Praktická cvičení z botaniky

Transkript

1 Schola Humanitas Litvínov Střední odborná škola pro obnovu a ochranu životního prostředí Praktická cvičení z botaniky ( pro vnitřní potřebu školy ) Mgr. Jaromír Brožík Litvínov 1999

2 Úvod Milí studenti, dostáváte do rukou skripta praktických prací z botaniky. Jsou určena především studentům prvních ročníků, kteří začínají studovat botaniku. Teoretické vědomosti, které jsou základním předpokladem úspěšného studia botaniky, jsou doplňovány praktickými pracemi. Máme tak možnost naše vědomosti obohatit o praktické dovednosti a tak více upevnit v paměti. Nezbytnou podmínkou úspěšné práce je zvládnutí mikroskopické techniky. Proto v první části se budeme věnovat práci s lupou, optickým mikroskopem a technikou zhotovování preparátů. Dále následuje řada cvičení, která podrobnými návody a nákresy umožňuje poznat anatomické struktury rostlinných těl, cvičení k důkazu základních a typických látek buněčného prostředí a cvičení zaměřená na poznávání základních anatomických a morfologických charakteristik vybraných trav. Jedno zvláštní cvičení je věnováno zpracováváním a hodnocením pokusných dat. Samostatná část se stručně zabývá problematikou zhotovení herbáře a uvádí zjednodušené klíče k určování vybraných druhů dřevokazných hub a základních druhů lišejníků. V příloze je uvedeno několik mikroskopických obrazů a schémat z rostlinné anatomie. Přeji mnoho úspěchů ve studiu a uspokojení nad poznáváním rostlinné říše. Nátura in minimis maxima Mgr. Jaromír Brožík 1999

3 Lupa Při prohlížení a zkoumání biologického materiálu nevystačíme s pozorováním předmětů pouhým okem, které rozliší dva body vzdálené 0,2-0,1 mm. Mluvíme zde o zorném úhlu a rozumíme jím úhel, vznikající v oku. Svírají jej paprsky vysílané z okrajů pozorovaného předmětu. Předměty pozorované pod menším úhlem nezjedná minuta zpravidla nevidíme. Lupa je jednoduchý optický přístroj, složený z jedné spojné čočky nebo z jednoduchého sytému čoček v různé kombinaci (rozptylek a spojek). Zkoumaný objekt klademe mezi čočku a její přední ohnisko.vzniká tak přímý neskutečný (zdánlivý neboli virtuální) a zároveň zvětšený obraz objektu. Praktické maximální zvětšení je krát. Při zvětšení 8 krát a více se znatelně projevují optické vady. Lupy rozdělujeme : a) podle úpravy vad čoček : - jednoduché lupy -jsou složené z jedné, maximálně dvou čoček. Jejich zvětšení obvykle nedosahuje hodnoty 10 x. - achromatické lupy - jsou složené z jedné nebo dvou achromatických dvojic čoček. Zvětšují obvykle 4-8 x, ale mají velké, rovné a především až do okrajů barevně čisté zorné pole. - aplanatické lupy - jsou lupy zvětšující 6-40 x s velkým zorným polem, sféricky i chromaticky dobře korigovaným obrazem a velkou pracovní vzdáleností. - astigmatické lupy - jsou lupy obvykle složené ze čtyř čoček, zvětšující x. Mají dobrou korekci obrazu a poměrně dlouhou pracovní vzdálenost. b) podle technické dokonalosti a účelu použití : technická dokonalost a vybavení lup jsou značně rozdílné, takže mnohé provedení připomíná nejjednodušší mikroskop. Takto můžeme rozlišovat ruční lupy, kapesní lupy, preyarační lupy, binokulární lupy, dalekohledové lupy Mikroskop Mikroskop je přístroj, který mnohonásobně zvětšuje než lupy a při biologické práci je nejdůležitějším pomocníkem. Podle toho na jakém principu je mikroskop založen, rozlišujeme dvě základní řady mikroskopů - mikroskopy optické a mikroskopy zvláštní. Optické mikroskopy -dosahují maximálně 3000 násobného zvětšení. Popis mikroskopu Prakticky každý optický mikroskop se skládá ze tri částí: a) části mechanická b) části optické c) části osvětlovací a) Část mechanická je tvořena podkovovitou nohou, která nese sloupek sloužící k upevnění nosiče tubusu. Nosič tubusu je se sloupkem pohyblivě spojen. Ke sloupku je připevněn stolek, na nějž klademe preparáty. Na jeho svrchní straně jsou pružné svorky, které slouží k přichycení preparátu. Pohyb tubusu s optikou pro zaostření umožňují dva šrouby : makrometrický, který slouží k hrubému zaostření a mikrometrický, který umožňuje přesné doostření. Mikrometrický šroub má dělící kruh, jehož jeden dílek odpovídá obvykle posunu tubusu o 0,002 mm. Jeho manipulací je možno merit také tloušťku preparátu.

