYNÁLEZU K AUTORSKÉMU OSVĚDČENÍ. československa socialistická ( 19 ) (61) (23) Výstavní priorita (22) Přihlášeno 05 09 83 (21) PV 6457-83 československa socialistická r e p u b l i k a ( 19 ) POPIS VYNÁLEZU K AUTORSKÉMU OSVĚDČENÍ (61) (23) Výstavní priorita (22) Přihlášeno 05 09 83 (21) PV 6457-83 (ii) CBi) (51) Int. Cl.' С 12 P 13/00 ÚŘAD

Více

TEST (Aminokyseliny) 9. Kolik je esenciálních aminokyselin a kdo je neumí syntetizovat?

TEST (Aminokyseliny) 9. Kolik je esenciálních aminokyselin a kdo je neumí syntetizovat? TEST (Aminokyseliny) A 1. Definuj deriváty uhlovodíků 2. Napiš obecný vzorec karboxylové kyseliny 3. Napiš vzorec ß - aminakyseliny 5. Doplň: větu: Oligopeptid je... 6. Doplňte větu: Silon vznikl... 7.

Více

Biochemie I. Aminokyseliny a peptidy

Biochemie I. Aminokyseliny a peptidy Biochemie I Aminokyseliny a peptidy Aminokyseliny a peptidy (vlastnosti, stanovení a reakce) AMINOKYSELINY Když se řekne AK ( -COOH, -NH 2 nebo -NH-) prostorový vztah aminoskupiny a karboxylové skupiny:

Více

Úloha č. 9 Stanovení hydroxidu a uhličitanu vedle sebe dle Winklera

Úloha č. 9 Stanovení hydroxidu a uhličitanu vedle sebe dle Winklera Úloha č. 9 Stanovení hydroxidu a uhličitanu vedle sebe dle Winklera Princip Jde o klasickou metodu kvantitativní chemické analýzy. Uhličitan vedle hydroxidu se stanoví ve dvou alikvotních podílech zásobního

Více

DĚLÍCÍ -SEPARAČNÍ METODY

DĚLÍCÍ -SEPARAČNÍ METODY DĚLÍCÍ -SEPARAČNÍ METODY Přehled nejdůležitějších separačních metod Separační (dělící) metody patří k základním typům operací prováděných v chemické laboratoři. Tyto operace se uplatňují při izolací jednotlivých

Více

Jméno autora: Mgr. Ladislav Kažimír Datum vytvoření: 21.03.2013 Číslo DUMu: VY_32_INOVACE_12_Ch_OB Ročník: I. Vzdělávací oblast: Přírodovědné

Jméno autora: Mgr. Ladislav Kažimír Datum vytvoření: 21.03.2013 Číslo DUMu: VY_32_INOVACE_12_Ch_OB Ročník: I. Vzdělávací oblast: Přírodovědné Jméno autora: Mgr. Ladislav Kažimír Datum vytvoření: 21.03.2013 Číslo DUMu: VY_32_INOVACE_12_Ch_OB Ročník: I. Vzdělávací oblast: Přírodovědné vzdělávání Vzdělávací obor: Chemie Tematický okruh: Obecná

Více

Projekt realizovaný na SPŠ Nové Město nad Metují

Projekt realizovaný na SPŠ Nové Město nad Metují Projekt realizovaný na SPŠ Nové Město nad Metují s finanční podporou v Operačním programu Vzdělávání pro konkurenceschopnost Královéhradeckého kraje Modul 02 Přírodovědné předměty Hana Gajdušková 1 Viry

Více

Elektronová mikroskopie SEM, TEM, AFM

Elektronová mikroskopie SEM, TEM, AFM Elektronová mikroskopie SEM, TEM, AFM Historie 1931 E. Ruska a M. Knoll sestrojili první elektronový prozařovací mikroskop 1939 první vyrobený elektronový mikroskop firma Siemens rozlišení 10 nm 1965 první

Více

SADA VY_32_INOVACE_CH2

SADA VY_32_INOVACE_CH2 SADA VY_32_INOVACE_CH2 Přehled anotačních tabulek k dvaceti výukovým materiálům vytvořených Ing. Zbyňkem Pyšem. Kontakt na tvůrce těchto DUM: pys@szesro.cz Výpočet empirického vzorce Název vzdělávacího

Více

ELEKTRICKÝ PROUD ELEKTRICKÝ ODPOR (REZISTANCE) REZISTIVITA

ELEKTRICKÝ PROUD ELEKTRICKÝ ODPOR (REZISTANCE) REZISTIVITA ELEKTRICKÝ PROD ELEKTRICKÝ ODPOR (REZISTANCE) REZISTIVITA 1 ELEKTRICKÝ PROD Jevem Elektrický proud nazveme usměrněný pohyb elektrických nábojů. Např.:- proud vodivostních elektronů v kovech - pohyb nabitých

Více

1.08 Tvrdost vody. Projekt Trojlístek

1.08 Tvrdost vody. Projekt Trojlístek 1. Chemie a společnost 1.08. Projekt úroveň 1 2 3 1. Předmět výuky Metodika je určena pro vzdělávací obsah vzdělávacího předmětu Chemie. Chemie 2. Cílová skupina Metodika je určena pro žáky 2. stupně ZŠ

Více