4 b) Část optická Je tvořena vlastním zvětšovacím zařízením. Je to nejdůležitější, nejdražší a nejcitlivější součást mikroskopu. Je tvořena dvojicí čoček - okulárem zasunutým do horního konce tubusu (blíže u oka) a objektivy zašroubovanými do otáčivého kotouče, zvaného revolver (blíže pozorovaného objektu). Na okulárech i objektivech je vyryto číslo jejich zvětšení. Celkové zvětšení mikroskopu vypočítáme, násobíme-li zvětšení okuláru zvětšením objektivu. U objektivů rozeznáváme několik důležitých znaků a vlastností, z nichž mnohé jsou závislé na korekci vad čoček. Čím přesnější je korekce, tím ostřejší je obraz a lepší kreslící schopnost mikroskopu. K těmto znakům a vlastnostem patří: Ohnisková vzdálenost - je na ní závislé zvětšení objektivu, je udávána v milimetrech a kolísá v rozmezí 30 mm až 1,5 mm. Z tohoto hlediska můžeme objektivy rozdělit na : 1.objektivy zvětšující slabě - o ohniskové vzdálenosti nad 20 mm, ( zvětšují 3-6 x ) 2.objektivy zvětšující středně - o ohniskové vzdálenosti 20-3 mm, ( zvětšují x) 3.objektivy zvětšující silně - o ohniskové vzdálenosti pod 3 mm, ( zvětšují x ) Volná pracovní vzdálenost - je kolmá vzdálenost mezi krycím sklem preparátu a čelní čočkou objektivu. Vzhledem k tomu, že volná pracovní vzdálenost je menší jak ohnisková vzdálenost může při použití silně zvětšujících objektivů ( od 45 x ) dojít při zaostřování k poškození preparátu nebo čočky objektivu ( viz. postup při mikroskopování). Ansulární apertura - otvorovy úhel - je tvořen dvěma okrajovými paprsky A a B, které ohraničují světelný kužel paprsků, přicházejících z určitého bodu předmětu Ježícího na optické ose, do objektivu. Teoreticky může být velikost tohoto úhlu 180, takže sinus alfa/2 je roven jedné. Numerická apertura - určuje přímo nebo nepřímo rozlišovací schopnost objektivu, prospěšné zvětšení, světelnost objektivu a hloubku obrazu. Numerická apertura je číslo, které se rovná sinu polovičního otvorového úhlu, násobeného indexem lomu prostředí n mezi čelní čočkou objektivu a preparátem. Tímto prostředím je u slabě zvětšujících objektivů vzduch o indexu lomu světla 1,0,u silně zvětšujících objektivů méně často voda o indexu lomu 1,33, častěji imerzní olej o indexu lomu 1,515, který je blízky indexu lomu skla 1,52. Schéma otvorového úhlu a numerické apertury apertury : Vzorec pro výpočet numerické n.sin.alfa/2 h O - předmět, ot - otvorovy úhel, d - polovina úhlu, n - prostředí, ob - objektiv

5 Rozlišovací schopnost objektivu - je schopnost objektivu ještě vytvořit obraz dvou pozorovaných blízkých bodů, tak aby je bylo možno okulárem a okem rozlišit. Tato vlastnost je tedy důležitá při pozorování jemných strukturálních detailů. Vzhledem k tomu, že světlo má vlnivou povahu, není ve skutečnosti obrazem bodu bod ani v dokonalém objektivu, ale rozptylový kroužek. Proto nezáleží rozlišovací schopnost na zvětšení, ale přímo na použité vlnové délce světla ( vlnová délka viditelného světla je 400 až 800 nm ) a nepřímo na numerické apertuře objektivu. Je tedy dána vzorcem vlnová délka dělena numerickou aperturou. Zároveň z toho vyplývá, že čím kratší je použitá vlnová délka světla, tím je větší rozlišovací schopnost objektivu a naopak. Penetrační schopnost neboli hloubková ostrost objektivu - je schopnost ostře kreslit do hloubky preparátu. Objektivy, které mají vysokou numerickou aperturu, mají zároveň malou hloubkovou ostrost, což se projevuje tím, že v preparátech, které si i v mikroskopických poměrech zachovávají svou prostorovost, tj. výšku, délku a šířku, můžeme ostře vidět detaily jen vjedné optické rovině, která je kolmá na optickou osu objektivu. Všechny ostatní detaily, ležící pod i nad touto rovinou jsou neostré nebo zcela mizí. Proto je nutno na jednotlivé optické roviny doostřovat mikrošroubem. Tato vada působí velmi rušivě při mikrofotografii. kde se proto používá silných objektivů o snížené numerické apertuře. Slabé objektivy s nízkou numerickou aperturou zobrazují současně ve více rovinách položených kolem roviny hlavní,takže vidíme ostře i struktury, umístěné pod a nad touto hlavní rovinou. Světelnost objektivu- je přímo úměrná čtverci numerické apertury a je závislá na lomu prostředí. V podstatě se jedná o schopnost objektivu přijmout co nejvíce světelných paprsků, které vycházejí z pozorovaného předmětu. Pro praktickou mikroskopii není již tak důležitá jako předešlé vlastnosti. V odstavci o numerické apertuře bylo zmíněno prostředí mezi preparátem a čočkou objektivu. U objektivů suchých je v tomto prostoru vzduch o indexu lomu světla 1,0. Paprsky procházejí krycím sklem a ve vzduchu se lámou od kolmice, a proto u těchto objektivů nedocílíme numerické apertury nad hodnotu 0,96. Jsou to objektivy málo zvětšující, (3-45 x), s volnou pracovní vzdáleností do 2 mm. Objektivy imerzní. ( někdy označované jako ponorné ), jsou charakteristické tím, že mezi krycím sklem preparátu a čelní čočkou objektivu, případně mezi čočkou kondenzoru a podložním sklíčkem je tekuté médium o vyšší lomivosti světla než vzduch a blízké indexu lomu skla 1,52-1,7. Jsou to objektivy silně zvětšující, o malé volné pracovní vzdálenosti a vysoké numerické apertuře až do 1,4, jejíž zvýšená hodnota je dosažena tím, že se paprsky v médiu málo lámou nebo se nelámou od kolmice. Hlavní výhodou imerzních objektivů je, že tímto způsobem je možno docílit numerické apertury vyšší než 1,0, což u suchých objektivů není možné. Nevýhodou imerzních objektivů je malá volná pracovní vzdálenost. Rozeznáváme : Imerzi olejovou - homogenní - název homogenní je dán tím, že paprsky procházejí v tomto případě jakoby opticky stejnorodým ( homogenním ) prostředím díky stejnému indexu lomu světla celého systému ( krycí sklíčko, imerzní olej, frontální čočka objektivu, případně čočka kondenzoru ).

6 Jako imerzní olej byl původně užíván cedrový olej získávaný z jalovce druhu Juniperus virginiana nikoliv z cedrů ( Cedrus libani). Ten však na suchu vysychá a tuhne. Proto byl v poslední době nahrazen syntetickým imerzním olejem. S oblibou je také používán anýzový olej o indexu lomu n = 1,5163. Ten se po určité době odpaří beze zbytku, takže odpadá pracné čištění objektivu. Imerzi vodní - index lomu světla vody je 1,33 a proto není tato imerze zcela homogenní. U objektivů docílíme numerické apertury maximálně 1,25. Používáme jí převážně u nativních preparátů, kde imerzní olej může pro svou hustotu způsobit posun krycího skla. Imerzi monobromnaftalenová - o indexu lomu 1,66. Kdysi se jí používalo ke studiu jemných struktur rozsivek. Má mnoho nevýhod a dnes se používá zřídka. Imerzi glycerolové - dnes se používá pouze pro práci s ultrafialovým světlem. Glycerol jako světlolomné médium má opět mnoho nevýhod. Pozorování imerzními objektivy Pozorování mikroskopických objektů pomocí imerze má odlišnosti, které pro kvalitu zobrazení je nutno respektovat: - detail objektu nejprve zaostříme silným suchým objektivem, nastavíme jej přesně do středu zorného pole a co nejpříznivěji osvětlíme - snížíme kondenzor a na jeho čelní čočku kápneme malou kapku imerzního oleje ( pro snížení možnosti bublin je výhodné nanést kapku imeze i na spodní stranu podložního sklíčka ) - kondenzor opět zvýšíme do horní polohy a detailním přiblížením provedeme spojení obou kapek (tzv. kondezorová imerze ). - revolverovou hlavicí zaměníme suchý objektiv za objektiv imerzní - na krycí sklíčko preparátu naneseme také polokulovitou kapku imerzního oleje - pohledem z boku hrubým posuvem provedeme spojení kapky na krycím sklíčku s čočkou objektivu - nepatrně objektiv od preparátu vzdálíme, nesmí dojít k přerušení kapky - pomocí mikrometrického posuvu objekt zaostříme - preparátem je možno pro snazší zachycení objektu pohybovat jen mírně - po zaostření je možno po vyjmutí okuláru z tubusu provést kontrolu stejnoměrného prosvětlené zadní části čočky objektivu - nestejnoměrné osvětlení opravíme - irisovou aperturní clonkou kondenzoru korigujeme průchod světla pozorovaným objektem - po skončení pozorování pomocí imezních medií všechny díly, se kterými přišla imerze do stykuje nutno řádně očisti ( používáme benzín nebo xylol)

7 Vznik obrazu v mikroskopu Ob - objektiv Ok - okulár F - ohnisko objektivu Fi - ohniska okuláru P - mikroskopovaný předmět 1 - obraz vytvořený objektivem 2 - obraz vytvořený okulárem c) Část osvětlovací Je tvořena vestavěnou lampičkou a kondenzorem. Před žárovičkou je umístěna irisová clonka, kterou regulujeme množství potřebného světla. Zároveň uzavíráním otvoru irisové clony snižujeme numerickou aperturu kondenzoru. Kondenzor je soustava čoček zasazených do objímky pod stolkem mikroskopu. Pomocí čoček je osvětlován objekt kuželem paprsků, které procházejí do objektivu o určité numerické apertuře. Hodnota numerické apertury bývá na kondensoru vyznačena. U kvalitních mikroskopů lze na kondenzoru nastavit numerickou aperturu tak, aby byla shodná s aperturou vytištěnou na právě používaném objektivu. Součástí osvětlovacího systému jsou různé filtry. Nejčastěji se používá modrý filtr (kobaltové sklo), které odstraňuje rušivé žluté paprsky používaného umělého osvětlení.

8 Zvláštní mikroskopy - do této umělé skupiny patří celá řada mikroskopů (inverzní mikroskop, stereomikroskop, ultramikroskop, tandemový řádkovací konfokálni optický mikroskop - TSM, laserový konfokálni řádkovací optický mikroskop - LSM, ultrazvukový řádkovací mikroskop a mikroskopy elektronové). Pro všeobecnou informovanost se zmíním o posledních dvou typech : Ultrazvukový řádkovací mikroskop - je zcela nový výrobek japonské firmy Olympus. Umožňuje pozorování podpovrchových struktur biologických materiálů bez barvení ve velkém rozsahu. Elektronový mikroskop - jeho dnešní konstrukce umožňuje ve zvětšení prakticky navazovat tam, kde možnosti optického mikroskopu končí. Moderní přístroj dosahuje až násobného zvětšení při rozlišovací schopnosti přibližně 0,3 nm ( 1 nm = 10 m ). Jako světelného zdroje je u těchto mikroskopů použito elektronové vlnění. Emise elektronů procházejí elektromagnetickými cívkami ( tzv. elektronové čočky ), které proud elektronů roztahují. Takto upravený proud elektronů dopadá na luminiscenční stínítko. Stejně jako u optického mikroskopu i u elektronového mikroskopu je rozlišovací schopnost závislá na vlnové délce, která je u elektronového paprsku přibližně 0,005 nm. Jedinou velkou nevýhodou elektronového mikroskopu je skutečnost, že nelze pozorovat živé objekty. Podle toho, jakým způsobem můžeme pozorovaný objekt v elektronovém mikroskopu zobrazit, rozeznáváme dva typy přístrojů - transmisní elektronový mikroskop (TEM) a řádkovací elektronový mikroskop ( SEM ). Zacházení s mikroskopem Mikroskop je velmi jemný a přesný přístroj, který vyžaduje šetrné zacházení. Při přenášení držíme přístroj jednou rukou za oblouk nosiče tubusu a druhou rukou zespodu za nohu. Prach z čoček odstraňujeme štětečkem, frontální čočku objektivu znečištěnou imerzní kapalinou čistíme velmi opatrně a rychle čistým, sepraným plátnem napuštěným xylolem nebo benzínem. Ostatní části mikroskopu ošetřujeme měkkou utěrkou. Zároveň dbáme aby osvětlení nebylo příliš prudké - škodí zraku i čočkám optiky. Mechanické části - šrouby a sáňky mažeme jemným olejem. Nepřítelem mikroskopů je prach, proto dbáme, aby po skončení práce byl přístroj kryt igelitovým obalem a uložen ve skříni. Nikdy nenecháváme mikroskopy volně na stole. Postup při mikroskopování 1. Upravíme pracovní místo, zrevidujeme čistotu optiky a dotažení objektivů, mikrometrický šroub ustavíme do střední polohy, zapneme osvětlení. 2. Provedeme kontrolu preparátu, čistotu podložního i krycího sklíčka. Nečistoty odstraňujeme hadříkem napuštěným xylolem nebo benzínem a otřeme do sucha. 3. Zvedneme tubus, nastavíme nejmenší zvětšení, otevřeme clonu a preparát zasuneme do svorek na stolku mikroskopu. Kondenzor na začátku pozorování je vždy v dolní poloze.

9 4. Viditelné objekty v preparátu umístíme přímo do optické osy mikroskopu. Objekty pouhým okem neviditelné hledáme tak, že systematicky prohledáváme celý prostor pod krycím sklíčkem ( zaostřujeme na dolní okraj podložního sklíčka ). 5. Při pohledu ze strany pomalu spouštíme tubus, až se čelní čočka objektivu téměř dotýká preparátu. Dáváme pozor,abychom nepoškodili krycí sklíčko a čočku objektivu. 6. Teprve nyní se budeme dívat do okuláru a pomalým pohybem makrometrickým šroubem zvedáme tubus, až se nám obraz preparátu jeví co nejostřejší. 7. Upravíme množství světla clonou tak, aby byly pozorované struktury co nejzřetelnější. Podle potřeby doostříme mikrometrickým šroubem. 8. Při použití silněji zvětšující objektivů dbáme aby žádané místo bylo ve středu zorného pole, pak teprve otočíme revolverem a nastavíme objektiv. 9. Každý prováděný úkol nebo pozorování zapisujeme do protokolu o cvičení. Pozorované objekty zakreslíme a jejich jednotlivé části v kresbě označíme a popíšeme. Záznamy musí být přehledné, zápisy stručné a jasné, kresby výstižné,dostatečně velké se správným popisem. lo.pracovní místo udržujeme v pořádku a po skončení práce uvedeme v laboratoři vše do původního předepsaného stavu. Kreslící zařízení - slouží k zakreslení jen hrubých obrysů pozorovaného objektu. Detaily dokreslujeme přímým pozorováním. Tato zařízení lze jednoduše zhotovit - na okulár položeného mikroskopu přilepíme krycí sklíčko pod úhlem 45. Pohledem shora pozorujeme zrcadlící se objekt na podloženém bílém papíře. Mikroskopické preparáty Mikroskopickým preparátem rozumíme různým způsobem upravený předmět schopný pozorování mikroskopem. Podkladem preparátu je podložní sklíčko, na něž se klade předmět do určitého prostředí ( udržuje jej v nezměněném stavu a má mít stejný lom světla jako sklo ). Pozorovaný objekt se překrývá krycím sklíčkem. Druhy preparátů Preparáty jsou dvojího druhu : 1. Nativní - zachycují nejvěrněji pozorovaný předmět, neboť k jejich přípravě používáme živé objekty, které pozorujeme zaživa. 2. Fixované - objekt je fixován ( umrtven ) a různými prostředky, nejčastěji barvením, upraven tak, abychom snáze rozeznaly jednotlivé složky. Podle způsobu provedení dělíme preparáty na : 1. Dočasné - uzavíracím prostředím je vysychající látka, nejčastěji voda. Tyto preparáty vydrží krátce a pro každé pozorování se musí připravit znovu. 2. Trvalé - uzavíracím prostředím je nevysychající, tuhnoucí látka, např. kanadský balzám, nebo látka tekutá,vysychavá nebo nevysychavá, ale uzavřená do tzv. rámečku z parafínu, glycerin-želatiny i jiných tmelů, které rychle tuhnou a chrání preparát před vyschnutím média. Tyto preparáty, jsou-li dobře zhotoveny, vydrží neomezeně dlouho. Jejich příprava je náročná na pečlivost.

10 Příprava mikroskopických preparátů V naší práci se omezíme jen na přípravu jednodušších preparátů. Všeobecné zásady přípravy všech preparátů jsou podobné. Seznámíme se nejdříve s jednoduchými pracovními postupy, které je nutné nejdříve zvládnout, abychom mohli v budoucnu připravit náročnější preparáty k mikroskopickému pozorování. Základní postupy : 1.Doprostřed dokonale vyčištěného podložního sklíčka přeneseme kapku vody, popřípadě jiné uzavírací látky. 2.Preparační jehlou, pinzetou, štětečkem vložíme do kapky připravovaný objekt určený k pozorování. 3.Čisté krycí sklíčko vezmeme za okraje, postavíme je hranou střechovitě k okraji kapky, přiblížíme je k ní tak, že se tekutina pod ní rozlije. Dále pozvolna sklíčko sklápíme, aby se nevytvořily bubliny. Předmět musí být menší než krycí sklíčko a po uzavření musí zůstat uprostřed. 4. Vytéká-li tekutina zpod krycího sklíčka a sklíčko zároveň při naklonění sjíždí, znamená to, že jsme použili příliš mnoho tekutiny. Přebytečné tekutiny se zbavíme odsátím proužkem filtračního papíru, přiloženého k okraji sklíčka. 5Byla-li kapka malá a pod sklíčkem zůstal vzduch, doplníme tekutinu přidáním kapky k okraji krycího sklíčka - tekutina se mezi obě skla vsaje. Řezání objektů Mikroskopické objekty pozorujeme v procházejícím světle, a proto musí být dokonale průsvitné. Takových materiálů však najdeme v přírodě málo.chceme-li pozorovat rozměrnější předměty, musíme z nich pořizovat tenké průsvitné lupínky - řezy. Dokonalé řezy pořídíme zvláštními přístroji - mikrotomy. Předměty se však musí pro ně připravovat velmi složitými postupy, a proto je výhodné zvládnout řezání objektů pouhou rukou a obejít se bez mikrotomu. Podle orientace řezu k ose předmětu rozeznáváme tyto druhy řezů : 1. radiální - řez rovnoběžný s osou, kterou zároveň protíná 2. tangenciální - řez rovnoběžný s osou, kterou však neprotíná 3. příčny - řez kolmý na osu předmětu Řezání předmětů rukou Rozměrnější předměty,které udržíme v ruce, řežeme přímo. Drobné nebo slabé přidržujeme v bezové duši " ( parenchymatické pletivo ). Špalíčky duše " na několik hodin ponoříme do vody. Pak je podélně řežeme do hloubky asi 2 cm. Do vzniklého rozštěpu vložíme objekt určený k řezání. Stiskem prstů svíráme rozštěp a řežeme i s duší". Řežeme nejlépe vždy novou žiletkou. Žiletku nasadíme na okraj řezné plochy a jednosměrným tahem za slabého tlaku se snažíme uříznout co nejslabší plátek. Řezy, které zůstávají na žiletce, snímáme vlhkým štětečkem a přenášíme do vody v Petriho misce, neboť řezné plochy nesmí oschnout. Při řezání držíme ruce volně, lokty se neopíráme o podložku. Vždy provádíme více řezů, ze kterých pak vybíráme k pozorování ty nejvhodnější.

11 Barviva a barvení preparátů Barviva, používaná k barvení živých nebo mrtvých objektů a způsoby barvení jsou důležitou součástí mikroskopické techniky při přípravě preparátů. Jednotlivé části objektu ( buňky, vnitřní struktury buněk, tkáně nebo neživé součásti ) se velmi málo liší svým indexem lomu světla a nelze je ve většině případů od sebe odlišit. Rozlišení jednotlivých struktur buňky tkáně, nebo odlišení struktur od prostředí provádíme pomocí vhodně volených barviv, přičemž využíváme toho, že tyto struktury vážou různá barviva v různé intenzitě pro ten který druh struktur charakteristické. Tak můžeme např. v buňce nebo tkáni rozlišit pomocí různých barviv nebo způsobů barvení řadu důležitých struktur. Rozdělení barviv můžeme provést z několika hledisek. Po chemické stránce jsou to např. barviva řady karmínové, odvozené od karmínu, nebo řady hematoxylinové, odvozené od hematoxylinu. Jsou to typická jaderná barviva přirozeného původu. Ze syntetických barviv jsou to např. barviva řady aromatické, tzv. anilínová. Důležitá je rozpustnost barviv ve vodě nebo alkoholu. Pro potřebu výuky na naší škole lze rozdělit barviva : a) kyselá - účinnou složkou je barevná kyselina nebo její sůl. Barví plasmu buněk a proto jim říkáme také plazmatická. Jsou to např. eosin, světlá zeleň, oranž G, kyselý fuchsin, trypanová modř a jiné. b) zásaditá - účinnou složkou je zásada nebo její sůl. Barví intenzívně jádra buněk, a proto jim říkáme jaderná - bazická. Patří sem bazický fuchsin, metylová zeleň, toluidová modř, methylenová modř, Janusova zeleň a jiné. c) neutrální či indiferentní - účinným barvivem jsou obě dvě složky tj. zásada i kyselina. Patří sem eosinát methylenové modři, Sudan III aj. Dále je možno dělit barviva na vitální - pronikají do buňky za živa a barví některé její součásti (neutrální červeň, Sudan III) a postvitální - barví jen mrtvé buňky a tkáně (hamatoxylin).

12 Cvičení č. 1 Téma : Buněčná stavba lístku meříku ( rod Mnium ) Cíl : zhotovení nativního preparátu lístku meříku, pozorování a nákres buněk s chloroplasty. Pozorování a popis plazmolýzy. Pomůcky : mikroskop, podložní a krycí sklíčko, hadřík, filtrační papír, pinzeta, preparační jehla, pipeta, list mechu meříku, 1 % roztok chloridu sodného, tužka č.l, měkká guma. Metodika a pozorování : pinzetou utrhneme z lodyžky meříku jeden lístek, vložíme jej do kapky vody na podložním sklíčku. Překryjeme krycím sklíčkem a pozorujeme. List tohoto mechu je tvořen jen jednou vrstvou buněk. Jsou zeleně zbarvené, obvykle šestiboké; při okrajích a ve středu, kde tvoří střední žebro, mívají protáhlý tvar. Okrajové buňky vystužují listovou plochu a středové buňky tvoří základ vodivých drah. Typické jsou chloroplasty, které zcela vyplňují obsah buňky, takže jádra a ostatní organely nejsou patrné. Některé buňky jsou bez obsahu. Jsou to buňky odumřelé. Na závěr pozorování provedeme pokus : ke hraně podložního sklíčka přikápneme pipetou 1 % roztok NaCl a z druhé strany jej odsajeme proužkem filtračního papíru. Plazma s plastidy se odtrhuje od stěny a shlukuje se uprostřed buňky v kuličku. Roztok chloridu sodného totiž odnímá buňkám vodu. Tomuto jevu říkáme plazmolýza. Prosajeme-li včas vodu opět vodu k buňkám, vrátí se plazma do původního stavu. Nastává opačný proces - deplazmolýza. Ztratila-li buňka při plazmolýze příliš mnoho vody nebo trvala-li plazmolýza příliš dlouho, proto plazma umírá a deplazmolýza již není možná. Úkol: prostudujte v učebnici kapitolu o osmotických jevech! Nákres :

13 Cvičení č. 2 Téma : Epidermis suknice cibule ( Allium cepa ) Cíl : zhotovení dočasného a fixovaného preparátu, pozorování a nákres buněk. Obarvení a pozorování jader. Pomůcky : mikroskop, podložní a krycí sklíčka, Petriho misky, hodinová sklíčka, etanol nebo 1 % kyselina octová pro fixaci, anilínová modř nebo methylová zeleň pro obarvení jader, žiletka, cibule, filtrační papír, štěteček, tužka č.2, měkká guma. Metodika a pozorování : nejprve připravíme nativní preparát buněk z epidermis cibule. Radiálně vedeným řezem vyřízneme z cibule dílek asi 0,5 cm široký a oddělíme a oddělíme jednotlivé zdužnatělé listy. Žiletkou je rozřežeme na kousky velikosti asi 4x4 mm. Z vnitřní strany těchto kousků stáhneme pinzetou jemnou blanku ( epidermis ) a ihned jich přeneseme několik do vody v Petriho miskách. Jeden čtvereček epidermis přeneseme štětečkem na hodinové sklíčko do etanolu a překryjeme jej víčkem od Petriho misky, aby etanol nevyprchal. V etanolu necháme tkáň 10 minut fixovat ( fixaci můžeme provést i v 1 % kyselině octové). Z jiného čtverečku připravíme dočasný preparát a prohlédneme jej pod mikroskopem. Pak přikápneme 1 % kyselinu octovou ( Cřb COOH ). Pozorujeme jak dříve špatně viditelná jádra zřetelně vystupují. Mají nejčastěji kulatý tvar, jsou umístěna buď ve středu buňky, nebo na jejím některém okraji u buněčné stěny. Pozorujeme strukturu jádra a jeho velikost. Uvnitř jádra jsou vidět dva, někdy jen jeden útvar. Je rovněž kulatý a zřetelně se od jádra liší. Jsou to jadérka. Po prohlédnutí tohoto preparátu vyjmeme z etanolu druhý čtvereček_a přeneseme do barviva (anilínová modř nebo 1 % methylová zeleň ) na 10 minut. Pak opláchneme vodou a přeneseme na podložní sklíčko, překryjeme sklíčkem krycím a pozorujeme. Použijeme-li anilínovou modř jsou jádra zřetelně modře zbarvena. Methylová zeleň barví jádra zeleně. Jadérka zůstávají nezbarvena. Nákres :

14 Cvičení č. 3 Téma : Pokožka listu poděnky ( Tradescancia sp. ) Cíl : reliéfovou metodou zhotovit preparát ze spodní strany listů a vysvětlit funkci průduchů Pomůcky : dvě rostliny poděnky - jednaje pečlivě zalévaná, druhá znatelně povadlá, bezbarvý lak na nehty, izolepa, mikroskop, podložní sklíčka, tužka č.2, měkká guma. Metodika a pozorování : spodní stranu obou rostlin potřeme slabou vrstvičkou bezbarvého laku na nehty, který necháme dobře zaschnout. Suchá blanka se sama odděluje od listu. Suché blanky sloupneme, odstřihneme čtverečky asi 5 x5 mm, položíme je na suché podložní sklíčko a přikryjeme izolepou, kterou pevně přitlačíme. Získali jsme negativní otisk povrchu listu. Tato metoda je vhodná ke studiu povrchových struktur. Její hodnota spočívá v její jednoduchosti a možnosti zachytit okamžitý stav povrchu živého těla, což je potřebné zvláště při fyziologických studiích. Pozorujme otisk pokožky. Mezi pokožkovými buňkami, přiléhajícími těsně k sobě, jsou vsazeny dvojice drobných buněk ledvinovitého tvaru. Jsou to svěrací buňky - průduchy ( stomata ), mezi nimiž je dýchací skulina. Při snížení turgoru svěrací buňky vadnou, uzavírají dýchací skulinu a snižují tak transpiraci, zároveň však i fotosyntézu. Nákres :

15 Cvičení č. 4 Téma : Parenchym z dužniny bezu černého ( Sambucus nigra ) Cíl : zhotovení preparátu parenchymatického pletiva z duše " bezu černého Pomůcky : dužnina bezu černého, mikroskop,žiletka,podložní a krycí sklíčka, tužka č.2, měkká guma. Metodika a pozorování : preparát připravíme příčnými a tangenciálními ( podélnými) řezy z dužniny. Mikroskopem pozorujeme parenchym. Buňky parenchymu mají přibližně stejnou výšku, šířku i délku, nebo jsou v jednom směru mírně protáhlé. Parenchym tvoří zpravidla živé buňky. Jejich buněčné stěny jsou neztloustlé nebo jen mírně ztloustlé a v místech, kde se setkávají tři a více buněk, vytvářejí mezibuněčné prostory.( Parenchym vodních a bahenních rostlin rozsáhlou soustavou mezibuněčných prostor - aerenchym ). Nákres :

16 Cvičení č.5 Téma : Aerenchym stonku sítiny ( Juncus sp. ) Cíl : připravit nativní preparát aerenchymatického pletiva, pozorovat a zakreslit jeho buňky. Pomůcky : mikroskop, Petriho miska, pinzeta, žiletka, bezová duše", stonky sítiny, preparační jehla, podložní a krycí sklíčka, tužka č.l, měkká guma. Metodika a pozorování: preparát zhotovíme z příčných řezů stonkem sítiny v bezové duši". Pozorujeme buňky s jádry. Mezi buňkami jsou četné mezibuněčné prostory, které rostlinu provzdušňují a nadlehčují ve vodě. Aerenhymatické pletivo se vyskytuje u rostlin vodních nebo rostlin vlhkých stanovišť. Nákres : ^

17 Cvičení č. 6 Téma : Buněčná stavba lístku rašeliníku ( Sphagnum sp. ) Cíl : zhotovit nativní preparát z lístku rašeliníku, pozorovat a zakreslit bezbarvé hyalocysty a zelené chlorocysty. Pomůcky : mikroskop, mech rašelinik, podložní a krycí sklíčka, tužka č.2, měkká guma. Metodika a pozorování : preparát zhotovíme tak, aby bylo možno pozorovat lístek z břišní strany. Lístky nemají střední žebro. Buňky lístků jsou rozlišeny ve velké bezbarvé hyalocysty (tyto velké buňky mají schopnost poutat velké množství vody) a menší zelené chlorocysty obsahující plastidy s chlorofylem. Nákres :

18 Cvičení č. 7 Téma : Příčný řez stonkem byliny pelargonie ( Pelargonium zonale ) Cíl : zhotovit nativní preparát ze stonku pelargonie, pozorovat, nakreslit a popsat jednotlivé struktury. Pomůcky : mikroskop, bezová duše", podložní a krycí sklíčka, kapátko, preparační jehla, žiletka, tužka č.l, měkká guma. Metodika a pozorování: preparát zhotovíme z vybraných příčných řezů stonkem pelargonie. Nákres :

19 Cvičení č. 8 Téma : Příčný řez stonkem hluchavky bílé ( Lamium album ) Cíl : zhotovení nativního preparátu stonku dvoudělozné rostliny a pozorování jednotlivých struktur. Pomůcky : mikroskop, bezová duše", podložní a krycí sklíčka, kapátko, preparační jehla, žiletka, tužka 5.2, měkká guma. Metodika a pozorování : pomocí bezové duše" zhotovíme více příčných řezů stonkem hluchavky. Jednotlivé řezy vkládáme do vody v Petriho misce, odkud vybíráme do kapky na podložní sklíčko, ty nejzdařilejší. Pozorujeme a provádíme nákres. Nákres :

20 Cvičení č. 9 Téma : Příčný řez stonkem kukuřice seté ( Zea mays ) Cíl : zhotovení fixovaného, trvalého preparátu ze stonku jednoděložné rostliny.pozorování a nákres parenchymu, sklerenchymu a uzavřeného kolaterálního cévního svazku. Pomůcky : mikroskop, mladé stonky kukuřice, podložní a krací sklíčka, preparační jehla, směs 2% anilínové modři a 2% kyselého fuchsinu, vodu k oplachování okyselenou několika kapkami kyseliny octové, žiletka, tužka 5.2, měkká guma. Metodika a pozorování: jednotlivé příčné řezy zhotovujeme ze spodní měkčí části internodia stébla kukuřice. Vybraný řez ( nezachycuje celou řeznou plochu ) na podložním sklíčku obarvíme kápnutím některou ze směsí barviv a necháme působit asi 10 minut. K přípravě preparátu použijeme jiné dokonale vyčištěné podložní a krycí sklíčko. Obarvený řez pinzetou vyjmeme z barviva, krátce jej opláchneme ve vodě na hodinovém sklíčku a ihned dáme do nádobky s absolutním alkoholem, v níž jej necháme asi 2 minuty. Z etanolu přeneseme řez do druhé nádobky s xylenem, a to nejméně na 5 minut, a také jí občas mírně pohybujeme. Řez proniklý xylenem ( nesmí vněm být bělavý zákal ) vyjmeme, položíme na čisté podložní sklíčko,, kápneme na něj kapku uzavírací látky a přikryjeme krycím sklíčkem, které mírně přitlačíme obrácenou jehlou. Je-li uzavírací látky málo, přidáme ji tyčinkou k okraji krycího sklíčka. Je-li jí mnoho a vytéká, nikdy ji neodstraňujeme, nýbrž ji po zatvrdnutí oškrábeme. Řez má po uzavření zůstat uprostřed. Preparát označíme tak, že na levou stranu nalepíme štítek s nápisem příčný řez stonkem kukuřice", na pravou stranu dáme štítek s jménem, kdo preparát zhotovil, a s datem zhotovení preparátu. Při nejmenším zvětšení si prohlédneme celkovou stavbu stonku. Pod pokožkou je nápadně vyvinutá sklerenchymatická pochva, která dodává stonku pevnosti ; obarví se červeně. Celý vnitřek stonku je vyplněn modře obarvenou parenchymatickou dření. Ve dřeni jsou patrné svazky cévní. Jsou nepravidelně roztroušeny po celé dřeni. Při okrajích je jich více, ve středu méně. Roztroušené svazky cévní jsou typické pro jednoděložné rostliny. Uvnitř cévních svazků vynikají nápadně velké otvory. Jsou to cévy, které jsou ve svazku cévním umístěny směrem ke středu stonku, to znamená, že část dřevní, v níž tyto cévy jsou, směřuje ke středu, část lýková, kterou vidíme jako modře obarvenou skupinu buněk uvnitř svazku cévního, je obrácena směrem k okraji stonku. Svazky cévní jsou uzavřené, bez kambia. Nákres: Při větším zvětšení si všímáme základního parenchymatického pletiva, které tvoří ve stonku dřen.